Universidad de Puerto Rico en Humacao

Departamento de Biología
Programa de Microbiología Aplicada

Unidad de Diluciones
Dr. Héctor L. Ayala del Río

La detección y enumeración de microorganismos es un componente esencial de la

microbiología. Sin embargo, la mayoría de los métodos de enumeración requieren que
la carga microbiana de la muestra se encuentre dentro del rango de confiabilidad del
método. Generalmente, las muestras analizadas tienen una carga microbiana mayor
que la permitida por el método. Es necesario diluir la muestra de manera que la carga
microbiana esté en el rango de confiabilidad del método. Entender los conceptos de
diluciones nos permitirá diluir de manera apropiada las muestras y poder calcular la
densidad de microorganismos en el cultivo original.

¿Qué es una dilución?

Una dilución se define como el acto de añadir un solvente a un soluto para reducir la
concentración del soluto. ¿Qué es el soluto? El soluto puede ser un compuesto
químico como la glucosa o un microorganismo como Escherichia coli. El principio en
ambos casos es el mismo, reducir la concentración (i.e. el número de moléculas de
glucosa o Escherichia coli por unidad de volumen). Esto lo logramos añadiendo más
solvente. El siguiente ejemplo ilustra el principio de diluciones:

Tenemos un tubo con 10 células en 2 ml de solvente. Le añadimos 3 ml de solvente

adicionales. ¿Cómo cambió la concentración de células en el tubo luego de añadirle el
solvente adicional?

Para poder contestar la pregunta es necesario

que calculemos la concentración de células
antes y después de añadir los 3 ml de solvente.
La concentración de células antes de añadir el
solvente sería:

número de células 10 células células

= = 5
volumen 2 ml ml

La concentración de células después de añadir 3 ml de solvente sería:

! número de células 10 células 10 células células
= = = 2
volumen 2 ml + 3 ml 5 ml ml

!
Si observamos detenidamente el ejemplo, notaremos que la cantidad de células no
cambia a pesar de añadir más solvente, lo que cambia es la cantidad de solvente en
que se encuentran dichas células. Por consiguiente, el añadir más solvente disminuye
la cantidad de células por unidad de volumen.

Existen varias estrategias para diluir. En nuestros cursos de química aprendimos cómo
diluir soluciones de las cuales conocemos la concentración original utilizando la
siguiente fórmula:

Ci "Vi = Cf "Vf
donde C = concentración, V = volumen, i = inicial, y f = final. Si despejamos esta
ecuación para que las concentraciones queden en un lado y los volúmenes en el otro
tendremos:
!
Ci Vf
=
Cf Vi
Esta igualdad nos indica que existirá una proporcionalidad entre las concentraciones
de las soluciones y los volúmenes de mezcla. Esta proporcionalidad es lo que
conocemos como el Factor de dilución.
!
Factores de dilución

El factor de dilución puede ser definido como una proporción que indica el número de
veces que hay que diluir el material original. Esta proporción nos indicará cuántas
partes de la muestra original hay que colocar en el total de partes de la mezcla.
Matemáticamente podemos calcular el factor de dilución utilizando volúmenes o
concentraciones:

Ci Vf
Factor de dilución (FD) = =
Cf Vi

Si utilizamos la concentraciones del ejemplo anterior para calcular el Factor de Dilución

tendríamos:
!
5células ml 5 2.5
FD = = = = 2.5
2células ml 2 1

Esto quiere decir que para obtener una solución con 2 células/ml es necesario diluir la
solución original 2.5 veces. Es importante notar que por ser una proporción los factores
de dilución no!tienen unidades y siempre se describen como una razón de partes
totales a partes de soluto. Generalmente se expresarán como el recíproco:

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 1 Volumen de soluto
FD = =
2.5 Volumen total de la solución

Por ser una proporción, es necesario que siempre expresemos los factores de dilución
relativo a una unidad de soluto. Si al calcular el FD necesario el soluto tiene un valor
menor de 1, entonces es necesario convertirlo a un valor entero 1. Si en el caso
!
anterior el volumen de inóculo hubiese sido 0.5 ml entonces el factor de dilución
hubiese sido:

