Los precursores de aromas específicos de cacao se generan mediante digestión proteolítica de la vicilina como

globulina de semillas de cacao

ARTÍCULO en QUÍMICA ALIMENTARIA · ENERO 1994

Se investigó la formación proteolítica de los precursores aromáticos específicos del cacao invitro utilizando sustratos
proteicos y proteasas purificadas a partir de semillas de cacao no germinadas. Una endoproteasa aspártica y una
carboxipeptidasa presente en células no germinadas Se encontró que las semillas de cacao eran necesarias para este
proceso. Los precursores de aromas específicos de cacao se obtuvieron por digestión proteolítica de la globulina
similar a la vicina, pero no por proteolisis de la albúmina de semillas de cacao.

INTRODUCCIÓN

La fermentación de las semillas de cacao se requiere para obtener aroma específico de cacao al tostar (Rohan, 1964).
Por lo tanto, se generan precursores esenciales de los componentes aromáticos específicos durante el proceso de
fermentación. Mohr y colaboradores extrajeron, fraccionaron y caracterizaron parcialmente los precursores de
aroma específicos de cacao procedentes de semillas de cacao fermentadas (Mohr et al., 1971, 1976). Estos autores
han informado que el aroma de cacao típico se obtuvo cuando se tostó una fracción de péptido aislada de semillas
de cacao fermentadas en presencia de aminoácidos libres y azúcares reductores (Mohr et al., 1976).

Estos hallazgos indican que los precursores de aroma específicos del cacao se forman durante la fermentación
mediante procesos proteolíticos (Ziegleder & Biehl, 1988). De hecho, tanto la proteolisis de las proteınas de semilla
como la formación de precursores del aroma dependen fuertemente del grado y del tiempo de acidificación de la
punta durante el proceso de fermentación (Biehl et al., 1982, 1985). Las fermentaciones con acidificación moderada
de la punta (pH 5.0-5.5) resultan en lotes de cacao crudo con potenciales de aroma considerablemente más altos que
las fermentaciones a pH 4.0-4.5 (Biehl et al., 1985). Los hallazgos de que existe una correlación entre la formación de
cacao específico Los precursores del aroma, la proteolisis de las proteınas de la semilla y el degre y el tiempo de la
acidificación durante el proceso de fermentación, han llevado al desarrollo de un procedimiento (almacenamiento
post cosecha de cáscaras) que ha mejorado la calidad del cacao en Malasia (Biehl et al , 1989, Meyer et al., 1989).

Las semillas de cacao no germinadas contienen una endoproteasa única, es decir, una proteasa aspártica con
actividad máxima alrededor de pH 3,5 (Passern, 1979, Biehl et al., 1993). Esta enzima debería, por tanto, estar
implicada en la generación de los precursores de aromas específicos del cacao. Sin embargo, una fuerte acidificación
del plumín durante la fermentación (pH 4.0-4.5) causa un bajo potencial de aroma, aunque la endoproteasa es más
activa a valores de pH aún más bajos. Por otra parte, se ha encontrado acumulación de aminoácidos libres
hidrófobos durante la fermentación o la fermentación como incubaciones de semillas de cacao (Kirchhoff et al.,
1989a, b).

Durante la fermentación, como las incubaciones de semillas a pH 5-5, se liberaron cantidades considerablemente
mayores de aminoácidos que a pH 4,5 (Kirchhoff et al., 1989b), indicando que una exopeptidasa también está
implicada en la generación de precursores aromáticos específicos del cacao. Para distinguir qué enzimas están
implicadas en este proceso, hemos comenzado a investigar la formación proteolítica de precursores de aroma
específicos de cacao in vitro usando polvo seco de acetona libre de polifenoles preparado a partir de semillas de
cacao no fermentadas (Voigt et al., 1994): Por incubación De acetona-polvo seco (AcDP) a pH 5,2, se obtuvieron
mezclas de péptidos hidrófilos y aminoácidos libres predominantemente hidrófobos que, al tostar en presencia de
azúcares reductores y manteca de cacao desodorizada, revelaron inequívocamente aroma típico de cacao. Sin
embargo, no se generaron precursores de aroma específicos de cacao cuando se realizó autólisis de AcDP a pH 3,5.

