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Contenido
Prólogo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XV
1. Introducción a la histotecnología aplicada al laboratorio de
anatomía patológica ..................... . .. . ... ... .. .
O'Valle, F.; Cámara, M. ; Andújar, M.; Medina, M. T.
2. Fundamentos generales sobre procesamiento histológico de
los tejidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
· O'Valle, F.; Caballero, T.
3. Fundamentos del proceso de fijación tisular ............. 27
García del Moral, R.; Aguilar, M.
4. Decalcificación y reblandecimiento tisular. Conservación de
tejidos y piezas quirúrgicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
García del Moral, R.; Ramírez, C.
5. Métodos y técnicas de inclusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
López Caballero, J. J.; Peña, M . C.
6. Micrótomos y técnicas de corte de los tejidos . .. . . . . . . . . . . 89
Rodríguez, M . D.; Sáez, F.; Alfaro, P. ; De Federico, M. J.
7. Fundamentos generales de coloración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
García del Moral, R.; Quesada, M. J.; Aguilar, D.
8. El microscopio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
Quesada, M . J .; López Hidalgo, J.
9. Coloraciones histopatológicas rutinarias de mayor interés . 155
Aguilar, D.; Bustos, M.; Caracuel, M. D.
~
1 O. Coloraciones para fibras cofage11~s y elásticas del tejido

conjuntivo. Coloraciones para sustan·cia amiloidea . . . . . . . . 175
López Caballero, J . :J.; Peña, M . C.; De Federico, M. J.
XII CONTENIDO
11. La impregnación argéntica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195

Rodríguez, M. D.; Quesada, M. J.
12. Coloraciones para estudios neurohistológicos . . . . . . . . . . . . 209
García del Moral, R.; Rodríguez, M. D.; Alfara, P.
13. Histoquímica de hidratos de carbono o glúcidos . . . . . . . . . . 225
Caballero, T.; Medina, M. T.; Caballero, M. A.
14. Histoquímica de proteínas, aminas biógenas y ácidos nuclei-

cos .................................................. 245
García del Moral, R.; Quesada, M. J.; Ruiz Avila, l.
15. Métodos para la identificación y tinción de pigmentos e

iones metálicos ....... .............. .... .. ... ......... 265
O'Valle, F.; Quesada, M. J.; Lucena, M. A.
16. Métodos para la detección de microorganismos . . . . . . . . . . 281
O'Valle, F.; Gómez Morales, M.
17. Histoenzimología ............ . ......... . .............. 293

Aguilar, D.; Fernández Ruiz, P. L.; Lucena, M. A.
18. Fundamentos biológicos de la inmunohistoquímica . . . . . . . 321

Gómez Morales, M.; Gómez Morales, M. A.
19. lnmunohistoquímica (1): Técnicas de inmunofluorescencia . 331

Gómez Morales, M.; Rodríguez, M. D.; Navarro, N.
20. Técnicas inmunohistoquímicas (11) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341

Gómez Morales, M.; Rodríguez, M. D.; Sáez, F.
21. Microscopía electrónica de barrido 369

Cañizares, J.; Crespo, V.
22. La histoautorradiografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383

Gómez Morales, M. D.; Bermúdez, F. J .; O'Valle, F.
23. Técnicas de análisis de imágenes en morfología microscópi-

ca .................................................. 405
García del Moral, R.; O'Valle, F. ; Masseroli, M.
24. ' Técnicas de manipulación de cultivos tisulares . . . . . . . . . . . 427

O'Valle, F.; Aguilar, D.; Alvaro, T.; Aneiros, J.
25. Técnicas de biología molecular en anat,o mía patológica . . . . 457

Lardelli, P.; O'Valle, F.
26. Riesgo tóxico y responsabilidad legal del técnico de labora-

torio de anatomía patológica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 487
Cámara, M.; López Gigosos, R.
CONTENIDO XIII
27. Marcadores tumorales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505

Aneiros, J .; Andújar, M.; Ruiz Avila, l.
28 . Métodos de estudio en los sistemas cardiovascular y respira-
torio ....... ... .. . .. .. . . ... .. .. .. . .. ... . ..... . . . ..... 527
López Caballero, J.J.; Peña, M. C.; Alonso, J .
29. Métodos de estudio del sistema urogenital . . . . . . . . . . . . . . 545
García del Moral, R.; Lardelli, P.; Fernández Ruiz, P. L.
30. Métodos de estudio del aparato digestivo . . . . . . . . . . . . . . . 565
Caballero, T. ; Medina, M. T.
31 . Métodos morfológicos de estudio para el sistema endocrino 575
Gómez Morales, M .; Ramírez, C.
32. Métodos de estudio del aparato locomotor 585
Aneiros, J .; Cámara, M .
33. Métodos de estudio del sistema nervioso . . . . .. : . . . . . . . . . 601
Cámara, M. ; Bustos, M.
34. Métodos de estudio del sistema hematopoyético y linfoide ·613
García del Moral, R.; Lardelli, P. ; Navarro, N.
35. Métodos de estudio en dermatopatología . . . . . . . . . . . . . . . . 631
García del Moral, R.; Andújar, M.
Apéndice A ....... . . . . . . . .. .. ... ..... . . . . .. . . . .. . . .. .. . .. . · 643
Apéndice B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 649
Bibliografía . . .. . ... . . .... . ... . . . .. . .. .. . . . . . ... . . . .. .. . .. 653
lndice de procedimientos técnicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 655
· Láminas en color 659
CAPITULO 1
Introducción a la
histotecnología aplicada al
laboratorio de anatomía
patológica
GUION DE CONTENIDOS
1. CONCEPTO Y OBJETO DE LA HISTOTECNOLOGIA.
MATERIAL HISTOLOGICO Y ANATOMOPATOLOGICO
2. ESTUDIOS CITOHISTOLOGICOS VITALES, SUPRAVITALES
Y POSTVITALES
3. CONCEPTOS DE BIOPSIA Y PIEZA QUIRURGICA
4. CONCEPTOS DE PREPARACION HISTOLOGICA,
EXTENSION CITOLOGICA E IMPRONTA
5. GENERALIDADES SOBRE EL EXAMEN MACROSCOPICO
DE BIOPSIAS
6. LA SALA DE ESTUDIO MACROSCOPICO
7. INSPECCION Y DESCRIPCION DEL MA"I:ERIAL
ANATOMOPATOLOGICO
8. MUESTREO Y SE.LECCION DEL MA ERIAL
2 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA
9. FORMULARIO DE ESTUDIO MACROSCOPICO

10. FOTOGRAFIADO V RADIOGRAFIA DE LOS ESPECIMENES
11. AUTOPSIA CLINICA V MEDICO FORENSE
12. SALA E INSTRUMENTAL DE AUTOPS.IAS
13. EL PERSONAL DE AUTOPSIA
14. AUTOPSIAS PARCIALES
15. FUNCIONES DEL TECNICO DE ANATOMIA PATOLOGICA
16. ORGANIZACION GENERAL DE UN SERVICIO
DE ANATOMIA PATOLOGICA
HISTOTECNOLOGIA APLICADA AL LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA 3
1. CONCEPTO Y OBJETO DE LA HISTOTECNOLOGIA.

MATERIAL HISTOLOGICO Y ANATOMOPATOLOGICO
La Histotecnología es la ciencia que estudia los fundamentos técnicos y la

secuencia de manipulaciones necesarias para llevar a cabo el análisis de los
tejidos de los seres vivos. Como para ello es imprescindible la utilización del
microscopio, este conjunto de técnicas tiene como finalidad última la prepara-
ción de los tejidos para su observación microscópica. Pero los límites de la
Histotecnología, se han ido ampliando para dar cabida a otros métodos de
estudio biológico que emplean técnicas cada vez más sofisticadas -cultivos
celulares, inmunohistoquímica, biología molecular, etc.- y que también tratare-
mos en este manual.
Según la procedencia de los tejidos y la finalidad de su estudio es posible
distinguir entre material histológico y material anatomopatológico.
Se denomina material histológico a toda muestra de tejidos obtenida de un
individuo o animal sano con la finalidad de investigar su estructura y composi-
ción normales. Reciben el nombre de material anatomopatológico, las muestras
procedentes de individuas o animales enfermos utilizadas para el diagnóstico o
investigación etiológica de la enfermedad.
Los tejidos normales humanos para estudio histológico se obtienen habitual-
mente a partir de cadáveres.
El estudio de los tejidos enfermos que constituye el objeto de la Histopatolo-
gía, se realiza a partir de material anatomopatológico procedente de: a) necrop-
sias; b) biopsias; e) extensiones citológicas, o d) patología experimental.
2. ESTUDIOS CITOHISTOLOGICOS VITALES. SUPRAVITALES

Y POSTVITALES
Se denominan vitales aquellos estudios citológicos o histológ icos que se

realizan sobre células o tejidos vivos sin que éstos hayan sido separados del ser
que los contiene: por ejemplo, la observación de la microcirculación sanguínea
sobre un lecho capilar translúcido. Debido a su dificultad, este tipo de estudio se
efectúa muy rara vez; son, por otra parte de escasa utilidad . Los estudios
supravitales son realizados sobre células o tejidos vivos, pero separados del
organismo del que proceden. En este caso las células siguen viviendo porque se
preservan en condiciones precisas de temperatura y en un medio de cultivo
adecuado, habitualmente por medio de técnicas de cultivo in vitro (véase capí -
tulo 24) o, en el caso de sangre, empleando la técnica de la gota pendiente para
la observación de hemoparásitos. Este último procedimiento se realiza colocan-
do una gota de sangre sobre un cubreobjetos que se invierte y se sitúa sobre un
portaobjetos provisto de una excavación central que permite mantener suspen-
dida la gota.
Para teñir las células en los estudios supravitales se utilizan colorantes que
aunque tóxicos, poseen cierto grado de compatibilidad con el metabolismo
celular, como el azul de metileno y el azul trypán. Una aplicación fundamental de
los colorantes supravitales es la determinación del número de células viables
existentes en una muestra dada, de forma que la coloración del núcleo es
indicativa de que la célula está muerta.
Se denominan estudios postvitales todos aquellos que se practican sobre

células muertas en estado natural (no fijadas) . En anatomía patológica se englo-
ban dentro de ellos todos los métodos que utilizan secciones de tejido congela-
do, incluida la biopsia intraoperatoria (véase capítulo 11).
3. CONCEPTOS DE BIOPSIA Y PIEZA QUIRURGICA
Una biopsia es una porción de tejido obtenida de un individuo vivo

para su estudio anatomopatológico. Según el objetivo perseguido al reali-
zar la toma, existen dos tipos fundamentales de biopsias: a) biopsias de diag-
nóstico y b) piezas quirúrgicas.
Las biopsias de diagnóstico tienen como objetivo fundamental concretar el
diagnóstico histopatológico (microscópico) de una enfermedad, al cual no se ha
podido llegar por los medios clínicos habituales. En general, se caracterizan por
ser de pequeño tamaño -en ocasiones se trata de cilindros obtenidos por
punción de órganos- y por no comprender la totalidad de una lesión, sino sólo
una porción de ella, ya que en la mayor parte de los casos la enfermedad no
tiene tratamiento quirúrgico. Son ejemplos de biopsias de diagnóstico los cilin-
dros de punción renal y hepática, las biopsias cutáneas en dermatosis, las
muestras obtenidas por fibrobroncoscopia, endoscopia digestiva, etc.
Las piezas quirúrgicas son de mayor tamaño; (fig . 1 .1 ), a menudo compren-
den órganos enteros e incluyen toda la lesión. Habitualmente son obtenidas por
el cirujano· para realizar el tratamiento de una enfermedad, si bien como comple-
mento imprescindible debe realizarse el estudio anatomopatológico con la finali-
dad de confirmar el diagnóstico, establecer un pronóstico y contribuir a la
planificación del tratamiento ulterior.
Figura 1 .1 . Fotografía tomada de una pieza macroscópica. (Pieza de his-

terectomía con doble anexectomía con teratoma maduro ovárico .)
4. CONCEPTOS DE PREPARACION HISTOLOGICA,

EXTENSION CITOLOGICA E IMPRONTA
Una preparación histológica es un fragmento de tejido que está dispuesto

para su observación microscópica. Se trata siempre de una porción de muy
escaso espesor (de 3-4 micras a varias decenas de micras) que mediante un
instrumento denominado micrótomo ha sido seccionada de un bloque o masa
de tejido incluido en un medio de homogenización (habitualmente parafina) y
coloreado a tal fin. Generalmente la lámina de tejido se encuentra adherida
mediante un pegamento especial (bálsamo) a una pieza rectangular delgada de
cristal (portaobjetos) y recubierta por otra de menor espesor y tamaño (cubreob-
jetos). El conjunto de manipulaciones y métodos que tienen por objeto la
confección de preparaciones histológicas recibe el nombre de procesamiento
histológico de los tejidos y comprende los pasos de fijación, inclusión, corte y
coloración, que serán objeto de análisis detenido a lo largo de los próximos
capítulos.
Una extensión citológica es un conjunto de células independientes proce-
dentes de un tejido y extendidas sobre un portaobjetos en forma de capa
unicelular que permite su observación microscópica . Cuando el material corres-
ponde a sangre, la extensión también recibe el nombre de frotis.
En órganos donde las células tienen escasos nexos de unión entre sí y con
las restantes estructuras tisulares (principalmente órganos hematopoyéticos co-
mo médula ósea, bazo y ganglios linfáticos), es posible obtener una capa unice-
lular sobre el portaobjetos por contacto directo de éste con la superficie de
sección del órgano, sin que sea preciso realizar raspado o exfoliación previa. La
preparación así obtenida se denomina impronta.·
Las técnicas de estudio para material citológico, así como los principales
aspectos sobre la interpretación de las lesiones presentes en el mismo serán
objeto de un manual complementario de citopatología.
5. GENERALIDADES SOBRE EL EXAMEN MACROSCOPICO

DE BIOPSIAS
El estudio macroscópico de biopsias y piezas qu1rurgicas comprende un

conjunto de métodos perfectamente estructurados que configuran una sistemá-
tica de actuación constante para cada muestra, de forma que los resultados
puedan ser reproducidos por distintos patólogos. Aunque el técnico de laborato-
rio no está obligado a participar en el preceso de examen macroscópico, consi-
deramos conveniente que conozca algunos aspectos generales del proceso,
soslayando los protocolos específicos para cada órgano que rébasan los límites
de este manual.
Los objetivos generales del examen macroscópico son:
a) Describir exactamente el tipo de material remitido para estudio, incluidas
sus dimensiones y las lesiones que contiene, así como especificar su
morfología, aspecto, coloración y, en el caso de las piezas quirúrgicas,
sus relaciones con estructuras vecinas. No debe olvidarse que, en oca-
siones, la descripción macroscópica aporta tantos datos como la micros-
cópica o incluso más, tal como ocurre en la patología vascular y cardía-
ca.
b) Seleccionar detalladamente las áreas sobre las que va a realizarse el
estudio microscópico. Este proceso, también conocido como muestreo o
«tallado» del material, debe ser realizado obligatoriamente por el persa-
nal facultativo del Servicio (habitualmente, los médicos residentes de

patología) auxiliados por el técnico de laboratorio, ya que un error de
muestreo por seleccionar una zona inadecuada puede tener consecuen-
cias muy graves.
6. LA SALA DE ESTUDIO MACROSCOPICO
Las actividades de estudio macroscópico y tallado de las biopsias se llevan a

cabo en una sala habilitada especialmente para ello, que debe contar con la
siguiente infraestructura mínima:
a) Area de disección y muestreo. Debe disponer de:

1. Campana de tallado sobre cuya superficie de metal o mármol el prosector
realiza la disección, y que debe estar diseñada para que los líquidos y
fluidos desprendidos por la pieza caigan en un recipiente o fregadero.
• Tomas de agua caliente y fría .

• Grifo dispensador de formalina.
En la actualidad se fabrican unos módulos compactos dotados de todo ello,

además de dictáfono de pedal incorporado (fig. 1.2) que facilitan todo el pro-
ceso.
Figura 1.2. Un modelo de banco de tallado dotado de los requerimientos

mínimos para el estudio macroscópico.
2. Estanterías para almacenar los recipientes que contienen el material.

3. Material quirúrgico, que incluye bisturíes, cuchillos, tijeras y pinzas de
diferentes tamaños, sondas metálicas y plásticas, etc.
4. Cinta métrica y balanzas para medir y pesar el material, respectivamente.
5. Numerosas cestillas metálicas o de plástico con tapadera para el procesa-
miento del material.
6. Sistema para la numeración automática de los casetes o cestillas de
inclusión o, en su defecto, material para el etiquetado de las muestras.
b) Sistema de dispensación de formalina neutra o tamponada al

1 O por 100, a ser posible conectado a los puestos de prosección.
e) Soluciones de otros fijadores como 85, líquido de Carnoy, líquido
de Bouin, etc., con instrucciones de uso.
d) Sistema de fotografía macroscópica y radiografía.
e) Sistemas de refrigeración a 4 oc y congeladores.
7. INSPECCION Y DESCRIPCION DEL MATERIAL

ANATOMOPATOLOGICO
La primera fase del estudio macroscópico es la inspección general del mate-

rial, con descripción del tipo de pieza, estructuras que la componen, dimensio-
nes, peso, forma y color, así como la identificación de las partes normales y las
aparentemente patológicas. Dependiendo del material y para obtener una ade-
cuada fijación, se procederá del siguiente modo: a) para órganos sólidos se
realizarán cortes seriados sin- trasfixiarlo por completo; b) las vísceras huecas
pueden abrirse en fresco o bien ser fijadas simultáneamente desde el exterior por
inmersión y desde el interior mediante inyección con jeringa o catéter; e) en las
lesiones quísticas (como algunos tumores ováricos) es aconsejable extraer por
punción su contenido líquido para realizar estudio citológico y bioquímico, y
reemplazarlo por formalina al 1 O por 1 00; d) en las piezas de gran tamaño es
aconsejable la fijación a 4 oc evitando así la autolisis propia del tejido; si además
las piezas tienen gran cantidad de tejidos blandos y óseos (por ejemplo, miem-
bros amputados), pueden congelarse previamente para hacer cortes transversa-
les y observar y muestrear todos los compartimentos anatómicos de la pieza.
También, es posible disecar las partes blandas de las óseas y fijar las primeras de
manera habitual.
El estudio de los límites de resección quirúrgica, sobre todo en patología
neoplásica, es de vital importancia por su trascendencia pronóstica y terapéutica.
Por ello es necesario ma~carlos con un colorante (tinta china) que permanezca
indeleble tras el procesamiento histológico del tejido y sea fácilmente reconoci-
ble por el patólogo en el examen microscÓpico.
Las piezas de tamaño muy pequeño (biopsias endoscópicas, cilindros obte-
nidos por punción, etc.) se fijan e incluyen directamente. Algunas de ellas
requieren orientación (las que tienen una cara luminal generalmente cubierta de
epitelio); para ello el patólogo indicará al técnico la posición deseada o la
incluirá en un material que la mantenga en dicha situación (solución de agar al 3
por 100 en agua destilada mantenida en estado líquido-viscoso a 60 °C). Las
muestras que por su tamaño milimétrico pudieran extraviarse durante el procesa-
miento histológico, deben colocarse en cestillas específicas de malla muy fina
\_
(ver fig. 5.4). Su coloración con hematoxilina o mercurocromo hace más fácil su
identificación para el técnico· de laboratorio que confeccionará el bloque de
parafina.
8. MUESTREO Y SELECCION DEL MATERIAL
El muestreo debe realizarse sobre la totalidad del material recibido aunque

sólo una pequeña parte de éste será seleccionado .para estudio histológico. El
procedimiento consiste en obtener láminas de tejido del material, preservando al

máximo la estructura y forma original de la pieza por si fueran necesarios
exámenes posteriores. Cuando una pieza se secciona de forma seriada, varios de
los cortes efectuados muestran características similares; por consiguiente, se
aconseja mantener intacto uno de ellos para la realización de posibles fotografías
o demostraciones macroscópicas.
La selección del material que se va a incluir se efectúa escogiendo las zonas
más significativas de las lesiones halladas, sin repetir áreas equivalentes. El
número de muestras dependerá de la naturaleza del caso, la apariencia macros-
cópica de la pieza, la experiencia y el sentido común.
Los fragmentos que se incluirán en las cestillas deben tener un tamaño algo
inferior a las dimensiones de éstas y no superar los 3-5 mm de espesor para
facilitar la infiltración de la parafina . No deben ser incluidos materiales tales
como grapas quirúrgicas, hilo de sutura y gasas que pueden dañar-la cuchilla del
micrótomo. Por igual motivo las zonas de calcificación y hueso deben sufrir un
proceso previo de decalcificación antes de ser incluidas.
En lo que respecta a la orientación del material al confeccionar el bloque de
parafina, el técnico colocará las muestras de forma plana y sin tener en cuenta la
cara de corte, a excepción de ciertas piezas que necesitan ser incluidas de forma
específica para que el examen histológico abarque todas las capas de tejido que
componen el órgano (vesícula biliar, tubo digestivo, vejiga, útero, piel, etc).
9. FORMULARIO DE ESTUDIO MACROSCOPICO
El formulario de estudio macroscópico es una hoja de instrucciones para el

procesamiento histológico, que cumplimenta el prosector y va dirigida al técnico
de laboratorio. En ella se hacen constar los siguientes datos:
• Número de la biopsia.
• Fecha del estudio.
• Identificación del prosector que realizó el tallado.
• Tipo de tejido incluido.
• Número total de muestras incluidas.
• Existencia de material restante para nuevas inclusiones.
• Petición de técnicas especiales.
• Otros (realización de fotografías y radiografías, existencia de material en
decalcificación, etc.).
10. FOTOGRAFIADO Y RADIOGRAFIA DE LOS ESPECIMENES
La realización de fotografías de las piezas obedece a dos motivos:

1. A que es necesario, para una correcta interpretación del caso, disponer
de una imagen en la que se observe la estructura completa de la pieza y
sus relaciones así como los lugares muestreados. Para ello generalmente
se utilizan instantáneas de tipo Polaroid.
2. Para complementar documentalmente cualquier tipo de pieza, ya sea por
su rareza, características especiales o con una finalidad didáctica, inde-
pendientemente de la interpretación histológica posterior.
El estudio radiográfico de las piezas quirúrgicas puede proporcionar informa-

ción valiosa sobre la estructura y componentes de los tejidos en estudio. Los
tejidos más apropiados son: hueso, masas de tejidos blandos calcificadas, mama
(especialmente si han sido estudiadas por mamografía), válvulas cardíacas y
grupos ganglionares en los que se realizó linfografía previa .
11. AUTOPSIA CLINICA V MEDICO FORENSE
Autopsia significa etimológicamente «investigar por uno mismo». En medici-

na, el término se aplica a conocimiento de la causa de la muerte, para el que
también se emplea la denominación de necropsia. Mediante el procedimiento de
autopsia se realizan una serie de manipulaciones instrumentales sobre el cadáver
con el propósito de investigar en sus órganos la causa del fallecimiento.
Dependiendo de la finalidad de la autopsia, se distinguen dos modalidades:
la autopsia medicolegal o forense y las autopsia clínica.
11 .1. Autopsia medicolegal
Trata de investigar el origen de un fallecimiento cuando existen implicacio-

nes penales o civiles en la causa o en las circunstancias de éste. La realiza el
médico forense por orden judicial y, las indicaciones varían según la legislación
de cada país.
11.2. Autopsia clínica
Al igual que la autopsia medicolegal tiene por objetivo conocer la causa del
fallecimiento, aunque aquí importan menos las circunstancias en que sobrevino.
La autopsia clínica, pone el máximo interés en analizar los hallazgos observados
con la finalidad de conocer la historia natural de la enfermedad que provocó la
muerte. Se pretende, por tanto, realizar una revisión anatomopatológica retros-
pectiva, recogiendo todas las lesiones, para intentar reunirlas en un mecanismo
patogénico común.
12. SALA E INSTRUMENTAL DE AUTOPSIAS
Las necropsias se llevan a cabo en la sala de autopsias, que existe en todos

los servicios de anatomía patológica y que es el lugar dotado de los medios
físicos e instrumentales adecuados para realizar la necropsia en las debidas
condiciones de higiene. Entre estos medios merecen ser destacados los siguientes:
1. Sistema de extracción o purificación y filtrado de aire para la elimina-
ción de los olores desagradables.
2. Mesa de autopsias de altura regulable, con agua corriente, sistema de
iluminación, aspirador y trituradores incorporados (fig . 1.3).
3. Cámaras frigoríficas y congeladores para conservación de cadáveres.
4. Sistema de fotografía macroscópica.
Figura 1.3. Sala de autopsias mostrando la mesa especialmente diseñada

para la realización de la necropsia. Al fondo de la habitación se aprecia el
dispositivo para fotografiar los órganos.
El instrumental necesario, con las salvedades relativas a su tamaño en fun -

ción del tipo de autopsia clínica, consiste básicamente en:
1. Balanza con peso máximo de 6000 g y sensibilidad de 1O g, para pesaje
de los órganos de individuos adultos.
2 . Balanza pequeña, con peso máximo de 500 g y sensibilidad de 0.1 g ,
para pesaje de los órganos de recién nacidos y fetos.
3. Cuchillo de autopsia con hoja desechable de 1 O a 15 cm de longitud.
4 . Cuchillo largo con hoja desechable de 32 cm de longitud.
5. Bisturí con hoja desechable.
6. Pinzas de dientes de ratón.
7. Pinzas de disección .
8. Tijeras con un brazo puntiagudo y otro romo.
9. Tijeras romas, incluido enterotomo.
1O. Tijeras para cortar hueso y materiales duros (costotomo).
11. Tijeras de brazos curvos.
12. Tijeras para coronarias.
13. Mosquitos hemostáticos.
14. Sonda de 1 mm de diámetro.
1 5. Catéter de bordes romos.
16. Regla métrica metálica.
17. Cilindro graduado para medir volúmenes de 100 ce .
18. Sierra automática para apertura de cráneo.
19. Martillo con gancho.
20. Sistema de aumento (lupas estáticas, lentes de dentista, microscopio de
disección , etc.).
A este material imprescindible deben añadirse utensilios de limpieza (gasas,
esponjas, etc.), jeringas y agujas estériles para extracción de líquidos para culti-
vo, material y portaagujas de sutura, recipientes de distintos tamaños para depo-
sitar los órganos y diferentes líquidos de fijación según las necesidades (véase
capítulo 4, Conservación de tejidos y órganos).
13. El PERSONAl DE AUTOPSIA
La autopsia es realizada por el médico anatomopatólogo (si es posible,

especializado en el tipo de autopsia de que se trate) o por un equipo de médicos
del que forman parte los residentes, todo ello en función del número de autop-
sias que se realicen a diario. Los «mozos de autopsias» se encargan de las
labores más mecánicas del proceso, como la limpieza del cadáver y su traslado al
depósito. En la actualidad esta profesión está mal regulada en las instituciones
sanitarias, de forma que en la mayor parte de los hospitales los mozos tienen la
categoría de celadores y no intervienen instrumentalmente en el proceso. En
otras ocasiones, estas labores las llevan a cabo los ATS o diplomados en Enfer-
mería, quienes sí pueden asumir gran parte de las tareas, como la de colaborar en
la apertura y cierre de las distintas cavidades.
Según la legislación vigente, el técnico de laboratorio no intervíene en la
evisceración del cadáver ni está presente durante la autopsia; su misión consiste
en recibir fragmentos de los órganos extraídos y prepararlos para su observación
microscópica o conservación indefinida.
El procesamiento histológico del material de autopsias sigue en líneas gene-
rales, la misma sistemática que cualquier biopsia. Sin embargo, suele ser necesa-
rio, someter el tejido antes de la tinción a una eliminación del depósito inespecí-
fico de pigmento formólico (véase capítulo 3).
14. AUTOPSIAS PARCIALES
En ocasiones, la autorización otorgada para la realización de una autopsia

condiciona la misma a una sola cavidad corporal (autopsias torácicas o abdomi-
nales) o bien, plantean su realización obligada a través de una única incisión
quirúrgica . En estos casos, la voluntad del paciente o sus familiares debe respe-
tarse a toda costa, aún a cambio de una correlación anatomoclínica insuficiente.
Actualmente ha cobrado gran interés la denominada autopsia por «punciones
múltiples», en la cual utilizando agujas de gran tamaño es posible obtener
muestras de órganos para su estudio microscópico respetando la integridad del
cadáver.
15. FUNCIONES DE lOS TECNICOS DE lABORATORIO

Dentro del territorio nacional, las funciones del técnico de laboratorio se

encuentran reguladas por Orden de 11 de diciembre de 1984, del Ministerio de
Sanidad y Consumo (B.O.E. n.o 8, de 9 de enero de 1985, y 21, de 24 de enero
de 1985, sección 7. 8 ) , d~bido a ello, los aspectos generales de referencia no se
detallan a continuación.
A cada una de estas funciones encomendadas al técnico especialista se
aludirá a lo largo del manual; en partícular en el capítulo 2 se realiza una
mención general de las principales tareas a su cargo dentro del laboratorio de
anatomía patológica.
En relación con el estudio macroscópico, las funciones del técnico de labora-
torio comienzan con la llegada del material al servicio de anatomía patológica a

través de la incripción y registro de las biopsias.
Considerando que la mayor parte de las piezas deberían ser enviadas en
fresco para que reciban una fijación lo más correcta posible, es misión del
técn ico de laboratorio en colaboración con el patólogo responsable de la sala de
estudio macroscópico, realizar la limpieza y apertura de piezas grandes o huecas,
así como indicar el tipo de fijador a emplear y la posible realización de técnicas
especiales (congelación del tejido, toma de muestras para microscopia electróni-
ca, etc.). Cuando se reciban las muestras ya colocadas en el líquido fijador, se
comprobará que es el adecuado (generalmente formol al 1 O por 1 00), y que su
volumen debe ser al menos 20 veces el del tejido. En el caso de piezas grandes,
solicitará la asistencia del médico encargado de la macroscopia, ayudando a éste
en el procesamiento del material.
De igual forma, para llevar a cabo el estudio macroscópico, el técnico organi -
zará la campana de tallado, distribuyendo el material quirúrgico arriba menciona-
do, los recipientes con las piezas quirúrgicas y sus peticiones, los casetes nume-
rados adecuadamente, sus tapaderas y todos los utensilios necesarios en este
proceso (tinta china, regla, balanza, dictáfono, lupa, material fotográfico, etc.) .
Durante la prosección, el técnico deberá ayudar al médico en aquellas tareas
que así lo requieran, como por ejemplo, la retirada de los casetes seleccionados,
el reemplazamiento de líquidos, fijadores y material quirúrgico fungible, realiza-
ción de material fotográfico y radiográfico, retirada de los recipientes con sus
piezas ya procesadas y limpieza de la sala y su material una vez finalizado el
estudio macroscópico. Asimismo, se informará de las piezas que requieren orien-
tación especial, completará el formulario de estudio macroscópico y será el
responsable del mantenimiento y puesta en funcionamiento de los procesadores
automáticos de tejidos para la inclusión en parafina.
16. ORGANIZACION GENERAL DE UN SERVICIO

La exposición detallada de la estructura y funciones de un servicio hospitala-

rio de anatomía patológica excede los límites de este manual. No obstante,
creemos necesario esbozar algunas ideas generales sobre esos aspectos. Como
punto de partida, conviene señalar la diferencia que existe entre un pequeño
hospital comarcal de 200 camas, donde habitualmente sólo hay uno o dos
patólogos y dos o tres técnicos especialistas para realizar labores de diagnóstico
elemental, y un gran hospital regional de tercer nivel, donde además de análisis
de material anatomopatológico muy variado, deben realizarse numerosas tareas
complementarias de investigación y docencia. Este segundo tipo de centro es el
que principalmente tomaremos como referencia.
En lo que respecta a la organización general, a medida que aumenta la
cantidad y las clases de material anatomopatológico se hace necesario parcelar
en distintos laboratorios cada una de las actividades posibles; diferenciando las
secciones de citopatología, autopsias clínicas y biopsias con sus correspondien-
tes laboratorios y personal técnico. Asimismo, y por lo que se refiere a los
métodos especiales de diagnóstico, la subespecialización siempre conduce a la
mejor realización y mayor fiabilidad de las técnicas por ello se tiende a separar
estos laboratorios (microscopía electrónica, inmunohistoquímica, cultivos celu-

lares, biología molecular, etc.) de los correspondientes a la actividad diaria de
diagnóstico histopatológico. En la página siguiente se muestra un gráfico en el
que se refleja un modelo organizativo propio de un servicio de anatomía patoló-
gica en un hospital de tercer nivel.
Independiente de la organización general de los laboratorios, a la que hare-
mos continua referencia a lo largo del manual, conviene señalar las tareas de
registro y archivo de las muestras, así como el procesamiento de los informes
anatomopatológ icos.
Las primeras son tareas que por orden ministerial están adscritas al técnico
de laboratorio (véase a continuación). En lo que respecta al registro de las
muestras, en todo servicio de anatomía patológica existen unos libros de registro
de entrada de material (independientes para biopsias, exámenes citológicos y
necropsias), El técnico encargado de recepción está obligado a reflejar en ellos
de forma inmediata la filiación del paciente, el servicio de procedencia y la fecha
y hora de entrada del material, para otorgar a cada muestra un número correlati-
vo por orden de recepción. Este número de registro será el principal dato para
identificar el material en su discurrir por el servicio de anatomía patológica.
Aunque el material puede llegar en fresco, lo habitual es que se reciba fijado
y acompañado de una solicitud normalizada de examen patológico cumplimen-
tada adecuadamente con los datos personales del paciente, datos clínicos esen-
ciales, orientación diagnóstica, intervención, hallazgos quirúrgicos y tipo de
tejido remitido.
Una vez registrado, el material es analizado desde el punto de vista macros-
cópico y procesado para las distintas técnicas de estudio.
Tras concretar el diagnóstico definitivo, el patólogo emite un informe, a ser
posible mecanizado por procedimiento informático y envía las preparaciones
histológicas al archivo general del servicio. Allí, el técnico responsable procede a
archivar ordenadamente, tanto las preparaciones como los bloques de parafina,
microscopia electrónica y en general, cuanto material exista de cada estudio (en
la actualidad, incluso se archivan en congeladores de alta potencia los restos de
material congelado para ulteriores estudios de inmunohistoquímica, biología
molecular, etc., configurando auténticas histotecas). El material fijado empleado
para el diagnóstico habitualmente no se archiva como tal sino que los casos de
mayor interés se seccionan e incluyen masivamente para una mejor conserva-
ción. La principal dificultad de los archivos es el espacio que ocupan si bien con
los modernos sistemas modulares para preparaciones histológicas (fig. 2.2a) y
bloques de parafina (fig . 2.2b) en gran medida el problema ha quedado resuelto.
LABORATORIOS TAREAS ASIGNADAS TEC,NICAS REALIZADAS

1 1 1 1
H GENERAL Procesado de T. HISTOOUIMICAS

1
1 1
Biopsias. HEMATOXILINA EOSINA.
Piezas quirúrgicas. PAS (ácido peryódico de
Material de autopsias. - Schiff) .
Material de intraoperatorias. TRICROMICO DE MASSON ,
GOMORI. .
RETICULINA.
ORCEINA.
GRIMELIUS.
MASSON FONTANA.
ROJO CONGO .
GRAM .
GIEMSA.
GROCOTI.
Zl EH L- N EELSEN .
SUDAN .
PERLS .
VON KOSSA. etc.
H INMUNOHISTOQUIMICA Procesado de
1
1
-Biopsias para estudio con lnmunohistoquímica .
anticuerpos poli y mono- 1--
clonales. lnmunofluorescencia .
H MICROSCOPIA ELECTRONICA Procesado de Inclusión en resina .

