Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Material Teórico Análisis Bromatológico PDF
Material Teórico Análisis Bromatológico PDF
Análisis Bromatológico
2009
ANALISIS BROMATOLOGICO
TOMA DE MUESTRA
La muestra de alimento que se somete al análisis debe estar correctamente preparada y ser
representativa del lote que se inspecciona. Por lo tanto se tendrán en cuenta los siguientes recaudos:
- Toma de la muestra representativa del lote de partida: se hace al azar según normas existentes para el
producto en cuestión, extrayendo la cantidad suficiente para la realización de todos los análisis. El
procedimiento es diferente según el alimento se encuentre fraccionado (en latas, cajas, botellas) o dispuesto a
granel (en silos, tanques, bodegas de buques).
Puede servir el sistema de cuarteo o el de numeración de lotes y uso de bolillero, pero se dan casos más
complicados en lo que se necesita planes de muestreo especiales (por ejemplo: toma de muestras de aceites
que presentan sedimentos y están alojados en camiones-tanque de sección transversal elíptica o circular).
- Rotulación de muestra: debe hacerse inmediatamente, dejando constancia del Nº de la partida, procedencia,
cantidad tomada y fecha. (Muestras oficiales y contra muestras usadas en peritajes, deben sellarse para que no
puedan ser abiertas subrepticiamente.).
- Evitar alteraciones físicas , químicas y biológicas: por ejemplo: ruptura de emulsiones, oxidaciones, cambios
enzimáticos y proliferación microbiana, antes y durante el análisis. Es por esto que las carnes y verduras
deben mantenerse refrigeradas, los productos grasos protegidos del aire y de la luz y las leches tienen que ser
analizadas en el día, por ser alimentos altamente perecederos.
CONTROLES DE COLOR.
Las sustancias que confieren color a los alimentos son:
A- Componentes naturalmente presentes en la materia prima (clorofilas, carotenos, antocianos,
flavonoides, mioglobinas).
B- Aditivos colorantes que se agregan de acuerdo a la legislación vigente.
C- Sustancias originadas durante la elaboración o almacenamiento del producto, por reacciones de
pardeo o de curado. Los controles objetivos de color se realizan utilizando espectrofotómetros y
colorímetros diferenciales, especialmente diseñados para expresar el color a través de tres números
relacionados con los primarios que lo componen. El análisis sensorial se basa en comparaciones
visuales contra colores patrones pintados en vidrios, cartones o modelos de cera.
CONTROL DE TEXTURA.
La textura de un alimento depende de las características estructurales que posee. Es resultado de la
disposición e interpretación de las partículas o células que lo componen, incluyendo a los productos con
estructura celular (carnes, verduras , frutas) y a las que no la poseen ( harinas, mieles. leches, vinos,
mantecas, jaleas, etc.). Hay muchísimos tipos de texturas, si bien pueden reducirse a cuatro grandes grupos
(alimentos líquidos, sólidos, plásticos y viscoelásticos). El principio que rige todo estudio o control de
texturas se basa en aplicar fuerzas de deformación al alimento y medir la resistencia que este opone. Para ello
se cuenta con prensas, émbolos, cuchillos, cizallas, etc.
CONTROL DE GUSTO.
Los gustos principales (salado, ácido, dulce y amargo) son conferidos por diversos tipos de
sustancias (sales, ácidos orgánicos, azúcares, péptidos, alcaloides, glucósidos, etc) el control objetivo se
encara, generalmente, a través de análisis químicos específicos para el componente que origina el gusto
estudiado.
CONTROL DE OLOR.
Es el más complejo de todos los análisis porque intervienen muchísimos componentes
simultáneamente, están en muy bajas concentraciones, se pierden fácilmente e interaccionan entre ellos. El
control objetivo se realiza analizando el vapor de “cabeza” del alimento en un cromatógrafo de gases.
DEFINICION DE FLAVOR.
Como la nariz y la boca se encuentran conectadas por la faringe, al comer un alimento se mezclan
gustos, olores y otras sensaciones bucales receptadas por el nervio trigémino.
Al conjunto de sensaciones gustativas, olfativas y táctiles (irritación, astringencia, calor, frio) que se
perciben al paladear un alimento, se le llama flavor.
Esta sensación, sumamente compleja, sólo puede estudiarse a través del análisis sensorial realizado
por expertos.
DETERMINACIONES FISICAS.
1) DENSIDAD
Se determina para controlar la genuinidad de productos generalmente líquidos (leche, vinos, aceites, etc. Ej.:
densidad de leches a 15ºC δ = 1.028-1.035) y como índice de concentración de soluciones, siempre que se
cuente con una tabla o gráfico de correlación (ej.: soluciones azucaradas o alcohólicas).
Se suele informar como “densidad relativa” utilizando un liquido de referencia, que casi siempre es agua. Por
ejemplo la expresión densidad (15/4)=1.030 significa que se ha determinado la densidad del producto a la
temperatura de 15ºC y se la divide por la del agua a 4ºC. Para errores de más menos 0.001 en la densidad, el
control de la temperatura debe estar dentro del +/- 1ºC.
δ = m/V.
En los tres casos mencionados no se tiene en cuenta el volumen del aire ubicado entre los granos o las
frutas, de allí el nombre de densidad “aparente” o “bruta”.
2) INDICE DE REFRACCION.
Se mide para estudiar la genuinidad de ciertos alimentos (aceites, mieles) y para efectuar controles
rápidos en procesos de elaboración. Por ejemplo, la hidrogenación de un aceite o la concentración de una
mermelada se controlan con mediciones refractométricas puesto que hay una relación lineal entre el índice de
refracción (IR) y el índice de yodo de un aceite, y entre el IR y la concentración de sólidos solubles en una
mermelada.
Se trabaja con refractómetros tipo Abbé a temperatura normalizada y sobre soluciones límpidas. En alimentos
que presentan materia en suspensión (ej.: puré de tomate) se hace necesaria una previa centrifugación para
separar la fase sólida. Si se trata de grasas se procede a fundirlas y se hace la lectura a 40ºC (con equipo
termostatizado).
