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Tecnicas de Tinciones Histologicas
Tecnicas de Tinciones Histologicas
OBTENCIÓN DE LA PIEZA
- Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadáver. Para histología normal es
necesario que se trate de un cadáver fresco y que no haya sido atacado por ninguna
lesión, por lo menos el órgano que se quiere estudiar.
- Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de
estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnóstico histopatológico.
- Piezas operadas: los tejidos que han sido extraídos de las intervenciones quirúrgicas,
generalmente tumores u órganos inflamados, también pueden darnos material de
investigación pero, como en el caso anterior, sólo servirán para anatomía patológica.
FIJACIÓN
La fijación tiene por objeto matar las células y conservarlas, hasta donde sea posible,
en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un método
histológico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura
morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo y que permite realizar,
posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el
completo conocimiento de su constitución íntima.
Fijación de la muestra.
Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes físicos que se utilizan
para tal fin.
1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los
fenómenos agónicos o post-mortem (autólisis, desintegración, etc.).
2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las
capas profundas de la pieza a fijar.
3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.
4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación
ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.).
5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de
ella.
6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales.
7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.
Varía con la composición o naturaleza de los mismos: coagulando las proteínas sin
combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor), formando combinaciones
químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reduciéndose en
contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (ácido
ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).
La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración
ulterior de los tejidos (recuérdese que éstos, en su mayoría, son reductores que
muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molécula
de hidrógeno con su cromóforo).
Fijadores químicos
Son los más utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola
sustancia química, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias
sustancias intervienen en su constitución.
FIJADORES SIMPLES:
d) Ácido ósmico al 1 ó 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien
estructuras celulares.
FIJADORES COMPUESTOS:
FIJADORES FÍSICOS:
1. Desecación.
2. Calor seco.
3. Calor húmedo.
4. Frío.
5. Congelación y desecación.
Deshidratación
Las piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están embebidas
en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar,
debemos deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos anhidros, ávidos de agua.
Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se aconseja
proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etílico de graduación
creciente.
Se dispone una lámina en un cassette de deshidratación.
Barras de Leuckart
OBTENCIÓN DE CORTES
- Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por
unas guías especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos
tornillos.
- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a
una platina, ésta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite
obtener cortes seriados en forma de cinta.
Corte en micrótomo tipo Minot.
Colorantes: reciben esta denominación las sustancias que pueden conferir color a otros
cuerpos.
MONTAJE
Tipos de tinciones
¿Que es un colorante?
Los protocolos de tinción deben escribirse de forma concisa, anotando de forma muy
precisa indicando claramente todos los pasos necesarios para preparar todas las
soluciones empleadas, tiempos de actuación, temperatura, condiciones, etc...
Los diferentes fijadores interactúan de forma diferente sobre las moléculas que
componen los tejidos produciendo modificaciones. En un mismo tejido, los colorantes
se comportan de forma diferente en funci²n del grado de fijación y de la naturaleza del
fijador utilizado. Por ejemplo, se conoce que tanto la formalina como el tetroxido de
osmio inducen basofilia en los tejidos, mientras que las soluciones colorantes a base de
dicromato inducen acidofilia. En comparación con la formalina, el fijador de Carnoy
incrementa la avidez del tejido por los colorantes, mientras que el fijador de Zenker
disminuye el grado de coloraci²n.
Una tinción progresiva es aquella en las que los cortes histológicos se sumergen en la
solución colorante durante el tiempo necesario hasta que adquieren el grado de tinción
deseada. Cuanto más tiempo están los cortes en la solución colorante, más fuerte es la
tinción. Una tinción regresiva es aquella en la que los cortes se "sobretiñen" dejándolos
en la solución colorante durante un tiempo excesivo y posteriormente se procede a
retirar el exceso de colorante (proceso que se llama "diferenciación") mediante
tratamiento con una solución ácida o alcohólica. En este caso se ajusta el tiempo de
diferenciación.
¿Qué diferencia hay entre una tinción física y una tinción química?