Los péptidos hidrófobos formados en estas condiciones podrían transformarse en mezclas de péptidos hidrófilos y
predominantemente aminoácidos libres hidrófobos mediante post-tratamiento con carboxipeptidasa comercial. De
nuevo, se mostró que estas mezclas de péptidos hidrófilos y aminoácidos libres hidrófobos contienen precursores de
aroma específicos de cacao. Por este enfoque experimental, hemos podido demostrar que los precursores de aroma
específicos de cacao se generan a partir de proteínas de semillas mediante la cooperación de una endoproteasa
aspártica y una carboxipeptidasa (Voigt et al., 1994).
Las incubaciones semejantes a la fermentación de semillas de cacao intactas bajo condiciones de laboratorio
controladas han revelado que a pH 4,0-4,5, tiene lugar una proteolisis inespecífica de todas las proteínas de semilla,
mientras que a pH 5,0-5,5 se degradan selectivamente las proteínas de almacenamiento vacuolar distintas (Biehl et
al. , mil novecientos ochenta y dos). Los polipéptidos que se degradan selectivamente durante las incubaciones de
semillas a pH 5,0-5,5 han demostrado recientemente ser las subunidades polipeptídicas de una globulina de tipo
vicilina (Spencer y Hodge, 1992; Voigt et al., 1994) indicando que los precursores de aroma específicos de cacao
Podría derivarse de una globulina similar a la de las semillas de cacao. Esta hipótesis fue corroborada por estudios in
vitro de la formación proteolítica de estos precursores de aromas particulares utilizando proteínas de sustrato
purificadas y proteasas como se muestra en la presente comunicación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

Las semillas de cacao fueron de vainas maduras y genéticamente indefinidas cosechadas en la División Cocoa y
Coconut del Instituto de Investigación y Desarrollo Agropecuario de Malasia (MARDI, Hilir Perak, Malasia), Se
extrajeron semillas no fermentadas de las vainas inmediatamente después de la llegada (4-5 días después de la
cosecha ), Congelado por choque en nitrógeno líquido después de la eliminación de la testae y radiculae y liofilizado.

Extracción de grasa

Los cotiledones secos se trituraron y se extrajeron porciones repetidas de 10 g cada vez en un aparato Soxhlet con
500 ml de éter de petróleo (pe 40-70 ° C). Después

Evaporación del disolvente, el material se pulverizó y se extrajo de nuevo de nuevo durante 8 h de la misma manera.
Finalmente, los alcaloides purínicos se extrajeron parcialmente con cloroformo durante 8 h en un aparato Soxhlet.

Preparación de AcDP

El AcDP de semillas de cacao se preparó esencialmente como se ha descrito recientemente (Kirchhoff et al., 1989a).
Para eliminar los polifenoles, los polvos de semillas desgrasados se extrajeron tres veces con acetona acuosa al 80%
(v / v) que contenía ascorbato de sodio 5 mM y posteriormente con acetona acuosa al 70% (v / v). Las suspensiones
(200 ml de acetona acuosa por 10 g de polvo de semilla) se agitaron durante 1 h a 4ºC y se extrajeron los extractos
por centrifugación (15 min a 13000 x g). Después de la etapa de extracción final, se comprobó la eficacia de la
extracción de polifenoles calentando una alícuota del polvo seco de acetona con HC1 5 M (el color rojo indica la
presencia de polifenoles residuales). Después de la extracción completa de polifenoles, el agua residual se eliminó
por extracción con acetona al 100%. Después de la centrifugación final, el sedimento se evaporó a presión reducida
para eliminar el disolvente. El polvo seco de acetona (AcDP) se almacenó a -20ºC.