Algunos refractómetros tienen una escala sacarométrica que expresa, aproximadamente, el porcentaje de
sólidos solubles presentes en soluciones azucaradas ( la escala está calibrada con soluciones de sacarosa
pura).
3) RANGO DE FUSION.
Se determina para controlar la genuinidad de ciertos productos, especialmente, la de alimentos grasos;
sirve también como índice digestibilidad de las grasas, pues ambas propiedades están directamente
relacionadas.
5) VISCOSIDAD.
Se determina en alimentos líquidos o semilíquidos pues su magnitud sirve como:
a) Indice de movilidad del alimento (importante en las operaciones de transporte por cañería, filtración
y llenado de envases).
b) Indice de despolarización de proteínas, almidones y otras macromoléculas.
c) Indice de calidad sensorial (la viscosidad es un atributo de la textura) los métodos empleados para
medir viscosidades varían según el alimento presente flujo newtoniano (vinos, aceites, soluciones
azucaradas) o no newtonianos (sopas, salsas, purés, cremas). Recordemos que en estos últimos los
valores de viscosidad varían si se los agita o mueve a mayor o menor velocidad.
TECNICAS
- FLUJO A TRAVES DE UN TUBO CAPILAR: sirve para alimentos newtonianos de baja viscosidad (ej:
viscosímetro Ostwald). Se expresa el resultado en forma relativa o absoluta (ecuación de Poiseulle).
- CAIDA DE ESFERA: aplicable a alimentos más viscosos (hasta 3x106 poise), newtonianos o no. Se mide el
tiempo que tarda una pequeña esfera, de diámetro y peso estándar, en pasar por dos marcas. Ese tiempo es
proporcional a la viscosidad. El resultado se informa como viscosidad relativa a la del agua o, si es aplicable
la ecuación de Stokes, como viscosidad absoluta.
- METODOS ROTACIONALES: sirven para todo tipo de alimento. Los hay de copa rotante, en los que gira
el recipiente que contiene la muestra hasta imprimir un torque en un cilindro interior concéntrico (ej.: Mac
Michael; Rotavisco) y están los de eje giratorio: el eje se introduce en el alimento girando a velocidad
constante, pero debido a la resistencia que le opone el fluido, disminuye su velocidad en forma proporcional a
la viscosidad del alimento (ej.: Brookfield).
- METODOS EMPIRICOS: expresan los resultados en unidades arbitrarias, que dependen del equipo
utilizado. Ejemplos:
a) tiempo de caída a través de un orificio (grados Ford, Saybolt, redwood).
b) distancia cubierta por la muestra al deslizarse un determinado tiempo en un plano horizontal
(consistómetro de Bostwick).
6) TENSION SUPERFICIAL
Se mide la fuerza de atracción que ejercen las partículas internas de un fluido sobre las que se encuentran
en la superficie. Esto sirve para estudiar las propiedades espumígenas y emulsionantes de ciertos alimentos
(leche, huevo) y de aditivos alimentarios tensioactivos.
El equipo que suele utilizarse es el tensiómetro de Du Nouy, consta de un anillo de alambre de platino
que se coloca rasante sobre la superficie del alimento; por medio de un engranaje el anillo se eleva lentamente
arrastrando una delgada lámina de fluido. En un dado momento, el anillo se desprende del liquido: a mayor
altura alcanzada por el anillo, menor tensión superficial.
7) CONDUCTIVIDAD DE ELECTROLITOS
ANALISIS QUIMICO
CONTENIDO ACUOSO.
2- AGUA LIGADA.
Presenta propiedades de congelación, evaporación, capacidad como solvente, etc. diferentes a las del
agua libre. Se distinguen dos tipos:
1) SECADO EN ESTUFAS
a) A 100-105°C Y PRESION ATMOSFERICA HASTA PESO CONSTANTE. Es un método largo
que puede requerir 5 ó más horas. Se acelera usando estufas de aire forzado y agregando piedra
pómez o arena para aumentar la superficie de evaporación y evitar formación de costras de azúcares
o de proteínas coaguladas. Conviene revolver periódicamente con una varilla.
b) SECADO A TEMPERATURA Y TIEMPO NORMALIZADOS. Ej: 130°C, 1 hora en harina de
trigo. La determinación es mucho más rápida y resulta apropiada para los controles rutinarios. Estas
condiciones de secado provocan parcial oxidación de las grasas y deshidratación de azúcares, y
quizás una perdida no total de humedad. Lo cierto es que estos fenómenos se compensan de manera
que el resultado concuerda con el del secado clásico. Debido a las alteraciones mencionadas, la
muestra no sirve paras otras determinaciones, salvo la de cenizas.
c) SECADO EN ESTUFA DE VACIO. El cuerpo de la misma esta conectado a una bomba capaz de
mantener un vacío equivalente a menos de 50-100 mmHg. La muestra permanece 4 horas antes de
hacer la primera pesada, para lo cual se hace entrar lentamente aire seco y se restablece la presión
atmosférica. Generalmente se termostatiza la estufa a 60-70°C para evitar alteraciones de
componentes sensibles y así se usa como método de referencia para secado de alimentos. Se puede
llevar al muestra a peso constante o trabajar a temperatura y tiempos normalizados.
Aplicación: productos grasos, cárneos, azucarados.
d) SECADO POR RADIACION INFRARROJA Y VACIO. Es muy rápido (aproximadamente 15
minutos) pero exige una calibración previa contra un método de referencia para fijar las condiciones
de la operación en cada alimento. Es útil para controles rutinarios (granos, harinas).
La muestra que no debe tener más de 15 mm de espesor, se coloca a una determinada distancia de la
lámpara IR, dentro de una balanza especialmente diseñada. Se produce una rápida penetración de
calor (los filamentos de la lámpara se calientan a ~700°C) y la disminución de peso por evaporación
se lee directamente en el visor.
SECADO CON AGENTES DESHIDRATANTES
Se recurre a ellos cuando no pueden aplicarse temperaturas superiores a la ambiente. Ej: harinas
leudantes y polvos para hornear, ricos en NaHCO3 y muy termolábiles. Requieren mucho tiempo y no son
precisos. El secado de carne molida puede llevar 1 semana; en general, se deja la sustancia en el desecador
con ácido sulfúrico y en vacío por lo menos 24 hs.