Volumen de soluto 0.5

FD = =
Volumen total de la solución 2.5

El factor de dilución descrito no cumple con el criterio de que el volumen de soluto debe
ser un valor entero. Es necesario convertirlo en un entero. Existen varias maneras de
hacer dicha conversión matemática. Una manera rápida es buscar el número con el
!
que se multiplicaría el volumen de soluto para convertirlo en 1. Esto se puede obtener
dividiendo 1 entre el volumen de soluto:

1 1
Múltiplo = = = 2
Volumen de soluto 0.5

Si multiplicamos el factor de dilución anterior (numerador y denominador) por dos

tendríamos:
!
0.5 1
"2 =
2.5 5
El factor de dilución de la nueva mezcla sería 5.

Empleando el factor de dilución original de 2.5 podríamos decir que si queremos

!
preparar una solución a una concentración de 2 células/ml, podemos combinar 1 ml de
la solución original (5 células/ml) en un total de 2.5 ml de solución. Esto no nos dice el
volumen de solvente que necesitaríamos para preparar dicha dilución. Para obtener el
volumen de solvente necesario, le restaríamos el volumen de solución original del
volumen total:

Volumen de solvente = Volumen total de la solución " Volumen de soluto

En el ejemplo original el volumen de solvente sería 1.5 ml.

!

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Los factores de dilución son una herramienta poderosa en la preparación de
soluciones. El conocer la proporción en que necesitamos diluir un soluto nos permite
poder calcular distintos volúmenes de solución utilizando principios de
proporcionalidad. Por ejemplo, si quisiéramos preparar un total de 35 ml de una
dilución 1/2.5 podemos utilizar la siguiente relación proporcional:

1 x
=
2.5 35
donde x representa el volumen de soluto necesario para mantener el mismo factor de
dilución original. Debemos recordar que un factor de dilución representa la proporción
de soluto a mezcla total. Por esta razón es que podemos despejar para un
!igualdad. Si despejamos para x tendremos que el volumen
desconocido utilizando una
de soluto necesario para obtener 35 ml de solución será 14 ml.

Diluciones en serie

Un cultivo de Escherichia coli puede alcanzar densidades de 3x109 células/ml en un

periodo de 24 horas. Sin embargo, para poder enumerar densidades de bacterias
utilizando métodos de enumeración viable, como el plato disperso, es necesario diluir el
cultivo para que tengamos en el plato entre 30 y 300 unidades formadoras de colonia
(ufc). Si asumimos que en un plato se coloca 1 ml de la solución, podríamos calcular el
factor de dilución necesario utilizando las concentraciones antes descritas:

3x10 9 células /ml 1x10 7

FD = =
300 células /ml 1

Si fuéramos a preparar esta dilución en una botella necesitaríamos 1 ml de cultivo y

9,999,999.0 ml de solvente (9,999.999 litros). Esto presenta varios problemas. En
primera instancia no podríamos medir con suficiente exactitud un valor como 9,999.999
!
litros. En segundo lugar, esto representa un desperdicio de recursos para colocar 1 ml
de solución en un plato de cultivo. Es por esta razón que recurrimos a las diluciones en
serie.

Las diluciones en serie requieren que la muestra se diluya en múltiples pasos de

manera sucesiva. Esto permitirá obtener factores de dilución altos, pero manteniendo
los volúmenes totales bajos. Para obtener el factor de dilución acumulado en
diluciones en serie, multiplicamos el factor de dilución de cada paso desde el principio
hasta el final. Por ejemplo, si utilizamos diluciones en serie para poder obtener el factor
de dilución de 1/1x107 podríamos utilizar un esquema como el siguiente:

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 El factor de dilución acumulado se obtendría de la multiplicación de los factores de
dilución en cada paso:
1 1 1 1 1
Factor de dilución acumulado = * * * =
100 100 100 10 10,000,000*

* 10,000,000 se puede expresar como 1x107

!
La mayor ventaja de las diluciones en serie es que reducimos dramáticamente el
volumen de solvente necesario. En el ejemplo anterior utilizamos un total de 306 ml,
!
una cantidad significativamente menor que los 9,999,999.0 ml requeridos si fuéramos a
realizar la dilución en un solo paso. Otra ventaja de las diluciones en serie es que la
disminución en el volumen de las diluciones tiene como efecto aumentar la exactitud de
la medidas. Esto resultará en resultados mas exactos y reproducibles.