En una tinción física, el colorante se disuelve en el sustrato. Por ejemplo el Sudán III se
disuelve en las grasas, y es empleado para demostrar gotas lipídicas. En una tinción
química, el colorante interacciona químicamente con el sustrato a través de fuerzas de
van der Waals, puentes de hidrógeno, enlaces covalentes o enlaces electrostáticos.
Las tinciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante, o múltiples
cuando se usan dos o más colorantes. En una tinción tricromía se emplean tres
colorantes, cada uno de ellos con unas particularidades, de tal manera que se consigue
teñir con colores diferentes, estructuras diferentes, permitiendo así su rápida
identificación en el microscopio.
Es aquella que se realiza sobre células frescas, recién obtenidas, con objeto de realizar
una observación de las estructuras teñidas con las células vivas. Por ejemplo, se puede
teñir las mitocondrias de células vivas con el colorante Verde Jano y observarlas con el
microscopio mientras las células permanecen vivas.
¿Qué es una tinción vital?
Esta forma de tinción se basa en que el colorante no-tiñe la estructura que se desea
estudiar, de tal forma que la morfología externa o los contornos de esa estructura
quedan delimitados por el propio colorante que se encuentra a su alrededor.
Usualmente los cortes histológicos se montan sobre portaobjetos antes de ser teñidos
lo cual facilita su manipulación. Sin embargo en ocasiones, sobre todo cuando se
utilizan cortes gruesos de 30-50 micras, obtenidos con un criostato o con un vibratomo,
conviene realizar determinado tipo de tinciones "en flotación". Para ello los cortes de
tejido se mantienen sumergidos (en flotación) en el interior de la solución colorante lo
cual permite la accesibilidad del colorante por ambas superficies. Este tipo de técnica
es poco común cuando se utilizan colorantes pero es habitual cuando se realizan
técnicas de tinción histoenzimáticas o inmunocitoquímicas.
1º-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60º. 5º- Lavar en H2O-2min.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min.
6º-Eosina alcohólica-1min.
Alcohol 96º-5min.
Alcohol 70º-5min.
7º-Deshidratar.
Alcohol de 70º
3º- Lavar en H2O destilada. Alcohol de 96º.
Alcohol absoluto.
Xilol.
1º- Desparafinar.
Estufa durante 30 min. a 60ºC 7º- Alcohol de 96º- 2-3 pases rápidos.
Sumergimos en xilol durnate 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min.
8º- Alcohol isopropílico -3 min.
Alcohol 96º -5min.
Alcohol 70º -5min.
SOLUCIONES:
1.- Solución Cristal Violeta: 2.- Solución Lugol:
-Cristal violeta-------------------------------------------2 gr. - Yodo ----------------------------------------------1.5 gr.
- Alcohol96º -------------------------------------------20 ml - Yodato potásico ---------------------------------3 gr.
- Agua destilada --------------------------------------78 ml - Agua destilada --------------------------------450 ml
4.- Solución Fucsina básica al 0.5 % :
- Fucsina básica----------------------------------------
3.- Solución de Eter – Acetona : 0.5 gr.
- Etil-éter ( concentrado ) ------------------------------125 ml - Alcohol95º ---------------------------------------------5
- Acetona--------------------------------------------------375 ml. ml
- Agua destilada ---------------------------------------95
ml
5.- Solución de ácido pícrico acetona :
6.- Solución Acetona xilol:
-Ácido pícrico------------------------------------------------0.1
-Acetona --------------------------------------------50 ml
gr.
- Xilol -------------------------------------------------50 ml
- Acetona---------------------------------------------------100 ml
TÉCNICA:
1.- Desparafinar e hidratar. 8.- Lavar en agua corriente
9.- Sumergir en acetona para que
empiece la diferenciación, y continuarla
2.- Solución cristal violeta ( filtrado ) - 2
con la solución de acetona-ácido
min.
pícrico, hasta que los cortes estén
amarillo-rosado.