3) METODOS ELECTRICOS
Son muy rápidos (aprox. 20 segundos) y sensibles, pero no exactos. Forzosamente deben calibrarse
con porcentajes de agua conocidos en base a muestras que previamente fueron analizadas con métodos
referenciales. En la determinación influyen: contenido en minerales, temperatura, textura, distribución de la
humedad en el alimento.
Usos: granos, harinas (se las presiona, dentro de un recipiente, logrando un determinado espesor).
a) Conductancia: solamente se mide agua libre, o sea la que actúa como electrolito. Un grano de cereal
con 14% de agua tiene conductividad 7 veces mayor que uno de 13%; uno de 15% tiene
conductividad 50 veces mayor que el de 13%. Estos valores demuestran la alta sensibilidad de la
técnica conductimétrica.
b) Capacitancia: es más exacta que la anterior pues influye menos en la forma en que se distribuye el
agua en el alimento. Se coloca la muestra en un campo electrostático alterno (o sea entre las
armaduras de un condensador) y se mide su constante dieléctrica. El agua presenta un valor muy
superior al de los otros componentes. La determinación incluye agua libre y combinada. Existen
equipos nuevos, no destructivos que dosan 0-35% de agua con error del 1% en cereales y
oleaginosas.
4) METODOS QUIMICOS
Son muy exactos y rápidos y no requieren calentamiento de la muestra. Se aplican en alimentos
termolábiles o cuando el contenido acuoso es muy bajo: leche en polvo, cafés, vegetales y frutas
deshidratadas, chocolate, aceites.
Existen varias técnicas: la del carburo de calcio se basa en medir la presión del acetileno formado al
reaccionar Cl2Ca con el agua del alimento. En la Bryan Smith el cloruro de acetileno, en presencia de agua,
libera acético, el cual es titulado.
La más empleada en alimentos es la de Karl Fischer :
Reacción: se basa en la reducción de Yodo con anhídrido sulfuroso, que sólo ocurre en presencia de
agua:
EXTRACTO SECO
Es el residuo que queda luego de eliminar a 100-105ºC las sustancias volátiles.
Salvo cuando están presentes otros componentes evaporables (esencias, alcoholes, etc.) o alterables,
se cumple: % sólidos totales + % agua = 100.
Se suele determinar para controlar la genuinidad de alimentos con alto porcentaje de agua, ejemplo:
leches, vinos, vinagres, jugos, puré de tomates.
En algunos casos interesa conocer la fracción soluble en agua del extracto seco (el C.A.A. exige por
ejemplo un valor mínimo de sólidos solubles para jaleas y mermeladas).
TECNICAS.
a) Evaporación hasta llegar a peso constante: el análisis se efectúa en forma similar al mencionado para
determinar contenidos acuosos por secado en estufa. Por este método, las leches deben dar un
mínimo de 8.25 % de extracto seco libre de grasa.
b) Evaporación durante tiempo normalizado: se recurre a esta técnica cuando existen componentes que
sufren alteraciones o perdidas parciales por calentamiento. La determinación es, además, más rápida.
En el análisis de extracto seco de vinos hay parcial evaporación de glicerina, oxidación de taninos y
caramelización de azúcares; por eso se calienta a B.M. 80 minutos y se completan 30 minutos más en
estufa a 100-105ºC.
Notas:
En los alimentos líquidos, con alto porcentaje de agua, se elimina la mayor cantidad de la misma por
calentamiento al aire (baño maría o baño de arena) para evitar saturar la estufa con vapores.
Los extractos secos de vino son muy higroscópicos debido a la glicerina; deben resguardarse
convenientemente y se pesan en cuanto llegan a temperatura ambiente.
c) Refractometría: Para algunos alimentos se han confeccionado tablas de correlación entre sólidos
solubles determinados por secado en estufa de vacío y lecturas refractométricas. Incluso existen
correlaciones de extracto seco total vs. Índices de refracción en ciertos alimentos fluidos.
Como la técnica refractométrica es sumamente rápida, resulta muy útil para acelerar los controles de rutina
pero los resultados tienen menor exactitud.
Nota:
La muestra que se coloca en el refractómetro no debe ser turbia; si es necesario se la centrifuga para
separar los sólidos dispersos.
I) EXTRACCION DIRECTA
a) Por digestión de una pequeña cantidad de muestra en un gran volumen de solvente: es rápido pero no extrae
el 100% de la grasa (ej: separación de la mayor parte de la grasa de un dulce de leche).
b) Por extracción continua (Twisselmann) o semicontinua (Soxhlet) en equipos especiales y a temperatura
ambiente: el solvente cumple ciclos sucesivos de evaporación, condensación y pasaje por la muestra
(colocada en un cartucho o paquete) extrayendo cada vez mayor cantidad de lípidos. Luego de 4-8 horas, el
material suele quedar “agotado” y la grasa disuelta se pesa, después de evaporar el solvente. Es un método
exacto y preciso pero muy largo.
* La cantidad y composición de los lípidos extraídos dependen del solvente usado; tiene que ser informado
junto con el resultado del análisis.
SOLVENTES COMUNES
- Eter de petróleo (mezcla de hidrocarburos. P.Eb. 40-60°): extrae sólo lípidos neutros (glicéridos, ácidos
grasos de cadena larga, sustancias insaponificables).
Puede perder fracciones más volátiles durante la extracción e ir cambiando su composición.
- Eter etílico (P.Eb. 35°): solvente muy eficiente de lípidos totales (polares tales como fosfolípidos o ácidos
grasos cortos y no polares). Pero absorbe hasta un 10% de agua, extrayendo componentes hidrosolubles
(azúcares, sales). Es peligroso a más de 35°C (ignición-explosión). Se lo seca y destila antes de usarlo para
eliminar peróxidos.
- Hexano técnico (P.Eb.≈ 70°; no es puro): disuelve lípidos neutros. Es más económico que los anteriores y de
uso muy extendido.
- Mezcla de solventes: se pueden preparar mezclas de polaridad adecuada para la grasa que se desea extraer.