Corte semifino.
Tinción azul de toluidina .
Corte ultrafino.
1
T. especiales.
Biopsias para M . E.
~ -lnmunooro.
-lnmunohistoquímica ul -
traestructural .
H CITO LOGIA Procesado de

1
1
-Material de Punción . T. Papanicolaou .
- Material de C. exfoliativa. - T.
T.
May Grümwald
de Shorr.
- Liquidas orgánicos, etc.
T. Giemsa
-1 CULTIVO Mantenimiento de
J
-Cultivos de órganos. T. Especificas.
-
-
Primoculti vos.
Líneas celulares.
- T. Histoquímicas.
T. lnmunohistoquímicas, etc.
---i BIOLOGIA MOLECULAR 1--- Procesamiento de

muestras para
estudios especiales.
Citometría de f lujo.
Análisis de imagen .
Autohistorradiografía.
y Hibridación in situ .
1
CAPITULO 2
Fundamentos generales
sobre procesamiento
histológico de los tejidos
GUION DE CONTENIDOS
1. ORGANIZACION Y EQUIPAMIENTO GENERAL DE UN
LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA
2. ASIGNACION DE TAREAS HABITUALES A LOS TECNICOS DE
LABORATORIO
3. NORMAS BASICAS PARA EL ENVIO DE BIOPSIAS
AL LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA
4. TRATAMIENTO DE LOS CORTES PREVIO A LA COLORACION
5. TRATAMIENTO DE LOS CORTES TRAS LA COLORACION
1. ORGANIZACION Y EQUIPAMIENTO GENERAL DE UN

LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA
Aunque cada laboratorio de anatomía patológica presenta características

arquitectónicas y de equipamiento instrumental específicos, todos ellos deben
reunir ciertos requisitos mínimos, definidos principalmente en función de su
volumen de trabajo y de los procedimientos técnicos susceptibles de realizarse
en ellos. En consecuencia, no es lo mismo hablar de un pequeño laboratorio
situado en un hospital comarcal , con un volumen muy restringido de biopsias
(no más de 2500/año) y necropsias, que de un gran laboratorio situado en un
hospital regional , donde, además de un volumen considerable de biopsias (más
de 1 O 000/año) y necropsias (más de 1 00/año), se realizan rutinariamente
técnicas de microscopia electrón ica, inmunohistoquímica e incluso de biología
molecular.
Sin embargo, sí es posible señalar tanto el equipamiento mínimo imprescin-
dible como las tareas elementales de rutina que en todos los casos deben realizar
los técnicos de laboratorio.
Por lo que se refiere al equipamiento, en todos los laboratorios de histopato-
logía existen procesadores automáticos para la inc:usión de los tejidos, micróto -
mos, criostatos, dispensadores de parafina, estaciones para la confección de
bloques, estufas, frigoríficos y congeladores, microscopios, etc., cuyo funciona-
miento detallado y normas de uso se describen en los capítulos correspondien -
tes de este manual. Un principio básico es que nadie debe manipular nunca
un instrumento de laboratorio sin autorización y sin haber sido previa-
mente instruido en su manejo o sin haber consultado detalladamente,
al menos, el manual de instrucciones. Para ello es obligado que una copia
de ese manual se encuentre junto al instrumento.
En cuanto a la organización general del laboratorio, es posible cualquier
distribución física de los instrumentos así como de los puestos de trabajo, si bien
para una correcta asignación de funciones hay que tener en cuenta que:
a) Los instrumentos para la inclusión automática de tejidos y la confección

de bloques deben estar en una habitación independiente o aislados en
campanas de extracción de gases.
b) Las baterías de coloración deben estar situadas junto a la toma de agua
corriente, y protegidas también por una campana de extracción de ga-
ses.
e) Los micrótomos y baños para extensión de cortes estarán situados en la
zona más iluminada del laboratorio; en su defecto, se situará un foco de
iluminación accesoria.
d) En zonas calurosas, y para facilitar la realización de secciones, es im-
prescindible que exista instalación de aire acondicionado.
e) En todo laboratorio debe existir al menos un microscopio para controlar
los resultados de los métodos de coloración utilizados.
f) Cuando el volumen de trabajo del laboratorio es suficientemente grande,
conviene establecer unidades independientes para realizar determinadas
tecnologías especiales (inmunohistoquímica, biopsias intraoperatorias,
etc.) (véase Esquema cap. 1).
g) El almacenamiento de los materiales inflamables y explosivos debe ha-
FUNDAMENTOS GENERALES SOBRE PROCESAMIENTO HISTOLOGICO DE LOS TEJIDOS 17
cerse fuera del laboratorio principal, lejos de focos de fuego y tomas de

corriente eléctrica . Asimismo, debe disponerse de extintores adecuados
al tipo de materiales inflamables acumulados.
2. ASIGNACION DE TAREAS HABITUALES A LOS TECNICOS

DE LABORATORIO
2.1 . Fijación de las biopsias
Consiste en preservar el tejido del deterioro provocado por la autolisis y

putrefacción derivada de la muerte celular (véase capítulo 3) . Aunque habitual-
mente las muestras llegan ya fijadas desde el lugar de procedencia, conviene
comprobar que el fijador es el adecuado en volumen y composición . En el caso
de que se soliciten estudios específicos que requieren material no fijado, como
las biopsias intraoperatorias y estudios especiales (inmunohistoquímicos, culti-
vos celulares, etc.), el muestreo del material debe ser realizado previamente por
personal facultativo, y el procedimiento ulterior variará según el tipo de muestra
y el laboratorio considerado. En la figura 2.1 se representa la sistemática general
seguida en nuestro servicio.
Congelación rápida
-50 oc con 2-metilbutano
Figura 2.1 . Esquema de la sistemática seguida en el Servicio de Anatomía

Patológica del Hospital Universitario de Granada para el procesamiento de
biopsias remitidas en fresco .
2.2. Fabricación de reactivos
Entre las tareas diarias del técnico de laboratorio se encuentra no sólo la de

elaborar todos los reactivos que empleará en los diversos procedimientos técni-
cos, sino también la de mantener una reserva suficiente de todas las soluciones
18 LABORATOR IO DE ANATOM IA PATOLOGICA
de almacenamiento empleadas para la fijación , procesamiento y decalcificación

de muestras.
2.3. Realización de la inclusión en parafina
Consiste en sustituir el agua tisular por un medio líquido capaz de solidificar

en las condiciones adecuadas de temperatura (en este caso parafina) , a fin de
proporcionar a la muestra la consistencia y homogeneidad adecuadas para obte -
ner secciones translúcidas muy delgadas mediante un instrumento denominado
micrótomo (véase capítulo 6) . En los modernos laboratorios este procedimiento
se realiza de forma automática mediante procesadores de inclusión.
Los técnicos de laboratorio tienen a su cargo la programación de dichos
instrumentos, el recambio periódico de sus líquidos y la colocación en su interior
de las canastillas que contienen las biopsias, con objeto de que se programe la
inclusión para que se inicie al final de la jornada y pueda completarse durante la
tarde/noche. Cuando la demanda de inclusiones es muy elevada, también es
competencia del técnico establecer las prioridades: en primer lugar deben proce -
sarse las pequeñas biopsias de diagnóstico, en segundo lugar, las piezas qu irúr-
gicas procedentes de cirugía, y finalmente, el material de autopsias e investiga -
ción .
2.4. Confección de los bloques de parafina y mantenimiento

de la estación de montaje
La primera tarea diaria del técnico de anatomía patológica debe ser la

fabricación de los bloques de parafina correspondientes a la inclusión del día
anterior, una vez extraídas las muestras del procesador automático de tejidos
(véase además el capítulo 5) . En las piezas que requieren orientación particular,
es conveniente la participación del técnico de laboratorio que ayudó al patólogo
prosector durante el estudio macroscópico de la biopsia .
También es competenc ia del personal técnico el mantenimiento, calibración
y limpieza (eliminación de restos de tejidos y parafina) del instrumento emplea -
do (estación de bloques, moldes de acero inoxidable, cestillas, tapaderas metá -
licas, pinzas, etc.) . Para ello se utiliza xileno caliente.
2.5. Corte de los bloques de parafina y confección

de las preparaciones histológicas
Generalmente es, junto con la coloración , la tarea en que mayor número de

horas se invierten. La sección se realiza en los instrumentos denominados micró -
tomos, y tiene como fin obtener preparaciones translúcidas susceptibles de ser
coloreadas y observadas en un microscopio óptico (véase capítulo 7) . Como
norma general, cada técnico de laboratorio ha de tener asignado un número
diario de bloques para seccionar, que constituye el principal índice para valorar
la productividad de cada persona. Asimismo, el número de secciones por bloque
ha de estar marcado por el número de técnicas solicitadas en la hoja de prosec-
c1on elaborada durante el estudio macroscop1co. En ocasiones es necesario

realizar nuevos cortes sobre bloques antiguos, según la demanda de coloracio -
nes adicionales.
La función tradicional de afilado de las cuchillas del micrótomo ha perdido
vigencia dentro del laboratorio a raíz de la introducción de los sistemas de corte
con cuchillas desechables. Sin embargo, cada vez ocupa más tiempo a los
técnicos la realización de secciones en criostato, tanto para la práctica de la
biopsia intraoperatoria como para estudios inmunohistoquímicos especiales.
Además de la ejecución de los cortes, el técnico tiene a su cargo la super -
visión y mantenimiento del instrumento, lo cual requiere el engrasado, descon -
gelación del criótomo y limpieza mensual.
2.6. Realización de las coloraciones
En principio, cada técnico debe teñir las preparaciones que realiza. Habitual -
mente, la tinción se realiza en la última parte de la jornada laboral, pero en el
caso de algunas coloraciones especiales que requieren mayor cantidad de tiem-
po el procedimiento puede aplazarse al día siguiente. El mantenimiento de una
buena reserva de reactivos facilita en gran medida esta fase del trabajo. Como
norma general, de todas las biopsias debe realizarse una coloración con hemato -
xilina -eosina. En determinadas muestras (riñón, hígado, piel, etc.), está determi-
nado por lo común el tipo y número de tinciones que debe realizarse .
2.7. Chequeo de temperaturas de los distintos instrumentos
La comprobación rutinaria de la temperatura de incubadoras, estufas, refrige -

radores y arcones congeladores que no dispongan de alarmas automáticas,
puede evitar graves pérdidas de tiempo y dinero. Normalmente el técnico las
revisa de forma indirecta, pero conviene hacerlo diaria y regladamente.
2.8. lavado del material de vidrio
Al acabar la jornada es necesario lavar todo el material sucio con agua

corriente y jabón, pues no se debe dejar toda la noche sin limpiar. La progresiva
introducción de máquinas automáticas ha simplificado esta tarea .
2.9. Archivo y control de los bloques y preparaciones histológicas
Con la finalidad de proteger los bloques de parafina de la oxidación, secado y

acción de vapores de sustancias volátiles generadas en el laboratorio, conviene
archivarlos todos los días. Existen archivadores especialmente diseñados para
ello. A fin de favorecer el orden y la futura recuperación , los bloques de parafina
de material de necropsias y las pirámides de microscopia electrónica se deben
almacenar en lugar aparte (fig. 2.2.A,B).
En lo que se refiere a las preparaciones histológicas, es imprescindible man -
B
A :· 1, 1• r· 1• • •• • rmr=-; r. ¡m-~
..... ·- ~' 1-
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1• 1• 1 ..• • a ¡ ...
i"' lll 1• lm
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---
Figura 2 .2. Archivadores modulares para almacenar: A) Portaobjetos. B)
Bloques de parafina .
tener un orden estricto, empleando para ello los modernos sistemas modulares
con capacidad para almacenar un gran volumen de portaobjetos en un mínimo
espacio.
2.10. Almacenamiento y control de los suministros
El personal técnico debe conocer exactamente el modo, lugar y temperatura

de almacenamiento adecuado para cada reactivo, y debe considerar esta tarea
como una de sus atribuciones. Asimismo, es responsable de renovar los produc -
tos caducados y en déficit.
3. NORMAS BASICAS PARA EL ENVIO DE BIOPSIAS

AL LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA
La norma que en teoría debiera presidir el envío de biopsias podría resumirse

diciendo que todas las muestras deben remitirse inmediatamente y en fresco
para proceder a su correcta fijación en el propio laboratorio. Sin embargo, la
demora habitual en el transporte y la propia dinámica del medio hospitalario
hacen impracticable esta posibilidad, salvo que se disponga de una conexión
centralizada de aspiración neumática con todos los quirófanos y consultas. Por
eso, la colocación de la mayor parte de las muestras en el correspondiente fijador
la realiza el personal auxiliar de enfermería del hospital bajo la supervisión del
médico correspondiente. Ello obliga a asesorar a todas estas personas acerca del
procedimiento más adecuado de fijación y conservación. Es aconsejable, pues,

elaborar un pequeño manual para uso interno que recoja toda la casuística
donde se encuentren recogidos todos los tipos de muestras y sus fijadores
idóneos.
En general, es posible clasificar los fijadores según el tipo de estudio solicita-
do y el tipo de sustancia que se quiere identificar. A continuación se exponen las
normas más elementales, si bien muchos de los conceptos aquí expuestos se
desarrollan en profundidad en otros capítulos.
1. Según el tipo de estudio:

- Muestra para estudio óptico rutinario: fijación en formalina al 1 O por 100,
en la proporción 1 :20 (veinte veces el volumen de la pieza). en el interior
de un frasco herméticamente cerrado e identificado mediante una etiqueta
donde conste la filiación del enfermo y el contenido.
- Muestra para un estudio intraoperatorio: remitir en fresco, cubierta con
una gasa empapada en suero fisiológico . En el laboratorio se fija y seccio -
na por congelación .
- Muestra para estudio inmunohistoquímico: remitir en fresco y congelar
con isopentano ( - 50 oc) en el propio laboratorio.
- Muestras para estudio ultraestructural : remitir fragmentos cuboidales de
tejido de 3 a 5 mm en glutaraldehído al 2,5 por 1 00 a 4 °C.
2. Según la sustancia que se vaya a preservar o identificar (véase tabla 2.1)
Tabla 2.1
Grasas neutras Glucógeno Enzimas Antígenos
Formaldehído Preserva Preserva Preserva Preserva *

Alcohol etílico Disuelve Precipita Preserva
Acetona Disuelve Mal fijador Preserva Preserva t
Sublimado Preserva Preserva Preserva t
Glutaraldehído Preserva Preserva Preserva
T. Osmio Fija
• Pobremente.
t Muy bien .
1
4. TRATAMIENTO DE LOS CORTES PREVIO A LA COLORACION
Por lo general, para que se produzca una correcta penetración de los colo -
rantes hay que extraer previamente el medio de inclusión sobre los cortes de
tejido incluido en parafina . Esto no siempre es necesario en los cortes infiltrados
con celoidina, que es permeable al agua. Tampoco es necesario en los cortes
criostáticos, salvo que hayan sido sometidos a algún tipo de f ijación particular
(acetona, alcohol-éter) : en tal caso puede ser conveniente rehidratar en aceto -
nas o alcoholes de gradaciones decrecientes.
La desparafinacíón se consigue sometiendo los cortes a tres baños consecu -
tivos de xileno de 1 O minutos de duración cada uno. Como este solvente no es
misc ible con el agua, debe ser eliminado en dos baños de etanol absoluto,
seguidos por una rehidratación en baños sucesivos de alcohol etílico a concen-
traciones decrecientes (96, 80, 70 y 40 por 1 00) de 1 - 2 minutos cada uno. Si
por la naturaleza de la técnica fuese preciso extraer la celoidina , ello se consigue
fácilmente con alcohol -éter al 50 por 100, para realizar luego la rehidratación
estándar.
Cuando la sustancia para demostrar es una macromolécula soluble en agua
(caso del glucógeno) , puede ser muy conveniente el colodionado de los por-
taobjetos para impedir que se d isuelva la sustancia hidrosoluble en el agua de
rehidratación o en la propia solución de colorante. Este procedimiento se basa
en la propiedad de membrana semipermeable que posee el colodión, que deja
pasa r el agua y moléculas pequeñas y retiene las de naturaleza proteica o
pol imérica .
PROCEDIMIENTO TECNICO
1. Llevar los cortes hasta etanol absoluto.

2. Tratar durante un minuto en solución de alcohol etílico-éter al 50 por 1 OO.
3. Cubrir el portaobjetos con una fina capa de la solución de:
- celoidina al 0.5 por 1OO.
- Alcohol absoluto 50 mi.
- Eter 50 mi.
Decantar el sobrenadante.
4. Dejar endurecer al aire hasta que la celoidina ya no se adhiera a los dedos.
5. Completar el endurecimiento en etanol al 70 por 1OO.
6. Lavar en agua destilada y completar la coloración .
5. TRATAMIENTO DE LOS CORTES TRAS LA COLORACION
Una vez completadas las manipulaciones que constituyen el proceso de

coloración tisular. normalmente los tejidos han de ser de nuevo deshidratados y
aclarados para conseguir la conservación definitiva de las preparaciones histoló -
gicas y facilitar su observación microscópica . La deshidratación se realiza a
través de baños sucesivos de alcohol etílico de creciente gradación (70, 80, 96 y
100 por 100) .
El aclaramiento de las preparaciones les confiere una refringencia homogé-
nea al realizar la sustitución del agente deshidratante por un líquido anhidro de
elevada refringencia (habitualmente un derivado del benceno). Puede realizarse
con cualquier agente aclarante de los empleados para la inclusión (véase capítu -
lo 5) ; en la práctica se usan de forma casi general tres baños consecutivos de
xileno de un minuto de duración cada uno, debido sobre todo a su baja volatili -
dad y a su menor coste. Si las preparaciones han sido teñidas con colo-
rantes de anilina. el aclaramiento en xileno está contraindicado, pues
produce la solubilización del colorante. De igual forma , los agentes aclarantes y
deshidratantes convencionales pueden modificar numerosos procedimientos de
coloración : este fenómeno se detalla explícitamente en todos los métodos reco -
gidos en este manual. Por último, si la deshidratación no se realiza de forma

completa, el aclaramiento también es deficiente y aparecen opalescencias en la
preparación final.
Para facilitar el manejo y transporte de las secciones de un baño a otro suelen
utilizarse contenedores especiales para múltiples preparaciones: cubetas vertica-
les provistas de hendiduras laterales para alojar cada preparación sin que se
adhieran unas a otras (jarra de Coplin - fig . 2.3A- ), o unas cestillas de vidrio
que se introducen en cubetas de igual tamaño (cristalizador de Schiefferdecker
- fig . 2.38- ) y que se disponen contiguamente para configurar las denomina-
das baterías de tinción . La batería más clásica es la de hematoxilina-eosina,
donde en primer lugar se disponen las cubetas para la desparafinación, seguidas
de las de hidratación en alcoholes decrecientes, la de tinción con el colorante
básico de hematoxilina, las de lavados de diferenciación, la de coloración con el
colorante citoplasmático (eosina) y las de los baños de deshidratación y aclara-
miento (fig . 2.4) .
Para las coloraciones más rutinarias existen actualmente teñidores automáti-
cos cuyo funcionamiento es equivalente al de los procesadores automáticos de
inclusión (véase capítulo 5) .
Una vez realizado el aclaramiento de las preparaciones, ha de procederse a su
montaje definitivo. Para ello hay que interponer, entre el portaobjetos y el
cubreobjetos de tamaño equivalente al de la sección, un medio de montaje que
evite el contacto de la preparación con el aire ambiental. En función de que haya
sido posible o no realizar la deshidratación y aclaramiento estándar, debe optar -
se por el medio de montaje cuyo índice de refracción esté más próximo
Figura 2.3. Distintos contenedores de vidrio para transporte y manejo

simultáneo de múltiples secciones histológicas: A) Jarra de Coplin . B) Cris-
talizador de Schiefferdecker y cestilla de vidrio .
al del líquido que impregne el corte (por lo común, xileno o agua, en el

caso de preparaciones no deshidratadas) .
Para el montaje de preparaciones deshidratadas venían empleándose resinas
vegetales como el bálsamo del Canadá . En la actualidad todas ellas han sido
sustituidas por pegamentos sintéticos en solución suministrados comercial-
mente, que por evaporación del solvente solidifican de forma rápida y proporcio-
nan un soporte idóneo para los tejidos. En el caso de preparaciones hidratadas,
los clásicos jarabes artesanales de glicerina o goma arábiga han sido también
sustituidos por soluciones comerciales de mayor estabilidad y duración, que en
algún caso alcanza incluso varios años sin necesidad de sellar los bordes del
cubreobjetos con parafina .
Medio de montaje glicerado de Kaiser

- Gelatina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O g
- Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 ml
- Glicerol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 ml
.- Fenol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.25 g
Disolver la gelatina en agua destilada a 37 y añadir los restantes compo - oc

nentes. Dejar solidificar y calentar levemente para su uso.
Medio de montaje de Apathy

- Goma arábiga cristalizada . . . . . . . . . . . . . . . . ... ............ 50 g
- Sacarosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... ............ 50 g
- Agua destilada ................. . . . . . . .. . .. . ........... 100 ml
- Timol ............ . .. . ................ ... ........ . ... 100 mg
Disolver con agitación continua y calor suave.

Durante el proceso de montaje de las preparaciones es esencial evitar la
formación de burbujas aéreas entre el portaobjetos y el cubreobjetos .
Para ello, y tras colocar una o dos gotas del medio de montaje sobre el cubreob-
Figura 2.4. Batería de cristalizadores de Shiefferdecker para tinción con

Papanicolaou
jetos invertido, se sitúa este último sobre el tejido y se deja difundir el medio de
montaje por capilaridad, colocando la preparación sobre uno de sus bordes
mayores y presionando levemente con una aguja de histología. Pese a la rapidez
de solidificación de los actuales medios de montaje, las preparaciones deben
manejarse con suma precaución durante las primeras horas para evitar artefactos
y la adherencia de unas con otras.
Una vez efectuada la coloración, si se ha realizado el colodionado de los
portaobjetos puede ser aconsejable eliminar la capa de celoidina que tapiza el
corte, para lo cual se procede a:
1. Deshidratar hasta etanol absoluto .

2. Tratar con etanol-éter al 50 por 1 00 hasta que la celoidina se disuelva
completamente.
3. Colocar en etanol absoluto durante 1 minuto.
4. Aclarar y montar.
CAPITULO 3
Fundamentos del proceso
de fijación tisular
GUION DE CONTENIDOS
1. INTRODUCCION
2. FIJACION TISULAR
3. PRINCIPIOS GENERALES DE LA FIJACION
4. T\POS DE F\JAC\ON
5. CLASES DE AGENTES FIJADORES SEGUN SU
MECANISMO DE ACTUACION
6. CARACTERISTICAS FUNDAMENTALES QUE DEBE POSEER
EL LIQUIDO FIJADOR IDEAL
7. REGLAS GENERALES A CONSIDERAR EN EL EMPLEO
DE LIQUIDOS FIJADORES
8. LAVADO POSTFIJACION
9. LIQUIDOS FIJADORES SIMPLES
9 .1 . Fijadores por deshidratación tisular
9.2. Fijadores por cambios en el estado coloidal de las
proteínas
9.3. Fijadores que actúan por formación de sales
con los tejidos
9.4. Fijadores que actúan por reticularización de las
proteínas
10. MEZCLAS FIJADORAS
10.1. Mezclas que contienen formol.
1 0.2. Mezclas que no contienen formol.
11. FIJACION EN MICROSCOPIA ELECTRONICA
28 LABORATORIO DE ANATOMIA PATO LOG ICA
1. INTRODUCCION
Si consideramos la vida como el proceso dinámico por el que los organismos

completan su ciclo biológico, la muerte es el nivel metabólico a partir del cual las
células que componen esos organismos no son capaces de recuperar las funcio-
nes vitales que les son propias.
Dentro de los fenómenos degradativos que llevan a la completa destrucción
del soporte material de los seres vivos, deben distinguirse dos fenómenos con-
ceptualmente diferentes, aunque estrechamente relacionados entre sí: autólisis y
putrefacción .
Autólisis es el proceso por el cual, después de la muerte, se produce la
autod igestión enzimática celular, tras la salida del contenido lisosómico al cito -
plasma por rotura de la membrana delimitante de estos orgánulos. Se denomina
putrefacción al efecto ejercido por determinadas toxinas y enzimas bacterianas
sobre los tejidos. Los microorganismos que originan esta acción son de carácter
saprófito y complementan el efecto lítico de la autólisis hasta conseguir la total
destrucción celular.
Sobre la autólisis y la putrefacción influyen diversos factores que dependen,
por una parte, de la localización y naturaleza del tejido considerado y, por otra,
de la temperatura existente en el medio donde se encuentra el tejido. Así. los
tejidos ricos en enzimas digestivas, como el páncreas, o que fisiológicamente
contienen gran cantidad de gérmenes, como el intestino, sufren estos fenóme -
nos con mayor intensidad . De igual forma , a mayor temperatura ambiente, mayor
velocidad de autólisis y putrefacción, ya que la temperatura óptima para la
actividad enzimática y bacteriana oscila entre 37 y 42 °C.
2. FIJACION TISULAR
Consiste en interrumpir los procesos de degradación que aparecen tras la

muerte celular, tratando de conservar la arquitectura y composición tisular lo
más próxima posible a como se encontraba en el organismo vivo . En otras
palabras: si tomamos el proceso vida-muerte -degradación orgánica como una
secuencia cinematográfica, la fijación en un momento determinado del proceso
proporciona una imagen estática de este proceso que debe incluir los fotogra-
mas más próximos al instante de la muerte y, por tanto, al estado vital de los
tejidos.
De estas consideraciones sobre el proceso de muerte celular y de fijación
hística surgen los conceptos de imagen histológica real y equivalente.
Se denomina imagen real de un tejido a la que mostraría ese tejido cuando
aún se encontraba vivo. Por su carácter dinámico, esta imagen es inalcanzable
tras el proceso de fijación.
Imagen equivalente es la obtenida después de la manipulación histológica
de los tejidos, manipulación que comprende fijación , inclusión, corte y colora -
ción (fig. 3.1 A, véase páginas en color) . Dentro de este complejo procesamien -
to, la fijación es la etapa más esencial y, lamentablemente, también la más des-
cu idada. No debe olvidarse que en histotecnología cualquier defecto o error
siempre puede ser subsanado, a excepción precisamente de los cometidos du -
rante el proceso de fijación tisular.
FUNDAMEN T-eS DEL PROCESO DE FIJACION TISULAR 29
Como es evidente, el objetivo fundamental de la técnica histológica es con -

seguir la mayor similitud posible entre imagen real y equivalente. Esta última
debe cumplir dos condiciones fundamentales para poder ser considerada como
tal :
1. La propiedad denominada constancia : la imagen equivalente ha de ob-
servarse en todos los tejidos idénticos obtenidos de distintos individuos
de una misma especie animal.
2. Su reproductibilidad en todas las preparaciones histológicas obtenidas a
partir de dichos tejidos, independientemente del proceso de fijación
empleado.
Las imágenes que no cumplen los requisitos de constancia y reproductibili-
dad deben considerarse artefactos inducidos a lo largo del procesamiento histo-
lógico y cambian de una preparación a otra .
Desde el punto de vista de la fijación , los artefactos más notables son
desgarros y retracciones, provocados por el distinto grado de retracción que
ocurre entre las diferentes partes de un tejido al someterlo a la acción de un
agente fijador (fig . 3.1 B, véase páginas en color) . Por lo común , estos cambios
se relacionan sobre todo con la distinta proporción de agua que albergan los
tejidos, y resultan potenciados por las notables diferencias que existen entre la
presión osmótica del fijador y la de los tejidos.
Un ejemplo ilustrativo de todo lo señalado hasta aquí es la enorme discusión
que existió durante tres siglos sobre la existencia o no de los llamados espacios
de Grunhagen-Mingazzini en el polo apical de las vellosidades intestinales: hoy
conocemos su origen artefactual por retracción secundaria al proceso de f i-
jación .
3. PRINCIPIOS GENERALES DE LA FIJACION
Se pueden resumir en cuatro postulados fundamentales :

1. No existe un método universal de fijación o, lo que es igual, un agente
fijador adecuado para un tejido, puede no serlo para otro.
2. No todos los fijadores conservan indefinidamente el tejido, ya que fija -
ción no equivale a conservación tisular. Este error surge de que la forma -
lina, el fijador más utilizado, es al mismo tiempo un gran conservante.
3. Como ya se ha mencionado, un defecto de fijación jamás puede ser
corregido.
4. Es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con graves
defectos de fijación .
4. TIPOS DE FIJACION
En función de las características del estudio microscópico que se vaya a

realizar, se distinguen dos tipos de fijación tisular: a) fijación histológica o
citológica, que pretende principalmente la conservación de la arquitectura y
estructura de los tejidos y células, sin considerar los cambios moleculares indu -
cidos sobre sus componentes bioquímicos, y b) fijación histoquímica, para la
cual es más trascendente preservar la composición molecular y bioquímica de

los tejidos que conservar los propios detalles morfológicos celulares. En este
último caso es posible realizar estudios microscópicos que incluyen datos sobre
el funcionalismo tisular (histoautorradiografía, histoquímica enzimática, etc.) y
su composición antigénica (inmunohistoquímica).
En lo que respecta a las fases del proceso de fijación , debe distinguirse la
fijación inicial o primaria, que es la realizada de forma inmediata sobre el
tejido fresco, de la fijación secundaria o refijación, que consiste en colocar
un tejido ya fijado en un segundo fijador para demostrar algún componente
tisular específico o simplemente para intensificar la fijación inicial.
5. CLASES DE AGENTES FIJADORES SEGUN SU MECANISMO

DE ACTUACION
Genéricamente, los agentes fijadores se clasifican, según su mecanismo de

actuación, en dos grupos: fijadores por métodos físicos y fijadores por
métodos químicos. En el primer caso se emplea el enfriamiento por congela-
ción del tejido como método para detener la autólisis y putrefacción tisular. En el
segundo, los agentes fijadores, generalmente en forma líquida, actúan desnatu-
ralizando e insolubilizando las proteínas tisulares, lo cual bloquea la autólisis por
inactivación enzimática . Además, algunos de estos líquidos fijadores impiden el
crecimiento bacteriano.
La fijación por métodos físicos es el método de elección para realizar estu -
dios morfológicos o funcionales en los que se requiera conservar intacta la
estructura antigénica del tejido o su contenido enzimático. La clave de una
correcta fijación por congelación del tejido radica en que su realización sea
instantánea: un enfriamiento lento provoca la formación de microcristales intrati -
sulares de hielo susceptibles de agregarse con el paso del tiempo y de producir
rotura y dislaceración tisulares que pueden dificultar el diagnóstico. Por todo
ello, el enfriamiento de los tejidos en congeladores, por muy potentes que sean,
o en criostatos en el curso de la biopsia intraoperatoria, debe evitarse salvo que
el estudio en congelac ión, y por tanto las secciones de tejido, se realice de
inmediato.
La congelación por inmersión directa del tejido en nitrógeno líquido tampoco
es un procedimiento aconsejable para estudios que requieran el empleo de
secciones criostáticas de tejido, ya que éste se torna quebradizo en exceso y,
además, la manipulación continua del nitrógeno líquido es engorrosa.
El procedimiento idóneo para fijar tejidos por congelación consiste en utilizar
isopentano a -50 oc como agente de congelación y realizar una fragmenta-
ción suficiente de la muestra que se vaya a congelar (comúnmente bloques de
no más de 3 cm 2 de superficie y 3 mm de espesor), de modo que el proceso de
congelación instantánea por inmersión no requiera más de 1 O segundos. De esta
manera se evita la formación de cristales de hielo en el interior del tejido y es
posible conservar la muestra indefin idamente, demorando cuanto se quiera la
realización de los cortes criostáticos. El mantenimiento continuo de isopentano
debe realizarse en un congelador programado a -70 °C, para que quede com -
pensada la subida inmediata de la temperatura que se produce al extraer el
líquido del congelador.
FUNDAMENTOS DEL PROCESO DE FIJACION TISULAR 31
Además del procedimiento de congelación instantánea anteriormente descri-

to, existen dos métodos complejos de fijación (criodesecación y criosustitución)
que utilizan agentes físicos, entre ellos el frío, para provocar la estabilización
tisular.
La criodesecación o liofilización consiste en someter el tejido a dos
manipulaciones complementarias de carácter físico : fijación instantánea por
congelación en nitrógeno líquido y desecación por sublimación directa del agua
congelada a vapor en una bomba de vacío. Este procedimiento es compl icado y
requiere un utillaje costoso (la cámara de liofilización) . Sin embargo, posee
múltiples ventajas sobre los métodos de fijación mediante agentes químicos,
fundamentalmente porque al eliminar por completo el agua tisular garantiza la
detención de la autólisis y una conservación indefinida, y al mismo tiempo evita
la inducción de nuevos enlaces químicos entre el tejido y el fijador, conserván-
dose en su integridad la estructura antigénica tisular. Este método se recomienda
principalmente para la fijación y conservación de sustancias difusibles intratisu-
lares.
La criosustitución se fundamenta en la sustitución lenta y progresiva del
agua congelada de un tejido por un líquido fijador que en ocasiones puede
actuar simultáneamente como medio de inclusión. Para ello, y tras la congela-
ción instantánea del tejido con nitrógeno líquido o isopentano a -50 oc, se
coloca el tejido congelado en el medio de sustitución . Generalmente este medio
está formado por una mezcla de alcohol etílico, acetona y propilenglicol como
agente hidrosoluble de inclusión, enfriado a - 40 oc. El intercambio del agua
tisular por el líquido de sustitución se realiza en condiciones de congelación
tisular y, por tanto, dentro de un congelador; debe procurarse que la temperatura
del congelador no descienda por debajo del punto de congelación del líquido de
sustitución.
A continuación se detallan las características más relevantes de los fijadores
por métodos químicos.
6. CARACTERISTICAS FUNDAMENTALES QUE DEBE

POSEER EL LIQUIDO FIJADOR IDEAL
1. Capacidad para bloquear de inmediato la autólisis: cuanto mayor

sea esta capacidad, mejor será el agente fijador. Este efecto del fijador
depende principalmente de su poder para producir la desnaturalización o
floculación proteica, de forma que la actividad enzimática del tejido
quede paralizada.
2. Efecto microbicida, que impide la acción bacteriana desencadenante
de la putrefacción .
3. No provocar sobre el tejido retracciones o distorsiones que determ inen
anomalías en su arquitectura.
4. Inducción de cambios en la textura y composición tisular que
favorezcan la inclusión, corte y coloración del material histológico.
La primera cualidad se relaciona fundamentalmente con la velocidad de
penetración y de fijación que posea el agente fijador.
Se denomina velocidad de penetración a la rapidez con la que un fijador
se difunde en el interior de un tejido. Esta propiedad depende de las cualidades

físicas de cada agente f ijador, y condiciona en gran medida el proceso de
fijación . Así, el tamaño de la pieza que se ha de fijar deberá ser directamente
proporcional a la velocidad de penetración del fijador. Hay que tener en cuenta
que aunque en la superficie la fijación sea muy rápida, el fijador no llega al
interior de la pieza hasta algún tiempo después de iniciada la autólisis, lo que
puede hacer imposible el diagnóstico histológico en piezas de gran tamaño.
La velocidad de penetración de los distintos fijadores es muy variable: la
mayor es la de los alcoholes y la acetona; la de los fijadores más utilizados en .el
procesamiento habitual de los tejidos oscila entre los 0.9 mm/hora de la formali-
na y los 0 .3 mm/hora del ácido pícrico y el sublimado.
La velocidad de fijación de un agente químico no está siempre en concor -
dancia con su velocidad de penetración : la formalina , por ejemplo, es un fijador
que penetra con relativa rapidez en el tejido y, sin embargo, lo fija con cierta
lentitud . Ello se explica porque el proceso de fijación es un fenómeno químico
determinado por el tiempo que cada fijador tarda en precipitar y estabilizar los
componentes químicos de los tejidos.
La capacidad de un fijador para pr~vocar fenómenos de retracción o distor-
sión tisular depende principalmente de los cambios inducidos sobre la presión
osmótica de los tejidos. En condiciones normales, la presión osmótica de los
tej idos es de 300 miliosmoles y se relaciona directamente con su contenido en
sales y proteínas. Por este motivo, cuando se somete un tejido a la acción de un
fijador y la presión osmótica de ambos no es coincidente, se establece un flujo
de agua entre el fijador y el tejido en función de un fenómeno de osmosis, hasta
que las dos presiones se equilibran. Si la presión del tejido es superior a la del
fijador, el agua es arrastrada hacia el interior del tejido, produciéndose su hin -
chamiento. En el caso contrario, el agua fluye hacia el fijador y ocurre una
retracción tisular.
La inducción sobre el tejido de efectos potenciadores de la coloración, o que
favorezcan su inclusión y corte en el microtomo, depende sobre todo de su
capacidad para provocar desnaturalización proteica que determine el endureci-
miento óptimo. Depende también del llamado efecto mordiente de los fijadores,
por el cual, y a través de mecanismos muy diversos, se produce un incremento
de la tinción provocada por un colorante determ inado. A causa de este último
efecto, para cada técnica de coloración se seleccionan unos fijadores de prefe -
rencia .
Como puede deducirse de todo lo expuesto, no existe un fijador ideal, o lo
que es lo mismo, todos los agentes fijadores actualmente disponibles ofrecen
ventajas e inconvenientes que los harán indicados para distintos tipos de mues-
tras y estudios.
7. REGLAS GENERALES A CONSIDERAR EN EL EMPLEO