3.- Lavar rápidamente con agua
10.- Lavar rápidamente en acetona.
corriente.
4.- Solución Lugol -1 min. 11.- Lavar en solución acetona-xilol.
5.- Lavar en agua corriente. 12.- Aclara con xilol
6.- Decolorar con solución éter-acetona,
gota a gota, hasta que no suelte más 13.- Montar.
color.
7.- Solución Fucsina básica ( filtrada ) - 3
min.
Tricromico de Masson
1º-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60º. 7º- Ácido fosfomolíbdico 5 min.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min.
8º- Ácido fosfomolíbdico 5 min.
Alcohol 96º-5min.
Alcohol 70º-5min.
3º- Lavar en H2O destilada. 9º- Verde luz 5-7 min.
10º-Deshidratar.
Alcohol de 70º
4º- Hematoxilina de Weigert 5 min.
Alcohol de 96º.
Xilol.
5º- Lavar con agua corriente 10 min. 11º- Montaje.
6º- Fucsina de Ponceau 5 min.
Tinción para reticulina
1º-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60º. 11º- Lavar con agua destilada 1-2 pases.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min.
12º- Formol al 10 % -5 min.
Alcohol 96º-5min.
Alcohol 70º-5min.
3º- Lavar en H2O destilada. 13º- Lavar con agua destilada 1-2 pases.
4º- Permanganato potásico al 1% -1 min. 14º- Cloruro de oro al 0.2%-2 min.
5º- Lavar con agua destilada 1-2 pases 15º Lavar con agua destilada 1-2 pases.
6º- Metabisulfito potásico al 2% - 1 min. 16º Metabisulfito potásico al 2%-2 min.
7º- Lavar con agua destilada 1-2 pases 17º- Tiosulfato sódico al 2%-- 1 min.
8º - Alumbre férrico al 2% - 2 min. 18º- Lavar con agua corriente 5 min.
19º-Deshidratar.
Alcohol de 70º
9º- Lavar con agua destilada -1-2 pases. Alcohol de 96º.
Alcohol absoluto.
Xilol.
10º- Reactivo de Wilder - 2 min. 20º- Montaje.
RESULTADOS:
Reticulina: negro.
Núcleos: grisáceo.
Colágena: púrpura grisáceo.
PAS
Se usa como técnica de rutina para observar las membranas basales que separan el
tejido epitelial del corión. Tiñe los núcleos de color azul, el glucógeno de color púrpura y
el material PAS + (polisacáridos simples, mucopolisacáridos neutros, mucoproteínas,
glucoproteínas y glucolípidos) rojo rosa.
SOLUCIONES:
SOLUCIONES:
1.- Hematoxilina de Verhoeff: 2.- Solución de Picrofucsina:
-Cloruro férrico al 10 %:
- Yoduro potásico al 10 %:
- Alcohol 50º
TÉCNICA:
1.- Desparafinar e hidratar 6.- Picrofucsina -------------------1 pase
2.- Hematoxilina de Verhoeff ---------30
7.- Deshidratar
min.
3.- Lavar ----------------------------------1 pase 8.- Aclara con xilol
4.- Cloruro férrico al 1 % ---------------1
9.- Montar
pase
5.- Lavado en agua corriente ---------1
pase
Azul Alcian
SOLUCIÓN:
Azul alcian---------- 1 gr.
1º-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60º. 10º- Lavar con agua destilada 6 pases.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min.
11º- Cloruro de oro al 0.2 % - 2-5 min.
Alcohol 96º-5min.
Alcohol 70º-5min.
3º- Lavar en H2O destilada 12º Lavar con agua destilada 5 min.
4º- Solución de ácido crómico al 4% - 1
13º- Tiosulfato sódico al 2% - 2-5 min.
hora
5º- Lavar en agua corriente 5 min. 14º- Lavar con agua corriente
16º-Deshidratar.
Alcohol de 96º.
7º- Lavar agua corriente 5 min.
Alcohol absoluto.
Xilol.
8º- Lavar con agua destilada 3-4 pases 17º- Montaje.