Ej. CH3OH (2:1) (Solvente de Folch) y Cl2CH : CH3OH : H2O (Lyons-Lippert) se usan en productos cárneos
y frutas; disuelven bien las lipoproteínas.
PREPARACION DE LA MUESTRA:
-Para facilitar la penetración del solvente y el contacto con la grasa, es imprescindible moler bien la muestra
(sobre todo si tiene estructura celular) en molinos eléctricos, hasta que las partículas pasen por un tamiz de
abertura normalizada.
- Si la humedad es elevada también hay que secarla para evitar emulsiones y extracción de sustancias
hidrosolubles (especialmente si se usan solventes más polares).
- Cuando los lípidos están combinados con azúcares o proteínas, se digiere previamente la muestra con
etanol/ClH (digestión ácida a temperatura ambiente una noche, ó a 80°C,1 hora) y luego se extrae con
solvente (por ejemplo: harina de trigo)
NOTAS
- Para evitar el arrastre mecánico de partículas de la muestra, se la empaqueta o coloca en un cartucho con
tapón de algodón.
- Si el extracto graso no es bien límpido debe secarse con agente deshidratante (Na2SO4 anhidro) en pequeña
cantidad para que no absorba grasa.
a) Método de Gerber:
Se aplica especialmente en leches. La grasa resulta alterada parcialmente y no tiene gran exactitud
(+ 0,05%) pero resulta apropiado para los controles rutinarios que se hacen en las usinas lácteas por ser
rápido.
Fundamento: Se destruye la membrana de los glóbulos grasos y se solubilizan todos los componentes
del alimento (menos los lípidos) con H2SO4 90% (δ= 1,82). La concentración de este reactivo es crítica pues a
menor densidad la grasa no se libera en su totalidad, y a mayor densidad se altera demasiado.
La materia orgánica no lipídica se carboniza parcialmente y queda disuelta en la solución sulfúrica,
separándose de la fase grasa por su mayor densidad.
TECNICA
Se trabaja con un recipiente especialmente diseñado por Gerber, llamado “butirómetro”. En él se
introducen 11,00 ml. de leche medidos exactamente, alcohol amílico y ácido sulfúrico y se agita
enérgicamente hasta que no se observen partículas blancas (se eleva la temperatura del sistema). Para que la
grasa se mantenga fundida se centrifuga la emulsión caliente, lográndose la separación de la fase lipídica en
3-5 minutos.
La lectura volumétrica se hace a temperatura normalizada (60°), observado la escala graduada del
butirómetro, la que expresa el resultado en gramos de grasa / 100 ml de leche. (Para obtener el resultado en
gramos/ 100 gramos, se parte de 10,75 ml de leche, existiendo pipetas aforadas especiales para esa finalidad.
(IRAM 9011).
- Finalidad del agregado de alcohol amílico: Como todo alcohol, ayuda a romper la emulsión.
Además, por su densidad se ubica en la interfase lípidos/solución sulfúrica (forma un éster sulfúrico)
mejorando la visión de la lectura volumétrica y protegiendo a las grasa de una carbonización más intensa.
Los lípidos separados por el método de Gerber están parcialmente alterados por el SO4H2 e incluyen
productos de degradación de azúcares y derivados del amílico. No pueden usarse para estudios posteriores.
Dispositivos parecidos al butirómetro de Gerber se emplean en la determinación de grasa en
derivados lácteos (butirómetro de Van Gulick) y en productos cárneos.
b)Método de Rosse-Gottlieb
Se utiliza como método de referencia (exactitud + 0,01%). La grasa se cuantifica
gravimétricamente y no sufre alteraciones, por lo que puede someterse a estudios posteriores.
FUNDAMENTO: Emplea una serio de reactivos y solventes con la finalidad de separar los componentes
lipídicos en una fase etérea. Se agregas en el siguiente orden y agitando luego de cada adición:
1) Hidróxido de amonio: Disuelve proteínas y aumenta la solubilidad de los fosfolípidos. Si hay ácidos
grasos libres quedan salificados.
2) Etanol: Deshidrata y ayuda a romper la emulsión.
3) Eter de etílico: Disuelve todos los lípidos presentes, pero también parte de agua, componentes
hidrosolubles (lactosa, sales, etc.) y etanol.
4) Eter de petróleo: Se mezcla con el éter etílico y expulsa la fase hidroalcohólica miscible en el éter
etílico. No puede usarse solamente éter de petróleo porque no disuelve los lípidos polares.
Se deja reposar 30 minutos - 2 horas para que haya una buena separación de las fases; se decanta la
etérea, evapora, seca y pesa.
La técnica se lleva a cabo en recipientes apropiados: tubo de Mojonnier, probeta con tapa o ampolla de
decantación (si el alimento es líquido).
Se aplica en leches fluidas, en polvo, condensadas, en dulce de leche, helados y cremas. Puede usarse
rojo congo para teñir la capa acuosa y observar mejor la línea de separación entre las dos fases.
METODO DE DUMAS
Incluye todas las formas de nitrógeno orgánico e inorgánico. Se basa en la pirólisis del producto a
700-800°C, con óxido cúprico como catalizador. Los óxidos de nitrógeno que se forman son reducidos a N2
sobre una espiral de cobre, cuantificándolo por cromatografía gaseosa.
Existen analizadores automáticos que utilizan este método y determinan porcentajes de C, S, H, O,
N, S, y P en pocos minutos, pero solamente son apropiados para alimentos homogéneos.
METODO DE KJELDAHL
Es uno de los más empleados en Química Analítica. Se basa en la oxidación de la materia orgánica
con ácido sulfúrico concentrado, quedando el nitrógeno retenido en forma amoniacal. No dosa nitratos y
nitritos pues en las condiciones del ensayo se volatilizan como ácidos nítrico y nitroso. Tampoco incluye
hidracinas y azocompuestos (se descomponen y liberan N2) pero esto último no es importante en alimentos.