DE LIOUIDOS FIJADORES
1. Para evitar la autólisis, el tejido debe ser colocado lo más rápidamente

posible en el líquido fijador.
2. El tejido debe estar seccionado en láminas de 0.5 mm de espesor máxi-
mo. Si fuere preciso fijar un órgano en bloque, porque se necesite preser-
var la arquitectura del órgano o porque la fijación vaya a ser realizada por
persona no habituada al estudio macroscópico de las lesiones, se deben
realizar incisiones sobre su superficie y apertura de las cavidades internas
a fin de que el líquido fijador alcance lo más rápidamente posible el
interior del tejido.
3. El volumen necesario de fijador está determinado por el del tejido que se
va a fijar. La relación entre el volumen de fijador y el de la pieza debe ser
de 20 a 1.
4. La presión osmótica del líquido fijador y la del tejido serán equivalentes;
si es necesario debe compensarse la del primero utilizando soluciones
salinas como agente de disolución.
5. El pH del líquido fijador debe aproximarse al pH fisiológico, salvo que su
composición deba contener ácidos.
6. El tiempo de fijación es específico para cada fijador, pero existe un
tiempo máximo de fijación que no debe ser sobrepasado.
8. LAVADO POSFIJACION
Es el aclarado que se realiza después del proceso de fijación para eliminar los
residuos del agente fijador. Por lo común, responde a algunos de los objetivos
siguientes: a) limitar el tiempo de contacto entre el fijador y el tejido, o b)
impedir el contacto del fijador con los medios de inclusión utilizados para
proseguir el tratamiento de la muestra (en este último caso, porque exista
incompatibilidad química entre ambos).
9. LIQUIDOS FIJADORES SIMPLES
Para el análisis de los líquidos fijadores simples que se utilizan independien-

temente como tales o formando parte de las llamadas mezclas fijadoras, se
agruparán éstos en cuatro apartados, según el mecanismo fundamental de ac-
tuación sobre los tejidos.
9.1. Fijadores por deshidratación tisular
Por ser sustancias altamente higroscópicas, actúan eliminando tanto el agua

libre como el agua ligada a las moléculas proteicas, de forma que estas últimas
precipitan a través de un proceso equivalente al de floculación de los coloides.
Este cambio proteico es conocido con el nombre de desnaturalización, y
provoca importantes alteraciones en la organización y en la estructura celular y
tisular. Por tanto, estos agentes fijadores inducen grandes cambios en la morfo-
logía orgánica, sobre todo si se emplean como agentes fijadores aislados. Sin
embargo, algunos alteran muy poco la estructura antigénica tisular (por ejemplo
la acetona). Ello se debe a que gran parte de los fenómenos inducidos por la
floculación proteica son reversibles tras la rehidratación tisular.
El fundamento molecular de la acción deshidratante de los alcoholes y la
acetona estriba en la competición que entablan con las proteínas por las molé-
culas de agua cuando se encuentran en solución concentrada . El fenómeno se

debe a que las mencionadas sustancias higroscópicas tienden a estabilizarse
molecularmente cuando fcrman puentes de hidrógeno utilizando los iones dipo-
lares del agua sustraída a las proteínas.
Estos agentes fijadores ejercen sobre las grasas una disolución parcial, y
sobre los hidratos de carbono, una conservación completa, ya que estas últimas
sustancias son insolubles en ellos. Sin embargo, por la rápida salida de agua
intracelular que provocan es frecuente que aparezca un endurecimiento tisular
excesivo, que incluso puede llegar a comprometer el corte en micrótomo, así
como fenómenos de desplazamiento y arrastre de sustancias, sobre todo glucó-
geno, que alteran gravemente su distribución intracelular.
Los principales agentes fijadores por deshidratación son los alcoholes,
esencialmente el metílico y el etílico, la acetona y el cloroformo. Los únicos
que se utilizan como fijadores simples son el alcohol etílico y la acetona. El
alcohol metílico se emplea exclusivamente para la fijación de extensiones hema-
tológicas, y el cloroformo, formando parte de mezclas fijadoras y sobre todo
como líquido intermediario durante la inclusión en parafina, por lo que se
estudiará más adelante.
ALCOHOL ETILICO (CH 3 -CH 2 0H)

Es un líquido transparente, inflamable, muy volátil y de olor agradable. En el
comercio se puede encontrar puro (llamado absoluto o de 1 00°), en cuyo caso
tiene fuertes gravámenes tributarios para evitar su utilización clandestina en la
fabricación de bebidas alcohólicas, o desnaturalizado diluido al 90 o 70 por 1 OO.
Preparación: como fijador único: tomar 70-90 mL de alcohol y llevar hasta
100 mL con agua destilada.
Preserva el glucógeno y la actividad de ciertas enzimas tisulares, fija los
pigmentos y se emplea en las extensiones citológicas. Por alterar escasamente la
estructura antigénica de los tejidos, es un buen agente fijador para inmunohisto-
química.
Ventajas:
1. Fija y deshidrata el tejido al mismo tiempo.
2. Posee una gran velocidad de penetración.
3. Precipita muy rápidamente las proteínas y el glucógeno, lo cual,
unido a la anterior propiedad, acorta extraordinariamente el tiempo de
fijación .
4. Es un notable agente bactericida y, por tanto, buen conservante.
Inconvenientes:
1. Es un fuerte reductor, y por consiguiente incompatible con fijadores
oxidantes como el dicromato potásico y el tetróxido de osmio.
2. No fija adecuadamente la cromatina, pues disuelve los ácidos nu-
cleicos. Asimismo, extrae parcialmente los lípidos.
3. Endurece y contrae excesivamente los tejidos.
4. A medida que realiza la fijación , se va diluyendo al incorporar el agua
que extrae de los tejidos, por lo cual pierde actividad progresivamente.
5. Prepara mal la tinción porque carece de efecto mordiente.

6. Suele dar origen a fenómenos de desplazamiento de sustancia·s .
ACETONA (CH 3 -CO-CH 3 )

Es un líquido transparente, inflamable, muy volátil y de olor dulzón . Su uso
como fijador simple está prácticamente limitado a los métodos histoquímicos e
inmunoquímicos, ya que preserva muy exactamente la estructura antigénica y la
actividad enzimática de éstos.
Preparación: se emplea generalmente sin diluir, a 4 oc.
Inconvenientes:
1. Provoca una gran contracción tisular y, por tanto, graves artefactos
que suelen hacer inútil su empleo en microscopia óptica convencional.
2. Debido a su rapidez de acción y a su capacidad de endurecimiento, es
imprescindible controlar el tiempo de fijación , que nunca debe
superar las 2 horas.
3. A temperaturas superiores a - 40 oc disuelve las grasas, a excepción
de algunos lípidos complejos como los fosfolípidos y los galactolípidos.
9.2. Fijadores por cambios en el estado coloidal de las proteínas
Las proteínas son moléculas anfóteras cuyo punto isoeléctrico global se

encuentra en torno a un pH de 5.8. En este punto, la estabilidad de las moléculas
es mínima, y su disociación máxima . La escasa estabilidad molecular se debe a
que las proteínas en este punto se desprenden del agua ligada o endógena
porque no mantienen la disociación electrostática que fija los iones dipolares del
agua a su estructura molecular.
Por este motivo, las soluciones coloidales precipitan en presencia de deter-
mi nados ácidos que disminuyen el pH de la disolución hasta alcanzar el punto
isoeléctrico de las moléculas en disolución coloidal.
Todos los fijadores contemplados en este grupo son de carácter ácido, se
emplean formando parte de mezclas fijadoras y poseen una gran velocidad de
penetración en los tejidos y algún poder de decalcificación .
ACIDO ACETJCO (CH 3 -COOH)

Es un líquido transparente y de fuerte olor avinagrado. En estado puro re~ibe
la denominación de ácido acético glacial. Cuando la temperatura ambiente
desciende por debajo de los 1 O oc, tiende a solidificarse en forma de agujas
cristalizadas muy cáusticas.
Preparación: se utiliza diluido en concentraciones entre el 1 y el 5 por 100
y formando parte de mezclas fijadoras o soluciones decalcificantes.
Ventajas:
1. Es el fijador ideal para nucleoproteínas y ácidos nucleicos.
2. Al precipitar las proteínas sin sustraer el agua de los tejidos (no es
higroscópico), produce en ellos un cierto edema intersticial que com -

pensa la excesiva retracción causada por otros agentes fijadores.
Inconvenientes:
1. Es un mal fijador de membranas y citoplasma celulares.
2. Destruye las mitocondrias.
ACIDO TRICLOROACETICO (CI 3 C-COOH):

Se encuentra en forma de cristales incoloros solubles muy cáusticos.
Preparación: se emplea en disolución, en concentraciones entre el 2.5 y el
5 por 1 OO.
Ventajas:
1. Es un excelente medio de decalcificación.
2. Fija muy adecuadamente todo tipo de estructuras nerviosas.
Inconvenientes:
1. Disuelve las nucleoproteínas y ácidos nucleicos.
2. Produce un hinchamiento excesivo de los tejidos que provoca nu -
merosos artefactos tras la deshidratación previa a la inclusión en parafi -
na.
ACIDO CROMICO (H 2 Cr0 4 ):

Preparación: se obtiene por disolución de cristales de anhídrido crómico en
agua . Se emplea en disoluciones al 2 por 1 00 formando parte de mezclas
fijadoras.
Ventajas:
1. Es un excelente fijador estructural.
2. Por ser un fuerte agente oxidante, actúa como mordiente en tinciones
que emplean colorantes básicos.
Inconvenientes:
1. Es incompatible con fijadores reductores como el formol y los alco-
holes.
2. Posee una escasa velocidad de penetración.
3. Impregna de una coloración verdosa los tejidos, por lo que hay que
lavarlos abundantemente en agua destilada tras usar este ácido.
9.3. Fijadores que actúan por formación de sales con los tejidos
En estos casos el agente fijador es un catión metálico, fundamentalmente

cromo o mercurio, o un derivado orgánico como el ácido pícrico, susceptibles de
formar con los tejidos proteinatos metálicos o picratos. Por lo general, todos los
agentes de este grupo poseen una gran velocidad de fijación , ya que la forma-
ción de la sal se produce instantáneamente. Sin embargo, un efecto barrera se
origina al actuar los proteinatos formados en superficie como obstáculo mecáni-
co, dificultando la penetración del fijador. La precipitación metálica sobre el
tejido provoca además un notable endurecimiento, lo que obliga a emplearlo en
mezclas fijadoras que amortigüen este efecto.
CLORURO MERCURICO O SUBLIMADO (HgCI 2 )

En el comercio se encuentra en forma de un polvo blanquecino muy tóxico.
El efecto fijador se consigue por la combinación de los iones de mercurio
(Hg + +) con los grupos ácidos de las proteínas, especialmente con los de
carácter carboxílico (-COOH), hidroxilo (- OH), sulfhidrilo (-SH) y residuos
fosfóricos de las nucleoproteínas.
Preparación: se utiliza en solución acuosa saturada.
Ventajas:
Además de las generales ya expuestas:
1. Es un excelente fijador de los caracteres morfológicos celulares,
y el de elección para patologías hematopoyéticas y renales, en las que el
diagnóstico se apoya usualmente en la observación de finos detalles
nucleares y citoplásmicos.
2. Es un excelente mordiente, ya que los puentes de hidrógeno intramo-
leculares de las proteínas quedan preservados tras la fijación y pueden
reaccionar luego con los colorantes. Por este motivo produce una inten -
sa y brillante coloración nuclear y citoplásmica.
Inconvenientes:
1. No es un buen bactericida .
2. Por su escasa capacidad de penetración requiere un fraccionamiento
muy cuidadoso del tejido (no más de 5 mm de espesor) .
3. Si se prolonga demasiado su tiempo de actuación, contrae y endurece
los tejidos hasta dificultar notablemente su seccionamiento en el micró-
tomo . Por ello, jamás deben sobrepasarse las 4 horas de fijación .
Tras haber cumplido ésta, y como paso previo a la inclusión, los tejidos
pueden conservarse indefinidamente en alcohol etílico al 70 por 1 OO.
4. Da origen a precipitados metálicos de color pardo sobre los tejidos,
lo cual dificulta su observación microscópica .
Estos precipitados pueden eliminarse mediante un tratamiento del
tejido previo a la coloración con soluciones alcohólicas yodadas seme -
jantes al lugol (véase «Soluciones para deszenkerizar los tejidos» bajo el
epígrafe «Mezclas fijadoras que contienen sublimado mercúrico»).
5. Por la intensa eosinofilia citoplásmica que provoca, puede dificultar el
reconocimiento de las zonas de necrosis tisular.
DICROMATO POTASICO (K 2 Cr 2 0 7
)
Es un polvo rojo amarillento de gran poder oxidante, que reacciona con las
proteínas para formar cromatos.
Preparación: se utiliza en dilución acuosa entre el 1 y el 2 por 1 00 y

formando parte de mezclas fijadoras en las que el ion cromo tiende a formar
complejos con el agua. A su vez estos grupos constituyen quelatos con las
proteínas al reaccionar con los grupos amines y carboxilos de éstas. El pH
óptimo de actuación para este fijador se sitúa por debajo de 4.4; con pHs
superiores están disociados la mayor parte de los grupos carboxilos existentes,
de forma que la reacción ocurre prioritariamente sobre ellos incrementándose
la proporción relativa de grupos básicos de las proteínas y, por ende, su aci-
dofilia .
Ventajas:
1. Posee un fuerte efecto mordiente al oxidar los grupos alcohólicos de

las grasas y polisacáridos a aldehídos, y por incrementar la basofilia de
las proteínas cuando se emplea a pH fuertemente ácido. Debido a este
efecto, es aconsejable emplearlo en mezclas para amortiguar la intensa
eosinofilia citoplasmática que provocan otros fijadores (por ejemplo, el
sublimado) .
2. Es un excelente fijador para los lípidos complejos y, por lo tanto,
para la mielina, las mitocondrias y el aparato de Golgi, que los contienen
en abundancia .
3. Su utilización es indispensable para demostrar la reacción croma-
fío v realizar las técnicas de Golgi para impregnación argéntica de
las células del sistema nervioso central.
Inconvenientes:
1. Por ser un fuerte oxidante es incompatible con agentes reductores

como alcoholes v formaldehído.
2. Posee una baja velocidad de penetración v endurece escasa-
mente los tejidos, lo que puede dificultar la microtomía ulterior.
3. Provoca artefactos tisulares como aparición de vacuolas citoplasmá -
ticas, retracciones y cambios en la morfología nuclear.
4. En soluciones no acidificadas el dicromato disuelve la cromati-
na, por lo cual los cromosomas se hacen imperceptibles. Por ello es
necesario asociarlo con el ácido acético o tricloroacético dentro de mez-
clas fijadoras.
5. Después de su fijación, los tejidos han de ser lavados abundante-
mente en solución salina o tamponada para evitar el depósito de
pigmento verde tras reducirse el trióxido crómico (Cr0 3 ) a óxido crómico
(Cr 2 0 3 ), en el curso de la inclusión o coloración tisular.
ACIDO PICRICO
Es el 2,4,6 -trinitrofenol. En el comercio se encuentra en forma de agujas

cristalizadas de color amarillo, muy tóxicas y de carácter explosivo. Actúa coa-
gulando las proteínas a través de la formación de picratos, que les confieren gran
apetencia por los colorantes ácidos.
Preparación: se utiliza en solución saturada al 2 por 1 OO.
OH
0 2 N~,.... . N0 2
V N0 2
Ventajas:
1. Es un excelente fijador estructural que conserva muy adecuada -

mente la composición proteica de los tejidos.
2. Controlando adecuadamente el tiempo de fijación , produce una óptima
contracción de los tejidos que favorece su procesamiento histológi-
co.
3. Aunque de penetración algo lenta, posee muy buena velocidad de
fijación .
4. No disuelve el glucógeno ni los lípidos, y por ello es el fijador de
elección para estas sustancias.
5. Posee una leve acción decalcificante, por lo cual puede emplearse
como fijador para las muestras de tejido óseo.
6. Se maneja fácilmente en soluciones debido a la gran estabilidad de
éstas como reservas.
Inconvenientes:
1. En estado puro, el ácido pícrico es explosivo si se somete a la acción

del calor. Por ello debe mantenerse alejado de fuentes de calor (fuego o
estufas). Tampoco deben dejarse evaporar sus disoluciones, para evitar
la formación de precipitados.
2. Si se prolonga el tiempo óptimo de fijación (4 a 18 horas según el
tamaño de la pieza), aparecen inconvenientes derivados de la excesiva
retracción tisular (sobre todo si la pieza ha sido inadecuadamente lavada
en agua, y luego deshidratada) y de la disolución que provoca este
fijador sobre los precipitados cálcicos y la hemosiderina .
3. No puede ser utilizado para fijar ciertos tejidos porque los hace frágiles y
quebradizos, dificultando el ulterior corte de éstos.
4. Además de teñir los tejidos de color amarillo, el ácido pícrico, si no es
completamente eliminado antes de la inclusión en parafina, provoca un
continuo deterioro de la estructura tisular que puede hacer imposible su
estudio histopatológico algunas semanas después del procesamiento. La
eliminación se realiza mediante lavados sucesivos en alcohol etílico de
70 -80 por 1 00 o en solución saturada de carbonato de litio en alcohol de
70 por 100.
5. Es incompatible con la inclusión en celoidina .
ACETATO DE URANILO [(CH 3 -C00) 2 U0 2 • 3H 2 0]

Se presenta en forma de cristales amarillentos muy solubles en agua y que se
descomponen con la luz. Su empleo está actualmente restringido a las técnicas
de microscopia electrónica, en las que se usa como agente de contraste suple-
mentario.
Preparación: se utiliza en disolución acuosa al 2-3 por 1 OO.
9.4. Fijadores que actúan por reticularización de las proteínas
El proceso que denominamos reticularización de las proteínas sobreviene

cuando la desnaturalización de estas moléculas se produce no por precipitación,
sino porque el agente que provoca el fenómeno induce la rotura masiva de los
puentes de hidrógeno determinantes de la estructura helicoidal de las moléculas
proteicas, y la formación ulterior de una malla reticular polipeptídica por asocia -
ción química entre los grupos activos desenmascarados por el líquido fijador.
Por lo común, el propio agente contribuye a la formación de la red actuando
como nexo de unión entre moléculas adyacentes.
Los principales agentes fijadores que actúan por este mecanismo son aldehí-
dos o potentes oxidantes como el tetróxido de osmio.
FORMALDEHIDO O FORMOL (CHOH)

En estado puro se trata de un gas tóxico y muy irritante para las mucosas que
se disuelve fácilmente en agua. En este estado, en concentraciones entre el 35-
40 por 100 y estabilizado con metano!, se denomina formalina pura o formol.
Por acción del frío la formalina pura tiende a precipitar al polimerizarse hacia
paraformaldehído (fig . 3.2), situación que es reversible añadiendo unas gotas de
hidróxido sódico y calentando la mezcla.
Polimerización del formaldehído paraformaldehído

Figura 3.2. Polimerización del formaldehído .
Preparación: como agente fijador, el formaldehído se emplea en una con-

centración del 4 por 1 OO. Sin embargo, como se parte de una solución de
formalina, esta concentración se obtiene diluyendo una parte de esta última en
nueve de agua, solución salina o tampón.
Desde el punto de vista químico, el formaldehído en disolución acuosa se
hidrata a radical metilenglicol, que es su forma reactiva . Esta sustancia tiende
a formar enlaces químicos con todos los grupos químicos, excepto con los de
carácter ácido. Por este motivo, tras la rotura de los puentes de hidrógeno
intramoleculares constituye puentes metílicos entre las moléculas proteicas ad -
yacentes, de forma que los surgidos entre grupos amino, imino, imido, guanidil,
FUNDAMENTOS DEL PROCESO DE FIJACION TISULAR. 41
hidroxilo, carboxilo y sulfhidrilo son reversibles. Por el contrario los que se

forman entre aminoácidos aromáticos, como la tirosina, triptófano, fenilalanina e
histidina, son indelebles.
Como puede imaginarse, todos los fenómenos descritos provocan un profun-
do cambio en la actividad funcional y en la estructura antigénica de las molécu -
las proteicas. En cuanto a las grasas e hidratos de carbono, su actuación sobre
las primeras es equivalente a la descrita para las proteínas; en cambio apenas
produce efectos sobre los hidratos de carbono.
Ventajas:
1. Es el fijador más barato que existe, por lo que es de elección para
trabajos de rutina en anatomía patológica.
2. Es un buen fijador único que determina una moderada conservación
de la estructura tisular.
3. Por ser buen desinfectante y no endurecer excesivamente los
tejidos, es un medio óptimo para conservar y almacenar biopsias y
piezas quirúrgicas.
4. Provoca escasa retracción tisular.
5. Posee una velocidad de penetración intermedia entre la de los
alcoholes y la del sublimado (aproximadamente 1 mm/hora), y apenas
altera la coloración tisular; por ello es el agente de elección para fijar
grandes piezas quirúrgicas.
6. Es un excelente fijador para el tejido adiposo y para lípidos en
general, y se emplea como agente de elección para fijar el tejido nervio-
so, células enterocromafines y, en general, antes de cualquier impregna-
ción argéntica.
7. El proceso de fijación puede ser acelerado o retrasado, sin graves
inconvenientes, modificando la temperatura. Así, a temperatura am -
biente se consigue una fijación completa a partir de las 36 horas; a 35 oc,
entre 12 y 24 horas, y a 55 °C, en sólo 3 horas. Por este motivo la
formalina es un fijador de elección cuando se emplean hornos de mi-
croondas en histotecnología.
8. Es compatible con la mayor parte de las tinciones que se utilizan
rutinariamente en anatomía patológica.
Inconvenientes:
1. Produce abundantes vapores de carácter irritante sobre la conjuntiva y
mucosa nasal.
2. Por acción de la luz y del oxígeno atmosférico se transforma progre-
sivamente en ácido fórmico. Esta sustancia tiene la propiedad de
disolver rápidamente la cromatina nuclear; por eso con el paso del tiem-
po los núcleos celulares adoptan un aspecto «fantasma». Para evitar este
inconveniente el formol debe guardarse en frascos opacos o em-
plearse en forma de solución neutra o tamponada.
3. Debido a su incorporación progresiva al tejido en forma de puentes
metílicos, el formaldehído se consume durante el proceso de fija-
ción, por lo cual debe encontrarse siempre en exceso.
4. Por lo anteriormente expuesto y por la baja presión osmótica que posee
la disolución de trabajo de formalina (180 mOs) , que provoca la incor-

poración de agua a los espacios intratisulares, el peso y volumen del
tejido, una vez fijado, se incrementa de forma notable. Este efec-
to puede prevenirse utilizando formol salino o amortiguado con tampo-
nes o solución de sacarosa.
5. Posee una relativa capacidad de fijación sobre las proteínas, pigmentos
que contienen hierro y derivados de la bilirrubina (confiere a estos últi-
mos color verdoso) .
6. Tras la utilización prolongada de formalina, y por su conversión en ácido
fórmico, puede producirse una reducción masiva de la hemoglobina y de
los pigmentos derivados de ella, hasta originar un precipitado cristali-
no birrefringente y de color pardonegruzco que dificulta la obser-
vación microscópica y recibe el nombre de pigmento formólico (he -
mateína ácida de formaldehído) .
Este pigmento se elimina fácilmente con el tratamiento de los cortes en solución

alcohólica saturada de ácido pícrico (1 0-12 gen alcohol etílico al 95-100 por 1 00)
durante 5 minutos, o mediante las soluciones alcohólicas alcalinas de Verocay
(una parte de hidróxido potásico al 1 por 100 en 99 de alcohol etílico al 80 por
100) o de Kardasewitsch (una a cinco partes de hidróxido amónico en 95 a 99 de
alcohol etílico al 70 por 1 00) . En ambos casos hay que tratar los cortes, durante 15
minutos seguidos, con dos baños de agua destilada y otro de alcohol al 70 por
100, de 5 minutos de duración cada uno.
SOLUCIONES FIJADORAS SIMPLES QUE CONTIENEN

FORMALDEHIDO
a) Formol salino
Se utiliza para prevenir el efecto osmótico que provoca el empleo de disolu -
ciones de formaldehído en agua destilada .
Preparación: disolver 9 g de cloruro sódico en 1000 ml de formalina al 1 O
por 1OO.
b) Formalina neutra
Preparación: tradicionalmente, se fabricaba añadiendo a la solución de for-
malina al 1 O por 1 00 una pequeña cantidad de carbonato cálcico insoluble que
quedaba depositado en el fondo del recipiente.
Esta sal neutraliza el exceso de ácido fórmico generado por la oxidación
espontánea del formaldehído. Aunque puede utilizarse todavía para la conserva -
ción de tejidos, en la práctica cotidiana ha sido desplazada por las soluciones
tamponadas.
e) Formol tamponado
Es la solución más empleada hoy día para prevenir el choque osmótico que
provoca la disolución de formalina en agua destilada, así como el depósito de
pigmento formólico que ocurre a pH inferior a 6.
FUN DA MENTOS DEL PROCESO DE FIJACION TISULAR 43
Preparación : como amortiguador se emplea el tampón fosfato calibrado -con pH

7.0-7.2 según la siguiente fórmula :
Formalina pura ...... . . . ........................... . 100.0 ml
Fosfato sódico monobásico ... . . . ... . ..... . .......... . 4 .0 g
Fosfato sódico dibásico (anhidro) . ............. . .... . . . 6.5 g
Agua destilada .................................... . 900.0 ml
d) Formalina ácida
Se emplea fundamentalmente para fijar tejido nervioso en la preparación de
algunas técnicas de impregnación argéntica.
Preparación: añadir una parte de ácido acético glacial a 99 partes de
formalina al 1 O por 1 OO. Con ello se consigue un pH en torno a 2.
e) Formol cálcico (solución de Baker)

En este caso los iones de calcio previenen la difusión de los fosfolípidos y
estabilizan las moléculas enzimáticas, de forma que, empleado a 4 el formol oc.
cálcico se utiliza como fijador de elección en algunas técnicas de histoenzimolo-
gía .
Preparación: añadir cloruro cálcico al 1 por 1 00 a una solución de formali-
na neutra o tamponada al 1 O por 1 OO.
GLUTARALDEHIDO
Es un líquido oleoso que en el comercio se encuentra en disolución al 25 por
1OO. Su mecanismo de actuación es análogo al del formaldehído.
o, C- CH - CH -CH -C
/ 0
/ 2 2 2 "'
H H
Preparación: como agente fijador se emplea en concentraciones entre el 1 y el
3 por 100.
Ventajas:
1. Por su excepcional capacidad para preservar la morfología celular es el
primer fijador de elección para microscopia electrónica, aunque
utilizado en mezclas junto al paraformaldehído.
2. Asimismo, se emplea para la fijación de animales por perfusión en pato-
logía experimental (solución de glutaraldehído al 3 por 1 00, glucosa al 3
por 100 y dextrano al 3 por 1 00 en tampón cacodilato al 0.1 M y pH
7.4) .
Inconvenientes:
1. Tiene una velocidad de penetración excepcionalmente baja; por
ello, los fragmentos de tejido no pueden tener un volumen superior a
unos pocos milímetros cúbicos.
2. Posee una gran capacidad de retracción y endurecimiento tisular

que impide prolongar el tiempo de fijación más allá de 3 horas.
3. Su osmolaridad en disolución al 2.5 por 100 es muy baja, lo que obliga
a emplearlo disuelto en soluciones amortiguadoras (preferente-
mente tampón cacodilato).
TETROXIDO DE OSMIO (Os0 4 )

En el comercio se encuentra en forma de cristales amarillentos solubles en
agua, muy volátiles y tóxicos. Actúa por reticularización de las proteínas y grasas
al formar peróxidos con ellas.
Preparación: como agente fijador se emplea al 1 por 100 en tampón
fosfato .
Ventajas:
1. Es el mejor fijador estructural conocido; por ello en microscopia elec-
trónica se utiliza específicamente como segundo fijador y como
agente de contraste suplementario tras la mezcla de paraformaldehí-
do-glutaraldehído.
Inconvenientes:
1. Es muy caro y se descompone en presencia de la luz, por lo que
debe conservarse en recipientes opacos y en la oscuridad .
2. Por su gran insolubilidad, es difícil preparar las disoluciones acuosas
con las que se trabaja .
3. Es muy tóxico, y en estado cristalino emite vapores irritantes para la
córnea y mucosas respiratorias . Por consiguiente, su manipulación debe
realizarse obligatoriamente en campana de extracción de gases, para
prevenir la aparición de queratitis.
4. Posee muy baja capacidad de penetración tisular, por lo que las
muestras deben tener poco volumen. Además, por su escasa presión
osmótica en disolución , siempre debe emplearse como disolvente una
solución tamponada .
5. Por su gran poder oxidante es incompatible con los fijadores reduc-
tores (formaldehído, principalmente) y con la coloración del PAS.
Este hecho, y el que su presencia en estado libre dificulte la coloración
nuclear, obliga a lavar abundantemente los tejidos tras utilizarlo.
6. Al fijar las proteínas por reticularización inactiva casi por completo
las enzimas y altera notablemente la composición antigénica
tisular.
10. MEZCLAS FIJADORAS
La combinación de diversos fijadores simples en soluciones complejas llama -

das mezclas fijadoras pretende sumar las ventajas de cada uno de ellos amorti-
guando sus inconvenientes.
Desde un punto de vista general, las mezclas fijadoras se clasifican en dos
grandes grupos, dependiendo de que contengan o no formaldehído en su com -

posición.
10.1. Mezclas fijadoras que contienen formol
LIQUIDO DE BOUIN
Es una solución muy utilizada como alternativa a la formalina cuando no se
desea emplear mezclas con sublimado a causa de su elevado poder de endureci -
miento, que vuelve excesivamente quebradizos ciertos tejidos como la piel,
órganos endocrinos, testículo y tejidos embrionarios en general. Sin embargo,
no está indicado para la fijación de las biopsias renales, sobre las cuales provoca
severa distorsión. Asimismo, debe elegirse cuando no se dispone de personal
técnico suficientemente experimentado en el corte en el micrótomo de material
fijado en dicha sustancia.
Preparación de la solución de Bouin :

Solución acuosa saturada de ácido pícrico . . . . . . . . . . . . . . . 750.0 ml
(Acido pícrico al 1 -2 por 100 en agua destilada)
Formalina concentrada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250.0 ml
Acido acético glacial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50.0 ml
pH final aproximado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2
Tiempo de fijación: 4 a 24 horas, en función del tamaño de la pieza.