Es importante recordar que aunque en el ejemplo anterior utilizamos mezclas de

solvente de 1 ml y 99 de solvente para lograr una dilución 1/100 lo mismo se puede
lograr en volúmenes más pequeños de muestra y solvente utilizando principios de
proporcionalidad. La siguiente tabla ilustra este principio

FD Soluto (ml) Solvente (ml) Total (ml)

1/100 1 99 100
1/100 0.5 49.5 50
1/100 0.1 9.9 10
1/100 0.01 0.99 1.0

Note que en los cuatro casos presentados en la tabla siempre se conserva el factor de
dilución, pero los volúmenes de soluto y solvente varían. La pregunta que uno se debe
hacer: ¿qué volumen debo de emplear? Estadísticamente hablando, si empleamos
volúmenes mayores la probabilidad de encontrar microorganismos en la muestra será
mayor. Sin embargo, hay que considerar los errores de medida. Volúmenes entre 0.1
ml y 10 ml pueden ser medidos con alta precisión utilizando pipetas serológicas,

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mientras que volúmenes por debajo de 0.1 ml pueden medirse con mayor precisión
utilizando micropipetas. La decisión de los volúmenes a utilizar dependerá de los
materiales que tenga disponibles y los volúmenes de solución que necesite.

Determinación de densidad y corrección por volumen de inóculo

Una vez diluidas nuestras muestras, el próximo paso es inocular los medios de cultivo
para determinar la densidad. El volumen de inóculo a ser empleado dependerá
principalmente del método de enumeración empleado. Sin embargo, ese volumen
tendrá un efecto en los cálculos de la densidad. Si tenemos un esquema de diluciones
como el de la figura a continuación, ¿cómo podemos calcular la densidad de bacterias
en el cultivo?

Para calcular la densidad de microorganismos en la muestra original seguiremos los

siguientes pasos:

1. Calcular el factor de dilución acumulado de la dilución a enumerar (el plato que

con 233 unidades formadoras de colonia [ufc]). El resultado sería:

1 1 1 1 1
Factor de dilución acumulado = * * * =
100 100 100 10 1x10 7

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 2. Multiplicar el recíproco del factor de dilución acumulado por el número de
colonias en el plato

1"10 7
* 233 = 2,330,000,000
1
En notación científica se expresaría :
2.33 "10 9

3. Las unidades dependerán del volumen de inóculo en el plato. En este caso se

empleó 1.0 ml por lo tanto las unidades serán ufc/ml.
!

Dependiendo del método de enumeración empleado es que decidiremos el volumen a

inocular en el medio de cultivo. Aunque en el ejemplo anterior empleamos 1.0 ml de
inóculo muchos métodos de enumeración solo emplean 0.1 ml. Si empleamos 0.1 ml
de inóculo entonces: ¿cómo serán las unidades? Unidades de ufc/0.1ml no hacen
sentido. Por esta razón es que cuando inoculamos volúmenes menores de 1.0 ml
tenemos que hacer una corrección que equivale a un factor de dilución. Esta
corrección se calcula dividiendo el volumen de inóculo sobre 1.0.

Volumen de inóculo 0.1 1

Corrección = = =
1.0 1.0 10

La corrección calculada es un factor de dilución adicional que hay que añadir al cálculo
de densidad. Esto quiere decir que si en el ejercicio pasado hubiésemos usado 0.1 ml
de volumen de!inóculo, entonces el cálculo de densidad sería:

1"10 7 10
Densidad del cultivo = " 233 " = 2.33 " 1010 ufc/ml
1 1

Esta corrección implicó un aumento por un factor de 10 en la densidad de la muestra

original.
!