La muestra a analizar, conteniendo 30-40mg de nitrógeno, se coloca en un balón de cuello alargado
(diseñado así para evitar pérdidas por proyección) junto con las siguientes sustancias:
- Ácido sulfúrico concentrado en cantidad suficiente para oxidar toda la materia orgánica y fijar el amoníaco
como sulfato ácido de amonio. Para acortar el tiempo y completar la oxidación (sobre todo si el alimento tiene
mucha fibra o proteínas ricas en histidina y triptofano), se incluye un catalizador (modificación de Wilfarth) y
elevador de temperatura (modificación de Gunning).
- Catalizador: sulfato de cobre, con dióxido de titanio.
- Elevador de temperatura: Con la finalidad de facilitar las reacciones, se agrega sulfato de sodio o potasio en
cantidad apropiada. Al calentar la mezcla, la temperatura del sistema puede llegar a los 390°C, completándose
la oxidación en aproximadamente 3 horas. (La temperatura crítica de la descomposición del amoníaco es
418°C).
ETAPA DE DIGESTION: Durante la digestión sulfúrica hay cabonización y desprendimiento violento de
vapores (CO2, H2O, SO2) que provocan proyecciones de la muestra y formación de espuma. La materia
orgánica se oxida a expensas de la reducción del sulfúrico. Al final, la ebullición se aplaca y la solución se
torna límpida (en el caso de haber empleado CuSO4 como catalizador, tendrá tono celeste).
El calentamiento se prolonga un tiempo para asegurar el ataque completo de los componentes más
resistentes y se da por terminada la digestión.
ETAPA DE DESTILACION: Una vez que la solución se enfría (pueden precipitar cristales de KHSO4) se
agrega agua cuidadosamente y, ya en el equipo de destilación, se alcaliniza con NaOH concentrado, para
liberar el NH3 retenido como (NH4)2SO4 o (NH4HSO4):
El empleo de ácido bórico reduce la volatilidad del amoníaco de la solución y disminuye los errores
de lecturas volumétricas pues se usa una sola medición con bureta.
PROTEINA BRUTA
Como al dosar nitrógeno total por el método de Kjeldahl se incluyen sustancias que no son proteicas
(nitrógeno de bases volátiles y de bases fijas, por ejemplo), cuando se hace la conversión a “porcentaje de
proteínas” tal como se explicó arriba, se cometen errores por exceso. Si además no se emplea el verdadero
factor de conversión que corresponde al alimento analizado,, se está informando un valor aproximado de
proteína, por eso el resultado se expresa como “proteína bruta”.
METODOS ESPECTROFOTOMETRICOS
Determinan el contenido aproximado de proteínas en forma muy rápida, siendo necesaria una previa
correlación con el método de referencia para cada producto. Son apropiados para alimentos homogéneos;
están estrictamente normalizados u requieren poca cantidad de muestra.
I) METODO DE UDY
Dosa proteínas y aminoácidos libres. Se basa en la reacción de los grupos NH3+ con colorantes ácidos
sulfónicos (naranja G o negro amido) a pH=2 y en la precipitación de esos compuestos.
Se lee la absorción del colorante a 470 nm antes de agregar la muestra y luego de ocurrida la
reacción (previa separación del precipitado). La disminución de la absorción en la solución coloreada
sobrenadante, es proporcional a la cantidad de proteólisis o combinación de los grupos aminos con azúcares
reductores, los resultados serán erróneos.
II)METODO DE BIURET
Se basa en la reacción de los enlaces peptídicos con CuSO4 en medio básico leyéndose la absorción del
complejo violáceo que se forma.
Tanto la muestra como el formol deben estar neutralizados. Si hay amoníaco o aminas presentes se
volatilizan previamente en medio básico.
El CO2 se valora recogiendo sobre hidróxido de bario. Los cetoácidos interfieren, por eso se los
descompone antes en caliente.
2) Técnica colorimétrica a pH 7
Esta reacción es usada en los analizadores automáticos para estudiar la composición en aminoácidos
de una proteína. Se la inyecta previamente hidrolizada y una columna de intercambio iónico fracciona los
diferentes aminoácidos. A medida que eluyen fluyen reaccionan con la ninhidrina y pasan al
espectrofotómetro. El gráfico obtenido se llama amono-grama.
El tono y la intensidad del color violáceo varían para cada aminoácido, que dificulta el análisis.
Otros fraccionamientos y dopajes pueden lograse cromatografiando sobre papel o placa delgada. En
caso de usar la CGL es necesario esterificar los grupos carboxilos y acilar los aminos para obtener derivados
volátiles estables.
También existen métodos biológicos, largos y poco precisos, para los diferentes aminoácidos, basado
en el crecimiento de microbios que los utilizan específicamente.
Las aminas terciarias se destilan (previa alcalinización del medio) y se dosan tal como se explicó para
Nbv (R1R2R3N).
- Alícuota C: Se agrega exceso de formol, el cual sólo reacciona con el amoníaco (en el destilado no hay
aminoácidos):
DETERMINACION DE AMONIACO
Suele hacerse una colorimetría con el reactivo de Nessler:
-
OH
2 NH2 + 2 (HgI2.2IK) 2 IK + NH4I + I3Hg2NH2
-------castaño--------
D-glucosa (dextrosa)
Hexosas D-fructosa (levulosa)
Monosacáridos D-manosa
D-galactosa
Pentosas L-arabinosa
Los más abundantes son glucosa y fructosa que se encuentras especialmente en frutas y miel aunque
también están ampliamente distribuidos en plantas y animales, libres y combinados. De menor importancia
son los restantes: Los tres son componentes de polisacáridos y galactosa también forma parte de lactosa.
Galactosa y manosa difícilmente se encuentren libres.
sacarosa
Disacáridos lactosa
maltosa
Oligosacáridos celobiosa
Trisacáridos rafinosa
Celulosa Almidón
Estructurales Nutrientes
Hemicelulosas Glucógeno
Densimetría
Tiene las mismas características que la refractometría. Industrialmente los resultados se expresan en
“°Brix” , escala que indica el % en peso de sacarosa en la solución a una temperatura prefijada (17,5°C).
Polarimetría
Por ser los hidratos de carbono sustancias óptimamente activas, se puede utilizar este método para su
dopaje en solución.