• Observaciones: tras la fijación, lavar abundantemente en alcohol al
70 por 100 hasta la decoloración de la muestra para asegurar la total
eliminación de ácido pícrico. Una vez fijado se puede almacenar el tejido
en etanol al 80 por 1 OO.
FIJADOR DE BOUIN-HOLLANDER
Es una variante de líquido de Bouin especialmente indicada para la fijación
de los cilindros de biopsia de médula ósea cuando no es posible controlar el
t iempo de fijación de la muestra (lo cual desaconseja la fijación en B-5) . En este
líquido la conservación puede incluso superar las 48 horas sin que se produzca
un excesivo endurecimiento.
Preparación: la solución se compone de:

Acetato neutro de cobre . ... . . . .... . .. . . . ....... .. . 2.5 g
Acido pícrico .......... . . . .... . ...... .. . . ... . .. . 4.0 g
Formalina concentrada .......... . .. . . . .. . .. . ... . . . 10.0 ml
Acido acético glacial ....... ... ......... ...... .. . . . 1.5 ml
Agua destilada ...... .. .. . . . .................. . . . 100.0 ml
• Observaciones: para preparar la solución se disuelve primero la sal
de cobre en el agua destilada, luego se añade el ácido pícrico y, tras
filtrarlos, el formol y el ácido acético glacial.
Esta solución se conserva indefinidamente a temperatura ambiente. El tiempo

de fijación oscila entre 48 - 72 horas y deben seguirse idénticas precauciones que
para el líquido de Bouin.
BOUIN ALCOHOLICO (FIJADOR DE DUBOSCQ-BRASIL)

Constituye una alternativa válida a la mezcla clásica de Bouin cuando la
pieza que se debe fijar es relativamente voluminosa (posee una velocidad de
penetración mucho más elevada} y cuando se precisa una fijación específica de
sustancias hidrosolubles, como el glucógeno, ya que evita su disolución .
Preparación: se compone de:

Alcohol etílico al 80 por 1 00 . .. ............... . ........ . 75.0 ml
Acido pícrico ............. . ......................... . 0.5 g
Formalina concentrada ............. . .................. . 30.0 ml
Acido acético glacial .......... . ... . ........ . .... .. . .. . 7 .5 ml
• Observaciones: mezclar antes de su uso. El tiempo medio de fija -
ción se acorta notablemente en relación con el líquido de Bouin acuoso.
Para fragmentos con un espesor en torno a 5 mm es de 2-3 horas.
LIQUIDO DE GENDRE
Constituye una variación del Bouin alcohólico especialmente diseñada para
la fijación del glucógeno y pigmentos derivados de la hemoglobina.
Preparación: se compone de:

Solución saturada de ácido pícrico en alcohol etílico al
70 por 100 ................. . .. .. .. . .. ....... ... . . . . . 80.0 ml
Formalina concentrada ......... . .. .... .............. .. . 15.0 ml
Acido acético glacial ... . . ... .. ..... .. ................ . 5.0 ml
• Observaciones: El tiempo de fijación oscila entre 1 y 4 horas. Tras
acabar el proceso deben realizarse sucesivamente dos lavados cortos en
etanol al 80, 95 y 100 por 1 OO.
FIJADOR DE MÜLLER
Corresponde en realidad a la disolución acuosa de un fijador simple, el
dicromato potásico, con la adición de sulfato sódico - aunque para Lillie esta
sustancia es inútil-. Su importancia actual radica en que se emplea para fabricar
los fijadores de Orth y de Zenker.
Preparación : se compone de:

Dicromato potásico ..... .. ...... .. ....... . . . . .. .... . 2.5 g
Sulfato sódico . . ..... . .... . . ... . . . . .. . . . . . ..... ... . 1.0 g
Agua destilada ..................... . .............. . 100.0 ml
• Observaciones: el tiempo de fijación oscila entre 24-48 horas. Tras

la fijación es necesario lavar abundantemente en agua corriente durante
unas horas.
FIJADOR DE ORTH
Hoy día se emplea casi exclusivamente para demostrar la reacción cromafín o
en ciertas técnicas de impregnación argéntica para tejido nervioso (principal-
mente Golgi rápido).
Preparación:
- Solución stock de Orth :
• Idéntica a la composición del fijador de Müller.
- Solución de trabajo :
• En el momento de su uso mezclar:
Solución stock . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90.0 ml
Formalina concentrada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.0 ml
• Observaciones: el tiempo de fijación para tejido nervioso es de 48
horas. Tras el proceso de fijación, los tejidos han de ser lavados abun-
dantemente en agua y almacenados en alcohol etílico al 70 por 100.
SOLUCION DE B-5 Y ZENKER-FORMOL (LIQUIDO DE HELLY)

Ambas mezclas fijadoras son en esencia casi idénticas. La denominación B-
5, consagrada por el uso diario, corresponde en realidad a una modificación de
la segunda. La solución de Zenker-formol, sin embargo, contiene además diera -
mato potásico y sulfato sódico.
La mayor utilidad de estos fijadores estriba en que mejoran considerable -
mente la tinción nuclear. De hecho, la fijación en una mezcla que contenga
sublimado es hoy día prácticamente imprescindible para el diagnóstico morfoló-
gico en las patologías del sistema linfoide y hematopoyético (fig. 3.3A y 3.38).
Ello es debido a la gran importancia que se otorga a la observación de finos
detalles nucleares (presencia o no de hen.diduras o repliegues nucleares y de
nucléolo) en el momento de catalogar un tumor maligno de ganglios linfáticos
(linfoma) o de la médula ósea (leucemia) como de alto o bajo grado de maligni -
dad y, por tanto, al recomendar la terapéutica más oportuna . Asimismo, la
solución de B-5 o de Zenker-formol es el fijador de elección para el riñón,
hígado, las fibras del tejido conectivo y la fibrina . Nosotros preferimos la primera
de ellas porque la eliminación del efecto inicial del dicromato sobre los tejidos
permite una mejor conservación de la cromatina nuclear y de la estructura
antigénica tisular, en este último caso. al eliminarse la intensa oxidación induci-
da por la sal de cromo.
Figura 3 .3. A) Imagen histológica de un ganglio linfático fijado en forma -

lina no tamponada al10 por 100 (H-E x 40) . B) Imagen equivalente fijada
en B- 5 (H-E x 40) .
SOLUCION DE B-5
Preparación :
-Solución stock de B- 5:
Cloruro mercúrico ... . ................. . . . .. .. . . 12.0 g
Acetato sódico ..................... . ... . . .. . . . 2.5 g
Agua destilada . .................... . ..... . ... . 200.0 ml
• Observaciones: esta mezcla es estable durante largo tiempo, pero
debe conservarse en frasco opaco y en oscuridad .
- Solución de trabajo de B-5:
En el momento de su uso mezclar:

Solución stock de B- 5 .................... . ... . . 20.0 ml
Formalina concentrada ........................ . . 2 .0 ml
• Observaciones: esta solución es inestable debido a que el formaldehído
reduce el sublimado a cloruro mercurioso (HgCI) y mercurio metálico, que se
depositan en forma de un precipitado blancogrisáceo. Por este motivo, así como el
elevado índice de endurecimiento que posee el sublimado, el tiempo de fijación
no debe superar las 4 horas. Además, el espesor máximo de las muestras

no debe superar los 4 mm a causa del escaso poder de penetración de la mezcla
fijadora. Debido a la aparición de precipitados mercúricos sobre los tejidos, las
secciones histológicas, antes de ser coloreadas, han de ser sometidas a tratamiento
específico mediante soluciones que eliminan estos depósitos (véase posterior-
mente) .
Tras la fijación, los tejidos pueden conservarse indefinidamente en alcohol
etílico al 70-80 por 1 OO.
SOLUCION DE ZENKER-FORMOL
Preparación:
- Solución stock de Zenker:
Cloruro mercúrico . . . . .. . ... ....... . ......... . . . 5g
Dicromato potásico ...... . . ... ..... .. .. . . . . ... . 2.5 g
Sulfato sódico .................. . . . ...... . . .. . 1g
Agua destilada ...... . ....... . ...... . ...... ... . 100 ml
- Solución de trabajo :
En el momento de su uso mezclar:
Solución stock de Zenker .... .. . ... . .. . ... .... .. . 95 ml
Formalina concentrada ...... . .. . . .. ... . ... .. ... . 5 ml
• Observaciones: tanto para la solución almacenada como para la de
trabajo, deben guardarse idénticas precauciones a las expuestas para la
solución de B-5.
ELIMINACION DEL PIGMENTO MERCURICO

Recibe coloquialmente el nombre de deszenkerización. Se realiza tratando las
secciones histológicas, antes de su coloración, con soluciones yodadas (solu-
ción de Gramo lugol), que transforman el mercurio métalico en yoduro mercúri -
co soluble en tiosulfato sódico .
Solución de fugo!:
Yoduro potásico ..... .................. ...... . . .. .. . 2g
Yodo (cristales) .... .. . ...... . .. . . . ............ .... . 1 g
Alcohol etilico de 70-80 por 100 ..................... . 100 ml
Solución de tiosu/fato sódico:
Tiosulfato sódico .... .... . ..................... . ... . 5g
Agua destilada ..... ....... .. .. .... ...... .. ....... . . 100 ml
,_
....
Procedimiento técnico:
Después de la desparafinación, tratar los cortes durante 1 O minutos con la solución
yodada. Lavar bien en agua destilada. Decolorar durante 2 minutos en la solución
de tiosulfato. Lavar en agua corriente durante 1 O minutos antes de realizar la
coloración .
10.2. Mezclas fijadoras que no contienen formol
LIQUIDO DE ZENKER
Trata de comb inar los efectos favorables del sublimado y los del dicromato
potásico. Sin embargo, en la práctica habitual ha dejado de utilizarse como
primer fi jador, siendo sustituido por el B-5. Su empleo ha quedado práctica -
mente restringido al proceso de refijación - decalcificación a que son sometidas
las biopsias de médula ósea cuando se rea liza fijación inicial con B- 5.
Preparación:
En su forma clásica, el líqu ido de Zenker se compone de:
Soluc ión stock de Zenker (véase página anterior) . . . . . . . 95 .0 mL
Acido acético glacial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.0 mL
• Observaciones: el ácido acético reduce lentamente al dicromato potásico,
por ello la solución se oscurece progresivamente y debe recomponerse exclusi-
vamente antes de su uso. El tiempo de fijación puede ser más prolongado
que con la solución 8 - 5, ya que el ácido acético previene un excesivo endureci -
miento. Con todo, no deben sobrepasarse las 48 horas. Tras la fijación, el
material debe ser tratado con sulfato sódico al 5 por 100 durante 1 o 2
horas.
LIQUIDO DE CARNOY
Es tal vez el mejor fijador conocido para el glucógeno y, en generaL
para los hidratos de carbono simples y para las proteínas fibrilares, pero
sobre todo para las miofibrillas . Además, su acción fijadora es extremada -
mente rápida , deshidrat ando el tejido al mismo tiempo. Sin embargo, produce
una excesiva retracción hística así como hemólisis masiva de los eritrocitos y
pobre con'Servación estructural de las proteínas globulares y del ADN .
Preparación : se compone de:

Etanol absoluto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60.0 mL
Cloroformo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30.0 mL
Acido acético glac ial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.0 mL
• Observaciones: el tiempo de fijación puede ser acortado hasta 3
horas. Las muestras deben cambiarse directamente a alcohol etílico ab-
soluto . El mayor endurecimiento se produce al prolongar demasiado la
FUNDAMENTO S DEL PROCESO DE FIJACION TISULAR 51
deshidratación en alcohol. Para prevenir este último inconveniente pue-

de sustituirse el etanol por metano! en la composición del líquido fijador
(Meta~arn o Metanoi-Carnoy), que además provoca menor retrttcción
tisular.
11. FIJACION EN MICROSCOPIA ELECTRONICA

En microscopia electrónica, donde se obtienen imágenes que se cifran en
varias decenas de miles de aumentos, es absolutamente imprescindible, por una
parte, la conservación de las células en el estado más próximo al vivo y, por otra,
la obtención de cortes extremadamente finos (su grosor se mide en decenas de
nanómetros) que permiten el paso del haz de electrones que proyectará la
imagen . La primera condición obliga a real izar la fijación de forma inmediata, es
decir, dentro de los primeros instantes que siguen a la extracción del tejido vivo.
La fijación más tardía, aunque es posible, siempre será menos satisfactoria . En el
caso de los animales de experimentación, se puede realizar la perfusión en vi11o
de los líquidos fijadores según métodos que escapan al marco de este libro.
Técnica de fijación
Como regla general , en microscopia electrónica se utiliza como primer fijador
de elección el glutaraldehído en tampón fosfato o cacodilato en concentraciones
entre el 2.5 -4 por 100 y, como segundo fijador, el tetróxido de osmio. La
elección del tampón para confeccionar la solución de glutaraldehído depende
esencialmente del tipo de estudio que se vaya a realizar. Para análisis de rutina
se prefiere el tampón fosfato, y para citoquímica, el de cacodilato. Este último
posee la ventaja adicional de contener arsénico, que actúa como agente anti-
bacteriano, favoreciendo la conservación de los especímenes.
Considerando la escasa capacidad de penetración, tanto del glutaraldehído
como del tetróxido de osmio, los fragmentos de tejido no superarán el volumen
de 1 mm 3 , debiendo cuidarse su manipulación para evitar aplastamientos.
Aunque el proceso de fijación inicial estándar sólo emplea habitualmente un
fij ador simple, se ha postulado la utilización a tal fin de una mezcla de parafor -
maldehído y glutaraldehído (solución de Karnovsky) que compensa la escasa
velocidad de penetración del segundo agente, facilitando la fijación en bloque
de piezas más voluminosas.
Cuando se utiliza la solución de tetróxido de osmio como único fijador, el
tiempo de fijación directa del tejido es de una hora . Si se emplea la doble fijación
en glutaraldehído y tetróxido de osmio, primero se fija el tejido durante 4 - 16
horas en la solución del aldehído (preferentemente en tampón cacodilato) . Tras
lavarlo en tres cambios de 5 minutos en la solución tampón, se vuelve a fijar
durante una hora en la solución de tetróxido de osmio a temperatura ambiente.
Después de lavarlo de nuevo en dos cambios de agua destilada, el tejido está
dispuesto para ser incluido en resina.
52 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGI CA
Solución de glutaraldehído al 4 por 100 en tampón fosfato 0.12 M según

Millonig
Preparación de las soluciones «stock»:
Solución A: ortofosfato dihidrogenado de sodio (NaH 2 P0 4 2H 2 0) al 2.26 por 1 OO.
Solución B: hidróxido sódico al 2.52 por 1 OO.
Solución C: cloruro cálcico anhidro 0.5 M .
Solución D: solución acuosa de glutaraldehído al 25 por 1 OO.
Procedimiento técnico:
1. Mezclar 41 .5 mL de la solución A y 8 .5 mL de la solución B . Controlar el
pH y ajustar entre 7.3-7 .4 si es necesario.
2. Añadir gota a gota y agitando 0 .1 mL de la solución C. Los precipitados
desaparecen sacudiendo enérgicamente la solución .
3. Añadir 8 mL de la solución D a 42 mL de la solución buffer completada en
el paso anterior.
• Observaciones:
1. El tiempo de fijación debe oscilar entre 4 y 16 horas.
2. La solución debe emplearse recién preparada, aunque es posible conservar-
la durante algunos días a 4 oc.
3. Las soluciones de almacenamiento se conservan con facilidad a 4 °C.
Solución de glutaraldehído al 2.5 por 100 en tampón cacodilato
- Preparación de la solución stock:

Disolver 21 .4 g de cacodilato sódico [Na(CH 3 ) 2 AS0 2 · 3H 2 0] en 900 mL de
agua destilada. Añadir 40 mL de ácido clorhídrico 1 M y ajustar a pH 7 .4 si es
necesa rio. Añad ir 1 O mL de cloruro cálcico 0 .1 M agitando. Añadir 30 g de suerosa
y agitar hasta su total disolución . Completar hasta 1000 mL con agua destilada.
- Preparación de la solución de trabajo:
La solución fijadora se prepara antes de usarla añadiendo 5 mL de solución
acuosa de glutaraldehído al 25 por 100 a 50 mL de la solución stock de tampón
cacodilato .
• Observaciones:
El tiempo de fijación debe oscilar entre 4 y 1 6 horas.
FUN DAMENTOS DEL PROCESO DE FIJACION TISULAR 53
Solución de Karnovsky
Soluciones stock:
a) Solución de paraformaldehído:
- Paraformaldehído . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g
- Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 ml
Disolver a 60 °C, agitando en recipiente cerrado para evitar la evaporación .
Añadir hidróxido sódico 1 M gota a gota (1 a 1 O) hasta que la solución esté
clara . Enfriar en agua corriente .
b) Solución tampón cacodilato:
- Cacodilato sódico 0.2 M . ...... . . . . .. .......... . 50.0 ml
- Acido clorhídrico 0.1 M . . .. ......... . .......... . 2.7 ml
Medir el pH y ajustar a 7.4 si es necesario.
Modo de operar:
1. Añadir 1 O ml de solución acuosa de glutaraldehído al 25 por 100 a 25 ml
de la solución a) .
2. Completar hasta 50 ml con la solución b).
3. Añadir 25 mg de cloruro cálcico anhidro (opcional).
4. Fijar el tejido entre 2 y 16 horas.
• Observaciones:
En ocasiones, la concentración de glutaraldehído debe reducirse a la mitad para
mejorar los resultados morfológicos.
Solución de tetróxido de osmio

El Os0 4 se encuentra en el comercio en forma de ampollas de 0 .5 g . Se
toman dos ampollas y se lavan antes de abrirlas.
Se colocan en agua a 40 C para fundir los cristales de manera que se transfor -

men en un líquido amarillo claro, que por movimientos de rotación ha de hacerse
cnstalizar sobre la superficie interna de la ampolla tras someterla a la acción del
agua fría . A continuación se sumergen las ampollas, siempre cerradas, en una
soluc ión sulfocrómica (dos partes de dicromato potásico al 1 O por 100 en una
parte de ácido sulfúrico concentrado) donde se mantienen 12 -24 horas.
Luego se lavan en agua corriente durante 4 horas, se colocan en agua destilada
y se guardan en refrigerador. En el momento de usarlas se vierte el agua destilada y
mediante un agitador calentando a la llama, se rompen las ampollas y se añaden
los restantes componentes de la mezcla fijadora .
54 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLO GICA
Preparación de la mezcla fijadora de tetróxido de osmio:

a) Solución acética :
- Acetato sódico .............. . ... . .......... . 1.904 g
- Agua destilada .. . ... . .. . ................... . 100 ml
b) Solución de veronal sódico:
- Veronal sódico ............................. . 2.58 g
- Agua destilada ... . ....... . .. . ........... . .. . 100 ml
e) Líquido fijador:
- Tetróxido de osmio 1 g (2 ampollas)
-Solución acética .......... . ..... . ... . ...... . 5 ml
-Solución de veronal sódico ................... . 5 ml
-Solución de HCI 0.1 N ..................... . . 5 ml
- Agua destilada .......... . ....... . .......... . 35 ml
Ajustar el pH a 7.38 mediante el HCI y el acetato/veronal.
Guardar el frasco oscuro, herméticamente cerrado, en refrigerador. El fijador
debe permanecer incoloro o levemente amarillo; si aparece color rosa, debe dese -
charse.
CAPITULO 4
Decalcificación y
reblandecimiento tisular.
Conservación
. . de
,
tejidos
.
y p1ezas qu1rurg1cas
GUION DE CONTENIDOS
1. INTRODUCCION
2. DECALCIFICACION QUIMICA
3. SOLUCIONES DECALCIFICANTES MAS UTILIZADAS
3.1. Soluciones que contienen ácidos fuertes
3.2. Soluciones que contienen acidos débiles
3.3. Soluciones fijadoras con poder decalcificante
4. DECALCIFICACION MEDIANTE QUELANTES QUIMICOS
5. ACELERACION DEL PROCESO DE DECALCIFICACION
OUIMICA MEDIANTE ULTRASONIDOS
6. DECALCIFICACION ELECTROLITICA
7. PRUEBAS DE CONTROL SOBRE EL GRADO DE
DECALCIFICACION TISULAR
8. DECALCIFICACION DE BLOQUES TISULARES INCLUIDOS
EN PARAFINA
9. CONSERVACION DE LOS TEJIDOS
1. INTRODUCCION
Se denomina decalcificación a la completa eliminación de las sales de calcio

presentes en los tejidos tras haber realizado su fijación . Habitualmente, este
procedimiento técnico se realiza de forma sistemática sobre tejidos mineraliza -
dos (dientes y hueso) y esporádicamente, sobre material anatomopatológico
con calcificaciones, que dificultan o impiden la observación microscópica de las
lesiones. Sólo está desaconsejado decalcificar el tejido en las enferme-
dades óseas metabólicas, en las que el estudio del frente de osificación es
imprescindible para valorar el equilibrio entre síntesis y destrucción de matriz
ósea y su grado de calcificación. En este último caso, se realizan cortes de tejido
sin decalcificar empleando un microtomo motorizado específico para seccionar
tejidos duros incluidos en plástico.
Los principales agentes decalcificadores están formados por ácidos fuertes o
débiles, empleados aisladamente o en conjunción con distintos líquidos fijado -
res. Además, se han utilizado resinas de intercambio iónico, quelantes químicos,
disociación electrolítica y, como aceleradores del proceso, emisores de ultraso-
nidos.
2. DECALCIFICACION QUIMICA
Como ya se ha mencionado, los principales reactivos que se utilizan son

ácidos inorgánicos fuertes, como el nítrico o el clorhídrico, y débiles, como el
ácido sulfuroso o ácidos orgánicos, como el fórmico, acético o tricloroacético.
Frente a los decalcificantes químicos por quelación, como el ácido etilén -diami-
no-tetracético (EDTA), todas estas sustancias presentan la ventaja de ser más
estables, baratas y de más fácil disponibilidad. El líquido decalcificante ideal
debe reunir las siguientes cualidades: a) Producir una eliminación completa
de los depósitos cálcicos; b) No provocar efectos indeseables o arte-
factos sobre los tejidos tratados y e) No interferir con los procedi-
mientos de tinción que se emplearán posteriormente. No obstante, y en
relación con esta última condición, ninguno de los agentes químicos de carácter
ácido empleados hasta la fecha permite la demostración de metacromasia (capí -
tulo 7) - sobre todo en el caso de los gránulos de los mastocitos, tras una
decalcificación por encima de 4 -6 horas- . Este hecho debe tenerse en cuenta
en el momento de elegir un método para decalcificar médula ósea cuando en el
diagnóstico diferencial pueda considerarse una mastocitosis.
El ácido nítrico es el agente más rápido y eficaz, aunque utilizado en concen-
tración alta (superior al 6 por 1 00) tiende a producir gran destrucción tisular,
que se atenúa en disolución alcohólica (fig . 4 .1 ) . El á~
· do clorhídrico, si bien no
es tan rápido como el nítrico, produce menor agresión t ular y no precisa lavado
postdecalcificación. Los ácidos orgánicos producen ese sos artefactos tisulares
y apenas interfieren en los resultados finales de la tinción; sin embargo, actúan
muy lentamente y requieren la renovación frecuente del líquido decalcificante,
por lo que están indicados exclusivamente cuando la muestra es tejido óseo
esponjoso y contiene sólo pequeñas espículas calcificadas.
Las principales normas genéricas que deben observarse durante el proceso
DECALCIFICACION Y REBLANDECIMIENTO TISULAR 57
Figura 4.1. Médula ósea fijada en formalina y decalcificada en ácido

nítrico ( x 4) .
de decalcificación y durante el ulterior procesamiento histológico de los tejidos

son :
1. Para disminuir en lo posible los efectos alterativos del decalcificador, la
fijación debe haberse completado antes de iniciar el proceso. El
empleo de fijadores por formación de sales (dicromato y B-5) junto con
la formalina acelera el proceso, mejora notablemente la imagen histoló -
gica y reduce la hinchazón de la colágena estroma! y de la matriz ósea
(fig. 4.2) .
2. La concentración del agente decalcificante debe ser óptima, de
manera que pueda alcanzarse un equilibrio entre la mayor rapidez de las
disoluciones más concentradas y el menor efecto alterativo tisular que
producen las soluciones más diluidas.
3. Debe usarse un volumen óptimo de líquido decalcificador (míni-
mo de 1 :20), que además será renovado con frecuencia.
4. Para acelerar el proceso, los bloques deben ser suspendidos en el
centro del recipiente de calcificación, ya que el fondo de éste se
acumula la mayor concentración de sales cálcicas solubles.
Figura 4 .2 . Médula ósea fijada en B-5 y decalcificada en Zenker-acético ( x 4).

5. La temperatura ideal para realizar la decalcificación se encuentra en

torno a los 25 °C. Por encima de ella el proceso de decalcificación se
acelera, aunque también lo hace el de descomposición del tejido (en
torno a los 60 oc la maceración es máxima), mientras que con tempera-
turas inferiores ambos procesos se invierten .
6. La agitación suave, manual o mecánica, del agente decalcificante
generalmente acelera el proceso.
7. La adición de alguna resina de intercambio iónico (sales de
amonio o resinas sulfonadas) al medio de decalcificación acelera
igualmente el proceso, al producir un atrapamiento progresivo de los
iones cálcicos liberados por el decalcificador químico.
8. Después de cualquier proceso de decalcificación química en el que se
haya empleado ácido el exceso de este último ha de ser eliminado
mediante lavados en soluciones neutralizantes (la mejor, el agua
corriente). Para disminuir el edema de las fibras colágenas, el primer
lavado se realiza en solución de sulfato sódico al 5 por 1 OO.
9. La imbibición en parafina de muestras pequeñas (incluso de cilindros
de médula ósea) puede realizarse directamente en los procesadores
automáticos de tejidos tipo Autotechnicon . Los bloques de mayor ta -
maño pueden requerir una eliminación más completa del agua y alcohol
absoluto. Para ello puede ser aconsejable una deshidratación manual de
mayor duración y un baño intermedio de benzoato de metilo.
1 O. La coloración de tejidos decalcificados puede ser interferida por un
exceso residual de los ácidos empleados para eliminar las sales cálcicas.
Por este motivo, un pretratamiento de los cortes con solución
acuosa de carbonato de litio al 1 por 100 asegura la neutraliza-
ción completa.
3. SOLUCIONES DECALCIFICANTES MAS UTILIZADAS

3.1. Soluciones que contienen ácidos fuertes
SOLUCION ACUOSA DE ACIDO NITRICO

Acido nítrico concentrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 ml
Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 ml
• Observaciones:
En caso de que la solución sea alcohólica, la proporción de ácido nítrico debe
ser del 7.5 por 1 OO. Tiempo medio de decalcificación para un bloque óseo de 5 mm
de espesor: 12- 24 horas.
Ventajas:
1. Provoca una rápida decalcificación. ~
2. Causa menor retracción tisular y mejor co oración de los núcleos que la
solución de formol-nítrico, por provocar ci rta hinchazón de las fibras
colágenas.
3. No es necesario neutralizar el agente decalcificante, sino que el
tejido puede pasarse directamente a etanol de 70° para iniciar la deshidrata-
ción .
OECALCIFICACION Y REBLANDECIMIENTO TISULAR 59
Inconvenientes:
1. La prolongación excesiva de tiempo de decalcificación suele anular la
fijación previa y alterar progresivamente el tejido .
SOLUCION DE FORMALINA-ACIDO NITRICO

Formalina ...................... . .................... . 10 ml
Acido nítrico concentrado .......... .. ................ . . . 10 ml
Agua destilada .......... . .. . .... . .................... . 80 ml
• Observaciones:
Tiempo medio de decalcificación para un bloque de tejido óseo de 5 mm de
espesor: de 1 a 3 días.
Ventajas:
1. Es de acción relativamente rápida.
2. Provoca menores alteraciones tisulares que la solución acuosa de
ácido nítrico.
3. Por su facilidad de manejo y rapidez de acción es la solución decal-
cificante más utilizada para las técnicas histológicas de rutina.
Inconvenientes:
1. Dificulta la tinción nuclear en mayor grado que otras soluciones decal -
cificadoras que contienen ácidos débiles.
2. Antes de su procesamiento, los tejidos requieren neutralización en
sulfato sódico al 5 por 100 y lavado ulterior en agua corriente al
menos durante 2 horas.
LIQUIDO DE PERENYI
Acido nítrico al 1 O por 100 .......................... . 40 ml
Etanol absoluto .. . ......... ..... ..... ........... .. . 30 ml
Acido crómico al 0 .5 por 100 en agua destilada ...... . . . . . 30 ml
• Observaciones:
Mezclar inmediatamente antes de su uso. Tiempo medio de decalcificación para
un bloque óseo de 5 mm de espesor: de 2 a 7 días.
Ventajas:
1. Prepara adecuadamente la tinción nuclear debido a la adición del
ácido crómico.
2. Apenas provoca maceración tisular por el efecto deshidratante del
alcohol etílico.
3. No requiere neutralización previa a la inclusión tisular.
Inconvenientes:
1. Actúa lentamente, por lo que no puede emplearse para trabajos de
urgencia.
2. Es incompatible con las pruebas rutinarias que se realizan para
comprobar que se ha producido la decalcificación completa.
3.2. Soluciones que contienen ácidos débiles
SOLUCION ACUOSA DE ACIDO FORMICO

Acido fórmico al 90 por 100 ......................... . 5-10ml
Agua destilada .... . ........ .. ........ .. ...... .. . .. . 90-95 ml
• Observaciones:
Tiempo medio de decalcificación para un bloque óseo de 5 mm de espesor: de
3 a 7 días.
Su empleo como solución tamponada (35 ml de ácido fórmico al 90 por 100
en 65 ml de solución acuosa de citrato sódico al 20 por 1 00), aunque de acción
más lenta (media de 3-14 días) , mejora notablemente la coloración nuclear y la
imagen histológica global del tejido.
Ventajas:
1. Fija y decalcifica simultáneamente.
2. No dificulta demasiado la coloración nuclear.
3. Está especialmente recomendada para decalcificar dientes.
Inconvenientes:
1. Es de acción muy lenta.
2. Requiere neutralización previa a la inclusión en sulfato sódico al 5 por
100 y lavado ulterior en agua corriente al menos durante 18 horas.
3.3. Soluciones fijadoras con poder decalcificante
Entre las más utilizadas se encuentran los líquidos de Bouin, Bouin-Hollan-

der y Zenker. Todos ellos poseen débil capacidad decalcificadora, por lo cual se
emplean casi exclusivamente como decalcificantes de los cilindros biópsicos
de médula ósea (constituidos mayoritariamente por esponjosa). o para elimi-
nar pequeñas calcificaciones distróficas. En el primer caso, y aunque cualquie -
ra de estas soluciones fija y decalcifica de forma simultánea, nosotros prefe -
rimos emplear secuencialmente un fijador por formación de sales el 8-5 y
una refijación-decalcificación posterior en Zenker-acético, según el método
que se expone en el capítulo de procesamiento del tejido hematopoyético y
linfoide.
4. DECALCJFICACION MEDIANTE QUELANTES QUIMICOS
Los quelantes químicos son sustancias capaces de combinarse con iones

metálicos, en solución o estabilizados en forma de sales, para constituir nuevos
compuestos, generalmente solubles en agua . El quelante más comúnmente utili-
zado es el ácido etilén-diaminotetracético (EDTA) . La sustracción de iones
cálcicos que procura el EDTA se realiza de forma muy lenta, aunque posee la
ventaja de no inducir artefactos sobre otros componentes tisulares si han sido
fijados previamente.
Preparación: Aunque se comercializa, la solución de EDTA se prepara por lo

general según la fórmula siguiente:
Sal disódica de EDTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.5 g
Formalina neutra al 1O por 100 ....... . ....... . . . . . . . . .100.0 ml
• Observaciones: El tiempo medio de decalcificación para un bloque de 5
mm de espesor correspondiente a esponjosa ósea es de 1 a 3 semanas, y para uno
de hueso cortical , entre 6 y 8 semanas. Con el tiempo, esta solución puede
enturbi arse. Para aclararla se neutraliza la acidez de la solución hasta pH 7 agre-
gando 25 g de hidróxido sódico por cada 1000 m l.
5. ACELERACION DEL PROCESO DE DECALCIFICACION QUIMICA

MEDIANTE ULTRASONIDOS
Tras una época inicial de grandes expectativas, el empleo de ondas ultrasóni-

cas de una frecuencia entre 1 O y 11.000 ciclos por segundo para favorecer el
proceso de decalcificación tisular ha caído en descrédito . Ello se ha debido
pri nc ipalmente a los graves efectos destructivos que las ondas ultrasónicas
provoca n en las estructuras celulares, sobre todo si el control del tiempo de
decalcifi cación no es muy estricto. El método se fundamenta en someter el
teji do, una vez inmerso en la solución decalcificante, a la acción del haz ultrasó-
nico en un baño líquido . De esta forma se induce una vibración molecular sobre
el material calc ificado que favorece la formación de sales entre los iones des-
prendidos y los ácidos o quelantes utilizados durante el proceso.
6. DECALCIFICACION ELECTROLITICA
Se basa en el empleo de una corriente eléctrica continua para provocar la

ioni zac ión de la solución salina o decalcificante en que se encuentra sumergido
el tejido. Así, las sales insolubles de calcio presentes en el tejido son desplazadas
por influj o del campo eléctrico creado, emigrando los cationes cálcicos hacia
electrodo negativo . Los radicales ácidos también migran , aunque más lenta -
mente, hacia el polo electropositivo, de forma que mientras persisten sobre el
teji do aceleran el ritmo de decalcificación.
Este proceso suele realizarse a temperatura entre 30 y 45 °C, y para especí -
menes pequeños se completa entre 45 y 60 minutos. Pese a las ventajas del
procedimiento, llama la atención el hecho de que no se aplique de forma rutina-
ria en la mayor parte de los laboratorios de anatomía patológica.
7. PRUEBAS DE CONTROL SOBRE EL GRADO

DE DECALCIFICACION TISULAR
El control exacto del tiempo óp,imo de decalcificación tisular es absoluta -

mente imprescindible: una duración mayor del proceso origina maceración y
destrucc ión celular, y su acortamiento impide obtener secciones microtómicas
adecuadas. Por ello se precisan mecanismos de control que permitan establecer

el momento en que el proceso se ha completado. Para tal fin existen tres tipos
distintos de métodos: físicos, químicos y radiológicos.
Los métodos físicos se basan principalmente en la experiencia del técnico
de laboratorio para detectar, mediante el tacto, el grado de dureza y calcificación
tisular. Debido a su gran subjetividad y a la posibilidad de inducir daño sobre el
tejido durante estas manipulaciones, estos métodos no son aconsejables.
Los métodos radiológicos, aunque bastante sensibles, requieren el em-
pleo de instrumental complejo y son costosos.
Los métodos químicos, comúnmente de elección, se basan en la detección
de iones cálcicos en el líquido decalcificante: cuando en los sucesivos recambios
del líquido dejan de encontrarse iones cálcicos, se considera que el proceso ha
finalizado. La prueba más utilizada es la del oxalato cálcico.
7.1. Método del oxalato cálcico
Soluciones:
Amoniaco concentrado ............................. .
Solución saturada de oxalato amónico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 ml
1. Se toman 5 ml de la solución decalcificante y, agitando, se añade amo -
niaco gota a gota hasta que la solución se torne neutra (el control se realiza
colocando en ella un papel de tornasol o cualquier otro de pH).
2. Se añaden 5 ml de solución saturada de oxalato amónico y se agita bien.
3. Se deja reposar 30 minutos.
Resultados: si se forma precipitado de hidróxido cálcico tras la adición del
amoniaco, la cantidad de calcio presente en el fluido decalcificante es tan alta que
la decalcificación completa del tejido es muy improbable. Si la precipitación ocurre
tras añadir el oxalato, la decalcificación, aunque mayor, debe continuar algún
tiempo. Si la solución final permanece clara, se considera que el proceso se ha
completado.
• Observaciones: esta prueba no es fiable para soluciones decalcifi-
cadoras que contengan más de un 10 por 100 de ácidos. La formación de
burbujas de anhídrido carbónico en una muestra -problema debido a la
acción de los ácidos sobre las sales de carbonato presentes en el tejido-, indica
que el proceso no se ha completado y, por tanto, hace innecesaria la prueba
del oxalato.
8. DECAlCIFICACION DE BlOQUES TISUlARES

INClUIDOS EN PARAFINA
Durante el proceso de corte de los bloques incluidos en parafina, aparecen a

menudo calcificaciones no detectadas durante el muestreo de material o restos
de tejido insuficientemente decalcificado. En estos casos se producen graves
desperfectos en la cuchilla, que pueden llegar a impedir que se realicen las

secciones necesarias.
El problema puede subsanarse sumergiendo la superficie del bloque en líqui-
do de Perenyi o en ácido fórmico al 50 por 1 00, una o dos horas antes de realizar
el corte, o bien empleando el método de Lendrum, que consiste en exponer la
superficie de corte a la acción de una solución de ácido clorhídrico al 2 por 100
durante varias horas.
9. CONSERVACJON DE LOS TEJIDOS
Cuando se practica un estudio histológico, sólo se incluye una pequeña

porción del material remitido para el análisis; el resto se guarda como material de
reserva para estudios complementarios. Casi nunca es posible conservar el tejido
en el mismo líquido utilizado para la fijación, ya sea porque éste provoca un
endurecimiento excesivo ( B-5, Bouin, tetróxido de osmio, etc.) o por los efectos
alterativos crecientes que induce sobre la estructura antigénica (como en la
fijación formólica prolongada) . En todos estos casos, la solución conservante
más indicada es el alcohol etílico al 70 por 1 OO. En él, además de iniciarse la
deshidratación, el tejido, una vez fijado, puede conservarse durante meses si~
sufrir apenas cambios. Como alternativa más simple, y siempre que no se desee
preservar el tejido para ulteriores estudios inmunohistoquímicos, puede emplear-
se como conservante una solución de formalina neutra o tamponada al 1 O por
100.
Cuando lo que se pretende exclusivamente es demorar la inclusión del tejido
en parafina, puede estar indicado, sobre todo para pequeñas muestras muy
delicadas, realizar la deshidratación completa de las muestras en alcoholes cre-
cientes y cqnservarlas en butanol. Este agente, además de completar la deshi-
dratación, permite una conservación indefinida y con el paso del tiempo incluso
mejora la textura tisular favoreciendo el corte.
Cuando el material que se desea conservar corresponde a órganos completos
procedentes de necropsia y cuya coloración es importante mantener en lo posi-
ble, la alternativa es utilizar las soluciones de Jores.
Método de Jores para la fijación

y conservación de órganos
a) Solución fijadora y conservante o solución de Jores-1 :

1. Sulfato sódico ..... .. .. . .... . .. ..... . ... . ..... . . 22 g
2. Sulfato potásico .. ... . . .... .. .. .. .... . ......... . 1 g
3. Cloruro sódico ............. . .... .. .... . ........ . 9g
4. Bicarbonato sódico ..... . .... . . . .. . .... . . . ...... . 18 g
5. Formol al 1O por 100 .. . ......... . . .. . . .... .. . . . . 50 ml
6. Sol. acuosa sat. de hidrato de cloral .. ....... .... ... . 50 ml
7. Agua destilada . ...... . ......................... . 1000 ml
Las piezas se dejan varios días o incluso semanas en esta solución .
b) Solución conservante o de Jores-11:

1 . Acetato potásico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300 g
2. Glicerina . .. ... ........... . .......... . ...... .. . 600 ml
3. Agua destilada ......... . .. ... .. . . . .... . ....... . .1 000 ml
En recipiente bien cerrado la conservación puede prolongarse algunos años.
CAPITULO 5
Métodos y técnicas
de inclusión
•
GUION DE CONTENIDOS
1. INTRODUCCION
2. DESHIDRATACION POR AGENTES OUIMICOS
2.1. Principales agentes deshidratantes
3. ACLARAMIENTO O DESALCOHOLIZACION
3.1. Agentes aclarantes
3.2. Características de los principales agentes aclarantes
4. INFILTRACION O IMPREGNACION
4.1. Infiltración en parafina
4.2. Otros métodos de inclusión
4.3. Inclusión en plástico (Resinas)
5. LA INCLUSION EN MICROSCOPIA ELECTRONICA
5.1. Inclusión en araldita
5.2. Inclusión en resina epon
5.3. Inclusión en resina de Spurr
6. REALIZACION DE LOS BLOQUES EN MICROSCOPIA
ELECTRONICA
1. INTRODUCCION
Los especímenes o muestras para estudio anatomopatológico pueden ser

preparados de muy diversas maneras, en función de la naturaleza de la muestra y
del tipo de técnica o estudio que vaya a realizarse. Con excepción de los tejidos
destinados a congelación o pulido, la mayor parte de las muestras para estudio
histopatológico requiere la inclusión en un medio sólido . Esta confiere a los
tejidos una dureza que impide su fragmentación durante el corte, mantiene la
estructura y las relaciones arquitecturales entre los distintos elementos y asegura
la obtención de cortes muy finos, regulares y homogéneos.
2. DESHIDRATA CION POR AGENTES QUIM ICOS
La deshidratación es el proceso que tiene por finalidad la eliminación com -

pleta de agua del espécimen o muestra tisular para que se pueda embeber
adecuadamente el tejido en aquellos medios de inclusión que no sean hidroso -
lubles. La deshidratación se puede llevar a cabo empleando agentes químicos o
reactivos deshidratantes o por procedimientos físico -químicos (criodesecación y
criosustitución - véase capítulo 3- ).
La deshidratación podrá realizarse utilizando cualquier reactivo capaz de
absorber el agua de los tejidos. Las condiciones esenciales de un buen agente
deshidratante son dos: 1) No debe alterar las estructuras tisulares, y 2)
Debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente acla-
rante.
Otras condiciones o ventajas deseables son: rapidez en concluir la deshidra -
tación, reducción a un mínimo aceptable del endurecimiento que provoca en
los tejidos, toxicidad o peligrosidad intrínseca mínimas. con escaso des-
prendimiento de vapores tóxicos (índices bajos de evaporación con una alta
presión de vapor), mínimos riesgos de incendio/explosión y baja toxici-
dad por inhalación, ingestión y contacto.
El proceso de deshidratación se suele realizar mediante el empleo del alcohol
etílico, y en él intervienen los siguientes parámetros:
a) Graduación de los alcoholes. En la práctica, la operación de deshi-
dratación se realiza empleando una serie de alcoholes de gradación ascenden-
te (50, 70, 80, 95 por 100, absoluto) , puesto que la acción brusca de un alcohol
de elevada gradación sobre el tejido provocaría una marcada retracción de éste.
El empleo de series más o menos largas de alcoholes de diferente gradación,
así como la decisión de iniciar el proceso en un alcohol de gradación media o
baja, estarán en función de la experiencia personal, la fragilidad de los tejidos a
incluir y el tipo de fijador utilizado (los fijadores con base alcohólica ya efectúan
cierta deshidratación durante el proceso de fijación) .
b) Volumen y número de los baños de deshidratación. No es preciso
que el volumen de alcohol sea demasiado elevado. Por lo general, suele reco-
mendarse un volumen del baño 10 veces superior al volumen de la
muestra que se va a deshidratar. aunque puede ser menor si se utiliza un
sistema agitador que impida el efecto de solvatación.
En cambio, se recomienda multiplicar el número de baños, puesto que tiende
METODOS Y TECNICAS DE INCLUSION 67
a producirse con bastante rapidez un estado de equilibrio entre el grado de

hidratación de la pieza y el del alcohol. Además, los baños múltiples implican :
1. Menor permanencia en cada baño, lo que ahorra tiempo y disminuye
el riesgo de endurecimiento excesivo del tejido.
2. Menor índice de saturación de agua en el alcohol, lo que posibilita
la reutilización del baño de alcohol.
3. Mejor control sobre el grado de deshidratación de la pieza o
tejido.
4. Menor riesgo de alteración tisular por cambio brusco en la fuerza de
extracción del agua.
e) Duración de la deshidratación. Se halla igualmente en función del
volumen de los fragmentos tisulares y de su contenido en agua, teniendo siem-
pre en cuenta dos premisas: 1 ) la deshidratación ha de ser completa, y 2) la
exposición prolongada al agente deshidratante provoca un endurecimiento de
los tejidos.
d) Empleo de agentes accesorios (sulfato de cobre anhidro, óxido de
calcio, resinas humectantes, etc.) durante el proceso de deshidratación. Es reco-
mendable usar estos agentes, porque eliminan el exceso de agua en el propio
agente deshidratante, consiguiendo una disminución de la presión de vapor del
agua de solvatación y, por tanto, un efecto deshidratante más uniforme. Ade-
más, suponen un cierto ahorro porque permiten reutilizar el baño deshidratante.
El sulfato de cobre anhidro sirve al mismo tiempo como indicador del grado de
deshidratación del baño de alcohol, ya que los cristales de sulfato de cobre
adoptan una tonalidad azul brillante cuando el líquido deshidratante se satura de
agua .
2.1. Principales agentes deshidratantes
Alcohol etílico (CH 3 CH 2 0H): es el agente más comúnmente usado. Exce-

lente deshidratante, presenta el inconveniente de que es muy inflamable y,
además, tiene un precio muy superior al del alcohol metílico. Para abaratar
costes es posible utilizar alcohol etílico desnaturalizado con metano!, también
denominado etanol para uso industrial.
Alcohol metílico (CH 3 0H): en ocasiones se emplea como sustituto del
anterior. Es muy inflamable y tóxico.
Acetona (CH 3 -CO-CH 3 ~: agente deshidratante muy volátil y de acción
rápida . Si el tratamiento de los tejidos es prolongado, aumenta extrardinaria-
mente su fragilidad .
Alcohol butílico (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 0H): es un deshidratante lento, misci-
ble con la parafina y que, por tanto, permite prescindir de los agentes aclarantes.
Dioxano (Dióxido de etileno): miscible con la parafina. Muy tóxico en
espacios pequeños.
Alcohol isopropílico (CH 3 CH[OH]CH 3 ): no puede utilizarse para la irí-
clusión en celoidina .
Tetrahidrofurano: agente de acción rápida que no causa retracción exce-
siva .
3. ACLARAMIENTO O DESALCOHOLIZACION
Su finalidad no es, como su nombre parece indicar, hacer transparente el

tejido, aunque en algunas ocasiones puede ocurrir esto.
Se trata de un proceso por el cual se consigue la sustitución del agente
deshidratante por una sustancia miscible con el medio de inclusión que
va a utilizarse. Con ello se pretende que toda la pieza histopatológica se halle
embebida en un agente químico líquido, en el que pueda disolverse el medio de
inclusión y, de éste modo, penetrar en el tejido.
3 .1. Agentes aclarantes
Son numerosos y su elección dependerá esencialmente de su rapidez para

eliminar el deshidratante, escasez de acciones nocivas sobre los tejidos y células
(endurecimiento, retracción , etc), adecuación del aclarante al agente deshidra -
tante y al medio de infiltración , facilidad de su eliminación, toxicidad, peligrosi-
dad intrínseca y coste. Los agentes aclarantes también reciben la denom inación
genérica de líquidos intermediarios.
La técn ica general de manejo de los agentes aclarantes incluye la realización
de baños sucesivos de duración variable en función de las características del
agente y del volumen de la pieza . En ocasiones se recomienda uti lizar, antes de
los baños de aclarante, diversas mezclas de agente deshidratante con el aclaran-
te en diferente proporción (2/ 1, 1 / 1, 1 / 2) .
3.2. Características de los principales agentes aclarantes
XILENO (DIMETIL BENCENO): el xileno comercial está compuesto por una

mezcla de orto- , meta- , y para -xileno:
Q cH, o-CH, H,c-Q-cH,

- CH 3
o - xileno CH 3 m -xileno p-xileno
Ventajas :
1. Es el agente aclarante más rápido .
2. No disuelve la celoidina.
3. Endurece poco los tejidos.
4. Se elimina fácilmente del medio de inclusión.
5. El punto óptimo de clarificación es fácil de apreciar.
Inconvenientes:
1. Es tóxico.
2. Sólo aclara desde el alcohol absoluto (100 por 100) .
3. Tiende a volver blanquecino el tejido.

4. Endurece si actúa mucho tiempo.
5. Tiende a la acidificación.
Interés práctico:
1. Aclara especímenes de grosor < a 5 mm en 1 /2 - 1 hora.
2. Empleo habitual (aclarante rutinario).
TOLUENO (METIL BENCENO):
Ventajas:
1. Es rápido (aunque menos que el xileno).
2. Endurece menos que el xileno y no blanquea los tejidos.
3. Puede conservar una muestra más de 12 horas sin alteración evidente.
4. Punto óptimo de clarificación fácil de apreciar.
Inconvenientes:
1. Es tóxico.
2. Sólo aclara a partir del alcohol absoluto (1 00 por 1 00).
3. Tiende a la acidificación.
Interés práctico
1. Tiempo de aclaramiento de un espécimen < 5 mm, 1 -2 horas.
2. Empleo habitual.
BENCENO:
Ventajas:
1.
2.
o
Es relativamente rápido .
Endurece muy poco y no blanquea.
3. Causa una retracción mínima.
4. Se elimina fácilmente.
Inconvenientes:
1. Muy tóxico.
2. Es altamente inflamable.
Interés práctico
1. Tiempo de aclaramiento de una muestra < 5 mm, 1 -3 horas.
2. Producto de sustitución .
CLOROFORMO (CHCI 3 ):
Ventajas:
1. Es muy tolerante.
2. No afecta al tejido.
3. Es lento.
4. Muy útil para tejidos fibrosos, muestras descalcificadas, piel, etc.
Inconvenientes:
1. El punto de aclaramiento es difícil de precisar.
2. El tejido tiende a flotar en el cloroformo.
3. Es muy difícil de eliminar de la parafina (a la larga, provoca el deterioro
del bloque) .
4. Es de olor poco agradable.
Interés práctico:
1. Tiempo de aclaramiento de especímenes de grosor < 5 mm: entre 12-24
horas.
2. Empleo en tejidos fibrosos, etc.
3. Producto de sustitución en determinadas condiciones.
TETRACLORURO DE CARBONO (CC1 4 ):

Ventajas:
1. No es inflamable.
2. Es de acción similar al cloroformo, pero más barato.
Inconvenientes:
1. Es muy tóxico.
2. Presenta inconvenientes similares a los del cloroformo.
Interés práctico:
1. Tiempo de aclaramiento: alrededor de 1 5 horas.
2. Utilización en piezas duras.
DIOXANO:
Ventajas:
() o
1. Por ser miscible con la parafina, puede emplearse de forma simultánea
como deshidratante y aclarante.
Inconvenientes:
1. Si no se realiza un intenso lavado previo, es incompatible con los fijado-
res que llevan dicromato.
2. Ofrece un índice de deshidratación más bajo que el del alcohol etílico.
3. Debe eliminarse el agua acumulada tras cada inclusión mediante trata-

miento con cloruro cálcico.
4. Es inodoro y muy tóxico (extremar las medidas protectoras incluyendo
obligatoriedad de empleo bajo campana de extracción de ga-
ses).
Interés práctico:
1. Empleo restringido a inclusiones donde está proscrita la deshidratación
en alcoholes.
4. INFILTRACION O IMPREGNACION
Es el proceso que tiene por objeto «rellenar o infiltrar» completamente

la muestra histopatológica con el medio que se va a utilizar para la
imbibición del tejido. El fundamento del proceso radica en la ocupación
completa con este medio de los espacios intra y extracelulares inicialmente
rellenos por el agua intratisular. Para conseguir este efecto, casi siempre es
imprescindible eliminar previamente todos los restos de aclarantes residuales en
el tejido. La finalidad última del proceso es proporcionar a la pieza anatómica
homogeneidad y dureza suficiente para que se puedan obtener secciones finas
de calidad. Aunque es posible realizar la inclusión en muy diferentes medios,
algunos de ellos hidrosolubles, el método de elección aún hoy día sigue siendo
la inclusión en parafina.
4.1 . Infiltración en parafina
Las parafinas son sustancias de tipo céreo compuestas por mezclas de hidro-
carburos saturados de cadena larga y que pueden obtenerse con una amplia
va ri ación en su punto de fusión (40°-70°), en gran medida condicionante de sus
diferentes aplicaciones en histotecnología.
Según el grosor de los cortes que se deseen obtener, el tipo de tejido y la
temperatura de corte (la temperatura ambiente ha de ser 30°- 35 oc inferior a la
de fusión de la parafina), se empleará uno u otro tipo de parafina (tabla 5.1 ) . Por
lo común , las parafinas de uso habitual poseen una temperatura de fusión de 54°
a 58 oc.
La dureza de la parafina está en función de la plasticidad, más que del punto
de fusión . El punto de plasticidad está unos pocos grados por debajo del punto
de fusión y se define como «la temperatura más baja a la que puede
ocurrir una deformación permanente sin fractura».
En la práctica diaria no suelen emplearse las parafinas clásicas, que tienen el
grave inconveniente de oxidarse con el paso del tiempo, adoptando una tonali -
dad amarillenta y consistencia más blanda, sino diversas mezclas con polímeros
plásticos de peso molecular controlado y otros aditivos que mejoran sus caracte -
rísticas como agente de inclusión. Estas mejoras pueden resumirse en :
- Obtención de cortes más uniformes y con menor efecto de compresión
sobre el bloque de tejido a la temperatura ambiente.
Tabla 5.3
Tiempo para procesamiento **

Baños Rápido manual En horno microondas *
Tiempo intensidad
- Formalina tamponada 30 minutos a 60 oc 3 minutos 25%
- Etanol al 70 por 100 30 minutos a 60 oc 5 minutos 25%
- Etanol al 96 por 100 30 minutos a 60 oc 5 minutos 25%
- Etanol absoluto 30 minutos a 60 oc 5 minutos 25%
- Etanol absoluto 15 minutos a 60 oc -
- Etanol absoluto 15 minutos a 60 oc -
- Etanol -acetona 15 minutos a 60 oc -
- Acetona 15 minutos a 60 oc -
- Xileno o tolueno 15 m a t . ambiente 5 minutos 25 %
- Xileno o tolueno 15 m a t. ambiente -
- Xileno o tolueno 15 m a t. ambiente -
- Parafina líquida 15 minutos a 60 oc 5 minutos 50%
- Parafina líquida 30 minutos a 60 oc 1 O minutos 50%
- Parafina líquida 1 hora a 60 oc -
Tiempo total 5 horas 30 minutos 38 minutos
• Según protocolo real izado en el hospital Nuestra Sra . de la Esperanza, Barcelona .

•• Vál ido tan sólo para material fresco no fijado .
b) Procesamiento automático de inclusión tisular

Desde hace años, los servicios asistenciales de anatomía patológica han
optimizado el procesamiento histopatológico de los tejidos empleando procesa -
dores automáticos que contienen múltiples vasos para realizar los baños y un
sistema mecánico de transporte a través de ellos regulado por un programador
horario (fig. 5.1) . Estos sistemas poseen tres ventajas fundamentales: a) permi -
ten procesar simultáneamente gran cantidad de muestras distintas; b) eco-
nomizan notablemente la cantidad de líquidos empleados en el proceso, y e)
realizan un rápido procesamiento a lo largo de la tarde/noche del día de
recepción y muestreo de las piezas, que están dispuestas para ser encastradas y
seccionadas en la siguiente jornada de trabajo.
Para obtener buenos resultados con estos sistemas es fundamental renovar a
menudo los líquidos contenidos en los baños: su enturbiamiento o la percepción
de olor a aclarante en el último baño de parafina indica la necesidad de cam -
biarlos.
En la tabla 5.2 se recoge uno de los muchos esquemas de programación .
e) Inclusión tisular mediante sistemas de presión negativa

Consiste en aplicar durante los baños de parafina un sistema de extracción
de gases por una bomba de vacío regulada a presión entre 400-500 mm de Hg
con la finalidad de: a) Eliminar la persistencia de vacuolas aéreas en el
tejido (sobre todo en el del pulmón) , y b) Extraer rápidamente los restos
de agente aclarante, facilitando su vaporización. Aunque se trata de una
práctica interesante, su aplicación es restringida por lo engorroso del mecanis-
Figura 5.1. Dos modelos de procesadores automáticos de tejidos: A)

Modelo de doble planta tipo autotechnicón que permite el movimiento
vertical de las muestras en el interior de los vasos para favorecer la inclusión.
8) Modelo de una sola planta que permite el movimiento rotatorio de las
cestillas portamuestras. Ambos disponen de reloj programador y vasos metá -
licos dotados de resistencias para mantener la parafina líquida.
mo. Un método de inclusión alternativo para piezas pequeñas y delicadas es el

de fijación por liofilización en el vacío seguida de inclusión directa en parafina
dentro de la propia bomba de liofilización (para más detalles, véase criofijación
en capítulo 3, así como procesamiento de muestras para microscopia electrónica
de barrido en capítulo 21).
ENCASTRAMIENTO DEL TEJIDO Y CONFECCION DE LOS BLOQUES

Este proceso consiste en la obtención de un bloque sólido de tejido, más
medio de inclusión, mediante el enfriamiento lento a 10°-15 oc
(temperaturas
más bajas producirían un efecto brusco de enfriamiento con contracción de los
bloques, que pueden llegar a fracturarse). La finalidad del proceso es obtener un
bloque fácil de manejar, de dureza homogénea y plasticidad y elasticidad ade-
cuadas, que permita realizar cortes de calidad sin distorsión ni fragmentación de
las estructuras constituyentes del tejido.
Para la realización de los bloques se utilizan las llamadas estaciones de
inclusión, que constan de (fig. 5.2) dispensador de parafina líquida, placa ca -
liente para la orientación de las piezas y placa fría para la solidificación del
S bloque (habitualmente a temperaturas inferiores a la ideal de 1 o °C.)
a
;-
Figura 5.2. Estación de inclusión dotada de dispensador de parafina líqui -

da, placa caliente y placa fría para solidificación de los bloques.
Fase 1. Orientación de la pieza

El espécimen infiltrado se coloca en la posición adecuada al tipo de corte que
se desea realizar, teniendo en cuenta que la cara inferior del bloque será la
superficie de corte (fig . 5 .3) . Esta posición deberá haber sido determinada antes
del procesamiento de la muestra, para lo cual la cara opuesta a la de corte deberá
ser marcada con tinta china durante la prosección.
Asimismo , deberá orientarse la pieza de tal modo que la parte más blanda del
tejido se corte primero, y la más dura o firme al final del proceso.
Fase 2. Moldes
Los moldes que se emplean en la confección de los bloques de parafina
suelen ser de base metálica (facilitan el enfriamiento homogéneo en dirección
ascendente y la transmisión del frío al medio de encastramiento).
El fondo de los moldes suele ser de tamaño variable, que se ajusta a los de las
piezas que se van a incluir; en ellos se encajan perfectamente las casetes que
llevan la muestra histológica y su identificación (fig. 5 .4), facilitando la confec-
ción de un bloque único que no precisa ningún tipo especial de montaje sobre el
portabloques del micrótomo . Los bloques pueden realizarse sin tamaño preesta -
blecido utilizando las clásicas pinzas de Leuckhart en forma de «L» (fig . 5.5).
4.2. Otros métodos de inclusión
Aunque se aplican muy raramente en la práctica asistencial diaria, son de

gran interés para procedimientos específicos de investigación o en determinadas
tecnologías especiales (sobre todo microscopia electrónica) . En general, se
plantea el empleo de medios alternativos de inclusión cuando : a) El tejido es
demasiado duro (p. ej ., hueso sin decalcificar) o contiene estructuras que se
desnaturalizan por el calor (estudio enzimático), o b) El tejido contiene abun-
dantes interfases de consistencia heterogénea (p. ej., globo ocular: esclera y
córnea , coroides, retina , vítreo, cristalino) o para el estudio se requieren seccio -
nes de espesor superior a 20 micras.
Figura 5.3. Dos instantáneas de la confección de bloques: A) Dispensan-

do la parafina sobre el molde metálico. B) Orientando la pieza y fijándola al
fondo del molde para colocar luego éste en la placa fría .
Figura 5.4. Moldes para la confección de los bloques de parafina . Casetes

y cestillas metálicas empleadas en la inclusión y como base del bloque
definitivo.
Figura 5.5. Pinzas clásicas de Leuckhart para la confección de bloques

de distinto formato.
A) INCLUSION EN GELATINA
La gelatina se utiliza como material de inclusión para muestras muy viables,

sobre todo para realizar cortes macromicrométricos de órganos completos en
micrótomos de tipo Tetrander (véase posteriormente), y como alternativa senci-
lla cuando se requieren cortes en congelación.
Al ser soluble en agua no es preciso deshidratar y aclarar el tejido, aunque
como el fijador desnaturaliza las proteínas que componen la gelatina esta sus-
tancia sí ha de ser completamente eliminada del tejido mediante lavado en agua
corriente en circulación continua durante 12-24 horas.
Además, como la gelatina tiene un punto de fusión bajo, las muestras infiltra-
das por este método no sufren el inconveniente del tratamiento a temperaturas
superiores a 40 oc. La inclusión se realiza mediante infiltraciones sucesivas en
gelatina a 37 oc en concentraciones crecientes.
Fijación: es preferible la formalina tamponada al 1 O por 100, aunque pueden

utilizarse otros.
1. lavado prolongado postfijación en agua corriente (12-24 horas).
2. Solución de gelatina al 1 O por 1 00 a 37 oc durante 24 horas.
3. Dos cambios en solución de gelatina al 20 por 1 00 a 37 oc de 12 horas
cada uno.
4. Confeccionar el bloque en molde adecuado con solución de gelatina al 20
por 100 y enfriar a 4 oc durante unas horás.
5. Retallar el bloque al tamaño deseado para las secciones.
6. Endurecer el bloque por inmersión en formalina cálcica al 1 O por 1 00
durante 12-24 horas.
-
• Observaciones:
1. Todas las soluciones de gelatina empleadas deben contener solución de
fenal al 1 por 100 para eludir la contaminación bacteriana.
2. Este tipo de inclusión presenta el inconveniente de que la gelatina no
puede ser eliminada del corte al ser solidificada por la acción del formol,
quedando fijados los colorantes que se hayan empleado previamente para
teñir los tejidos.
3. Las piezas incluidas por este método no deben exceder los 3 mm de
espesor para facilitar la penetración del agente de impregnación.
B) INCLUSION EN CELOIDINA
La celoidina es una sustancia amorfa, blancoamarillenta, insoluble en agua y
soluble en alcohol-éter al 50 por 1 00 y benzoato de metilo; en el primer caso
recibe la denominación de colodión elástico. Químicamente se corresponde con
una forma purificada de nitrocelulosa, empleándose por lo general como mezcla
de di- , tri- y tetranitrato de celulosa. Además, existe un derivado de la celoidina
de menor peso molecular: la nitrocelulosa de baja viscosidad, de mayor potencial
explosivo pero que se disuelve a mayor concentración en alcohol-éter.
La inclusión en celoidina se emplea en contadas ocasiones: en ciertos traba-
jos neurohistológicos y en muestras duras, frágiles o de gran heterogeneidad
(grandes cortes de tejido óseo, globo ocular, etc.) . Con este procedimiento se
obtienen bloques de gran dureza y no se precisan temperaturas elevadas. Sin
embargo, la mayor limitación para su empleo deriva del mucho tiempo necesario
para completar el procesamiento, tiempo que se mide en días, o incluso en
semanas, más que en horas. Por otra parte, los cortes obtenidos a partir de
celoidina no pueden ser inferiores a 1O ¡.tm de grosor (media de 15 ¡tm).
Fijación: es preferible la formalina tamponada al 1O por 100, pero pueden em-

plearse otros agentes a excepción del ácido pícrico, con el cual es incompatible.
Modo de operar:
a) Deshidratación: debe ser completa y perfecta. Para ello se realizan los
siguientes pasos:
1. Alcohol etílico de 70° de 1 a 3 días según el tamaño de la pieza .
2. Alcohol etílico de 96° de 2 a 5 días, dependiendo del paso anterior.
3. Alcohol absoluto de 2 a 5 días, dependiendo del paso anterior.
• Observaciones: durante la deshidratación deben renovarse los alcoholes
al menos una vez para cada paso.
b) Aclaramiento: se realiza en una mezcla de alcohol -éter al 50 por 100
durante 12-24 horas.
e) Infiltración: se realiza en soluciones crecientes de celoidina .
1. Solución débil (celoidina al 2 por 100 o nitrocelulosa de baja densidad al
5 por 1 00) durante 3-5 días.
2. Solución media (celoidina al 4 por 100 o nitrocelulosa de baja densidad al

1O por 1 00) durante 5 días.
3. Solución fuerte (celoidina al 8 por 100 o nitrocelulosa de baja densidad al
20 por 1 00) durante 5 días.
d) Endurecimiento: dos imperativos condicionan la confección adecuada
de un bloque de celoidina : a) la evaporación uniforme y lenta del solvente, y b)
la ausencia de formación de burbujas de aire. Por ello, la celoidina se endurece
colocando el tejido embebido en un recipiente descubierto bajo campana de
extracción de gases en el que se vierte celoidina espesa al 14 por 100 o nitrocelu-
losa de baja densidad al 30 por 1 OO. Se deja reposar algunos días para evaporar
el solvente, comprobando la dureza con el extremo de una varilla de vidrio. Cuando
el bloque adquiere al tacto la consistencia del caucho, se talla y se conserva en
alcohol al 80 por 100, donde se endurece aún más hasta que se proceda al corte.
e) Montaje del bloque sobre el portabloques del micrótomo: se rea -
liza agregando al portabloques cierta cantidad de solución concentrada de celoi-
dina o nitrocelulosa que se coloca encima el bloque de tejido. Es preferible realizar
este paso durante la fase anterior de endurecimiento. A continuación, se deja
evaporar el solvente para que ambas piezas formen un cuerpo común .
•Precauciones generales:
a) Todas las soluciones deberán guardarse en frascos herméticos para
impedir la evaporación del éter y la humidificación del alcohol.
b) Antes de su disolución, la celoidina debe secarse sobre papel de filtro
a 37 C toda la noche y pesarse una vez seca, humidificándola durante varias
horas en un volumen de alcohol al que se añade a continuación un volumen igual
de éter. Tras mezclarla con cuidado, se deja reposar toda la noche.
C) INCLUSION DE TEJIDOS EN MEDIOS HIDROSOLUBLES

DISTINTOS DE LA GELATINA
Se emplean fundamentalmente para la demostración de enzimas, lípidos y cuan -
tos elementos intratisulares puedan ser desnaturalizados por el calor o por el
tratamiento con agentes deshidratantes y aclarantes.
El producto más empleado es el polietilenglicol y sus derivados, que son
polímeros de peso molecular variable y fórmula genérica HOCH 2 (CH 2 0CH 2 )n
CH 2 0H . Como regla general, las moléculas de peso inferior a 1000 se encuen -
tran en estado líquido y son hidrosolubles; a medida que el peso aumenta, o lo
que es igual , se incrementa el grado de polimerización, aumenta de forma
paralela su grado de viscosidad hasta alcanzar un punto en que se transforman
al estado sólido (carboxirresinas) .
El fundamento del método radica , pues, en embeber el tejido en polietilglicol
de bajo peso molecular para realizar después polimerización, por lo común
empleando monoestearato de polietilenglicol, químicamente activo y capaz de
desencadenar la unión molecular.
Fijación: dependerá del elemento intratisular que pretende demostrarse (p. ej.,
formalina tamponada al 1 O por 100 para lípidos, fijadores alcohólicos para glu-
cógeno, ninguna fijación para actividad enzimática, etc.) .
Modo de operar:
1. Lavado postfijación prolongado en agua destilada.
2. Solución acuosa de polietilenglicol (pM = 550, aunque puede variar li-
geramente dependiendo del reactivo comercial elegido) al 50 por 100
durante 30 minutos.
3. Solución acuosa de polietilenglicol 550 al 70 por 100 durante 30 minutos.
4. Solución acuosa de polietilenglicol 550 al 90 por 100 durante 60 minutos.
5. Solución concentrada de polietilenglicol 550, 30 minutos a 37 °C.
6. Solución concentrada de polietilenglicol 550, 30 minutos a 37 oc.
7. Solución concentrada de polietilenglicol 1000, 30 minutos a 37 °C.
8. Mezcla a partes iguales de polietilenglicol 1000 y activador de la poli-
merización durante 20 minutos a 37 °C.
9. Solución concentrada de activador durante 20 minutos a 37 oc.
1O. Una vez realizados los bloques, se guardan en refrigerador a 4 oc.
• Observaciones:
a) El método de inclusión que se expone corresponde a una de las muchas
ceras carbónicas para inclusión disponibles comercialmente. Estos pasos
pueden modificarse de forma notable en función de los reactivos escogi-
dos.
b) Es preferible realizar el procesamiento en moldes individuales recubiertos
de una fina capa de albúmina glicerinada, a fin de que el colado de bloque
se lleve a cabo de forma simultánea a la infiltración del tejido . En caso con-
trario, la confección del bloque se realiza polimerizando directamente po-
lietilenglicol concentrado con iniciador.
e) La agitación continua durante el proceso de imbibición acelera la inclu-
sión y mejora los resultados.
d) Los cortes se realizan preferentemente en criostato y se extienden en una
solución de 40 partes de dietilenglicol, 1 O partes de formol concentrado al
40 por 1 00 y 50 partes de agua . Es aconsejable efectuar el montaje en so-
luciones adherentes específicas (gelatina-glicerina, gelatina -crómica, etc.).
4.3. Inclusión en plástico (resinas)
La utilización de resinas acrílicas (metilmetacrilato, glicolmetacrilato, butil-

metacrilato, resinas hidrosolubles, etc.) o de tipo epoxi como medio de incluir
tejidos ha experimentado un notable desarrollo en los últimos tiempos (fig. 5.6) .
Este método ha llegado ha ser el procedimiento básico de infiltración en micros-
copia electrónica de transmisión, así como en el estudio de tejido óseo sin
descalcificar y de materiales de elevada dureza (p. ej ., dientes) . Las resinas
plásticas se emplean asimismo en microscopia óptica de alta resolución, ya que
permiten realizar cortes muy finos con excelente conservación de la estructura y
Figura 5.6. Procesador automático para la inclusión en plástico.
aplicar sobre ellos técnicas de histoenzimología e inmunohistoquímica cuando

la resina es hidrosoluble.
Todos los métodos existentes se basan en la polimerización de una sustancia
elemental de bajo peso molecular hasta transformarla en un compuesto sólido,
transparente y de gran dureza. El procedimiento más simple es la inclusión en
metacrilato, que se comentará más adelante.
La deshidratación del material ha de ser exhaustiva, y suele llevarse a cabo en
acetona . A continuación se procede a infiltrar con el monómero plástico, activa-
do mediante la adición de un catalizador. El tiempo de infiltración varía según el
plástico que se utilice. Antes de que el plástico solidifique, se prepara la pieza ya
infiltrada para la confección del bloque, orientándola y colocándola en el molde
preparado al efecto.
Muchas de las resinas empleadas tienen el inconveniente de que su polimeri -
zación se realiza en forma de reacción exotérmica que puede inducir daño en los
componentes celulares debido a la elevada temperatura que se alcanza.
A continuación se exponen las técnicas de inclusión en metilmetacrilato y
resinas hidrosolubles de aplicación en microscopia óptica. Los métodos emplea-
dos en microscopia electrónica se estudian dentro de este epígrafe.
A) INCLUSION EN METILMETACRILATO
La sustancia elemental empleada como agente de infiltración es el metilmeta -
crilato monomérico, que responde a la fórmula general CH 2 = C(CH 3 )COOCH 3 .
Pero debido a la extrema dureza que posee el polímero en su forma pura, se
suelen preparar mezclas con una sustancia análoga, el metacrilato de butilo que,
aisladamente formaría un polímero demasiado blando para ser cortado. Como
activador de la polimerización se utiliza el peróxido de benzoilo, que, en condi -
ciones de polimerización adecuadas ~· produce radicales fenilo que reaccionan
con los monómeros de acrilato rompiendo el doble enlace entre los carbonos; de
esta forma los carbonos se ligan a otra molécula vecina de acrilato. El electrón
libre generado puede perpetuar el proceso hasta que todas las moléculas de
acrilato estén desdobladas al reaccionar con nuevas. moléculas vecinas. (Para
procesamiento técnico véase capítulo 32).
B) INCLUSION EN RESINAS HIDROSOLUBLES:

GLICOLMETACRILATO Y JB4
INCLUSION EN GLICOLMETACRILATO
El 2-hidroxietil metacrilato o glicolmetacrilato es una resina acrílica miscible

con el agua, lo que la diferencia del metilmetacrilato. Habitualmente no se
emplea en estado puro, sino con adición de otras sustancias como el polietilen-
glicol y el butoxietanol, que le confieren mayor plasticidad. El fundamento de la
inclu sión es análogo al de la inclusión en metilmetacrilato con la adición de la
NN-dimetilanilina como acelerador.
Fijación: cualquiera, preferiblemente formalina tamponada .
Preparación de las resinas:

Solución A :
-2-hidroxietil metacrilato ........................... . 320 ml
- Butoxietanol ................................... . 32 ml
-Peróxido de benzoilo ... ... .. .. . ...... . .... .. ... .. . 2g
Los reactivos pueden mezclarse directamente, pues al ser hidrosoluble la resina,
el agua contenida en el peróxido no interfiere en el proceso.
Solución 8:
- Polietilenglicol 400 ......... ............ .... .. ... . 8 partes
- N,N-Dimetilanilina .............................. . 1 parte
La solución debe ser preparada en el momento de usarla.
Modo de operar:
1. Deshidratar en alcoholes crecientes (70, 96 por 100 y absoluto), dos cam-
bios de 15 minutos para cada uno de ellos. La deshidratación puede no ser
completa, ya que el glicolmetacrilato es miscible con agua.
2. Infiltrar en dos cambios de la solución A, de 5 horas de duración cada uno.
3. Embeber en una mezcla de 42 partes de la solución A y una parte de la so-
lución B.
4. Confeccionar los bloques y dejar polimerizar toda la noche a temperatura
ambiente colocando los moldes en un baño de agua fría para disipar el ca -
lor liberado durante la polimerización.
• Observaciones:
a) La solución B no debe entrar en contacto con la solución A hasta la fase
final de proceso, una vez confeccionados los bloques, pues podría produ -
cirse la polimerización espontánea de la resina .
b) Aunque la conservación del tejido es mejor que la proporcionada por el
metilmetacrilato, el glicolmetacrilato tiene el inconveniente de que es más
difícil de seccionar y no puede ser eliminado del tejido, por lo que interfiere
de forma más acusada en la coloración .
Inclusión en resinas hidrosolubles utilizando preparados comerciales