Fraccionamiento de proteínas de semillas

Las proteínas de la semilla se extrajeron a partir de AcDP libre de polifenoles como se describió recientemente (Voigt
et al., 1993a): Se extrajo primero AcDP (50 g) con 5 litros de un tampón de baja sal que contenía ascorbato sódico 5
mM, EDTA 2 mM y 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) para obtener la fracción de albúmina. La suspensión se agitó durante 1 h
a 4ºC y posteriormente se centrifugó durante 20 min a 20.000 x g y 4ºC en el rotor Sorvall GSA (Du Pont de Nemours
GmbH, Bad Homburg, Alemania). La extracción se repitió tres veces para minimizar una transferencia de proteínas
solubles en condiciones de baja sal a la fracción de globulina. Sólo los dos primeros extractos se combinaron y se
almacenaron a -70 ° C hasta su uso. Posteriormente, se extrajo el AcDP pretratado con 5 litros de NaCl 0,5 M que
contenía ascorbato de sodio 5 mM, EDTA 2 mM y Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) para obtener la fracción de globulina. La
suspensión se agitó a 4ºC durante 1 h y se centrifugó durante 20 min a 20000 x g y 4ºC en el rotor Sorvall GSA. La
extracción se repitió y los sobrenadantes se combinaron. Cuando se dializó el extracto de alta sal con agua destilada
y posteriormente con acetato sódico 20 mM (pH 5,0), se formó un precipitado que se encontró que consistía en una
globulina casi pura (Fig. 1, carril d, véase Pettipher , 1990).
Figura 1. Perfiles SDS-PAGE de las fracciones proteicas
preparadas a partir de semillas maduras de cacao. Las
fracciones de proteína se obtuvieron por
fraccionamiento de solubilidad a partir de polvo de
acetonio libre de polifenoles como se describe en la
sección 'Materiales y Métodos', y se sometieron 60tzg
de cada fracción a SDSPAGE de acuerdo con Laemmli
(1970). Los geles se tiñeron con azul brillante de
Coomassie. Los pesos moleculares (Mr) de los patrones
de proteínas (fosforilasa b = 97000, albúmina de suero
bovino - 68000, ovoalbúmina = 46000, anhidrasa
carbónica = 29000, inhibidor de tripsina 24000,
hemoglobina - 15500, citocromo c - 12.300) Números a
la derecha. A) proteínas totales de semillas; (B)
albúmina cruda; (C) globulina cruda; Y (d) globulina
purificada por precipitación a baja concentración de sal
y condiciones ácidas.

El extracto de baja sal se fraccionó mediante cromatografía de intercambio aniónico usando una columna Whatman
DE-52 (50 mm x 250 mm) equilibrada con fosfato de sodio 10 mM (pH 7,5). El extracto de baja sal se aplicó
directamente a la columna. Después de lavar con 500 ml de tampón de equilibrado que contiene ascorbato de sodio
5 mM, la columna se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 100-400 mM en tampón de equilibrado que contenía
ascorbato de sodio 5 mM (2 litros cada uno). Se recogieron fracciones de 20 ml y se midió la absorbancia a 280 nm y
las actividades de la endoproteasa aspártica, carboxipeptidasa y enzima de escisión de leucina-p-nitroanilida.

Además, las fracciones de eluato se analizaron para detectar la presencia de la albúmina de 19 kDa mediante SDS-
PAGE según Laemmli (1970). Las fracciones de pico se combinaron, se concentraron mediante tratamiento con
Aquacide II (Calbiochem-Behring, Marburg, Alemania), se dializaron frente a fosfato sódico 10 mM (pH 7,5) y se
almacenaron a -20ºC.

Ensayos enzimáticos

La actividad endoproteasa aspártica de la endoproteasa aspártica se midió en tampón de Mcllvaína (Na2HPO4 0,2 M
ajustado a pH 3,5 por adición de ácido cítrico). Las mezclas de reacción de 1 ml que contenían 9 mg de albúmina de
suero bovino como sustrato se incubaron a 45ºC durante 1 h. La reacción se detuvo por adición de 0,2 ml de ácido
tricloroacético (25%, p / v). La proteína precipitada se eliminó por centrifugación a 10000 xg durante 15 min.
Posteriormente, la proteólisis se midió colorimétricamente por el método del ácido trinitro-bencenosulfónico como
se describe por Shutov et al., (1982). Cada muestra se analizó para determinar la actividad de la proteasa tanto en
presencia como en ausencia de 10 \ mu g de pepstatina A (Sigma Chemie, Deisenhofen, Alemania). Una unidad de
endoproteasa aspártica es la actividad sensible a la pepstatina que libera 1 / xmol de grupos NH2 por minuto a pH 3-
5 (tampón de Mcllvaína 0-2 M) y 45ºC.

Actividad de carboxipeptidasa

Las muestras se preincubaron primero en presencia de 10g / ml de pepstatina A (Sigma Chemie, Deisenhofen,
Alemania) durante 1 hora en un baño de hielo para inhibir la endoproteasa aspártica (Biehl et al., 1993). A
continuación se añadieron alícuotas a 0,9 ml de tampón de Mcllvaína (Na2HPO4 0,2 M ajustado a pH 5,8 por adición
de ácido cítrico) que contenía Z-Phe-Leu 5 mM (Sigma Chemie, Deisenhofen, Alemania) añadido a partir de una
solución madre 125 mM en metanol. Las mezclas de reacción se incubaron a 45ºC. Después de 3 h, la reacción se
detuvo mediante la adición de 0,2 ml de ácido tricloroacético al 25% (p / v) y la proteína precipitada se separó por
centrifugación a 10000 xg durante 15 min. Finalmente, la leucina liberada se determinó colorimétricamente por el
método del ácido trinitrobencenosulfónico como se describe por Shutov et al., (1982). Una unidad de
carboxipeptidasa es la actividad que libera 1 p ~ mol de leucina por minuto a pH 5,8 y 45 ° C.