Esquemáticamente los elementos fundamentales de un polarímetro son:
B A F C E
Determinación
Las mediciones polarimétricas son exactas con tal que:
- La solución esté clara e incolora o levemente coloreada.
- La concentración de azúcares esté en el rango óptimo.
- La solución no contenga interferentes óptimamente activos.
-
de (1) k= α [α]20D = α
c l 1 (g/ml). 1 (dm)
Se define el poder rotatorio específico de una sustancia ópticamente activa como la rotación
producida por 1 g de sustancia disuelta en 1 ml de solución a 20°C en un tubo de 1 dm de longitud a la
longitud e onda de la línea D del Na. Expresando la concentración en g/100 ml:
[α]20D = α = α 100
g/100 ml. x 1(dm) g. x 1(dm)
En los polarímetros clásicos se usan frecuentemente tubos de 2 dm de longitud. En este caso, para
independizarse de 1, se usa ſ, que es el poder rotatorio específico de 1g de sustancia en 100 ml de solución en
un tubo de 2 dm.
[α]20D = ρ x 100 ρ= [α]20D
(1 g/100 ml) x 2dm 50
Factores que inciden en el poder rotatorio específico
1) Concentración de la sustancia ópticamente activa. Las variaciones dependen del azúcar. Ejemplo:
Azúcar
% Sacarosa Glucosa Maltosa Fructosa Lactosa
Invertido
5 66.50 52.60 138.4 -89.4 52.55 -1.98
10 66.50 52.75 138.3 -90.7 “ -2.00
15 66.55 52.90 138.2 -92.0 “ -2.02
20 66.55 53.10 138.1 -93.3 “ -2.03
30 66.50 53.50 137.9 -95.9 “ -
40 66.35 54.05 - -98.4 “ -
50 66.10 54.75 - - “ -
Algunos como fructosa, varían mucho, otros como lactosa se mantienen constantes en un amplio
rango de variación de la concentración. Libros especializados proveen tablas y fórmulas para conocer el valor
correcto de [α]20D según la concentración de trabajo. Los valores tabulados en manuales y libros generales
corresponden a una concentración de aproximadamente 10%. Si hay más de un azúcar presente la
concentración considerada es la de los azúcares totales.
Métodos polarimétricos para análisis de azúcares en presencia de otras sustancias óptimamente activas.
Hidrólisis ácida o enzimática, según convenga (la hidrólisis ácido es menos selectiva). Se aplica
cuando el azúcar a dosar es un disacárido. Se mide antes y después de hidrólisis. Ej. Sacarosa en presencia de
monosacáridos:
Antes de hidrólisis sacarosa + monosacáridos L1 = cs . ρs + Lm
Donde:
L: lectura polarimétrica
c: concentración (g/100ml)
s: sacarosa
m: monosacáridos
[α]TD = [α]20D + γ ( T - 20 )
Sacando γ de tablas
LT = L20 + γ g ( T - 20 ) g = LT - L20 .
γ ( T - 20 )
Considerando que la L de las otras sustancias óptimamente activas al no variar con la temperatura:
L´T - L´20 = 0
L1 = x ρx + y ρy
L2 = x ρx + y . 1,053 ρai
L1 = x ρx + y ρy
L2 = x ρx + y . 1,053 ρai
1.6N [NaOH]
Por lo que es importante usar la concentración de álcali prefijada para obtener resultados reproducibles.
2) Temperatura.
La velocidad de reacción aumenta con la temperatura llegando a un máximo a 80°C. Por razones
prácticas se utiliza la temperatura de ebullición, fácil de reproducir y mantener.
3) Tiempo de reacción.
Comprende el tiempo que se necesita para alcanzar la temperatura de ebullición y el de reacción a
esa temperatura. Ambos se fijan previamente.
Valoración
Siendo tantos y tan diversos los productos formados por oxidación de azúcar, lo más práctico es
valorar el Cu2O formado o medir la cantidad de solución de azúcar necesaria para reducir todo el Cu2+.
El más directo y muy utilizado es el Munson y Walter, en que se recoge el precipitado de Cu2O en un
crisol de Gooch tarado que se pesa una vez seco. Para calcular la concentración de azúcar se recurre a la tabla
del método en que de la masa de Cu2O precipitada se obtiene la masa de azúcar original. La tabla está
dividida en varias columnas que corresponden a diferentes azúcares, ya que masas iguales de distintos
azúcares precipitan diferentes cantidades de Cu2O. Un esquema de la tabla es:
Cu2O mg glucosa azúcar invertido Azúcar invertido + sacarosa lactosa Lactosa + sacarosa
x mg sac y mg sac z mg sac
10
12
14
16
18
Si hay más de un azúcar en un azúcar en la solución los resultados pueden expresarse en el que está
en mayor proporción o elegir uno arbitrariamente ya sea que este o no presente. Generalmente los azúcares
reductores se expresan en glucosa. Este método es bastante exacto si el precipitado de Cu2O está bastante
puro. Si en el precipitado hay impurezas en cantidades no despreciables este método sirve.
Si las impurezas son de naturaleza orgánica pueden eliminarse por calcinación del precipitado con
oxidación del Cu2O a CuO. No conviene utilizar este compuesto directamente para la valoración porque es
higroscópico y, además, la oxidación del Cu2O no siempre es completa. Entonces se reduce en corriente de H2
a Cu0, que se pesa
Calcin. H2
Cu2O CuO Cu° pesada
(0) (red)
Si no hay impurezas orgánicas puede disolverse el precipitado en HNO3 que lo oxida a Cu2+, el que
puede valorarse por yodometría o por complejometría con EDTA usando murexida u otro indicador apropiado
o por deposición electrolítica (reducción a Cu0 que se pesa).
deposición
electrolítica Cu0 pesada
H+
Cu2O + Fe2+ Cu2+ + Fe2+
½ alcalino
Azúcar + Cu2+ Cu2O + productos de oxidación
se acidifica la solución y agrega K2C2O4 y KI (el K2C2O4 compleja al Cu2+ en exceso). En medio ácidos e
genera I2 por reacción entre IO3- y I-:
IO3- + I- I2
I2 + Cu+ I- + Cu2+
valorándose el exceso de I2 con S2O32-. Para saber que cantidad de I2 reaccionó, es necesario conocer
exactamente la concentración de KIO3 (patrón) en la solución inicia lo realizar un blanco paralelo.