(JB4. LR White, etc)
Por lo general , se trata de resinas acrílicas totalmente solubles en agua, lo
que permite usarlas directamente para infiltrar tejidos no deshidratados, al igual
que el polietilenglicol. Se venden en forma de preparados para empleo directo,
con dos soluciones -de infiltración y de aceleración- y un catalizador. El
fundamento básico de la inclusión es equivalente al descrito para otras resinas
acrílicas. En cuanto a su utilización, basta con seguir las instrucciones del
fabricante. Poseen la gran ventaja de ser de fácil manejo, pero su costo suele ser
elevado.
5. LA INCLUSION EN MICROSCOPIA ELECTRONICA
En microscopía electrónica los procesos de inclusión son , a grandes rasgos,

idénticos a los descritos para la inclusión general, pues sus procedimientos
obedecen a la misma dinámica. No obstante, la metodología y los medios
empleados deben estar en consonancia con el producto final que se desea
obtener: un corte dispuesto para observación . Por las características del proceso
de observación en microscopía electrónica, el corte debe poseer dos cualidades
fundamentales: a) una extraordinaria finura o delgadez que permita el paso de
los electrones para proyectar una imagen, y b} una presentación idónea de la
estructura celular y subcelular objeto de observación .
Respecto a la primera condición , la microscopía electrónica impone necesa -
riamente el empleo de un medio de inclusión de elevada dureza, que permita
obtener secciones ultrafinas. Por este motivo, las características físico-químicas
del medio de inclusión condicionan toda la cadena de reactivos previos al
encastramiento, corte y tinción .
Deshidratación
Entre los agentes de deshidratación más comúnmente empleados en micros -
copía electrónica se encuentran el etanol y la acetona, aislados o combinados. El
principio fundamental del proceso de deshidratación es que ha de ser exhausti -
va , porque la mayor parte de los medios de inclusión utilizados son fuertemente
hidrófobos y la persistencia de restos acuosos hace prácticamente imposible la
ulterior sección del bloque.
Por lo general , el número de baños y los tiempos de permanencia en cada
uno de ellos tenderán a ser más cortos que en la inclusión en parafina, dado que
el volumen de las piezas destinadas al estudio con microscopía electrónica es

sensiblemente menor que en el caso de la microscopia óptica.
Una pauta válida empleando exclusivamente alcoholes pued~ ser la si-
guiente:
- Alcohol etílico al 50 por 1 00 ...................... . 5 minutos
- Alcohol etílico al 70 por 1 00 . . ..... . . .. . . ... .. ... . . 1 O minutos
- Alcohol etílico al 96 por 100 ....... . .... .. ..... . .. . 1 O minutos
- Alcohol etílico absoluto . ........ . . . .. . .... ... .. .. . 3 x 5m
Una pauta combinada , quizás más adecuada debido al mayor poder deshi-
dratante de la acetona, puede incluir la sustitución con acetona absoluta de los
dos pasos finales por etanol absoluto.
líquidos intermediarios
Si el etanol o la acetona son miscibles con el agente de inclusión, es posible
el cambio directo del tejido al agente. Pero incluso en ese caso suele ser
preferible utilizar algún agente de transición que facilite la penetración del medio
de infiltración . De hecho, prácticamente todos los laboratorios coinciden en
emplear el 1 :2 epoxipropano u óxido de propileno, sobre todo cuando se ha
escogido como medio de inclusión algún tipo de epoxirresina . En el caso del
procesamiento rutinario, suelen emplearse 2-3 pasos de 5-15 minutos de dura -
ción cada uno.
Inclusión
Por lo común, el medio utilizado para la inclusión en microscopía electrón ica
es de tipo plástico. Aunque existen numerosas variedades de este medio, el
procedimiento general es válido para todas ellas y equivalente al indicado para la
inclusión plástica en general.
En un principio, la mayor parte de los laboratorios realizaban la inclusión en
meti lmetacrilato, pero desde la introducción de las epoxirresinas el interés de esa
inclusión ha quedado casi reducido al meramente histórico. El fundamento
general del método y su procedimiento técnico son idénticos a los expuestos. En
general, los metacrilatos poseen la ventaja de que su elasticidad y du reza pueden
ser modificadas en función de la proporción de monómeros que constituyen la
mezcla final , siendo posible adaptarlas a la dureza y composición del tejido que
se vaya a procesar. Sin embargo, han caído en desuso debido a sus inconve-
nientes, tales como la dificultad para el corte y los artefactos que induce por
alteraciones en la polimerización .
Inclusión en epoxirresinas
Este grupo de sustancias está integrado por un ampl io conjunto de polímeros
plásticos entre los cuales se encuentran el araldite, la resina epon y la resina de
Spurr, que por retraerse escasamente (menos de un 2 por 1 00 del volumen
total} , suelen proporcionar una buena conservación de la estructura subcelular y
mayor preservación del corte que el metacrilato. Este último hecho se debe a su
menor índice de sublimación bajo el haz electrónico y a su mayor conductibili -
dad térmica . Sus inconvenientes más graves son, tal vez, su elevada viscosidad,
que d ificulta y enlentece la penetración en el tejido, y la toxicidad de sus
moléculas, pri ncipalmente del componente denominado dióxido de vinilciclohe -
xano (VCD) , considerado un potente carcinógeno y determinante de las nume-
rosas normas establecidas para su manipulación .
Precisamente la dificultad de manejo de las primitivas resinas (araldita, epon
812) condujo a Spurr a introducir en 1969 una resina de muy baja viscosidad,
desarrollando un esquema de inclusión que hoy lleva su nombre y es el utilizado
en la mayor parte de los laboratorios a pesar de sus inconvenientes (escaso
contraste f inal con el c itrato de plomo, que requiere el uso adicional del acetato
de uranilo como contraste suplementario, y extrema toxicidad) .
El fundamento general de la inclusión en epoxirresinas radica en la utilización
de una resina monomérica líquida que se transforma en un polímero sólido de
gran dureza en presencia de calor, un endurecedor, un acelerador de la reacción
y, opcionalmente, un agente plastificante que disminuye su fragilidad . El cata-
lizador es, por lo común , un anhídrido responsable de la ruptura de los enlaces
de tipo éster del monómero para que aparezcan los puentes intermoleculares
determinantes de la polimerización . A medida que aumenta la longitud de la
cadena alifática del anhídrido, se incrementa la plasticidad interna del polímero.
Entre los aldeh ídos, se utilizan fundamentalmente el dodecinilsuccinico (DDSA)
y el metilnádico (AMN) .
Como aceleradores de la polimerización se emplean derivados amínicos co -
mo la bencildimetilamina (BDMA) u otros que poseen además propiedades
plásticas, como el dimetilaminofenol (DMP30) o el ftalatodibutilo (DBP) .
5.1. Inclusión en araldita
Lo esencial de este procedimiento de inclusión estriba en la utilización de la

dosis exacta de agente plastificante, en este caso el dibutilftalato, de manera que
al ir creciendo la cantidad del mismo aumenta la plasticidad del bloque y
dism inuye su dureza. Por este motivo es difícil definir una pauta de inclusión
válida para todos los casos posibles, sobre todo considerando que cuanto más
duro es el tejido menor plasticidad del bloque se requiere .
5.2. Inclusión en resina epon
La resina epon, de menor viscosidad que la araldita, representó la primera

alternativa para solventar los problemas que plantea ésta . Contrariamente a lo
que sucedía con la araldita, los esquemas de inclusión son aquí muy semejantes
en lo que respecta a la composición del reactivo, de forma que se constituyen
dos resinas de diferente dureza y composición constante que, al mezclarse en
distintas proporciones, confieren la dureza deseada al bloque.
Reactivos:
SolucionA de almacenamiento (resina blanda):
-Resina epon 812 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 ml
- DDSA .. ... .......................... . .. . ... . .. 100 ml
Solución 8 de almacenamiento (resina dura) :

-Resina epon 812 ............. .. ................. . 100 ml
-MNA .............. . .......................... . 89 ml
Soluciones de trabajo de dureza intermedia (válidas para rutina):

1) -Solución A ...... . .. . .... . .... . ..... . .......... . 12.0 ml
-Solución B ...... .. . . .. . .. . ... .. ...... ... ...... . 8.0 ml
-Acelerador (DMP30) .......... .. ................ . 0.3 ml
11) -Solución A .................................... . 30.0 ml
-Solución B ........ ............... ... ..... . .... . 70.0 ml
-Acelerador (DMP30) .. .. .... .. .... .. ...... .... .. . 1.5 ml
La solución 1 está diseñada para incluir tejidos más blandos y la 11 tejidos de
mayor consistencia. Debido a la baja viscosidad de las mezclas, la agitación de los
reactivos debe ser continua.
Modo de operar:
1. Si el tejido procede de óxido de propileno, se inicia la inclusión con un
baño de óxido de propileno y medio de inclusión de 60 minutos a tempera-
tura ambiente. Si sólo se ha realizado deshidratación en etanol es conve-
niente intercalar dos baños de óxido de propileno de 5 minutos cada uno
a temperatura ambiente.
2. Eliminar el reactivo por decantación y realizar una infiltración de 2 a 6 horas
con la solución de trabajo elegida a temperatura ambiente.
3. Colocar la muestra en nuevo medio de inclusión y polimerizar a 60 oc du-
rante toda la noche.
5.3. Inclusión en resina de Spurr
Se trata de una resina de muy baja viscosidad cuyo uso está ampliamente
extendido pese a los inconvenientes señalados. Básicamente consiste en una
mezcla· de un diepóxido alifático cíclico (vinilciclohexano, VCD o ERL 4206)
con un plastificador (polipropilenglico/ o DER 736), un endurecedor como el
anhídrido nonenilsuccínico (NSA) y el acelerador dimetilaminoetanol. DMAE o
S-1. Si se quiere disminuir aún más la viscosidad, se puede utilizar como
plastificador el anhídrido hexenilsuccínico y como endurecedor el butanidiolgli-
ceril éter.
Reactivos:
- ERL 4206 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 ml
-DER 736 ........................ .. ........ . ... . 19 ml
- NSA ........ . ..... . .. . ........... . ........... . . 78 ml
Mezclar con agitador magnético durante 15 minutos y añadir lentamente 1.4
ml de acelerador S-1 manteniendo la agitación. Almacenar a - 20 oc para eludir
la polimerización espontánea. La resina puede conservarse un máximo de 8 se-
manas.
Modo de operar:
1. Tras la fijación en glutaraldehído y refijación en tetróxido de osmio, el tejido
debe ser lavado en agua destilada e impregnado en bloque para aumentar
el ulterior contraste con acetato de uranilmagnesio en solución acuosa al
2 por 100 30 minutos a temperatura ambiente.
2. Deshidratar en etanol o acetonas crecientes según la pauta estándar.
3. Aunque no imprescindible, sí es conveniente realizar dos cambios en óxido
de propileno de 15 minutos cada uno.
4. Impregnar en una mezcla de óxido de propileno y resina de Spurr al 50 por
100 durante 30 minutos a temperatura ambiente.
5. Infiltrar con la resina de Spurr durante 2 horas a temperatura ambiente.
6. Embeber con resina en el molde para bloques y polimerizar a 60 oc duran-
te toda la noche.
• Observaciones:
a) La dureza final del bloque puede controlarse aumentando la cantidad de
DER 736, que provoca un reblandecimiento. El incremento de acelerador
disminuye rápidamente la viscosidad y completa antes la polimerización
final. Sin embargo, debe controlarse estrictamente su uso para evitar una
infiltración deficiente.
b) Un problema adicional de la resina de Spurr es la imposibilidad de elimi-
narla del tejido, por lo que las técnicas de coloración de microscopia con-
vencional están muy restringidas y, en general, han de ser modificadas para
su empleo en estas condiciones.
6. REALIZACION DE LOS BLOQUES

EN MICROSCOPIA ELECTRONICA
El encastramiento y confección de los bloques suele realizarse en moldes

plásticos o de silicona, que se desechan tras la polimerización seccionándolos
longitudinalmente con una cuchilla , o en cápsulas de gelatina que se eliminan
por disolución en un baño de agua a 70 oc. Cuando la muestra a estudio
requiere condiciones de orientación especiales, la manipulación, una vez coloca -
da en la resina fresca del molde, ha de realizarse con extremo cuidado para no
producir burbujas.
CAPITULO 6
Micrótomos y técnicas
de corte de los tejidos
GUION DE CONTENIDOS
1. CONCEPTO
2. TIPOS DE MICROTOMOS
2.1. De oscilación o balanceo
2.2. De rotación
2.3. De deslizamiento
2.4. De congelación
2.5. Criostato o criotomo
2.6. Ultramicrótomo
3. TIPOS DE CUCHILLAS PARA EL MICROTOMO
4. AFILADO DE LAS CUCHILLAS DEL MICROTOMO
5. TECNICA DE CORTE SOBRE BLOQUES DE PARAFINA
6. TECNICA DE CORTE PARA MATERIAL INCLUIDA
EN CELOIDINA
7. TECNICA DE CORTE SOBRE MATERIAL CONGELADO
8. CORTE EN EL MICROTOMO DE CONGELACION CLASICO
9. TECNICA DE CORTE EN EL CRIOSTATO
10. TECNICAS DE CORTE Y MANEJO DE LAS SECCIONES
1. CONCEPTO
El micrótomo es un instrumento mecánico con el que se realizan secciones

tisulares de espesor micrométrico y, por tanto, lo suficientemente delgadas para
permitir su ulterior observación microscópica.
Existe seis tipos fundamentales de micrótomos: micrótomo oscilatorio o
de balanceo, micrótomo de rotación o tipo Minot, micrótomo de desli-
zamiento, micrótomo de congelación, criostato o criotomo, y ultrami-
crótomo.
Todos los micrótomos poseen idénticos principios básicos de funcionamien-
to: un portabloques en el que se apoya el material que se va a cortar avanza
discontinuamente sobre una cuchilla gracias a un mecanismo regulable de cre-
mallera. De forma periódica se hace incidir el bloque sobre la cuchilla, obtenién-
dose secciones tisulares de espesor equivalente al seleccionado previamente en
el tornillo micrométrico que controla el mecanismo de avance.
Se denomina «portabloques» al dispositivo donde se coloca el material tisular
incluido en algún medio de homogenización (por lo común, parafina) . En los
portabloques antiguos la fijación del bloque se realizaba adhiriéndolo, con para -
fina previamente calentada, a la superficie rugosa del portabloques. Los moder-
nos micrótomos poseen un mecanismo de pinza que se adapta a cualquier tipo
de base o molde con el que esté fabricado el bloque. Es conveniente que el
portabloques esté también provisto de un dispositivo de orientación que garanti-
ce su paralelismo con la cuchilla (fig. -6.1 ).
El portacuchillas clásico consiste en un dispositivo de fijación basado en una
pinza orientable espacialmente. Esta pinza permite variar el ángulo de inclina-
ción de la cuchilla , así como su grado de aproximación al portabloques (fig.
6.2) .
Se denomina «mecanismo de avance» del portabloques sobre la cuchilla al
sistema mecánico o electrónico que proporciona cortes sucesivos de tejido a
partir del bloque. El continuo perfeccionamiento de los sistemas de avance, así
Figura 6.1. Detalle del portabloques del micrótomo de parafina o tipo

Minot.
MICROTOMOS Y TECNICAS DE CORTE DE LOS TEJIDOS 91
Figura 6.2. Detalle del portacuchillas del micrótomo de parafina y de la

maniobra de orientación y ajuste de la cuchilla .
como su motorización, ha permitido una progresiva mejora de las técnicas de

corte. En la actualidad se roza el límite de 1 micra de espesor en micrótomos
mecánicos, lo que hace 1 O años sólo parecía estar al alcance de los ultramicróto-
mos.
2. TIPOS DE MICROTOMOS
2.1. Micrótomo de oscilación o balanceo
Este tipo de micrótomo, utilizado tradicionalmente para cortar bloques de

tej ido incluido en parafina, ha quedado relegado a la función de sistema de corte
en algunos criostatos.
Posee un mecanismo de avance de tornillo y las secciones se obtienen por
un sistema oscilatorio de palanca que realiza el portabloques sobre la cuchilla al
bascular sobre ella apoyándose en un pivote intermedio.
Su principal ventaja como dispositivo de corte radica en su simplicidad y su
bajo coste, si bien su mecanismo de funcionamiento no permite obtener seccio -
nes seriadas.
2.2. Micrótomo de rotación o tipo Minot
Desde su introducción en 1885, ha sido probablemente el instrumento más

empleado en los laboratorios de anatomía patológica (fig . 6.3) . A diferencia del
micrótomo de balanceo, el portabloques, colocado en posición vertical, se mue-
ve arriba y abajo delante del filo de la cuchilla . Cuando el movimiento de
rotación del brazo del micrótomo se convierte en lineal se produce además el
avance automático y constante del portabloques.
Figura 6.3. Micrótomo de parafina o tipo Minot.
Ventajas:
La gran desmultiplicación que produce el cambio de un mov1m1ento de
rotación a otro de traslación , así como el mayor peso del instrumento, le confiere
gran precisión y le permite producir secciones seriadas muy finas.
Inconvenientes:
Los principales inconvenientes de este tipo de micrótomo son su elevado
precio, debido a la complejidad del mecanismo de avance -que además difi-
culta y encarece las reparaciones- , y la imposibilidad de cortar con él tejidos
incluidos en celoidina, gelatina y propilenglicol.
2.3. Micrótomo de deslizamiento
Existen dos tipos fundamentales de micrótomos de deslizamiento, según que

se movilice el portabloques sobre la cuchilla, permaneciendo ésta fija, o vicever-
sa . En ambos casos, el movimiento que produce el corte es el avance y retroceso
de la porción móvil del micrótomo sobre unas guías metálicas.
El primer modelo, de portabloques deslizante o tipo Leitz (fig. 6.4). es
más estable y proporciona mejor calidad de corte, porque la vibración de la
cuchilla se elimina al permanecer fija . En los dos casos el mecanismo de avance
es puramente de tornillo, y se activa para cada sección al impactar contra un
pivote al final del recorrido sobre las guías metálicas. El segundo modelo, de
cuchilla móvil o tipo Reichert-Jung, se encuentra en desuso por los proble-
mas que provoca la excesiva vibración de su cuchilla, muy voluminosa. Junto a
los dos tipos descritos, existe un tercer modelo de micrótomo de deslizamiento
de gran tamaño, denominado de tipo Tetrander, que se emplea para realizar
secciones macro - microscópicas de órganos completos.
Ventajas:
Las principales ventajas de estos micrótomos derivan de: 1) su diseño y
construcción sencillos, que ocasionan muy pocas averías; 2) el control directo
Figura 6.4. Micrótomo de deslizamiento.
por el operador de la inercia de corte, lo cual permite, para cada secc1on, la

regulación exacta de la presión de la cuchilla sobre el tejido; 3) las
grandes dimensiones de su cuchilla, que permiten seccionar bloques tisula-
res de mayor tamaño, y 4) la peculiar disposición de esta última, que permite
efectuar cortes sobre tejido incluido en celoidina.
Inconvenientes:
Entre sus inconvenientes merecen destacarse los siguientes: 1) no permite
realizar cortes seriados, por lo que la lentitud del proceso de corte es mayor;
2) la exposición de su cuchilla favorece la producción de accidentes, y 3) es
casi imposible obtener secciones de un espesor inferior a 8 micras.
2.4. Micrótomo de congelación
Se utiliza para efectuar secciones de tejido congelado y no deshidratado. La

congelación del material se realiza haciendo circular por el interior de su porta -
bloques hueco una corriente de anhídrido carbónico procedente de una bombo-
na a presión . De esta manera el gas, al expandirse, provoca el enfriamiento del
tejido. Una vez congelado el material, las secciones se practican con una cuchi-
lla que pivota sobre un eje fijo, de forma que el avance lo realiza el portabloques
por un mecanismo directo de tornillo (fig . 6 .5).
Debido a sus grandes inconvenientes (dependencia del gas carbónico para
mantener la congelación, espesor de los cortes - por lo común superiores a 1 O
micras- y dificultad para su estiramiento), este tipo de micrótomo ha sido
desplazado por el criostato, salvo cuando se precisan secciones de gran espesor
para estudio simultáneo arquitectural e histoquímico, como en el caso de algu -
nas técnicas para sistema nervioso.
Figura 6.5. Micrótomo de congelación .
2.5. Criostato o criotomo
Consta de un micrótomo de tipo Minot, semejante al convencional de parafi-

na . incluido en una cámara de congelación. El volante de inercia que controla la
realización del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el
mecanismo de avance están situados dentro de la cámara fría (normalmente. a
- 20 °C) . Pese a la disposición horizontal de la cuchilla , la obtención de seccio -
nes seriadas es posible gracias a la existencia de un sistema antienrollamiento
que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla (fig . 6 .6).
En los modelos más modernos es posible optar por el corte manual o motori -
zado, así como enfriar rápidamente la muestra a - 60 oc gracias a la existencia de
una placa de congelación instantánea .
Frente al micrótomo convenc ional de congelación , el criostato posee la gran
ventaja de que permite realizar cortes mucho más delgados (por lo general de 4
micras, y en manos experimentadas, hasta de 2 micras). Por ello, en los servicios
de anatomía patológica es de uso común para realizar no sólo biopsias intraope-
ratorias, sino tamb ién todos los estudios histoenzimáticos o inmunohistoquími -
cos que se practican sobre tejido congelado.
2.6. Ultramicrótomo
Es un micrótomo básicamente derivado del tipo Minot para cortes en parafi-

na, aunque dotado de numerosas mejoras técnicas que permiten efectuar sec-
ciones de hasta unas pocas decenas de nanómetros de espesor a partir de
material incluido en plástico.
Figura 6.6. Criostato . A : inserto de cuchilla; 8: criostato.
Los principales avances tecnológicos que incorpora son: 1) sistema de ilumi -

nación múltiple con luz incidente sobre el bloque, transiluminación de éste y
campo oscuro; 2) avance térmico por dilatación de una varilla metálica, o
mecánico de alta precisión , controlados ambos automáticamente por un mi-
croordenador que permite el ajuste digital en pasos de 1 nm; 3) platina portacu-
chillas regulable y apta para cuchillas de vidrio o diamante; 4) sistema óptico
con microscopio esteroscópico incorporado; 5) movimiento motorizado regula-
ble del brazo, y 6) unidad de control independiente con selectores para avance
macro y micrométrico y regulación de la amplitud y velocidad de movimiento del
brazo (fig . 6 .7) .
Figura 6. 7. Ultramicrótomo.
3. TIPOS DE CUCHILLAS PARA El MICROTOMO
Hasta hace poco tiempo, la selección y cuidado de las cuchillas de micróto -

mo era esencial para confeccionar buenas preparaciones histológicas, hasta el
punto de que cada técnico de laboratorio poseía las suyas y se encargaba
personalmente de su mantenimiento . Actualmente, los sistemas de microtomía
que emplean dispositivos de cuchillas desechables han simplificado mucho todo
este proceso, y están desplazando a los de cuchillas permanentes.
Existen cuatro tipos básicos de cuchillas para el micrótomo (fig . 6 .8) :
1. Bicóncava en ambas caras. Se utiliza para cortar bloques de parafina
blanda en el micrótomo de balanceo o de rotación . Tiene el inconvenien -
te de que vibra en exceso, pero produce excelentes secciones, sobre todo
si el tejido es suficientemente blando.
2. Planocóncavas, también denominadas de tipo A y B, según sea mayor
o menor el grado de concavidad de la cara no aplanada . La de tipo A se
emplea para cortar bloques de parafina en el micrótomo de deslizamien -
to, mientras que la de tipo B es de elección para seccionar bloques de
tejido incluido en celoidina .
3. Biplana, en cuña o de tipo C . Se utiliza indistintamente para cortes en
criostáticos en congelación o de bloques de parafina en el micrótomo de
tipo Minot. Este tipo de cuchilla se ha impuesto en la práctica habitual
debido a su mantenimiento más fácil y a su mayor polivalencia cuando la
dureza de los tejidos oscila notablemente.
4. Biplana con faceta o tipo D. Se emplea sobre todo para cortar tejido
congelado en el micrótomo de gas carbónico, o cuando el material que
se ha de seccionar es muy duro.
En la cuchilla de tipo C, o biplana, debe diferenciarse claramente entre el
ángulo de las caras de la cuchilla, formado por la prolongación espacial de
los planos que se apoyan sobre ambas, con un valor en torno a 20 grados, y el
ángulo de bisel o chaflán, determinado por la confluencia de las caras que
conforman el filo de la cuchilla . Como es lógico, el valor de este último es algo
mayor y puede cambiar según el tipo e intensidad de afilado, considerándose un
valor óptimo situado entre 27 y 31 grados.
<~~-:::::J 11 ~- -------~ 11 ·~
111
===l --==-==l IV
Figura 6 .8 . Esquema de los tipos de cuchillas de micrótomo: 1) Bicónca -

va . 11) Planocóncavas tipo A y tipo B. 111) Biplana con fateta . IV) Biplana.
MIC ROTOMO S Y TECNICAS DE CORTE DE LOS TEJIDOS 97
4. AFILADO DE LAS CUCHILLAS DEL MICROTOMO
Puede realizarse de forma manual o automática . En el primer caso es impres-

cindible disponer de dos accesorios: un mango con tornillo que se inserta en el
orificio situado a tal fin en el borde de la cuchilla, y un protector en forma de
an illa semicircular para mantener, entre el filo y la superficie de afilado, un
contacto homogéneo que evite irregularidades en el ángulo de bisel.
Como superficie de afilado se utilizan diversas piedras naturales (amarilla de
Bélgica) , sintéticas (como la de carborundo) o incluso una placa de vidrio a la
que se añaden diversos abrasivos en forma de pasta (fundamentalmente óxido
de aluminio y derivados).
Los sistemas automáticos de afilado se basan en el empleo de máquinas de
afilar provistas de piedras giratorias a las que se agregan abrasivos y aceites
minerales. Desde los primitivos modelos, en los que el ajuste se realizaba ma -
nualmente, se ha progresado hasta modernos instrumentos que permiten con -
trolar y modificar exactamente el ángulo de bisel según las necesidades del caso
(por lo general, entre 15 y 80°) .
El proceso de afilado de una cuchilla consta habitualmente de tres fases
sucesivas: 1) afilado, en la cual se desgasta acero del filo para eliminar sus
porciones dañadas (principalmente, muescas o mellas) ; 2) debastado, para
eliminar las pequeñas irregularidades y partículas de acero levantadas tras el
proceso anterior (se realiza con piedras de grano más fino que giran a menor
velocidad , o mediante abrasivos) , y 3) suavizado, cuya finalidad es perfeccio -
nar el filo empleando una cinta o disco de cuero a la que se añade una grasa
especial para suavi.zado.
Tras realizar varios afilados manuales de una cuchilla es conveniente reacon -
dicionar el ángulo de bisel. Para ello, y si no se dispone del instrumento adecua-
do (por lo común un afilador automático de la última generación). debe enviarse
la cuchilla a la casa comercial que la suministra .
A fin de preservar el filo de las cuchillas durante el mayor tiempo posible, el
debastado de los bloques (eliminación de las capas de medio de inclusión que
se interponen hasta alcanzar en su totalidad la superficie del tejido) , debe
realizarse con una cuchilla destinada especialmente a este menester o, en su
defecto, con uno de los extremos de ésta , reservando las porciones restantes
para la confección de los cortes finos . Como regla general, no deben debas-
tarse bloques realizando cortes de espesor superior a 20-25 micras,
pues de lo contrario el filo de la cuchilla se deteriora muy rápidamente.
Otras precauciones convenientes para conservar en buen uso las cuchillas
del micrótomo son : 1) mantenerlas siempre guardadas en su correspon-
diente caja; 2) realizar un suavizado diario antes de usarlas; 3) limpiar
con xileno el filo de la cuchilla antes y después de su empleo; 4)
impregnarlas con aceite especial conservante cuando vayan a ser almace-
nadas durante mucho tiempo, y 5) procurar no prestar este utillaje, puesto
que en la técnica de corte y en el mantenimiento de las cuchillas se siguen
pautas muy personales.
5. TECNICA DE CORTE SOBRE BLOQUES DE PARAFINA
En anatomía patológica, la obtención de secciones adecuadas de tejido

incluido en parafina es una de las labores de mayor trascendencia de entre las
que debe realizar el técnico de laboratorio. Por lo común, y suponiendo un
procesamiento histológico adecuado del tejido, la profundidad y exactitud del
diagnóstico histopatológico que se realiza sobre un determinado material de-
pende fundamentalmente de la calidad y espesor de los cortes obtenidos en el
micrótomo. Para garantizar el proceso son necesarias tres condiciones básicas:
1) contar con un micrótomo moderno y cuyo mantenimiento técnico sea ade-
cuado; 2) disponer de una cuchilla de micrótomo correctamente afilada (en la
actualidad, es posible gracias a la difusión de los sistemas de corte basados en
cuchillas desechables), 3) que el personal posea la formación y experiencia
necesarias. La histotecnología clásica ha definido la microtomía como un arte,
aunque esa apreciación tal vez sea excesiva,
Esta última condición es absolutamente crucial para garantizar la perfección
de todo el proceso, y su incumplimiento origina muchos de los problemas de
numerosos servicios de anatomía patológica de nuestro país, por otra parte
perfectamente dotados del instrumental necesario.
La confección de los cortes en parafina consta de seis maniobras o pasos
sucesivos, todos ellos de gran importancia: 1) retallado y enfriamiento del
bloque; 2) fijación al portabloques; 3) orientación del bloque; 4) orien-
tación de la cuchilla del micrótomo y debastado del bloque; 5) selec-
ción del espesor del corte, y 6) realización de las secciones.
5.1. Tallado y enfriamiento del bloque
Retallar un bloque es eliminar el exceso de medio de inclusión existente en

su periferia con la finalidad de disminuir la superficie total en contacto con la
cuchilla. Mediante esta maniobra, que se realiza con una hoja de bisturí, se
preserva su filo y se consigue que el bloque oponga solamente la resistencia al
corte propia del tejido.
A continuación, y antes de colocar el bloque sobre el micrótomo, debe
procederse a su enfriamiento para conseguir una consistencia óptima de la
parafina. La temperatura ideal de la parafina en el momento de realizar los cortes
se encuentra entre 5 y 1 O oc; por ello el enfriamiento más adecuado se obtiene
almacenando los bloques en una cámara frigorífica a 4 oc. Jamás deben colo-
carse los bloques a temperaturas inferiores a O oc (o lo que es igual, en el
congelador del frigorífico), ya que la parafina y sus derivados sintéticos tien-
den a cristalizar, resquebrajándose los bloques y apareciendo artefactos en los
tejidos.
5.2. Fijación al portabloques
Hoy día, en la confección habitual de los bloques de parafina se emplean

sistemas comerciales dotados de soportes plásticos de forma paralepipédica
directamente adaptables a la pinza portabloques del micrótomo. Si no se dispo·
ne de estos sistemas, antes de iniciar la maniobra de corte es imprescindible fijar

el bloque de parafina a un soporte metálico de superficie estriada, utilizando
parafina licuada que se deja solidificar.
5.3. Orientación del bloque
Una vez colocado el bloque en el portabloques, se hace descender el brazo

del micrótomo hasta que la superficie del bloque entra en contacto con la cara
interna de la cuchilla de debastado. En ese momento se comprueba el exacto
paralelismo entre ambas; en caso necesario se restablece mediante manipulación
de la rótula del portabloques (figs. 6.9 y 6.1 O).
Figura 6.9. Orientación del bloque de parafina: corrección de la excesiva

inclinación vertical.
Figura 6.10. Orientación del bloque de parafina : corrección del ángulo

horizontal.
5.4. Orientación de la cuchilla del micrótomo y debastado del bloque
Para orientar correctamente la cuchilla de un micrótomo de tipo Minot hay

que tener en cuenta que existen cuatro ángulos de control de la incidencia del
bloque sobre la cuchilla (fig . 6.11 ): 1) ángulo de inclinación (1); 2) ángulo de
arrastre (A); 3) ángulo de corte (C) , y 4) ángulo libre (L) .
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¡__...\
1 L \
1 \
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1
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Figura 6.11 . Esquema de los ángulos definidos en la cuchilla del micróto-

mo: 1: Angulo de inclinación . L: Angulo libre. C: Angulo de corte. A: Angulo
de arrastre.
El ángulo de inclinación es el formado por el plano que discurre por la cara

inferior de la cuchilla y el plano de corte sobre el bloque. Debe encontrarse entre
1 O y 15°. El ángulo libre es el formado entre el plano que pasa por la faceta
inferior de corte de la cuchilla y la superficie del bloque; su valor debe oscilar
entre 5 y 8°. El ángulo de corte es el determinado por el plano que se apoya
sobre la faceta superior del filo de la cuchilla y la superficie del bloque; su valor
se sitúa en torno a los 60°. Finalmente, el ángulo de arrastre es el formado por el
plano superior de la faceta de corte de la cuchilla y la perpendicular al plano del
bloque; su valor es siempre el del complementario del ángulo de corte.
Si el valor del ángulo de bisel de la cuchilla no se mantiene constante (es
decir, si se modifica la aproximación de las dos facetas de corte del filo), todos
los ángulos de control sobre la inclinación de la cuchilla pueden variar hasta
hacer imposible la obtención de cortes.
Aunque de todo lo expuesto parece deducirse que orientar la cuchilla del
micrótomo es tarea ardua y complicada, lo cierto es que con algo de experiencia
suele ser fácil conseguir el ajuste correcto (véase en los problemas que plantea
la obtención de cortes en parafina).
Una vez orientada la cuchilla sobre el bloque, se procede al debastado de
éste eliminando las capas de parafina situadas sobre el tejido, con las precaucio·
nes antes expuestas acerca del cuidado de las cuchillas. El debastado termina
cuando se obtiene en cada corte la superficie completa del tejido.
5.5. Selección del espesor de los cortes
Las secciones produeidas a partir del tejido incluido en parafina suelen tener
un espesor de entre 4 y 6 micras. Los cortes más delgados son difíciles de
obtener, aunque pueden ser muy útiles en el diagnóstico de las patologías renal,
hematopoyética y linfoide, en las que la observación de finos detalles citológicos
suele ser crucial. Las secciones más gruesas, de entre 1O y 20 micras, se emplean
para el estudio del tejido nervioso central. Hay que tener en cuenta que el tejido
incluido en parafina no puede ser seccionado a un grosor mayor a 20 micras,
puesto que los cortes se arrollan de manera irreversible. En caso de que sea
necesario, la inclusión del material ha de realizarse en coloidina.
5.6. Realización de las secciones
Tras sustituir la cuchilla de debastado por la utilizada para cortes finos, o tras
movilizar la única existente hasta la zona óptima para el corte, se inicia el
movimiento rítmico del volante de inercia que, al ser transmitido al brazo del
micrótomo, genera una cinta continua de cortes. La naturaleza del bloque y la
del tejido condicionan el ritmo y la velocidad de corte, que es inversamente
proporcional a su dureza .
Para evitar el fraccionamiento de la cinta de cortes, es conveniente sujetarla
con un pincel o espátula (fig . 6.12). Cuando el tejido tiende a quebrarse o
desmoronarse por estar demasiado frío, ser heterogéneo (coágulos, tejido óseo,
etc.) o estar cargado de electricidad estática, suele ser muy útil exhalar vaho de
la respiración sobre el bloque de parafina .
Figura 6.12. Obtención de la tira de cortes.
5.7. Estirado de los cortes y confección de las preparaciones
Una vez obtenida la cinta de cortes, se selecciona la zona de mayor calidad , y

se estira en un baño de agua caliente. Este se realiza a temperatura entre 45 y
Figura 6.13. Transporte de la tira de cortes al baño de flotación .
50 oc gracias a las fuerzas de tensión superficial que se generan en la lámina de

parafina y tejido al hacerla flotar sobre el líquido (fig. 6.13).
Las posibles arrugas y pliegues que suelen producirse al transportar los
cortes desde el micrótomo al baño pueden ser eliminadas mediante manipula -
ción de los cortes, una vez estén sobre el agua, con dos pinceles de pelo fino o
dos agujas de histología (fig. 6.14).
Las burbujas de gas atrapadas bajo el corte son difíciles de eliminar sin
producir artefactos sobre el tejido. Un método adicional para facilitar el estira -
miento de las secciones histológicas consiste en situarlas inicialmente sobre un
portaobjetos humedecido en etanol al 70 por 1 00 y dejar reflotar los cortes en el
baño de agua.
Tras las maniobras descritas, se procede a capturar los cortes elegidos, intro-
duciendo verticalmente el portaobjetos en el baño hasta tocar la sección por uno
de sus bordes. Cuando comienza la adherencia de la sección sobre el cristal, se
extrae poco a poco el portaobjetos del baño dejando drenar el agua por grave-
Figura 6.14. Estirado de los cortes con pincel sobre el agua .