Ejercicios de práctica

1. La compañía de Biotecnología Puertorriqueña está lista para producir una

proteína recombinante usando un clon bacteriano. Para esto hay que preparar
un inóculo inicial que será llevado a un fermentador. El procedimiento para
preparar el inóculo indica que se combinen 8.0x1015 células liofilizadas (i.e. en
polvo) en 20 ml de medio de cultivo.
a. ¿Cuál será la densidad del inóculo inicial?
b. Si en lugar de 20 ml de medio se añaden 35 ml de medio, ¿cuál será la
concentración?

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 2. Para detectar bacterias fijadoras de nitrógeno estaremos empleando un
anticuerpo específico para la nitrogenasa. Como el anticuerpo es
extremadamente sensitivo, una dilución de 1:15,000 es suficiente para detectar
la enzima. Sin embargo, para realizar el experimento solo necesitamos 8 ml de
anticuerpo diluido. Calcule el volumen de solvente y anticuerpo para producir 8
ml de anticuerpo.
3. El técnico de laboratorio le entregó una suspensión de Escherichia coli a una
densidad de 2.4x107 células/ml. El experimento que realizarás necesita que E.
Coli esté a una densidad de 1.0x103 células/ml.
a. Calcula el factor de dilución para lograr esto.
b. Calcula los volúmenes de salina y células para preparar 100 ml de
dilución.
c. Calcula cuántas células hay en los 100 ml de dilución.
4. Si preparamos cuatro diluciones en serie con los siguientes volúmenes:
a. Calcule el factor de dilución en cada dilución
b. Calcule el factor de dilución acumulado

# de dilución Volumen Soluto Volumen Solvente

1 0.1 9.9
2 1.0 9.0
3 0.1 5.5
4 0.5 7.5

5. Su compañero de laboratorio y usted son responsables de enumerar la densidad

de un cultivo de Staphilococcus aureus. Su compañero no durmió mucho
anoche y en la primera dilución mezcló 0.7 ml del cultivo con 25 ml de diluente.
De esa dilución tomó 0.25 ml y los combinó con 9.75 ml de diluente. Finalmente
usted inoculó el plato con 0.3 ml de la ultima dilución. El resultado de la
enumeración fueron 160 ufc.
a. Calcule el factor de dilución acumulado incluyendo la corrección de
inóculo.
b. Calcule la densidad del cultivo original.
6. El volumen del cultivo original eran 10 ml. Luego de realizar diluciones en serie
para un factor de dilución total 1/10000000 se obtuvieron 43 colonias por plato.
¿Cuantas células en total habían en el cultivo original? Asuma que el volumen
de dilución inoculado en cada plato fue de 0.1 ml.
7. Un técnico nos informa que la densidad del cultivo con el que trabajará es
3.15x106 células/ml. Para obtener este número él contó 45 colonias en un plato
que fue inoculado con 0.1 ml. Conteste las siguientes preguntas:
a. Calcule el factor de dilución TOTAL para obtener el resultado propuesto.
b. Recree el esquema de diluciones empleado por el técnico para lograr ese
resultado. Recuerde que el volumen máximo que el técnico puede
emplear en una dilución es 100 ml.
8. Usted tiene un cultivo con una concentración desconocida para el cual obtiene
257 colonias en una dilución 1/1x108. Calcule la densidad original del cultivo.

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 9. Un estudiante empleó el siguiente esquema de diluciones: diluir 0.1 ml del cultivo
original en 9.9 de diluente. De esa dilución transfieres 0.1 ml a 9.9 de diluente.
Finalmente transfieres 0.2 ml de la ultima dilución al plato. El promedio de ufc
fue 232.
a. Haga un dibujo del esquema de diluciones
b. Calcule el factor de dilución de cada paso (incluyendo corrección de ser
necesaria) y total.
c. Calcule la densidad del cultivo original.
10. Dado que un cultivo debe tener una densidad aproximada de 5x1011 células/ml
diseñe un esquema de diluciones donde pueda emplear las botellas de dilución
con 90 ml de salina que tengo disponibles y que le produzca entre 30 y 300 ufc
en el plato.