9º- Solución argéntica de trabajo:
En estufa 60º--------------------------------- 1
hora
En microondas (descongelación) -------- 1-2
min.
Hierro coloidal
1º-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60º. 7º- Mezcla ferrocianuro-clorhídrico 20 min.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min.
8º- Lavar con agua corriente -5 min.
Alcohol 96º-5min.
Alcohol 70º-5min.
3º- Lavar en H2O destilada. 9º- Lavar en agua destilada 3-4 pases.
11º-Deshidratar.
Alcohol de 70º
5º - Solución de trabajo de Hierro coloidal 1
Alcohol de 96º.
hora.
Alcohol absoluto.
Xilol.
6º- Solución acética 4 lavados ( 3
12º- Montaje.
min./lavado )
Mucicarmin de Mayer
Las mucinas o mucoproteínas son proteínas con H.C. en una proporción superior al 4
%. La técnica del mucicarmín de Mayer sirve para identificar globalmente las mucinas,
pero no reconoce su naturaleza bioquímica.
1º-Desparafinado.
6º - Solución diluida de mucicarmín ( 1:4 )
Estufa durante 30 min. a 60º.
30 min.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min.
7º - Lavar con agua corriente 10 min.
Alcohol 96º-5min.
Alcohol 70º-5min.
8º-Deshidratar.
Alcohol de 70º
3º- Lavar en H2O destilada. Alcohol de 96º.
Alcohol absoluto.
Xilol.
1º-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60º. 5º-Lavar con agua corriente 5 min.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min. 6º Contracolorear ( si se quiere ) con
Alcohol 96º-5min. hematoxilina-eosina u otro colorante.
Alcohol 70º-5min.
7º-Deshidratar.
Alcohol de 70º
3º- Lavar en H2O destilada. Alcohol de 96º.
Alcohol absoluto.
Xilol.
1º-Desparafinado.
7º- Solución de Orceína --1:30 h. en
Estufa durante 30 min. a 60º.
estufa.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min. 8º - Lavar en agua corriente y dejar
Alcohol 96º-5min. secar.
Alcohol 70º-5min.
1º-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60º. 6º - Hematoxilina de Mayer -10 min.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min. 7º- Lavar en agua corriente hasta que
Alcohol 96º-5min. vire.
Alcohol 70º-5min.
3º- Lavar en H2O destilada. 8º- Eosina 1 pase.
9º-Deshidratar.
Alcohol de 70º
4º - Reactivo de perls 30 min. Alcohol de 96º.
Alcohol absoluto.
Xilol.
5º - Lavar con agua corriente 5 min. 10º- Montaje.
RESULTADOS:
Hierro: azul.
Rojo congo
1º-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60º. 7º- Lavar en agua corriente - 5 min.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min.
8º- Yoduro potásico --3-4 min.
Alcohol 96º-5min.
Alcohol 70º-5min.
3º- Lavar en H2O destilada. 9º- Lavar con agua corriente.
10º-Deshidratar.
Alcohol de 70º
4º- Hematoxilina de Carazzi o de Weigert 10
Alcohol de 96º.
min.
Alcohol absoluto.
Xilol.
5º- Lavar en agua corriente - 10 min. 11º- Montaje.
6º- Solución Rojo Congo - 10 min.
(en el momento del uso se cogen 8 ml de rojo
congo y se mezclan con 2 ml de glicerina.
Filtrar)
Plata metenamina o Hexamina
1º-Desparafinado.
9º- Tiosulfato sódico o hiposulfito
Estufa durante 30 min. a 60º.
sódico 5 min.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min.
10º- Lavar en agua destilada.
Alcohol 96º-5min.
Alcohol 70º-5min.
3º- Lavar en H2O destilada. 11º- Hematoxilina de Mayer 10 min.
4º- Ácido per yódico al 0.5 % - 15 min. 12º- Lavar en agua corriente
5º- Solución de Ag-Metenamina:
. En estufa - 60 min.