Figura 6.15. Extracción de los cortes desde el baño sobre portaobjetos.
dad (fig . 6.15). En esta fase la sección puede ser reflotada y orientada de nuevo,
si se considera necesario.
Después de montar las preparaciones correspondientes, y antes de proceder
al estirado de las siguientes, debe eliminarse del agua del baño cualquier vesti -
gio de las secciones anteriores para evitar contaminaciones accidentales. Este
efecto se consigue pasando sobre la superficie del agua un papel de filtro .
En algunos laboratorios se prefiere estirar los cortes directamente sobre unas
gotas de agua colocadas sobre los portaobjetos, que se llevan enseguida a una
estufa con calor suave para que la extensión del tejido y el secado se realicen
simultáneamente.
5.8. Secado de las preparaciones histológicas
Una vez montados los cortes sobre portaobjetos, y antes de iniciar el proceso
de coloración, las preparaciones han de ser secadas meticulosamente para evitar
su desprendimiento. La desecación puede realizarse de forma rápida, colocando
los portaobjetos en estufa a 60 oc durante 1 O a 20 minutos o, preferiblemente,
dejándolas a 37 oc hasta el día siguiente. La extendida práctica de someter las
preparaciones a un fuerte calentamiento para alcanzar temperaturas próximas a
los 100 oc, que se dice favorece la adhesión de los cortes al portaobjetos, debe
ser absolutamente proscrita por el deterioro irreversible que provoca sobre la
mayor parte de los componentes bioquímicos y antígenos tisulares.
5.9. Problemas más comunes en el corte de tejidos incluidos

en parafina
Los mayores problemas que plantea la obtención de secciones en el micróto-

mo de tipo Minot derivan de una inadecuada orientación de la cuchilla. Por lo
general, a un técnico con suficiente experiencia la simple observación de la
superficie del bloque que está siendo cortado y de la secuencia de cortes le
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A
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Figura 6.16. Esquema del efecto que ejerce la inclinación de la cuchilla
sobre el bloque. A) Cuchilla demasiado inclinada que se incrusta en el
bloque . B) Posición normal para obtener un corte adecuado. C) Cuchilla
demasiado inclinada que no incide sobre el bloque.
basta para reorientar la cuchilla si ello fuera necesario. Cuando el ángulo de

inclinación es mayor de 15°, y por tanto el ángulo libre es superior a SO y el de
corte a 60° (cuchilla excesivamente perpendicular al bloque), el filo tiende a
introducirse profundamente en la parafina del bloque, arrancando parte de ella
e induciendo una fuerte vibración de la cuchilla . Todo ello origina peque-
ñas ondulaciones en la superficie del bloque y cortes de grosor muy irregular
(fig. 6.16) .
Por el contrario, cuando el ángulo de inclinación es menor de 10°, el ángulo
libre es negativo y el de corte menor de 60° (cuchilla excesivamente paralela al
bloque), el filo de la cuchilla no incide sobre la superficie del bloque, sino que
la faceta inferior de corte se desliza sobre él. De esta forma no es posible obtener
una sección hasta que el bloque ha avanzado lo suficiente como para salvar la
faceta de corte de la cuchilla . Ello -se traduce en la obtención de cortes disconti ·
nuos de gran espesor (fig . 6.16) .
6. TECNICA DE CORTE PARA MATERIAL INCLUIDO EN CELOIDINA
La realización de secciones histológicas sobre material incluido en celoidina

comprende varias operaciones sucesivas que, si bien son análogas a las expues-
tas para los bloques de parafina, merecen algunas consideraciones específicas.
6.1. Conservación, tallado y fijación de los bloques al micrótomo
A diferencia de los bloques de parafina, los de material incluido en celoidina

no conservan sus propiedades de consistencia y ductilidad en el medio ambiente
habitual del laboratorio. Para su conservac1on y grado óptimo de dureza es

necesario mantenerlos inmersos en alcohol etílico al 70 por 1 00, lo cual hace
engorroso su manejo. Antes de fijarlos sobre el micrótomo han de ser pegados
sobre un portabloques de madera o vulcanita, ya que no es posible emplear para
su confección las estaciones convencionales que emplean la cestilla de inclusión
como portabloques estándar. Para ello se cubre la superficie del portabloques
con una cantidad adecuada de celoidina al 8 por 1 00 y se coloca sobre ella el
bloque correctamente orientado, manteniendo durante unos minutos la presión .
Se deja secar al aire y se coloca al menos 30 minutos más en etanol de 70° para
conseguir un endurecimiento adecuado.
Como en el caso de los bloques de parafina, es conveniente el tallado del
bloque para eliminar con una hoja de bisturí el exceso de medio de inclusión en
su periferia. Sin embargo, no es necesario realizar un enfriamiento previo al
corte.
6.2. Características del micrótomo y orientación del bloque
Por la especial manipulación que requiere el tejido embebido en celoidina

(véase más adelante), es necesario realizar las secciones en un micrótomo de
deslizamiento, preferentemente de cuchilla fija y portabloques deslizante o tipo
Leitz. La orientación del bloque sobre la cuchilla se realiza de manera similar a la
expuesta para el corte en parafina.
6.3. Orientación de la cuchilla del micrótomo y debastado del bloque
En el micrótomo de deslizamiento se consideran los mismos ángulos de

influencia sobre el plano de corte que en el caso del micrótomo de tipo Minot o
de parafina. La variación de mayor trascendencia afecta exclusivamente al ángu-
lo de inclinación de la cuchilla formado por la cara inferior de ésta (recuérdese
que se trata de una cuchilla planocóncava) y la superficie del bloque. En este
caso el ángulo pasa de oscilar entre 1 O y 15° a ser ligeramente inferior a 15°. Por
ello el ángulo libre decrece hasta situarse entre O y 5°.
Debido a la mayor dureza y rigidez de la celoidina en comparación con la
parafina, en este tipo de micrótomos la cuchilla suele estar dispuesta oblicua-
mente en el eje transversal del bloque, de forma que las secciones se realizan al
sesgo con una declinación de hasta 160°. El debastado de los bloques se
efectúa de forma análoga al de los bloques de parafina.
6.4. Obtención y manipulación de los cortes
Para obtener secciones adecuadas es imprescindible pincelar continuamente,

con etanol al 70 por 100, tanto la cuchilla del micrótomo como la superficie del
bloque, y aun los propios cortes conforme se obtienen, ya que ello evita su
natural tendencia a enrollarse, facilita su ulterior estiramiento (fig. 6.17) y contri-
buye a mantener la consistencia más adecuada del bloque.
Los cortes se obtienen de uno en uno haciendo incidir el portabloques móvil
Figura 6.17. Pincelado del bloque de celoidina con alcohol.
sobre la cuchilla a través de su deslizamiento sobre las guías del micrótomo. Se

estiran directamente con el pincel mojado en etanol de 70° sobre la propia
superficie de la cuchilla , donde quedan retenidos (fig. 6.18) . A continuación se
hacen flotar en un baño de alcohol al 70 por 100 y se reservan. La coloración se
real iza habitualmente por flotación previa al montaje sobre el agente colorante
deseado, pero se puede efectuar sobre el propio bloque antes del corte.
Figura 6.18. Obtención de cortes en celo idina y su mantenimiento sobre

la cuchilla .
7. TECNICA DE CORTE SOBRE MATERIAL CONGELADO
La obtención de secciones histológicas a partir de material congelado es de

sumo interés en la biopsia intraoperatoria, que en la actualidad constituye la
base del tratamiento quirúrgico en numerosos campos de la Oncología. Este
hecho ha desplazado la responsabilidad de las decisiones desde el cirujano hacia
el patólogo. Por ello, para garantizar un diagnóstico en congelación que resulte

prácticamente definitivo, es imprescindible poseer una técnica adecuada de
biopsia preoperatoria, con secciones de calidad equivalente a las de la parafina .
Por otra parte, en el diagnóstico morfológico es cada vez mayor el empleo de
técnicas histoenzimáticas e inmunohistoquímicas para determinar actividad fun -
cional y antígenos de superficie. Estas técnicas requieren una preservación abso-
luta de la estructura de las proteínas y del fenotipo celular, por lo que se ha
impuesto la necesidad de realizar anualmente miles de secciones en congelación
como complemento del diagnóstico convencional.
Teóricamente las secciones histológicas sobre material fijado por congela -
ción se pueden realizar con el micrótomo de congelación clásico que utiliza el
anhídrido carbónico, pero en la práctica dicho instrumento ha sido desplazado
por el criostato o criotomo, debido tanto a la gran delgadez de los cortes que
este último proporciona como a la mayor sencillez de su manejo. Sin embargo, el
conocimiento de la técnica de corte con el micrótomo de gas carbónico puede
ser útil en caso de avería del criostato o, lo que es más frecuente, para obtener
secciones gruesas (superiores a 20 micras) , necesarias en la histoquímica de
tejido nervioso, en que es imprescindible poder seguir las prolongaciones neuro -
nales el mayor espacio posible.
8. CORTE EN EL MICROTOMO DE CONGELACION CLASICO
8.1. Congelación del bloque
Como ya se ha mencionado, el portabloques del micrótomo de congelación

está hueco y permite la circulación interior del gas carbónico contenido en una
bombona a presión, de forma que al expandirse en su interior se produce el
enfriamiento progresivo de la superficie donde se coloca el tejido (fig. 6.19).
Para facilitar el despegamiento posterior de éste, una vez realizados los cortes, es
conveniente situar un papel de filtro húmedo entre el tejido y la superficie
estriada del portabloques. A partir de ese momento se inicia el proceso de
Figura 6.19. Detalle del portabloque del micrótomo de congelación .

congelación abriendo con pequeños intervalos la espita del gas carbónico a

presión. Se consigue un enfriamiento más rápido y homogéneo situando sobre
el portaobjetos una pequeña cazoleta que disminuye notablemente la cámara
áerea que se va a enfriar y hacer recircular hacia el tejido parte del gas que sale
por los orificios de expansión del portabloques.
8.2. Obtención de las secciones
Tras el proceso de congelación , se aproxima manualmente el tejido a la

cuchilla empleando el torn illo sin fin del portabloques y se inicia el debastado
del tejido hasta obtener secciones que comprendan su superficie total. Si el
tejido se ha congelado en exceso, los cortes suelen ser difíciles y se astillan con
facilidad . En este caso puede ser muy útil calentar levemente la superficie del
tejido con la yema del dedo. Si por el contrario el tejido no se ha enfriado
suficientemente, tiende a ser machacado por la cuchilla y a desprenderse del
portabloques, en cuyo caso debe volver a ser congelado .
Los cortes se realizan con un espesor próximo a las 1 O micras y en el preciso
momento en que el tejido comienza a deshelarse, lo cual suele apreciarse con
facilidad a simple vista .
8.3. Confección de las preparaciones
Una vez obtenidos los cortes (recuérdese que no se produce una tira de ellos,
sino secciones independientes) , se recogen de la superficie de la cuchilla con un
pincel o con el dedo y se hacen flotar en un baño de agua fría del que son
recogidas las secciones de manera similiar a las de parafina .
9. TECNICA DE CORT E EN El C RIOSTATO
Por las especiales características técnicas de este instrumento (como ya se ha

indicado, se trata de un micrótomo de rotación situado en el interior de una
cámara congeladora), es posible obtener secciones tisulares extremadamen-
te delgadas - hasta 2 micras, aunque lo habitual es que oscilen entre 4 y
6 micras.
9.1. Congelación del material
Para la realización de técnicas histoenzimológicas o inmunoquímicas es im -

prescind ible que el tejido no haya sido fijado y que su congelación no se haya
realizado lentamente en la cámara fría del criostato, debido a la gran formación
de cristales intratisulares de hielo que esta práctica provoca. Si el criostato
dispone de sistema de congelación ultrarrápido (placa y contenedor para iso-
pentano a - 50 °C) , puede utilizarse éste; en su defecto, se empleará isopentano
enfriado en nitrógeno líquido hasta alcanzar idéntica temperatura (fig. 6.20) . De
Figura 6.20. Congelación del material en isopentano a - 50 oc en el

interior de un termo que contiene nitrógeno líquido.
ambas formas se consigue que el tejido ya se encuentre suficientemente conge-

lado cuando se coloque en la cámara de corte del criótomo; incluso puede ser
necesario aguardar algún tiempo hasta que se alcance la temperatura idónea
para efectuar los cortes (en torno a -20 °C).
La realización de los cortes se facilita si antes de ser congelado el tejido se
coloca en el interior de una gran gota de medio sintético como el O.C.T.
(compuesto por alcohol de polivinilo [1 0.24 por 1 00], polietilenglicol [ 4 .26 por
1 00] y excipientes [85.50 por 1 00]) Ames o similares. De esta forma se provoca
el engastamiento del material en este medio de imbibición . Además, el medio de
imbibición actúa produciendo la fijación del tejido al portabloques del criostato
(fig . 6.21 ) .
Figura 6.21. Obtención de los cortes en el criostato y su manipulación

después de quitar la pieza de antienrollamiento .
110 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOG II
9.2. Realización de las secciones
Tras la congelación , el portabloques se sitúa en la pinza del criotomo y !

realiza la orientación de la cuchilla y del portabloques como con el micrótom
de parafina . Si la temperatura de la cámara de corte no es suficientemente baj.
puede forzarse el mantenimiento de la congelación empleando algún nebuliZé
dar comercial de gas freón aplicado sobre la cuchilla , y nunca directamen1
sobre la muestra, para evitar el cuarteamiento y los artefactos del tejido.
La técnica de corte es muy similar a la de parafina, obteniéndose, al igual qu
en aquella, cintas de secciones. La única diferencia fundamental que merec
destacarse es la necesidad de emplear en el criostato un dispositivo especi<
antiarrollamiento. Este dispositivo consiste en una delgada lámina de materi<
plástico que, al apoyarse directamente sobre el filo de la cuchilla, impide (
enrollamiento de los cortes sobre sí mismos, fenómeno que siempre ocurr
espontáneamente. La mayor dificultad para la obtención de los cortes estrib
precisamente en la regulación del avance del antirrol sobre la cuchilla : si e
insuficiente, las secciones no se introducen entre el dispositivo y la cuchilla , y ~
es excesivo, el bloque de tejido tropieza con él al oscilar sobre la cuchilla .
Una vez obtenidos los cortes, se capturan directamente de la superficie de li
cuchilla empleando portaobjetos (fig . 6.22) .
Figura 6.22. Captura de los cortes en el criostato mediante un portaobje -

tos.
9.3. Soluciones adherentes para portaobjetos
Habitualmente los portaobjetos utilizados en histopatología de rutina tienen

un tamaño de 7.6 x 2.5 cm y un esp~sor de 1 y 1.2 mm . Los que se empleaban
antes eran en su totalidad de vidrio liso, por lo cual la identificación debía
realizarse utilizando un lápiz de diamante con elevada tasa de accidentes ocula -
res por incrustación de partículas cristalinas durante el proceso de marcaje. En la
actualidad se han generalizado los portaobjetos que muestran una zona marginal
de vidrio deslustrado que permite la identificación con lápiz de grafito.
Para los procedimientos más rutinarios la adhesión del tejido al portaobjetos

queda garantizada con el proceso de desengrasado meticuloso anteriormente
expuesto. Pero hoy día se realizan numerosas técnicas histoquímicas, de base
inmunológica y de biología molecular sobre las preparaciones histológicas obte-
nidas en parafina, resinas plásticas o congelación. Como estas técnicas tienden a
producir con gran frecuencia el desprendimiento progresivo de los cortes, es
imprescindible impregnar los portaobjetos con sustancias fijadoras que dificul-
ten este fenómeno. Con tal fin se han utilizado sustancias naturales como la
albúmina de huevo o la gelatina en diversas fórmulas, aunque actualmente están
siendo sustituidas por otros agentes y fórmulas disponibles comercialmente
(resinas de tipo araldita, poli-L-Iisina), que si bien son de mayor costo, propor-
cionan la máxima adhesividad (imprescindible en biología molecular).
ALBUMINA
Constituye el adhesivo más clásico y barato, fundamentalmente porque la
fuente de albúmina puede ser la clara de huevo. Por este motivo sigue siendo el
adhesivo de elección para las técnicas convencionales que requieren una adhe-
sión más fuerte que la proporcionada por el secado de los portaobjetos (caso de
técnicas histoquímicas en general, a excepción de aquellas que utilizan álcalis
fuertes, como ciertas impregnaciones argénticas en que se prefieren las solucio-
nes gelatinadas) . La adhesión con albúmina es incompatible con las modernas
técnicas inmunohistoquímicas que incorporan la metodología de la avidina - bioti -
na (véase el correspondiente capítulo) .
Solución de albúmina glicerinada de Mayer
Reactivos:
-Clara de huevo recién extraída .................... . 50 ml
-Glicerol ...................................... . 50 ml
- Salicilato sódico 1g
Modo de operar
1. Mezclar en agitador magnético. Filtrar
2. Lavar previamente los portaobjetos en solución de alcohol-clorhídrico (1
ml de ácido clorhídrico concentrado en 1000 ml de alcohol etílico de 96°) .
3. Impregnar cada portaobjetos en una fina película de la solución albuminosa.
4. Secar al aire y calentar posteriormente a 60 oc para coagular las proteínas.
GELATINA
Sustituye con ventaja a la albúmina en la impregnación argéntica e inmuno-
histor¡uímica. Aunque existen múltiples formas de preparación, en la actualidad
está generalizado su empleo con la adición de alumbre de cromo y otras sustan -
cias que mejoran la adhesividad.
112 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGI CA
Solución de gelatina-alumbre de cromo
Soluciones requeridas:
Solución A:
-Gelatina molida . ... .......... ......... .. .. ... ... . 4.5 g
-Agua destilada ... ...... ... ...... .... .... .. .... .. . 1000 ml
Calentar progresivamente a 75 C en agitación continua y, tras la disolución
completa, enfriar hasta 50 C.
Solución B:
-Alumbre de cromo (KCr(S0.) 2 • 12H 2 0) al4 por 100 38.5 ml
- Ftalato de dibutilo ............................... . 1 ml
- Merthiolate . . ...... .. ...... . ..... .. ...... .. .... . 0 .1 g
Modo de operar:
1. Preparar la solución A.
2. Mezclar con la solución B.
RESINAS Y OTROS ADHESIVOS DE GRAN POTENCIA

Las resinas acrílicas de tipo araldita y epoxirresinas proporcionan la máxima
adhesión aunque son de difícil manejo. Habitualmente se utiliza una solución de
resina en acetona , en proporción 1 :1 O, aplicada sobre el portaobjetos inmediata-
mente antes de su uso. La resina polimeriza a lo largo del proceso de hidratación
proporcionando la adhesividad deseada.
La poli-L-Iisina constituye la base de todos los portaobjetos comercializados
con el adhesivo incorporado. Proporciona una adhesividad excelente con una
mínima impregnación por los colorantes y reactivos inmunoquímicos en general,
por lo cual es el agente de elección para técnicas inmunohistoquímicas combi -
nadas con múltiples pasos y, sobre todo, para biología molecular, donde se
requieren incubaciones prolongadas a 100 oc de temperatura .
10. TECNICAS DE CORTE Y MANEJO DE LAS SECCIONES

10.1. Espesor de los cortes ultrafinos
La observación mediante microscopia electrónica exige un espesor de corte

del orden de algunas decenas de nanómetros debido a la baja capacidad de
penetración del haz electrónico (véase observación de los cortes en el capí-
tulo 8) . Por ello, deben obtenerse cortes de grosor inferior a 1 micra, oscilando
las secciones normales entre 30 y 120 nm .
10.2. Cuchillas del ultramicrótomo
Son fundamentales para la calidad del corte, ya que ésta depende, en su

mayor parte, del estado general de la cuchilla.
TIPOS DE CUCHILLAS
a) Cuchillas de vidrio: son las que se emplean habitualmente debido a su
bajo costo y a que son desechables.
Su principal inconveniente es que se deterioran con facilidad y sólo sirven
para un número limitado de cortes.
El vidrio que se utiliza es diferente al común , pues su cristalización se lleva a
cabo en condiciones especiales de temperatura . De esta manera se evitan las
tensiones intermoleculares con el fin de que, cuando se rompa para realizar la
cuchilla , dé origen a un filo muy nítido y cortante. En el comercio, el vidrio se
adquiere en forma de barras de 40 a 50 cm de longitud por 4 ó 5 cm de anchura
y 0.4 ó 0.5 cm de altura .
- Fabricación de las cuchillas:
1. A mano, rayándolas con un diamante y quebrándolas con tenazas espe -
ciales. Este método no se practica actualmente porque es más dificultoso
y porque además sólo sirven las cuchillas cuyo filo está desprovisto de
irregularidades.
2. Con un instrumento para fabricar cuchillas que corta la barra de
vidrio en paralelepípedos de superficie rectangular, para seccionarlos
posteriormente por su diagonal y obtener prismas de cristal dotados de
un filo con ángulo de corte de 45° (fig. 6.23). El cuidado del filo es
fundamental ; su estado puede controlarse con la lupa binocular del
ultramicrótomo (debe observarse como una línea brillante no ase-
rrada en el fondo oscuro del campo). Cuando existe suciedad en su
borde, la limpieza se realiza con acetona concentrada .
Figura 6.23. Detalle del portabloques y de la cuchilla del ultramicrótomo

con baño de flotación incorporado. Esquema de la cuchilla con baño incor-
porado .
b) Cuchillas de diamante: son de tipo multiuso y mucho más caras que

las cuch illas de vidrio (en torno a las 500 000 pts/unidad}. Su filo se obtiene
mediante pulimentación, y por eso es algo más imperfecto que el de las cuchillas
de vidrio. Se emplean sobre todo para cortar tejidos muy duros, como los tejidos
que están calcificados o impregnados metálicamente, así como los tejidos • no
animales y diversos minerales, etc.
10.3. Técnica de corte en ultramicrotomía
Por lo general, la obtención de cortes ultrafinos es difícil y requiere mucha

práctica.
EMPLAZAMIENTO DEL ULTRAMICROTOMO

Es esencial. Debe estar en un lugar donde no se produzcan vibraciones,
exista temperatura constante y no se formen corrientes de aire. Por ello es
importante que el ultramicrótomo esté situado sobre una mesa antivibratoria
y protegido por una mampara.
PREPARACION DEL BLOQUE

La inclusión definitiva del tejido en resina se presenta como un pequeño
fragmento tisular de 1 mm 3 inmerso en un cilindro de plástico. Por tanto, es
imprescindible ir tallando este último hasta conseguir que el tejido rodeado de
plástico más inmediato quede en forma de pirámide truncada (fig. 6.24) .
Esta maniobra corresponde al debastado de los bloques de parafina . Como
condiciones para realizar un corte correcto, merecen destacarse las siguientes:
1. Es importante que la superficie tallada no tenga una amplitud
superior a 1 mm 2 en el metacrilato y a 0.5 mm 2 para la resina de
epon. Si la superficie es mayor, el corte saldrá sistemáticamente vibrado.
2. Si el corte sale vibrado a pesar de que la superficie sea adecuada y el filo
de la cuchilla esté bien , deberá revisarse la velocidad del brazo del
ultramicrótomo para disminuirla al máximo .
Figura 6.24. Esquema de tallado de la pirám ide en ME.

PREPARACION DE LA CUCHILLA
Antes de fijar la cuchilla al soporte del ultramicrótomo, debe colocarse sobre
ella un pequeño baño de flotación para recoger los cortes (fig. 6.25). Dicho
baño puede realizarse con una cinta adhesiva (cinta plateada impermeable) que
se coloca justamente sobre el filo de la cuchilla con el fin de obtener una balsa o
pocillo junto a su cara interna . Luego se sellan los filos de la cinta con parafina o
cera, se coloca la cuchilla y se llena el pocillo con el líquido de flotación para
recoger los cortes. Actualmente se han comercializado diversos modelos de
balsas desechables.
Figura 6 .25. Técnica de corte en ultramicrótomo.
ORIENTACION DE LA CUCHILLA
Es variable, dependiendo de que el bloque para cortar sea metacrilato o
resina epon . En este segundo caso, el filo de la cuchilla ha de estar casi perpen-
dicular al plano de corte (ángulo que forma la cuchilla con la vertical entre 3 y 5°).
Si el bloque es de metacrilato, la inclinación de la cuchilla suele ser mayor,
con lo cual se facilita la obtención de las secciones. Como líquido de flotación
en la balsa, se utilizará agua acetonada (5-1 O por 1 00) si el bloque es de resina
epon o araldita (polímero plástico), o una solución de cloruro de bario 0.5 M si
es de metacrilato, para prevenir en este último caso una excesiva hidratación de
los cortes.
OBTENCION DE CORTES SEMIFINOS

Reciben también la denominación de cortes control , ya que sirven para
seleccionar la zona que preferentemente se pretende observar en el corte ultrafi -
no. Se trata de una sección de entre 0.5 y 1 micra de espesor, que es teñida por
una coloración estándar de microscopia óptica -generalmente azul de toluidi -
na- (fig. 6.26, véase páginas en color) o bien es observada en microscopia de
contraste de fase, con la finalidad de comprobar previamente la naturaleza de
las estructuras contenidas en el tejido. Se obtienen de forma análoga a la que

se describirá más adelante para los cortes ultrafinos.
Técnica del azul de toluidina alcalino

Se disuelven 0.5 g de azul de toluidina en 100 ml de agua destilada, a la que
se habrá añadido borato sódico al 1 por 1 OO. Una vez seco el corte, se le añaden
unas gotas de esta solución colorante, colocando el porta sobre una llama o placa
caliente hasta que comience a emitir vapores, sin llegar a la ebullición. Una vez
teñido, el corte puede ser deshidratado, aclarado y montado en bélsamo.
REALIZACION DEL CORTE ULTRAFINO

Las secciones ultrafinas deben tener un espesor de entre 30 y 90 nm, siendo
suficiente para la mayor parte de las aplicaciones un espesor de 80 nm. Una vez
movilizada la cuchilla para situarla en una zona de filo virgen y regulado el
espesor deseado de corte, se procede a conectar el movimiento del brazo,
obteniéndose una cinta de cortes que flotarán en el pocillo.
SELECCION DE LOS CORTES ULTRAFINOS

En microscopia electrónica es posible apreciar el grosor de los cortes me-
diante un sistema bastante preciso que se basa en el llamado fenómeno de
interferencia de las ondas luminosas reflejadas por el corte y la superficie del
líquido de flotación . Paradójicamente, esta observación no es posible en el caso
de los cortes para microscopia óptica convencional. Ello ocurre debido a que el
corte es más delgado que la longitud de onda de la luz que lo atraviesa, por lo
cual es susceptible de generar fenómenos de interferencia entre los rayos «R»
reflejados por la superficie del líquido de flotación (fig. 6.27).
El mecanismo anteriormente descrito determina que al iluminar el corte con
una luz blanca de incidencia especial, se produzcan interferencias entre los rayos
R
S
R'
e n
----~=----~A~g~ua~-= sL
Figura 6.27. Esquema de selección de cortes en ultramicrotomía. S: Luz

incidente. R R' : Luz reflejada . e: Espesor. SL: Superficie líquido. n: lndice de
refracción del medio. r: Angulo de incidencia del rayo refractado .
que refleja el tejido y el reflejado en la superficie del líquido flotador. Ello origina
la aparición de una gama de colores que depende del grosor que posea el corte.
Para poder observar los colores que reflejan los cortes son necesarios ciertos
requisitos fundamentales:
- El ángulo de incidencia de la luz sobre el tejido debe estar en
torno a los 45°, la luz debe proceder de una lámpara de hendidura.
-El líquido flotador no debe estar iluminado directamente, con el
fin de obtener un fondo oscuro donde contrasten los cortes.
Colores que se obtienen Espesor del corte
Amarillo 280 a 320 nm

Verde .... . ............. .. ....................... . 240 a 280 nm
Azul .. ....... . ....... . . ... ................ ... ... . 190 a 240 nm
Púrpura ... . ..... . ......... . ..................... . 150 a 190 nm
Oro intenso ........ ... ........ ·.. . ................ . 120 a 150 nm
Oro pálido .... . ............... . ...... . ........... . 90 a 120 nm
Plata .... . . . . . ... . . . ....... . ............ .... . .... . 60 a 90 nm
Gris .... . ... . .. . ... . ... . ...... . ... . . .. . . ...... . . . < 60 nm
Dependiendo del color del corte se procederá a seleccionarlo o no; como es

lógico, los cortes buenos son los grises y los de color plata .
EXTENSION DE LOS CORTES

El problema es diferente según que el medio de inclusión utilizado sea
metacrilato o resina epon .
a) Para extender cortes en metacrílato: se acerca al pocillo fabricado sobre
la cuchilla -en el que se encuentra flotando el corte- un papel de filtro
humedecido o impregnado en un líquido volátil de baja tensión super-
ficial, como el benceno o el cloroformo. Al recibir los vapores del líquido,
el corte se extiende bruscamente, ya que se ve sometido a una baja
tensión superficial.
b) Para extender en epoxírresina: sólo interviene la habilidad del técnico.
En líneas generales se realiza , como el extendido en los baños de parafi -
na, utilizando microinstrumentos.
Hilos de cobre-50 Jl
~l:t:t:t:t::t:~~1------ Espacios vacíos -1 50 Jl
Figura 6.28. Rejilla para montaje de los cortes en ME.

MONTAJE DE LOS CORTES

Por lo común se realiza sobre una rejilla con un baño electroquímico metálico
y de unas dimensiones de 3 x 2.3 mm . Estructuralmente consiste en un entrete-
jido de hilos de cobre de 50 micras de diámetro entre los cuales quedan espacios
en torno a las 150 micras (fig . 6 .28) .
La técnica de montaje sobre rejilla es semejante a la de la microscopia óptica,
es decir, el corte se adhiere a la rejilla por fuerzas de tensión superficial y se deja
secar. Una vez seco, se puede pasar a la i!J1pregnación del corte, que es esencial
en los cortes realizados en metacrilato (véase coloración de los cortes ultrafinos
en el capítulo 9) .
CAPITULO 7
Fundamentos generales
de coloración
GUION DE CONTENIDOS
1.
2. TIPOS DE COLORANTES
3. NATURALEZA OUIMICA DE LOS COLOR l
CROMOFOROS. CROMOGENOS Y AUXOCROMOI
4. CLASIFICACION DE LOS COLORANTES lliGU~ SU8
GRUPOS CROMOFOROS .
6. ClASIFICACION DE LOS COLORANTES SEGUN SUt¡
GRUPOS AUXOCROMOS Y APETENCIA TISULAR
6. MECANISMOS GENERALES DE LA COLORACION
7. COLORAClONES NUCLEARES
7.1. Hematoxilinas
7.2. Otros colorantes nucleares
8. COLORANTES CITOPLASMATICOS
8.1. Colorantes xanténicos
8.2. Cromotropo 2R
1. COLORES Y MOLECULAS COLORANTES
De forma genérica, todos los tejidos de origen animal son incoloros salvo que
contengan algún tipo de pigmento, en cuyo caso adoptan el color que aquél les
proporciona. Así ocurre, por ejemplo, en la piel, donde la melanina pigmenta de
color más o menos pardo la epidermis y anejos cutáneos, o en la sangre y en
todos los tejidos vascularizados, a los que la hemoglobina confiere su caracterís-
tica coloración roja o rosada .
La primera utilización conocida de un agente colorante para teñir un tejido
animal se debe a Van Leeuwenhoek (1714), que empleó una solución de
azafrán en vino para facilitar la observación de las fibras musculares estriadas en
sus preparaciones histológicas. Más tarde se introdujeron como colorantes el
carmín (Goppert y Cohn, 1849) y la hematoxilina (Waldeyer, 1863). A partir de
1856 comienza la gran expansión mundial de la industria textil motivada por la
fabricación de los primeros colorantes artificiales, los colorantes de anilina, que
rápidamente se extienden a los métodos de coloración para cortes histológicos
provocando un vertiginoso desarrollo de la histotecnología .
El fundamento de cualquier método de tinción radica en la propiedad que
poseen todos los tejidos para incorporar y fijar de modo variable diversas sustan-
cias coloreadas llamadas colorantes. La percepción de los colores por la retina
humana está ligada a la capacidad que poseen sus fotorreceptores para captar la
radiación luminosa comprendida entre 400 y 800 nanómetros de longitud de
onda y cuya mezcla homogénea se denomina convencionalmente luz blanca o
espectro visible de la radiación solar.
Cuando un cuerpo iluminado por la luz refleja en su superficie toda la
radiación que recibe, la retina lo percibe de color blanco; si por el contrario
absorbe toda la radiación emitida, se percibe de color negro. En el caso de que
se produzca una absorción parcial de la radiación lumínica, los fotorreceptores
retinianos captan el espectro complementario de la radiación absorbida, produ -
ciéndose la percepción de los colores. En otras palabras, puede decirse que el
color visible es el complementario del color espectral absorbido. Por ello y en
sentido amplio, un colorante puede definirse como una sustancia que, puesta en
contacto con un soporte adecuado, se une a él de forma perdurable transmitién-
dole su color.
2. TIPOS DE COLORANTES
En función de su origen, se distinguen dos tipos fundamentales de coloran-
tes: naturales y artificiales. Los colorantes naturales son relativamente
escasos y se obtienen en forma de extractos a partir de ciertas plantas o insectos.
En la histotecnología de rutina son ampliamente utilizados, siendo los más
conocidos como colorantes nucleares la hematoxilina y el carmín, y como colo-
rantes citoplasmáticos, la safranina y la orceína.
Los colorantes artificiales, en su mayor parte derivados de la anilina (del
árabe an-nll, «azul oscuro») comenzaron a introducirse en la segunda mitad del
siglo XIX, y hoy día en número de varios centenares, constituyen la base de
numerosas coloraciones histológicas. Aunque inicialmente se obtienen a partir
del alquitrán de carbón, en la actualidad se sintetizan en el laboratorio, por lo
que su gama crece continuamente.
FUNDAMENTOS GENERALES DE COLORACION 121
3. NATURALEZA QUIMICA DE LOS COLORANTES:

CROMOFOROS. CROMOGENOS Y AUXOCROMOS
El soporte químico fundamental de la mayor parte de los colorantes

naturales y de la totalidad de los artificiales son anillos aromáticos
derivados del benceno. El hecho de que los dobles enlaces entre los átomos
de carbono de estos anillos no sean fijos y, por tanto, puedan ser reordenados,
es la causa de la gran diversidad posible de los derivados del benceno y, en
consecuencia, de los colorantes de anilina .
El benceno, al igual que todos los hidrocarburos aromáticos, es originaria-
mente una sustancia incolora aunque susceptible de absorber radiación dentro
del espectro de la luz ultravioleta . Si en un momento determinado se produce la
fijación de los dobles enlaces dentro del anillo por ocurrir alguna reacción
química sobre éste, el derivado bencénico que se obtiene puede absorber radia-
ción luminosa dentro del espectro visible y mostrar color. Los radicales químicos
responsables de la modificación molecular a la que se debe la aparición del color
reciben el nombre genérico de grupos cromóforos. reservándose la denomi-
nación de cromógeno para el c_onjunto formado por el grupo cromóforo más
anillo aromático. Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que cromógeno no es
sinónimo de colorante, ya que el primero no siempre posee apetencia específica
por los tejidos o, lo que es más habitual, no se liga fuertemente a ellos.
En determinadas condiciones. un colorante puede perder temporalmente su
capacidad para absorber radiación lumínica dentro del espectro visible. Ello
ocurre por lo general a través de un proceso de reducción del grupo cromóforo
que lo transforma en un leucoderivado. En estos casos, el color suele reaparecer
tras realizar una oxidación que restaura el grupo cromóforo.
Los principales grupos cromóforos conocidos son los radicales etileno
(>C=C<), carbonilo (>C=O), tiazólico (>C=S), imino (>C=N). azoico
(-N=N-), nitroso (-N=O), nitro (-N0 2 ) y en general cualquier anillo derivado
de las quinonas (fig . 7.1 ).
o
11
o
quinona
Figura 7.1. Anillo de las quinonas.
La conversión de un cromógeno en colorante está vinculada a la adición

sobre la molécula aromática, de otros grupos atómicos que le confieren la
propiedad de disociarse electrolíticamente o de formar sales con los tejidos.
Estos radicales reciben la denominación genérica de grupos auxocromos o
potenciadores de color, y por lo común están dotados de carga eléctrica, o lo
que es igual, poseen carácter ácido o básico, siendo los responsables de que el
colorante tenga mayor o menor afinidad por la estructura que se va a teñir.
Los grupos auxocromos de más importancia son los radicales hidroxilo

(-OH), carboxilo (-COOH), amino (-NH 2 ), sulfhidrilo (-SH) y determinados
iones metálicos derivados del hierro, cromo, aluminio, molibdeno, etc.
4. ClASIFICACION DE lOS COLORANTES SEGUN SUS GRUPOS