Estos son los métodos más usados, aunque hay otras modificaciones: por ejemplo, el uso de citrato
en lugar de tartrato como complejante de Cu2+; Na2CO3 en vez de NaOH como medio alcalino; el método de
Sichert Bleyer usa Cu(AcO)2 en vez de CuSO4 para diferenciar mono y disacáridos ya que estos no son
oxidados apreciablemente por el reactivo.
En cada método se indica cual es l atabla a utilizar para la cuantificación.
Na2CO3
Fe(CN)63- + azúcar Fe(CN)64- + productos de oxidación
2 K3Fe(CN)6 + 2 KI 2 K4Fe(CN)6 + I2
La reacción transcurre en presencia de Zn2+ que forma un complejo con el Fe(CN)64-, el que precipita
volcando el equilibrio de la reacción hacia la derecha. El I2 formado se titula con Na2S2O3.
La ventaja del ferricianuro con respecto al del cúprico es que todas las reacciones ocurren ene l
mismo recipiente y que el ferrocianuro formado es más estable que el Cu2O., por lo tanto, la reacción es
reproducible y adecuad apara determinaciones de rutina. La desventaja es que no es un método tan específico
como el del Cu+2 ya que el ferricianuro pude ser reducido poro tras sustancias además de azúcares. Es
especialmente utilizado para dosaje de pequeñas cantidades de maltosa en hidrolizados de almidón., inclusive
en la determinación de actividad diastásica en harinas.
Yodometría de aldosas
Se basa en la oxidación de aldosas con NaIO proveniente del a reacción entre I2 e NaOH. La reacción
es prácticamente estequeométrica y cuantitativa si ser espetan las condiciones fijadas. La interferencia de
cetosas es mínima. La secuencia de reacciones es:
Una vez transcurrida la reacción principal, se acidifica el medio y el NaIO en exceso vuelve a formar I2
El I2 se titular con S2O3-2. Paralelamente se realiza un blanco con los reactivos para conocer la
cantidad original de I2. Este ese el único medio posible debido a la inestabilidad de las soluciones de I2 que
impide conocer su concentración exacta.
Para valorar aldosas pro este método es necesario que no estén presentes sustancias que puedan
reacciona con I2, ejemplo, etanol, acetona, manitos, glucosa, lactosa, urea, formiato, etc.
Las condiciones a respetar son:
-Las soluciones de I2 e NaOH deben conservarse en frascos distintos y agregarse directamente a la muestra. Si
se mezclan previamente ocurre:
3 NaIO NaIO3 + 2 NaI
NaIO3 no oxida al os azúcares. Una pequeña cantidad de NaIO3 no molesta porque el acidificador
vuelve a formar I2
El riesgo al mezclar previamente las soluciones es la formación de una cantidad importante de iodato con la
consiguiente pérdida de NaIO activo.
-Las cantidades de I2 e NaOH deben estar en relación estequiométrica. Si el I2 está en exceso hay riesgo de
oxidación de grupos alcohólicos terminales (error por exceso). Si ese l álcali el que está en exceso puede
haber parcial reordenamiento de cetosas (error por exceso). Esta última reacción es rápida por lo que
conviene, además, agregar el I2 en primer término para que en ningún momento esté el álcali en exceso.
Pueden evitarse muchos de los inconvenientes del método utilizando cloramina T y KI como reactivos.
Cerimetría
Los métodos perimétricos son de dos tipos:
-Titulación de azúcares reductores con Ce(ClO4)4 usando nitroferroína como indicador.
-Ebullición con Ce(SO4)2 en H2SO4 diluído y titulación del exceso de Ce4+ por retorno con sales de Fe2+
En estas condiciones:
P1 = x * ſx + y * ſy + z * ſz
1. Es necesario multiplicar “y” por la relación de PM ya que la mása de la glucosa y maltosa que
reaccionan con un mol de yodo depende de sus respectivos pesos moleculares.
2. Después de hidrólisis de sacarosa reacciona con yodo sólo la glucosa.
3. Esta ecuación no tiene utilidad práctica ya que las masas de CuO2 generadas por un monosacárido y
un disacárido son muy diferentes lo que impide todo cálculo. Si bien después de inversión hay
diferentes monosacáridos presentes el error es mucho menor (si bien persiste) porque las masas de
CuO2 generadas por distintos monosacáridos no son demasiado diferentes.
De todos modos, la aplicación de estas fórmulas para resolver mezclas de varios azúcares no es posible
en la práctica porque la acumulación de errores experimentales hace que los resultados obtenidos carezcan de
validez.
METODOS COLORIMÉTRICOS
peroxidasa
H2O2 + leuco-cromogeno cromógeno + H2O
Glucosa + fructosa:
hexoquinasa
Glucosa + ATP glucosa-6-P + ADP
hexoquinasa
Fructosa + ATP fructosa-6-P + ADP
fosfoglucoisomerasa (1)
Fructosa-6-P glucosa-6-P NADPH (2)
Cromatografía en columna
Es el más antiguo de los métodos cromatográficos usados para separación e identificación de
azúcares. No tiene mucho uso actualmente.
Cromatografía gas-liquido (CGL)
Se trabaja especialmente con los trimetilsililderivados. Se puede lograr excelente resolución y
cuantificación.
Cromatografía liquida de alta presión (HPLC)
Es un método especialmente útil para la separación y cuantificación rápida de azúcares. En muchos
alimentos no requiere preparación complicada de la muestra. Se utilizan columnas de intercambio iónico.
PREPARACION DE LA MUESTRA
Para la aplicación de la mayoría de los métodos anteriores es necesario que los azúcares estén en
solución. El solvente por excelencia es el agua., pero si hay polisacáridos que es conveniente separar, o si hay
enzimás que pueden hidrolizar los oligosacáridos, se recurre a una solución de etanol 80%. Por la misma
razón, no conviene que el pH sea ácido por lo que suele agregarse carbonato de calcio para tener una solución
neutra.