Actividad de escisión de la leucina-p-nitroanilida Las muestras se preincubaron en presencia de 10 \ mu g / ml de

pepstatina A (Sigma Chemie, Deisenhofen, Alemania) durante 1 h en un baño de hielo para inhibir la endoproteasa
aspártica contaminante. Alícuotas (0-2 ml) de la mezcla preincubada Las muestras se mezclaron con 0,2 ml de L-
leucina-pnitroanilida 2 mM (Sigma Chemie, Deisenhofen, Alemania) y 5,6 ml de tampón de Mcllvaína (Na2HPO4
0,2M

Ajustado a pH 6-8 por adición de ácido cítrico). Las mezclas de reacción se incubaron a 45ºC durante 2 h. Finalmente,
la liberación hidrolítica de p-nitroanilina se determinó fotométricamente a 400 nm (Passern, 1979; Biehl et al., 1993).
Una unidad es la actividad que escinde 1 / xmol de leucina-p-nitroanilida por minuto en las condiciones descritas
anteriormente.

Determinación de la proteína

Las concentraciones de proteínas se determinaron por el método de Lowry et al., (1951) utilizando albúmina de
suero bovino como patrón.

Electroforesis

La SDS-PAGE se realizó sobre placas de gel (140 mm x 140 mm x 1,5 mm) de acuerdo con Laemmli (1970). Las
fracciones de proteína a analizar se sometieron a precipitación de TCA y los precipitados se lavaron repetidamente
con agua destilada y se redisolvieron en tampón de urea-SDS que contenía urea 8 M, SDS al 2% (p / v), EDTA 2 mM,
Tris-HCl 20 mM (pH 7,5 ) Y 200 mM de 2-mercaptoetanol (Voigt, 1985). Después de la adición de 0,25 volúmenes de
tampón de muestra de acuerdo con Laemmli (1970) que contenía 0,005 (p / v) de bromofenol como colorante de
seguimiento, las muestras se sometieron a análisis de SDS-PAGE. Los geles se tiñeron para proteína con Coomassie
brillant blue R250.

Digestión de proteínas de semillas purificadas con endoproteasa aspártica de cacao

Las proteínas de sustrato purificadas (5 g) se disolvieron o suspendieron en 2 litros de agua destilada. Después de la
adición de 100 mg de endoproteasa aspártica parcialmente purificada (0,5 unidades / mg), las soluciones se
ajustaron a pH 5-2 o pH 3-5 por adición de ácido acético y se incubaron a 50ºC. Se añadieron otros 100 mg de
endoproteasa aspártica parcialmente purificada después de 3 h. Después de 16 h, se añadió metanol hasta una
concentración final del 70% (v / v). Las suspensiones se agitaron a temperatura ambiente durante 1 h y se
centrifugaron a 20000 x g durante 30 min. Los sobrenadantes se recogieron y el metanol se eliminó a presión
reducida a 40ºC por medio de un evaporador rotatorio. Finalmente, las disoluciones acuosas se congelaron.

Digestión con carboxipeptidasa

Se disolvieron mezclas de péptidos (2-3 g) obtenidas por proteolisis de sustratos proteicos purificados con
endoproteasa aspártica en 2 litros de agua destilada y las soluciones se ajustaron a pH 5,8. Después de la adición de
300 unidades de carboxipeptidasa parcialmente purificada a partir de semillas de cacao, las soluciones se incubaron
a 45ºC en un baño de agua con agitación. Después de 3 h, se añadieron otras 300 unidades de unidades de
carboxipeptidasa. Las incubaciones se detuvieron después de 16 h. Las mezclas resultantes de péptidos y
aminoácidos libres se liofilizaron.