(controlar la tinción hasta que alcance un
color tabaco y comprobar al microscopio
13º- Eosina - 3 min.
que se han teñido los glomérulos)
1º-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60º. 5º- Lavar con agua corriente.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2º- Hidratación.
Alcohol absoluto-5min. 6º- Hematoxilina o carmín (para el
Alcohol 96º-5min. contraste)--5-10 min.
Alcohol 70º-5min.
RESULTADO:
1º- Desparafinado.
Estufa durante 30 min.a 60º. 4º- Violeta de cresilo 0.1% entre 20-30 min.
Sumergimos en xilol durante 10-15 min.
2º-Deshidratación.
Alcohol absoluto durante 5 min.
5º- Lavar en agua corriente.
Alcohol 96º 5 min.
Alcohol 70º 5 min.
Colorante Histológico.
Empleado para la investigación histológica del ácido nucleico contenido en los
tejidos, así como para demostrar la presencia de células de la serie linfática y
células plasmáticas.
RESULTADOS
Coloración de Papanicolaou
Hematoxilina Biopur
Colorante nuclear. Las características y recomendaciones para el uso de
Hematoxilina Biopur fueron expuestas en la sección anterior. Rogamos referirse
a la misma para información adicional.
OG Biopur
Se trata de una solución alcohólica de ácido fosfotúngstico y Orange G. El ácido
fosfotúngstico acidifica la solución y aumenta la unión del Orange G a zonas
citoplasmáticas densas.
EA Biopur
Se trata de una solución alcohólica, fotoestable que elimina los problemas
causados por las tradicionales e inestables fórmulas numeradas EA-36/50/65/etc.
No requiere filtración. Listo para usar.
Esta técnica consiste en la hidrolización del DNA mediante una dilución débil de
ácido clorhídrico que libera las bases púricas, quedando libres los radicales
aldehídos de las pentosas, y en la coloración con leucofuscina, que pone de
manifiesto los grupos aldehído.
Tincion Fluorescente
Solución 1
Manipular la auramina con guantes, debe evitarse todo contacto porque es cancerígena
- Auramina 0,1 g
- Etanol 95% 10 ml
Disolver la auramina en el etanol
Solución 2
- Cristales de fenol 3 g
- Agua destilada 87 ml
Disolver los cristales de fenol en el agua.
Mezclar las soluciones 1 y 2. Guardar el colorante así preparado en una botella color
ámbar bien tapada, alejada del calor y de la luz. Rotular con el nombre Solución de
Auramina-O y las fechas de preparación y vencimiento. Almacenar a temperatura
ambiente no más de 3 meses. No filtrar con papel. Puede detectarser alguna turbidez
que no afecta la coloración.
Solución decolorante
- Ácido clorhídrico 0,5 ml
- Etanol 70% c.s.p. 100 ml
Colorantes de contraste
Disolver y guardar en una botella color ámbar bien tapada. Rotular con el nombre y las
fechas de preparación y vencimiento. Almacenar a temperatura ambiente no más de 3
meses.
Solución de naranja de acridina
− Fosfato dibásico de sodio anhidro 0,01 g
− Agua destilada 100 ml
− Naranja de acridina 0,01 g
Horobin RW, Kiernan JA (2002) Conn's Biological Stains. A Handbook of Dyes Stains
and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine. 10th ed. Oxford: BIOS. ISBN 1-
85996-099-5
http://elprofedebiolo.blogspot.mx/2010/01/tecnicas-de-tincion.html
http://es.scribd.com/doc/15606061/Tarea-4-tincion
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n
http://html.rincondelvago.com/histoquimica.html
http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/5-histoquimica.php
http://www.bu.edu/histology/m/append02.htm
http://www.uam.es/departamentos/medicina/patologia/Tecnicas.htm
http://www.uv.es/histomed/practicas/04-adip/04-adip.htm
Penney DP, Powers JM, Frank M, Churukian C (2002) analysis and testing of Biological
Stains - the Biological Stain Commission Procedures. Biotechnic & Histochemistry 77:
237-275.