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Soluciones problemas de práctica

1.
8.0 "1015 células
a. = 4.0 " 1014 células/ml
20 ml

8.0 "1015 células

b. = 2.29 " 1014 células/ml
! 35 ml

2. La manera más sencilla de resolver este ejercicio es emplear proporciones:

!
1 X
=
15,000 8

8
=X
15,000

5.33 " 10 -4 = X

3.
a. El factor de dilución sería:
!
Ci 2.4 "10 7 células/ml 1
= 3
=
Cf 1.0 "10 células/ml 24,000

b. Para calcular los volúmenes de salina e inóculo puedes emplear una

proporción:
!
1 x
=
24,000 100

100
=x
24,000

0.00416 = x

c. Número total de células

3 células
1.0 "10
! "100 ml = 100,000 células
ml

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 4. Contestaciones en la tabla

# de Volumen Volumen (a) Factor (b)Factor de

dilución Soluto Solvente de dilución
dilución acumulado
1 0.1 9.9 1/100 1/100
2 1.0 9.0 1/10 1/1,000
3 0.1 5.5 1/56 1/56,000
4 0.5 7.5 1/16 1/896,000

5. Factor de dilución
a.
Primera dilución = 0.7/25.7 = 1/36.7
Segunda dilución = 0.25/10 = 1/40
Factor de corrección = 1.0/0.3= 1/3.33

1 1 1 1
Factor de dilución acumulado " " =
36.7 40 3.33 4,888

4,888
b. Densidad del cultivo sería: 160 ufc " = 7.82 " 10 5 ufc/ml
1
! asumir que el volumen de inóculo es 1.0 ml.
6. En este ejercicio tienes que
Entonces el número de células será:

10,000,000 !
" 43 colonias = 4.3 "10 8 células/ml
1

células
Células totales = 4.3 "10 8 "10 ml = 4.3 " 10 9 células
ml
7.
a. Este ejercicio se puede resolver empleando un poco de álgebra
! 45 " X = 3.15 "10 6 células/ml
3.15 "10 6 células/ml
X=
45
X = 70,000

El factor de dilución total seria 1/70,000

!

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 b. Para recrear el esquema, primero debemos separar el factor de dilución
de las botellas y la coerción. En este caso, la corrección sería 1/0.1
=1/10. Para conocer el factor de dilución de las botellas podemos dividir
el factor de dilución total entre la corrección.

8. La densidad original del cultivo sería”

1"10 8
257 " = 2.57 " 1010 células/ml
1

9. Ver figura para las contestaciones a, b y c

!

10. Este problema requiere que inicialmente calculemos un factor de dilución para
luego trabajar el esquema. El factor se puede calcular empleando la cantidad de
células en un mililitro de cultivo original y el número de ufc que deseamos tener

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 en el plato (entre 30 y 300). Vamos a asumir que deseamos tener 200 colonias
en el plato.

5 "1011 2,500,000,000 2.5 "10 9

FD = = =
200 1 1

Ahora necesitamos que el factor de dilución total de nuestro esquema de

diluciones sea igual al que acabamos de calcular. Como se nos proveen
botellas de 90 ! ml de salina lo más sencillo es emplear diluciones de 1/10 en las
botellas. Para solucionar el ejercicio podríamos emplear ocho botellas de 1/10 y
luego que la dilución en el plato sea 1/25 o emplear 9 botellas de 1/10 y que la
dilución al llevar al plato sea 1/2.5.

Para confirmar que nuestro esquema está correcto podemos emplear el factor
de dilución obtenido y la densidad original para calcular cuántos ufc deben haber
en la placa.

Densidad 5 "1011 5 "1011

= = = 200
1 1 2.5 "10 9
FD 1
2.5 "10 9

!
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