Evaluación sensorial

Se mezclaron productos de proteólisis (0-75 g) con 0,25 g de glucosa, 0,75 g de fructosa y 0,3 g de agua. Después de
la adición de 8,25 g de manteca de cacao desodorizada, las mezclas se formularon bien con mortero y pilón o por
ultrasonicación durante 30 s usando un Branson Sonifier B12 a potencia máxima. Finalmente, las muestras se
llenaron en placas de Petri de vidrio como capas delgadas (2-3 mm) y se asaron durante 10-15 minutos en un horno
precalentado a 120 ° C. Los aromas generados se evaluaron mediante análisis de olfato. Las evaluaciones de los
aromas de tostado fueron realizadas por un panel de 10 personas de prueba. La evaluación sensorial de los aromas
obtenidos se limitó a una identificación cualitativa de notas aromáticas. Se encontró que la proporción de personas
de prueba que reconocían el aroma de cacao era el único valor confiable para evaluar los aromas de tostado. Cada
análisis de aroma se repitió al menos tres veces con diferentes preparaciones del mismo tipo.

Análisis por HPLC de péptidos

Las mezclas de péptidos se analizaron por HPLC de fase inversa como se describió recientemente (Voigt et al., 1994)
usando el sistema de HPLC Gold (Beckman Instruments, SanRamon, CA, EE.UU.) equipado con una columna
Ultrasphere ODS 5 / zm (4,6 mm x 250 mm ). La elución de los péptidos se realizó a 30 ° C y un caudal de 1 ml / min
con ácido trifluoroacético acuoso al 0,1% (v / v) (7 min) y posteriormente con un gradiente lineal de 0 a 50% (v / v) de
acetonitrilo Que contiene ácido trifluoroacético al 0,1% (v / v) (Bennett et al., 1980, Mahoney & Hermodson 1980).
Los péptidos de elución se controlaron midiendo la absorbancia de los efluentes a 210 nm. No había cafeína residual
ni teobromina presentes en la mezcla de péptidos tal como se reveló mediante análisis por HPLC de extractos de
metanol preparados a partir de mezclas no incubadas de proteasas y sustratos proteicos.

Análisis de aminoácidos

Los aminoácidos se convirtieron en los derivados de o-ftalaldehído (OPA), separados por HPLC de fase inversa
usando una columna Shandon Hypersil ODS 5 (240 mm x 4,6 mm) y una precolumna Shandon Hypersil ODS 10 (20
mm x 4,6 mm) como recientemente Descrito (Kirchhoff et al., 1989a). Los efluentes se monitorearon
fluorométricamente con un espectrofluorómetro Hitachi modelo F-3000 (excitación a 334 nm, emisión medida a 425
nm).

RESULTADOS

Como se ha informado recientemente, los precursores del aroma específicos del cacao pueden producirse in vitro
(Voigt et al., 1994)

 ya sea por autólisis a pH 5-2 de AcDP preparado a partir de semillas de cacao maduras no fermentadas,
 por autólisis de AcDP a pH 3,5 y posterior digestión de los péptidos hidrofóbicos resultantes con
carboxipeptidasa comercial A a partir de páncreas porcino.

Estos hallazgos indican que los precursores de aroma específicos de cacao se generan mediante la digestión
cooperativa de proteínas de semillas por una endoproteasa (aspártica) y una carboxipeptidasa presente en semillas
de cacao no germinadas. Posteriormente, se ha investigado a partir de qué proteína (s) de semilla se obtienen los
precursores de aroma específicos del cacao.

Para aislar los sustratos proteicos y las proteasas presentes en las semillas de cacao no germinadas, primero hemos
extraído la AcDP bajo condiciones de baja sal para obtener la fracción de albúmina (Figura 1, carril b). A continuación,
la fracción de globulina se extrajo por tratamiento con NaCl 0-5 M. Esta fracción de globulina cruda contenía todavía
pequeñas contaminaciones de albúmina (s) (figura 1, carril c). Para purificar la globulina, el extracto de alta sal se
dializó frente a agua destilada y acetato de sodio 10 mM (pH 5,0). El precipitado formado (= globulina purificada) se
recogió por centrifugación. El análisis de la fracción de globulina purificada por SDS-PAGE (figura 1, carril d) reveló
que contenía solamente las subunidades polipeptídicas (47 kDa, 31 kDa, 15,5 kDa y 14,5 kDa) de la globulina tipo
vicilina de las semillas de cacao Spencer y Hodge, 1992, Voigt et al., 1993).
Figura. 2. Distribución de las actividades proteolíticas
entre la albúmina y la fracción de globulina de semillas
de cacao no germinadas. La albúmina y las fracciones
de globulina se prepararon y analizaron para las
actividades de proteasa como se describe en la sección
'Materiales y Métodos'. Los valores se expresan como
porcentaje de las unidades enzimáticas totales
encontradas en ambas fracciones.