En la mayoría de los alimentos hay que eliminar los interferentes, que pueden ser diferentes según el método a
aplicar:
- Lípidos y clorofila se eliminan del alimento sólido por extracción con un solvente como éter de
petróleo a no más de 40-50°C para no disolver almidón.
Las proteínas interfieren por enturbiar las soluciones para polarimetría; por precipitar el cobre en los
métodos por oxidación con CuSO4. Se eliminan por precipitación con sales de metales pesados (Zn,
Pb, Al) junto con otras sustancias coloidales. Los desecantes deben cumplir algunos requisitos:
eliminar los interferentes sin adsorber o modificar los azúcares, precipitado poco voluminoso y
procedimiento simple. Algunos de los desecantes más usados son: acetato básico de plomo muy
eficiente pero da precipitados voluminosos que adsorben azúcar; acetato de plomo neutro menos
eficiente pero no tan voluminoso, ambos también decoloran, parcialmente. Para eliminar el exceso de
plomo que puede combinarse con los azúcares, se usa una sal de sodio tal como oxalato, sulfato,
fosfato o difosfato; hidróxido de aluminio de bajo poder desecante, apto para alimentos de bajo
contenido proteico (ej, miel) o para combinar con los desecantes de Pb; solución de Carrez
(ferrocianuro de potasio y sulfato de zinc) para productos de alto contenido proteico pero poco o
nada coloreados y pobres en gomas y pectinas; ácido tricloroacético; ácido fosfotúngstico (para, por
ejemplo, determinación de actividad diastásica en harinas).
2) Por decarboxiliación
a) igual que en 1)
b) ebullición con HCl de alta concentración para producir decarboxilación
c) medición de CO2 liberado
3) Métodos colorimétricos
a) igual que en 1)
b) el más difundido utiliza carbazol en H2SO4
Fibra Dietaria
Es el conjunto de todos los polisacáridos no digeribles por las enzimas alimentarias humanas y la
lignina. Esto incluye a los componentes de la pared celular de las plantas (lignina, celulosa, hemicelulosas,
pectinas, proteínas, lípidos, constituyentes inorgánicos), además de otras sustancias componentes naturales o
aditivos de los alimentos tales como gomas, mucílagos, celulosas y almidones modificados.
La diversidad de estos compuestos dificulta la valoración de la “fibra dietaria” fisiológica, a la que se
trata de aproximarse por diferentes caminos.
Según el sistema de determinación, los métodos pueden dividirse en tres categorías:
1. Métodos gravimétricos
2. Métodos colorimétricos
3. Métodos C.G.L.
a) El método de fibra cruda según A.O.A.C. fue desarrollado a mediados del siglo pasado para
la determinación del material no digestible en alimento para ganado. Debido a la falta de un
método más adecuado, su uso se extendió a los alimentos humanos. Ya hace tiempo que se
sabe que no es un método apropiado para este fin porque se obtienen resultados muy bajos
por pérdida de hidratos de carbono no digestibles. La diferencia con el valor de fibra
dietaria es muy variable dependiendo de su composición. Sin embargo hasta hace
aproximadamente 10-15 años, no había sido reemplazado, y aún actualmente sigue
usándose en determinados alimentos. Consiste en una digestión ácida con H2SO4 1,25%,
seguida de una con NaOH de la misma concentración que completa el ataque de hidratos de
carbono iniciada por el ácido, solubiliza material hidrogenado, libera grasa y solubiliza las
huminas formadas por la digestión ácida. (Las huminas son compuestos formados por
deshidratación y polimerización de azúcares por calentamiento en medio ácido).
El material remanente formado por fibra cruda, y materias minerales se seca y calcina. La
diferencia de peso entre el residuo seco y el calcinado es la fibra cruda.
Por eso la definición de “fibra cruda” es: “el material que se pierde por ignición del residuo
seco remanente de la digestión de la muestra con H2SO4 1,25% e NaOH 1,25% bajo
condiciones específicas.”
El método está normalizado a fina de obtener resultados comparables.
Esta fibra está constituída por celulosa, cantidades variables de lignina y los pentosanos que
resistieron la doble hidrólisis.
Hay más de 100 modificaciones de este método.
b) Método con detergente. Como la mayor pérdida de componentes en fibra cruda ocurre
durante el tratamiento alcalino, se eliminó este. Para solubilizar los restos proteicos que,
entonces, quedarían Van Soest ideó el método conocido como ADF (acid detergent fiber)
que usa un detergente catiónico en medio ácido. Determina celulosa y lignina, aunque suele
haber restos de hemicelulosas y pectinas. El otro método, también de Van Soest, es el NDF
(neutral detergent fiber) que utiliza un detergente aniónico en medio neutro y, a veces,
EDTA. Es un método más suave que deja las hemicelulosas, pero extrae las pectinas con
EDTA. El problema de este método suele ser la eliminación incompleta de almidón,
obviado en su mayor parte por el uso de amilasa para solubilizarlo según el método de la
AACC (American Association of Cereal Chemists). La diferencia entre ADF y NDF son las
hemicelulosas dosadas por este último.
Estos métodos también fueron desarrollados para el análisis de alimentos para ganado y
forrajes, pero también en este caso luego se aplicaron a alimentos para humanos. Su gran
ventaja es la sencillez y la rapidez, similar a la del método de fibra cruda. No obstante, se
pierden componentes solubles de la fibra dietaria por lo que los resultados pueden diferir
bastante de los reales según el alimento. Pero el NDF puede servir como meto bastante
rápido de rutina una vez que se estableció la relación con el valor real para el alimento
específico analizado.
d) Métodos enzimáticos.
i. Para fibra insoluble: mide el residuo insoluble después de digerir el alimento con
enzimás proteolíticas y amilolíticas.
ii. Para fibras insolubles y solubles: tratan de recuperar la fibra soluble por
precipitación con EtOH (la técnica más común) o por ultra filtración.
Si bien hay notables progresos en este tipo de métodos los errores suelen deberse a los restos de
proteínas y/o almidón que quedan sin digerir.