El análisis de las actividades de proteasa de las semillas de cacao no germinadas reveló la presencia de una
endoproteasa aspártica, una actividad de carboxipeptidasa y una enzima de escisión de leucinoopnitroanilida (Biehl
et al., 1991, 1993).

Por lo tanto, hemos estudiado la distribución de estas actividades proteolíticas en la albúmina cruda y globulina
fracciones preparadas a partir de AcDP. Como se muestra en la Fig. 2, las proporciones predominantes de todas estas
actividades enzimáticas se encontraron en la fracción de albúmina. No se encontró actividad proteolítica en la
fracción de globulina purificada por precipitación en condiciones de baja salinidad (diálisis contra agua destilada y
posteriormente contra acetato de sodio 10 mM, pH 5-0). Para separar la albúmina predominante de las diferentes
actividades de proteasa, la fracción de albúmina cruda se sometió a cromatografía de DEAE-celulosa. Como se
muestra en la Fig. 3, la actividad carboxipeptidasa, la albúmina 19 kDa y la endoproteasa aspártica están
suficientemente separadas entre sí bajo las condiciones cromatográficas utilizadas. La carboxipeptidasa se eluyó al
comienzo del gradiente (100 mm de NaCl), la endoproteasa aspártica cerca del final del gradiente (330-390 mm de
NaCl). La albúmina de 19 kDa apareció como un pico amplio entre 250 y 350 mm de NaCl. La enzima de escisión de
leucina-p-nitroanilida se eluyó entre 300 y 360 mm de NaCl. Por lo tanto, tanto la albúmina de 19 kDa como la
endoproteasa aspártica estaban más o menos contaminadas por la enzima de clivaje con leucina nitroanilida.

Figura. 3. Purificación parcial de las actividades

proteolíticas y la albúmina de 19 kDa por cromatografía
de DEAE-celulosa del extracto de albúmina cruda a
partir de semillas de cacao no germinadas. El extracto
de albúmina cruda obtenido a partir de 50 g de polvo
seco de acetona se aplicó directamente a una columna
Whatman DE-52 (50 mm x 250 mm) y se fraccionó
mediante un gradiente lineal de 100 ~ 00 mM de NaCl
como se describe en los "Materiales y Métodos"
sección. Las fracciones de eluato (20 ml) se analizaron
por absorbancia a 280 nm (A); Actividad endoproteasa
(B); Actividad carboxipeptidasa (C); Y actividad de
leucina-p-nitroanilida (Leu-pNA) peptidasa (D). La
distribución (contenido relativo) de la albúmina de 19
kDa (B) se determinó por análisis SDSPAGE de las
fracciones de eluato. Se encontró que la actividad
endoproteasa (B) era sensible a la pepstatina A.
 Figura. 4. Análisis SDS-PAGE de los productos formados
durante la incubación de la albúmina y la globulina a
partir de semillas de cacao en presencia y ausencia de
endoproteasa aspártica. La albúmina y la globulina,
respectivamente, preparadas a partir de polvo seco de
acetona de semillas de cacao no germinadas se
incubaron a pH 3,5 y 50 ° C en ausencia o presencia de
endoproteasa aspártica (20 g por mg de sustrato
proteico) como se describe en la sección 'Materiales y
Métodos . Después de 16 h, alícuotas de las mezclas de
reacción correspondientes a 70 μg de proteína se
sometieron a análisis de SDS-PAGE de acuerdo con
Laemmli (1970). Los geles se tiñeron con azul brillante
Coomassie. Los pesos moleculares de las normas de
proteínas (Mr) se indican mediante números a la
derecha. 19 kDa Albúmina incubada en ausencia (a), o
presencia de endoproteasa aspártica (b), globulina
incubada en ausencia (c), o presencia de endoproteasa
aspártica (d), mezcla de albúmina y globulina incubada
en ausencia E), o la presencia de endoproteasa
aspártica (f).

No se observó ninguna degradación de la albúmina purificada y globulina, respectivamente, cuando estas proteínas
se incubaron sin adición de endoproteasa aspártica (Figura 4, carriles A y C). Tanto la globulina como la albúmina de
19 kDa se degradaron por la endoproteasa aspártica parcialmente purificada (Figura 4, carriles B y D). Sin embargo,
se encontró que la globulina era más susceptible a la digestión proteolítica por esta enzima particular que la
albúmina de 19 kDa. Bajo las mismas condiciones, donde se observó una degradación completa de la globulina
(Figura 4, carril D), una proporción considerable de la albúmina de 19 kDa no fue aparentemente clivada por la
endoproteasa (Figura 4, carril B). Esta proteólisis diferencial era obvia cuando, en otro experimento, se incubó una
mezcla de albúmina y globulina en presencia de endoproteasa aspártica (Figura 4, carril F). A temperaturas inferiores
a 40 ° C y valores de pH superiores a 5,0, no se observó degradación de la albúmina de 19 kDa por la endoproteasa
aspártica (datos no mostrados) mientras que la globulina fue atacada eficazmente bajo estas condiciones.

La albúmina y la globulina similar a vicilina purificada a partir de semillas maduras de cacao no germinadas se
sometieron a digestión proteolítica por endoproteasa aspártica en una escala preparativa con o sin post-tratamiento
con carboxipeptidasa. Los productos proteolíticos obtenidos se tostaron en presencia de azúcares reductores y
manteca de cacao desodorizada y los aromas resultantes fueron evaluados sensualmente por un panel de 10
personas. No se detectó ningún aroma de cacao o chocolate por ninguna persona de ensayo en el caso de mezclas de
péptidos obtenidas por proteolisis de globulina purificada con endoproteasa aspártica parcialmente purificada (Tabla
1, I y II). Sin embargo, cuando estos péptidos fueron post-tratados con carboxipeptidasa, cinco a seis de los diez
panelistas reconocieron el aroma típico de cacao al tostar en presencia de azúcares reductores (Tabla 1, III y IV). Los
mismos resultados se obtuvieron cuando la digestión de la globulina por endoproteasa aspártica se realizó a pH 5,2 o
pH 3,5 (Tabla 1, III y IV). Sin embargo, los post-tratamientos con la carboxipeptidasa de semillas de cacao tuvieron
que realizarse a pH> 5,0. Los productos de proteólisis de la albúmina con endoproteasa aspártica parcialmente
purificada y carboxipeptidasa de semillas de cacao no revelaron aroma de cacao o chocolate al tostar en presencia
de azúcares reductores y manteca de cacao desodorizada (Tabla 1, V).
Los patrones de oligopéptidos y aminoácidos libres en los diferentes productos de proteólisis se analizaron
comparativamente (Figura 5, Tabla 2). La HPLC de fase inversa de los oligopéptidos formados por digestión de la
globulina similar a vicilina y la albúmina, respectivamente, con la endoproteasa aspártica, reveló patrones complejos
diferentes de componentes más o menos hidrófobos (Fig. 5A, C). Estas mezclas de péptidos hidrófobos se
transformaron en componentes más hidrófilos por tratamiento con carboxipeptidasa a partir de semillas de cacao
(Figura 5B, D). En el caso de la globulina, el patrón muy complejo observado después de la incubación con
endoproteasa aspártica (Figura 5A) se alteró considerablemente después del tratamiento con carboxipeptidasa. Sólo
se observaron algunos picos dominantes (Figura 5B). Estos hallazgos indican que una proporción considerable de los
oligopéptidos formados por cooperación de la endoproteasa aspártica y la carboxipeptidasa no se separan por HPLC
de fase inversa.

Precursores de aromas específicos de cacao de las semillas de cacao

Tabla 2. Aminoácidos libres presentes en los productos de proteólisis generados in

vitro por degradación de la albúmina o la globulina a partir de semillas de cacao con
endoproteasa aspártica y carboxipeptidasa de semillas de cacao.

La albúmina y la globulina, respectivamente, preparadas a partir de semillas de cacao

maduras, no germinadas, se digirieron con endoproteasa aspártica de semillas de
cacao tal como se describe en la sección "Materiales y Métodos". Se analizaron los
aminoácidos libres presentes en los productos de proteolisis antes de (menos CP) y
después de post-tratamiento con carboxipeptidasa de semillas de cacao (más CP)
mediante HPLC de fase inversa de los derivados de OPA (Kirchhoff et al., 1989a). CP,
carboxipeptidasa a partir de semillas de cacao maduras no germinadas. Valores en
nmol / mg peso seco.

Se encontraron cantidades muy bajas de aminoácidos libres en los productos de proteolisis obtenidos por digestión
de la albúmina y la globulina, respectivamente, con la endoproteasa aspártica solamente (Tabla 2). Cuando los
péptidos de globulina se trataron con carboxipeptidasa, se liberaron preferentemente aminoácidos hidrofóbicos
especialmente leucina, fenilalanina, alanina, valina y tirosina (Tabla 2). Los péptidos de globulina generados por
endoproteasa aspártica a pH 5,2 y pH 3,5, respectivamente, revelaron los mismos patrones de aminoácidos libres
después del tratamiento con carboxipeptidasa (Tabla 2). Los aminoácidos hidrofóbicos, especialmente leucina,
fenilalanina y alanina, también se liberaron por carboxipeptidasa a partir de los péptidos de albúmina (Tabla 2).
Sin embargo, los aminoácidos predominantes liberados de los oligopéptidos derivados de la albúmina por
tratamiento con carboxipeptidasa fueron ácido aspártico, ácido glutámico y asparagina (Tabla 2).

DISCUSIÓN

En las últimas tres décadas, la evidencia ha demostrado que los precursores esenciales de los componentes
aromáticos específicos del cacao son generados por procesos proteolíticos que ocurren durante la fermentación de
semillas de cacao (Rohan, 1964, Mohr et al., 1971, 1976, Biehl et al., 1985; Ziegleder y Biehl, 1988). Las incubaciones
de semillas de cacao en condiciones asépticas han revelado que se requiere una acidificación moderada de las
semillas (a pH 5.5-5-0), pero no la presencia de microorganismos para la formación de los precursores de aromas
típicos (Biehl et al., 1985). La conclusión de que la proteólisis inducida por ácido de las proteínas de semilla se
produce debido a proteasas endógenas (Biehl et al., 1982, 1985), ha sido corroborada recientemente por la
formación in vitro de precursores de aroma específicos de cacao (Voigt et al., 1993b, 1994). Los precursores de
aroma típicos se generaron durante la autólisis de AcDP a partir de semillas de cacao no fermentadas a pH 5-2, pero
no a pH 3,5. La autólisis de AcDP a pH 3-5 reveló una mezcla compleja de oligopéptidos hidrófobos. Se obtuvieron
precursores de aroma específicos de cacao cuando estas mezclas de oligopéptidos hidrófobos se trataron con
carboxipeptidasa a de páncreas porcino (Voigt et al., 1993b, 1994).

Estos hallazgos indican que los precursores de aroma típicos presentes en las semillas de cacao fermentadas se
generan a partir de proteínas de semilla mediante la cooperación de una endoproteasa (aspártica) y una
carboxipeptidasa (Voigt et al., 1994). Además, estos hallazgos conducen a la identificación de la proteína de semilla a
partir de la cual se derivan los precursores de aroma específicos de cacao. Las semillas de cacao contienen dos
proteínas principales: una albúmina de 19 kDa y una globulina similar a vicilina (Spencer y Hodge, 1991, 1992, Tai et
al., 1991, McHenry y Fritz, 1992, Voigt et al., 1993d). Como se muestra en la presente comunicación, se obtuvieron
precursores de aroma específicos de cacao cuando la globulina aislada fue sucesivamente degradada por la
endoproteasa aspártica y la carboxipeptidasa

Parcialmente purificado a partir de semillas de cacao no germinadas. No se obtuvieron precursores de aroma típicos
cuando la fracción de albúmina se sometió a proteólisis por endoproteasa aspártica y carboxipeptidasa a partir de
semillas de cacao. Junto con los hallazgos anteriores de que, en condiciones de fermentación, donde se obtuvieron
cacahue- tos crudos con altos potenciales de sabor, cuando las subunidades polipeptídicas de la globulina se
degradaron selectivamente (Biehl et al., 1982, Voigt et al., 1993a) Muestran que los precursores de aroma
específicos del cacao se derivan de la globulina similar a la vicilina de las semillas de cacao.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Los autores agradecen al Dr. S. Kamaruddin (División de Investigación del Cacao y el Coco, Hilir Perak, Malasia, del
Instituto de Investigación y Desarrollo Agropecuario de Malasia) por proporcionar vainas de cacao frescas. Este
trabajo ha sido apoyado por una subvención (AIF 8427) de la Arbeitsgemeinschaft Industrieller
Forschungsvereinigungen e.V./Forschungskreis der Ernahrungsindustrie (FEI).