CROMO FOROS
En función del grupo cromógeno que contienen, se distinguen 8 grandes

grupos de colorantes (fig . 7.2).
O
,N
q NO,
OH
NO, b) Colorante azoico

a) Nitrocolorante
d) Acridina
e) Antraquinona
(Xo~
N~ ·
e) Oxacina
CXS~ N
T0
Tiacina
ex::o Acina
f) Trifenil metano
OCD o
g) Xanteno
.//
Ftalocianina de cobre
Figura 7 .2. Principales tipos de colorantes según sus grupos cromóforos.

a) Colorantes nitrados y nitrosados. Son nitro (-N0 2 ) o nitrosoderi-

vados (-N=O) del benceno o naftaleno con algunos grupos hidroxilo,
amino, etc. El más sencillo es el 2,4,6-trinitrofenol o ácido pícrico,
obtenido por nitración del fenol. La presencia de los tres grupos nitro
incrementa notablemente el carácter ácido del grupo fenólico.
b) Colorantes azoicos, que contienen el cromóforo -N = N- vinculando
anillos adyacentes derivados del benceno o antraceno. En general se
trata de colorantes ácidos, pero también los hay neutros o básicos.
Pueden ser a su vez, monoazoicos (orange G, cromotropo 2R, ponc;eau
de xilidina) , o diazoicos (sudán rojo y negro, rojo Congo, escarlata de
Biebrich, azul tripán).
e) Colorantes derivados de la antraquinona, obtenidos a partir de la
oxidación del antraceno para constituir anillos quinónicos (rojo de aliza -
rina S).
d) Colorantes derivados de la acridina y que contienen el cromóforo
>C = N- (naranja de acridina) .
e) Colorantes derivados de iminas quinónicas, que poseen dos gru-
pos cromóforos y en función de ellos se clasifican en : 1) derivados
oxacínicos (galocianina, azul de Nilo, violeta de cresilo) ; 2) derivados
tiacínicos (tionina, azul de metileno, azur A, B y C, azul de toluidina,
tioflavina T), y 3) derivados acínicos (rojo neutro, safranina E, azocar-
mín).
f) Colorantes derivados del difenilmetano (auramina) y del trife-
nilmetano (fucsinas, verde ligero), cuyo cromóforo es el grupo
>C=NH. Los colorantes de este grupo pueden ser ácidos o básicos
dependiendo de los auxocromos vinculados a la molécula.
g) Colorantes derivados del xanteno, con cromóforos variables entre
los que se encuentra la pironina, rodamina y sulfaftaleína.
1) Colorantes derivados de las ftalocianinas; como el azul o amarillo
alcián, que contienen de dos a cuatro grupos de isotiouronio alrededor
de un átomo de cobre para formar una molécula que recuerda vaga-
mente al anillo hem- de la hemoglobina .
Por lo común, junto al nombre de los colorantes y su designación de grupo,

figuran algunas siglas y ciertos códigos alfanuméricos. Las primeras correspon -
den a abreviaturas de características comunes a diversos colorantes, por ejem-
plo: B = azulado; G = verdoso; l = insensible a la luz; M = mezcla; R =
rojizo; S = soluble; W = soluble en agua; Y = amarillento, etc.
El código alfanumérico remite al índice colorimétrico del colorante
(C.I.) , que es un sistema de identificación estándar para cada agente tintorial
expresado en forma de cinco dígitos.
5. CLASIFICACION DE LOS COlORANTES SEGUN SUS GRUPOS

AUXOCROMOS Y APETENCIA TISUlAR
Se distinguen cinco grupos fundamentales : colorantes básicos, ácidos, neu-

tros, indiferentes y metacromáticos.
1
COLORANTES BASICOS
Están formados por la asociación de un cromógeno de baja intensidad y

carácter débilmente ácido, con grupos auxocromos catiónicos fuertemente bási-
cos que son los responsables de la carga global del colorante. Por este motivo se
utilizan para colorear estructuras ácidas, principalmente contenidas en el interior
de los núcleos celulares en forma de ácidos nucleicos {lacas de hematoxilina,
fucsina básica, galocianina, etc.).
COLORANTES ACIDOS
Son productos de la unión de un cromógeno de baja intensidad débilmente

básico con grupos auxocromos ácidos que confieren dicho carácter al colorante.
En general, tiñen estructuras básicas contenidas en los citoplasmas celulares
(eosinas, fucsina ácida, pironina, etc.).
COLORANTES NEUTROS
Se producen por la unión de carácter salino entre colorantes ácidos y básicos

para formar un precipitado, comúnmente insoluble en agua y muy estable en
disolución alcohólica. De esta forma, siendo su carga global neutra conservan
en parte la propiedad de colorear conjunta o separadamente diversas estructuras.
Ello depende de que sean o no capaces de atrapar alguno de los iones genera-
dos cuando la sal se disocia tras ser inestabilizada al colocarla en disolución
acuosa (tinción de Giemsa) . Las estructuras así coloreadas adquieren una tona-
lidad polícroma.
COLORANTES INDIFERENTES
Son aquellos que no poseen un carácter ácido, básico o salino definido, po1
lo que habitualmente colorean los tejidos a través de un mecanismo por impreg ·
nación física.
COLORANTES METACROMATICOS
En condiciones normales, la mayor parte de los tejidos tienden a teñirse cor

una tonalidad semejante a la del colorante utilizado para su demostración. Est<
propiedad recibe la denominación de ortocromasia. Sin embargo, cuando sE
utilizan ciertos colorantes básicos derivados de la anilina, algunas estructura:
tisulares se tiñen con tonos de color totalmente distinto al que cabría esperar po
el colorante empleado (por ejemplo, gránulos de los mastocitos de coloraciór
roja con el azul de metileno o de toluidina) . Este efecto se conoce con el nombrE
de metacromasia y las estructuras así teñidas, cromótropas. Los colorantes meta
cromáticos son sustancias químicamente puras y no de carácter salino. Por elle
la exp.licación más comúnmente aceptada para este fenómeno es la de que sE
produce una polimerización entre las moléculas de colorante adyacentes a lé
estructura que se va a teñir (para más detalles, véase Fundamentos de la reac
ción metacromática).
6. MECANISMOS GENERAlES DE lA COlORACION
Según la naturaleza de la vinculación molecular entre los colorantes y los

tejidos, existen tres mecanismos generales: de carácter físico, fisicoquímico o
histoquímico. Estos mecanismos combinados entre sí en distinta medida expli-
can las particularidades de las principales técnicas de tinción en anatomía pato-
lógica.
Los mecanismos de carácter puramente físico están ligados a las propiedades
de disolución e impregnación del colorante sobre el tejido. En el primer caso, el
colorante es más soluble en el tejido que en el disolvente que actúa como medio
de transporte, de forma que tiende a pasar desde éste a aquél. Un ejemplo
característico de este tipo lo contituyen las tinciones para grasas. En el caso de la
impregnación, el colorante, por su gran volumen molecular o por una precipita -
ción selectiva en forma de agregados insolubles, queda atrapado entre la malla
de células y fibras que constituyen los tejidos. Ejemplos típicos de impregnación
son algunas tinciones argénticas para células nerviosas, así como las coloracio-
nes diferenciales para fibras colágenas del tejido conjuntivo.
Las tinciones ligadas a un mecanismo principalmente químico están basadas
en el desarrollo de una reacción química entre el colorante (comúnmente un
leucoderivado) y la estructura objet o de tinción de forma que al interaccionar
ambos se produce un nuevo cromógeno responsable del color obtenido. El
conjunto de procedimientos técnicos que se fundamentan en este mecanismo
común se agrupan dentro de la histoquímica, rama de la histotecnología, que
estud ia la estructura química y composición de los tejidos mediante la aplicación
de reacciones químicas específicas para la localización microscópica unívoca de
determinadas sustancias.
Los mecanismos fisicoquímicos de coloración tisular están vinculados a la
formación de uniones intermoleculares por atracción electrostática o por fuerzas
de tensión superficial. Los primeros se basan en la propiedad de ligarse entre sí
que poseen las moléculas de carga eléctrica contraria, de manera que los colo-
rantes de carácter ácido t iñen las estructuras básicas, y viceversa, por electroad -
sorción.
Los fenómenos de tensión superficial, responsables de la interacción mole-
cular en los líquidos, son debidos a las fuerzas de gravitación generadas al
disponerse las moléculas muy próximas entre sí. Este tipo de mecanismo tintorial
está implicado fundamentalmente en coloraciones que utilizan moléculas en
dispersión coloidal para interaccionar con agregados moleculares dispuestos en
la superficie de la estructura a colorear.
7. COlORACIONES NUClEARES
La mayor parte de las coloraciones que se utilizan habitualmente en histopa -

tología contienen algún colorante que tiñe de manera específica el núcleo celu -
lar, definiendo su contorno y realzando su contenido cromatínico. Con esta
finalidad se utilizan generalmente colorantes de carácter básico con apetencia
por los grupos fosfóricos ácidos del ADN. Entre ellos se encuentran algunos
colorantes artificiales como la galocianina, el verde de metilo, el azul de alizarina
S, la fucsina básica, el violeta de cresilo o el rojo nuclear extra, si bien los de
mayor importancia son de origen natural como el carmín, la safranina y sobre

todo la hematoxilina, que es el colorante nuclear por excelencia.
7.1. Hematoxilinas
La hematoxilina es un colorante natural que se extrae del árbol hematoxylon

campechianum, palo de campeche o palo azul de Centroamérica. Inicialmente
fue utilizado para teñir seda y lona, y en 1862 empezó a emplearse en la
coloración de tejidos animales. En el comercio se encuentra en forma de cristales
rosados o amarillentos solubles en agua y alcohol. Tradicionalmente se ha
mantenido que la hematoxilina en su forma natural no es un colorante, pero los
recientes progresos de la química de los colorantes han permitido establecer que
pese a expenderse en forma de leucocompuesto, la molécula de hematoxilina se
une específicamente mediante puentes de hidrógeno a diversos sustratos entre
los que se encuentran múltiples derivados de la celulosa, si bien esta unión no
genera color.
OXIDACION DE LA HEMATOXILINA
Para que la hematoxilina pueda ser empleada como colorante en histotecno-
logía, ha de ser oxidada previamente a hemateína . Este proceso oxidativo -que
puede ocurrir espontáneamente en contacto con el oxígeno atmosférico a lo
largo de 4-6 semanas, o ser inducido de forma artificial a través del empleo de
agentes químicos de carácter oxidante-- provoca la aparición sobre la molécula
de un anillo paraquinónico que, actuando como cromóforo, le confiere la pro-
piedad de teñir. La hemateína así obtenida pGsee una carga electrostática débil-
mente ácida y una característica coloración rojo vinosa (fig . 7.3) .
OH
Hematoxilina Hemateína
Figura 7 .3. Oxidación de la hematoxilina .
El proceso de oxidación del colorante, conocido también con el nombre de

maduración de la hematoxilina, puede ser acelerado mediante la utilización
de agentes oxidantes artificiales como óxido de mercurio (0.5 g), el yodato de
sodio (0.05 g), el permanganato potásico (0.177 g), el dicromato potásico
(0.28 g), el clorato potásico (0.11 g) y el yodato potásico (0.20 g) (cantidades
todas ellas para un gramo de hematoxilina).
• En los casos de oxidación inducida químicamente, el tiempo de

actuación del agente es crucial, puesto que un exceso de actuación
puede transformar la hemateína en leucoderivados incoloros o que
impregnan los núcleos de una coloración parda escasamente específi-
ca. A fin de evitar este fenómeno es aconsejable utilizar los oxidantes químicos
a mitad de concentración para, una vez consumidos en el proceso, dejar concluir
la maduración de forma espontánea con el oxígeno atmosférico.
La estabilidad de las soluciones de hemateína así obtenidas suele estar
influida por el tipo de disolvente utilizado; así, las soluciones acuosas neutras se
sobreoxidan con facilidad, por lo que son relativamente inestables; las alcohóli-
cas glicerinadas, por el contrario, poseen mayor duración media. Análogamente,
las soluciones de carácter básico aceleran la oxidación, mientras que las mode-
radas o fuertemente ácidas la enlentecen de manera notable.
LACAS DE HEMATOXILINA
Tras la oxidación de la hematoxilina, normalmente se debe incrementar su
capacidad tintorial agregándole determinados grupos auxocromos que, además,
le confieren un carácter fuertemente básico y son los responsables de su especi-
ficidad por los núcleos celulares. Como auxocromos se emplean sales metálicas
bivalentes o trivalentes, por lo general ~ n forma de alumbres, de tal modo que se
forman diversas lacas de hematoxilina de carácter catiónico y tonalidad azulada
o negruzca dependiendo de la sal metálica utilizada. La laca de hematoxilina más
utilizada es la producida a partir del alumbre aluminicopotásico, conocida tam -
bién de forma genérica como hemalumbre. En ella el complejo metálico en
disolución actúa como indicador, adoptando color rojo por debajo de pH 3 y
azul violáceo por encima de este valor.
Sin embargo, otras sales metálicas (de plomo, cobre, tungsteno, hierro, mo-
libdeno, cromo, etc.) pueden combinarse con la hemateína para conferirle carác -
ter de colorante catiónico. Estas sales, englobadas genéricamente dentro de los
mordientes, actúan como nexo de unión entre el colorante y el tejido a través de
la formación de un quelato en forma de precipitado insoluble. La constitución
del quelato requiere que en el colorante coexistan un grupo fenólico y un grupo
carboxílico en posición orto, de manera que se produzca el desplazamiento de
una molécula de agua y la formación de la laca .
La estabilización definitiva del complejo metálico suele requerir la adición de
otra molécula de hemateína sobre el catión metálico. Ello determina que la carga
global de las lacas formadas a partir de metales trivalentes, como las sales de
aluminio, sea + 1.
En cuanto al mecanismo de unión de las lacas catiónicas de hematoxilina a
los tejidos, parece probado que inicialmente se debe a una atracción electrostáti-
ca hacia los grupos aniónicos hísticos. Pero, a diferencia de la unión que se
observa en el caso de los colorantes básicos de anilina -que es completamente
reversible mediante tratamiento con una solución alcohólica-, los complejos
lacados suelen ser mucho más estables. Ello implica necesariamente la forma-
ción de enlaces químicos de tipo covalente entre los cationes metálicos y los
radicales aniónicos tisulares para constituir un quelato, tendencia que es mucho
más potente en las lacas crómicas y férricas que en las derivadas del aluminio.
La unión de las lacas de hematoxilina a los núcleos celulares se debe proba-
blemente a un mecanismo equivalente al descrito con anterioridad, y relacionado

con los grupos aniónicos del ácido fosfórico que existen en el ADN. Sin embar-
go, es también probable un efecto adicional por vinculación entre los anillos de
configuración paraquinoide de la hemateína no lacada y los residuos electropo -
sitivos de arginina existentes en las proteínas básicas nucleares (sobre todó las
histonas) . Este fenómeno está apoyado por el hecho de que con la hematoxilina
no se produce pérdida de tinción nuclear tras extraer los ácidos nucleicos en el
curso de la decalcificación de los tejidos.
La selectividad de la tinción nuclear obtenida con las lacas de hematoxilina
puede ser incrementada acidificando la solución del colorante, ya que la dismi -
nución del pH del medio reduce el potencial ácido de las moléculas con carácter
anfótero (principalmente aminoácidos de las proteínas), con lo cual decrece la
fijación de la laca sobre ellas. Además, el pH ácido retrasa la posible sobreoxida -
ción del colorante. Puede obtenerse un incremento adicional de la selectividad
de las lacas de hematoxilina modificando la proporción relativa del alumbre que
contienen . De esta forma , la competencia de los cationes metálicos libres por los
lugares específicos de tinción retarda su impregnación por la laca de hematoxili-
na y aumenta la selectividad de esta última . La adición de algunas otras sustan -
cias también puede modificar la estabilidad o potenc ia tintorial de las lacas de
hematoxilina. Este es el caso del etanol o el glicerol, que retrasan la coloración al
atenuar la ionización de las moléculas e impedir la colonización bacteriana,
aunque mejoran en cambio la conservación del reactivo, previniendo la sobreo -
xidación y la evaporación del colorante.
• Como regla general para la preparación de las lacas de hematoxi-

lina debe tenerse en cuenta que todos los componentes de la fórmula
han de agregarse en el orden establecido y deben estar totalmente
disueltos antes de añadir el siguiente.
Algunas lacas de hematoxilina tiñen los núcleos por un mecanismo de colora-

ción terminal o incluso progresiva, pero en ocasiones es necesario realizar una
diferenciación complementaria de la coloración utilizando soluciones débil-
mente ácidas que, por competencia con el tejido, atrapan las moléculas de
hemalumbre. Este paso suele ser imprescindible sobre todo si se ha utilizado
mucha sal metálica en la composición del colorante. El control microscópico del
proceso de diferenciación suele ser también imprescindible para evitar la decolo-
ración excesiva y para favorecer la homogeneidad de las coloraciones realizadas
en distintos momentos.
En cuanto a los tiempos de tinción, no debe olvidarse que las soluciones de
hematoxilina se utilizan repetidas veces para contrastar núcleos, lo que supone
una depleción continuada de moléculas de colorante y un descenso en su
concentración. Ello suele ser causa de que se prolonguen los tiempos de colora -
ción, y finalmente motiva una progresiva palidez de la tinción que obliga a
renovar la solución de hemalumbre.
Tras la diferenciación es necesario practicar el azuleamiento de la hematoxili -
na en medio básico (habitualmente en torno a 8) para aprovechar su cualidad de
indicador de pH y virar la tinción a la tonalidad más azulada posible. Como
agentes de azuleamiento se emplean el agua corriente o soluciones acuosas de
amoníaco, carbonato de litio o bicarbonato sódico.
HEMATOXILINA DE HARRIS
Es la laca de hematoxilina más utilizada en la coloración rutinaria de los
núcleos celulares (fig 7 .4, véase páginas en color), debido fundamentalmente a
su estabilidad (se conserva entre 6 y 12 meses) y a su facilidad de manejo. Por
tratarse de una coloración regresiva requiere diferenciación ácida meticulosa
para obtener la intensidad deseada de coloración . La adición de cierta cantidad
de ácido acético glacial a la solución final de hematoxilina incrementa la especi-
ficidad de la coloración nuclear y hace innecesaria una diferenciación ulterior.
Preparación de la solución de hematoxilina de Harris:
-Hematoxilina (cristalizada) ....... . ... . .... . . .. .... . 1 g
-Etanol absoluto . ............ ... ....... .. ........ . 10 ml
Disolver calentando suavemente:
-Alumbre potásico o amónico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 ml
Disolver en caliente. Añadir la solución de hematoxilina y llevar a ebullición.
Cuando comienza a hervir se añade:
-Oxido rojo de mercurio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 g
Dejar disolver el óxido removiendo lentamente hasta que la solución adquiera
color púrpura. Sumergir inmediatamente en agua fria. Cuando la solución se haya
enfriado, filtrar y añadir:
- Acido acético glacial 10 ml
• Observaciones:
Filtrar de nuevo antes de usarla. Almacenar en frasco opaco bien cerrado.
Tiempo medio de tinción entre 1 y 2 minutos.
HEMATOXILINA DE MAYER
Esta laca de hematoxilina es muy selectiva para colorear la cromatina nuclear
y, por tratarse de una tinción progresiva, no requiere diferenciación ulterior. Esta
última circunstancia la hace muy apropiada para el contraste de preparaciones
inmunohistoquímicas, ya que el grado de acidificación provocado sobre el tejido
es mucho menor. Sin embargo, como parte de una coloración de conjunto no es
del todo satisfactoria, ya que tiñe débilmente las estructuras basófilas extra-
nucleares así como algunos parásitos y microorganismos.
Preparación de la solución de hematoxilina de Mayer:
-Hematoxilina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1g
Disolver la hematoxilina en el agua destilada.

Añadir:
- Yodato sódico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.2 g
Añadir y disolver mediante un agitador magnético (no calentar) :
-Alumbre potásico o amoniaco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 g
- Acido citrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g
-Hidrato de cloral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 g
Filtrar.
• Observaciones:
El color final de la solución es rojo violáceo. Almacenar en frasco bien cerrado.
Tiempo medio de tinción: alrededor de 1O minutos (coloración progresiva) .
HEMATOXILINA ACIDA DE EHRLICH

Se trata de una laca de hematoxilina con baja proporción de alumbre a la que
se agrega glicerol para prevenir la sobreoxidación de la hemateína. Proporciona
una tinción nuclear algo menos intensa que las anteriores aunque más uniforme.
PROCEDIMIENTO TECNIG,O
Preparación de la solución de hematoxilina de Ehrlich:

-Hematoxilina cristalizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.0 g
-Alcohol etilico al 95 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200.0 ml
Disolver la hematoxilina en el alcohol. A continuación añadir:
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200.0 ml
- Yodato sódico al 1O por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.0 ml
Aguardar 1O minutos y añadir:
-Alumbre potásico o amónico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.0 ml
-Glicerol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200.0 ml
- Acido acético glacial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20.0 ml
• Observaciones:
Esta solución puede usarse de inmediato. Tiempo medio de coloración entre 15
y 40 minutos.
HEMALUMBRE DE DELAFIELD
Colorea los núcleos celulares de un azul muy suave; por ello es, al igual que
la hematoxilina de Mayer, ideal para realizar contraste en técnicas histoquímicas
o de carácter inmunológico. Aunque puede realizarse maduración rápida em-
pleando yodato sódico, es preferible seguir la pauta clásica de maduración
espontánea propuesta por Delafield.
Preparación de la solución de hematoxilina de Delafield:

- Hematoxilina cristalizada ............. . ........... . 5g
- Etanol absoluto . ................... .. .......... . 25 ml
Disolver la hematoxilina en el alcohol absoluto. Añadir:
- -- Yodato sódico 1O por 100 . . . . . . . .. : . . . . . . . . . . . . . . . . 10.0 ml
-Alumbre amoniacal (solución acuosa saturada) (15.0 g por
100 ml aproximadamente) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 800.0 ml
-Glicerol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100.0 ml
-Alcohol metllico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100.0 ml
OTRAS LACAS DE HEMATOXILINA

Aunque el mordiente más empleado para componer las lacas de hematoxilina
es una sal doble sulfatada que contiene constantemente aluminio (alumbre
potásico o amónico) , de manera ocasional se emplean otras sales metálicas
trivalentes en las cuales el aluminio es sustituido por cromo (hemalumbre crómi -
co), hierro (hemalumbres de Weigert y Heidenhein) o tungsteno (hematoxilina
ácida fosfotúngstica o PTAH). Salvo en la PTAH la aportación del catión se
realiza a partir de la sal de alumbre que corresponde a cada metal, de forma que
el catión crómico determinante de la coloración negroviolácea de su forma
cristalina se ajusta a la fórmula [Cr(OH 2 ) 6 ] + + + y la de su equivalente férrico, a
[Fe(OH 2 ) 6 ] + + +. En disolución, los complejos métalicos ceden uno o dos hidro -
geniones al medio, acidificando la disolución, y quedan como iones mono -
valentes o divalentes responsables de la unión doble al cromógeno y al tejido,
con la particularidad de que los quelatos 1 :1 de hemateína son rojos y los 1 :2
(metal :hemateína) , azules.
El caso de la hematoxilina ácida fosfotúngstica (PTAH) , introducida por
Mallory en 1900, es muy particular. Por una parte, los complejos PTAH se
forman lentamente debido al carácter aniónico de sus dos componentes, la
hemateína y el ácido fosfotúngstico; por otra, la intensidad de tinción varía
según el grado de envejecimiento del reactivo.
La disolución de PTAH, al igual que las lacas crómicas y férricas, es química -
mente heterogénea por contener dos componentes: azul y rojo. El complejo azul
contiene más ligantes de hemateína y es menos estable que el rojo en el cual se
convierte con facilidad . La solución recién preparada de PTAH contiene exclusi -
vamente complejo azul, adquiriendo progresivamente mayor cantidad de com -
ponente rojo . La mezcla de ambos quelatos es la responsable del efecto policró-
mico de tinción provocado por la PTAH. Así, las tonalidades de color azul serían
debidas a la unión, mediante puentes de hidrógeno, entre los componentes
tisulares y los dos grupos hidroxilos de cada residuo de colorante, mientras que
el componente rojo sería captado mayoritariamente por las estructuras hísticas
de menor basofilia.
Por su carácter de coloración polícroma, la técnica de la hematoxina ácida
fosfotúngstica se expone en el capítulo siguiente, dentro de las coloraciones
consideradas de conjunto.
HEMATOXILINA CROMICA
Constituye una excelente tinción simultánea para núcleos y grumos de Nissl,
y puede equipararse a tal efecto con el método de la galocianina de Einarson .
Preparación de la solución de hematoxilina crómica:

-Hematoxilina cristalizada . ............. . . . . . .. .... . . 1.0 g
-Agua destilada ... . ........... .. ... . ............ . . 15.0 mL
Disolver en caliente:
-Alumbre crómico Cr2 (SO,H) 3 ~SO, 24H 2 0 . . . . . . . . . . . . 15.0 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250.0 mL
Llevar a ebullición y mezclar bien hasta que la solución adopte coloración
verdosa. Añadir a esta solución la de hematoxilina. Mezclar bien. A continuación,
incorporar:
- Acido sulfúrico al 1O por 1 00 ... ... . ... ... ..... .. .. . 5.0 mL
Añadir gota a gota sobre agitador:
- Dicromato potásico .... ... . . .. ... ... . .. . . . ..... .. . 0 .552 g
-Agua destilada . .. .. . ....... . .. . .. . .. . . . ...... . . . . 20.0 mL
Hervir la mezcla durante 1-2 minutos hasta la formación completa de la laca.
Enfriar antes de su uso
• Observaciones:
El tiempo de coloración con la Hx crómica es de 1 hora, pero puede oscilar
entre 30 segundos y 1 hora, ya que no existe problema de sobrecoloración. La
diferenciación se realiza con ácido clorhidrico 0.36 N (aprox. HCI al 3-3.2 por
100). Azulear en agua corriente. La tinción citoplásmica puede ser incrementada
disminuyendo la cantidad de ácido sulfúrico hasta 1.0 -3.0 mL o añadiendo amo-
niaco o carbonato sódico a la solución. Los núcleos y grumos de Nissl se tiñen de
color negroazulado.
L-----------------------------------------------------------~1 '
HEMATOXILINAS FERRICAS
Estas hematoxilinas son muy útiles para realizar la tinción nuclear cuando es
necesario completar la coloración con soluciones fuertemente ácidas y específi -
cas para el citoplasma y componentes extracelulares hísticos (fibras conjuntivas,
sustancia osteoide, matriz cartilaginosa, etc.), susceptibles de disolver las lacas
convencionales de hematoxilina que contienen aluminio. Esto ocurre con la
mayor parte de las coloraciones tricrómicas del tejido conjuntivo.
En lo que respecta al fundamento básico de la coloración se distinguen dos
tipos de coloración con hematoxilina férrica: en un tiempo o variante de Weigert
y en dos tiempos o hematoxilina de Heidenhaim. En el primer caso, cromógeno y
mordiente se combinan inicialmente entre sí y luego se vinculan al tejido. En el
segundo, primero se realiza el mordentaje del tejido con alumbre férrico y des-
pués se agrega la hemateína.
HEMATOXILINA FERRICA DE WEIGERT
Preparación de la solución de hematoxilina férrica de Weigert:

a) Soluciones stock:
Solución 1:
-Hematoxilina cristalizada .. . . . .............. .. ..... . 1.0 g
- Etanol al 95 por 1 00 .................... ... .. .. . . . 100.0 ml
Solución 11:
-Cloruro férrico anhidro (FeCI 3 o .... ... .... . ... .. .. . . 1.5 g
FeCI 3 6H 2 0 .. . ................. · · · · · · · · · · · · · · · · · 2.48 g
-Agua destilada .................................. . 100.0 ml
b) Solución de trabajo:
-Mezclar a partes iguales las soluciones 1 y 11. En este momento la solución
se torna de color negroazulado que rápidamente vira a pardonegruzco.
Preparar en fresco y añadir:
- Acido clorhidrico concentrado . ......... ... . . .. .... . . 1.0 ml
• Observaciones:
La solución de trabajo es poco estable, por lo cual no debe emplearse
más alié de una semana después de su reconstitución. El tiempo de tinción
con la solución de trabajo de Weigert es de 1O minutos. Si la coloración se
prolonga durante más de 30 minutos siempre ocurre tinción excesiva que impide
visualizar la distribución de la cromatina. Los núcleos se colorean con una fuerte
tonalidad negroazulada (fig. 7.5, véase páginas en color).
HEMATOXILINA FERRICA DE HEIDENHAIN
Preparación de la solución de hematoxilina férrica de Heidenhain:

a) Solución de hematoxilina:
- Hematoxilina cristalizada ........ . . ............... . 1.0 g
-Etanol al 95 por 100 ........... . .......... ..... . . 20.0 ml
Disolver y añadir:
-Agua destilada .. . ... . ... . ........ . . ... . . .. .. ... . . 18.0 ml
- Yodato sódico en solución acuosa al 1 por 100 . . . . .. .. . 2.0 ml
Madurar durante algo más de 15 minutos. Añadir:
- Acido acético al 1O por 100 en solución acuosa . . . . . . . . . 60.0 ml
b) Solución de mordiente:
-Alumbre de hierro (sulfato doble de hierro y amonio) al 2 por 100 en
solución acuosa (pH 2-2.5)
·~
• Observaciones:
Aunque puede utilizarse cualquier fijador, los resultados mejoran sobre material
fijado en liquidas que contienen cloruro mercúrico. Mantener con la solución de
mordentaje durante una hora. El tiempo de tinción es de una hora en solución áe
hemateina preparada recientemente. Evitar el contacto de las soluciones con
útiles metlillicos durante el proceso de coloración. Se colorean de negro los
núcleos celulares, incluyendo cromatina y nucleolos, estriaciones de las fibras
musculares, fibrina, tonofibrillas citoplásmicas, canal/culos biliares, mitocondrias y
amebas. Citoplasmas teñidos con tonalidades variables de gris. Fibras del tejido
conjuntivo sin colorear.
7 .2. OTROS COLORANTES NUCLEARES
CARMIN
El carmín es un colorante natural de color rojo púrpura que se extrae de una
especie particular de cochinillas hembras machacadas y secas por calor. Quími-
camente, se trata de una molécula muy compleja constituida por cuatro radicales
de ácido carmínico unidos a iones cálcicos y de aluminio, los primeros formando
puentes de tipo salino con los grupos /J-hidroxilos y los segundos en forma de
quelato metálico. Aunque se ha atribuido gran importancia tintorial al compo-
nente de proteínas asociadas presente en el carmín, hoy día se considera irrele-
vante para la génesis de la coloración pues se ha comprobado que ésta no
disminuye cuando se emplea carmín enmohecido pobre en componente protei-
co.
Para la coloración nuclear, el carmín se utiliza en forma de carmalumbre que
tiñe aproximadamente las mismas estructuras que las lacas de hemateína.
Preparación de la solución de carmalumbre:

-Alumbre amoniacal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.0 g
Disolver removiendo lentamente. Añadir:
-Carmin (C.I. 75470) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.0 g
Llevar a ebullición durante 15 minutos, enfriar v filtrar. Añadir 1 mL de formol
puro para evitar el enmohecimiento.
• Observaciones:
El tiempo medio de coloración oscila entre 1 v 24 horas, realizándose en agua
la diferenciación. Los núcleos se colorean de rojo.
FUCSINAS
Todas ellas son derivados del anillo del triaminotrifenilmetano y su principal
grupo cromógeno está formado por un anillo quinónico. Actualmente tienen
escasa utilidad como colorantes nucleares, pero siguen siendo muy empleadas
para teñir materiales extracelulares en los métodos de coloración tricrómica del
tejido conjuntivo y en algunas técnicas histoquímicas para glucoproteínas (mé -
todo del ácido periódico de Schiff) y ADN (método de Feulgen) así como para
determinadas cápsulas bacterianas (técnica de Ziehi-Neelsen para bacilos áci-
do-alcohol resistentes).
Las bases simples de las que se derivan los distintos tipos de fucsina son
incoloras y reciben el nombre genérico de rosanilinas. La existencia de deriva-
dos coloreados se debe a la incorporación de un anillo quinónico a su forma
salina tras tratamiento con ácido clorhídrico. La fucsina básica del comercio
(rubina o fucsina diamante) es una mezcla de parafucsina (magenta 0) y fucsi -
na (magenta 1). Esta variedad química de fucsina es la empleada para colorear
núcleos, fundamentalmente en división activa, por un mecanismo equivalente al
de la safranina.
El número romano que distingue a cada variedad de magenta hace referencia
al número de radicales metilo (- CH 3 ) de cada molécula (fig. 7 .6)
Parafucsina Fucsina (cient.) Neofucsina

(Magenta O) (Magenta 1) (Magenta 11)
Figura 7.6. Fórmula del magenta O, 1, 11.
Preparación de la solución de fucsina básica:

- Fucsina básica {C. l. 42 51 O) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.0 g
• Observaciones:
Los núcleos y células en mitosis se tiñen de color rojo púrpura.
Preparación de la solución de fucsina ácida

La fucsina ácida (fucsina S o rubina S) (fig. 7.7) se obtiene por acción
del ácido sulfúrico sobre la fucsina básica para producir un derivado sulfatado
con carga ácida global que tiñe, en principio, las estructuras hísticas de carácter
básico. Como los núcleos celulares contienen abundantes proteínas básicas, se
produce una adsorción del colorante sobre ellas. Así pues la fucsina ácida puede
emplearse para producir una tinción nuclear que constituye la imagen comple-
mentaria de la obtenida con las lacas de hematoxilina. Se utiliza en soluciones
acuosas al 0.5-1 por 1 OO.
Los otros dos derivados fundamentales de la fucsina, el ácido sulfofucsídi-
co y la fucsina fenicada o de Ziehl, serán analizados al tratar la coloración del
PAS para hidratos de carbono y la técnica de Ziehi-Neelsen para micobacterias,
ya que constituyen los reactivos fundamentales de ambos métodos.
N,o,~ ~cr e
11
ea,sf) NH ,
(j)
Figura 7.7. Fórmula de la fucsina ácida .
SAFRANINA
La safranina es una sustancia de carácter básico derivada de las acinas (fig.
7.8) que constituye un excelente colorante de la cromatina a la que tiñe de
color rojo brillante, por tanto, es de elección en la coloración específica
de los cromosomas. El agente fijador de elección para este caso son los
líquidos que contienen cromo o tetróxido de osmio.
Preparación de la solución de safranina:

Solución «stock» de safranina:
- Safranina G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.0 g
-Etanol al 96 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155.0 ml
Mezclar ambos liquidas y ulteriormente disolver la safranina. Almacenar a 4 oc.
FUNDAMENTOS GENERALES DE COLDRACION 137
Figura 7.8. Fórmula de la safranina.
Solución de trabajo:
-Solución «stock)) de safranina . . . . . . . ..... . ... . ..... . 20.0 mL
- Etanol al 50 por 1 00 . .. . . . . .. .. .. ... .... . ...... .. . 80.0 mL
• Observaciones:
Teñir durante 24 horas. Diferenciar en una mezcla de ácido clorhldrico al 1 por
100 y etanol absoluto a partes iguales, controlando al microscopio.
GALOCIANINA Y AZUL DE CELESTINA B

Ambos colorantes son sustancias de carácter básico derivadas de las oxaci-
nas (iminas quinónicas -figs. 7.9 y 7 .1 0- ) y, al igual que la hemateína, son
susceptibles de combinarse con iones metálicos como el cromo, hierro y alumi -
nio, para formar lacas aplicables a la coloración nuclear. Estos colorantes se
comportan en disolución como sustancias anfóteras, por lo cual pueden teñir
indistintamente tanto estructuras basófilas como acidófilas, dependiendo del pH
del medio . En el caso del azul de celestina B, la sustitución del grupo carboxilo
de la galocianina por un grupo amino lo hace más soluble en agua, facilitando
su conversión en laca, y aumenta su punto de disociación, de manera que
amplía el rango de pH en el que la coloración nuclear es fuertemente selectiva .
La galocianina, a través de sus dos grupos hidroxilos adyacentes, tiende a
formar lacas crómicas o férricas tras realizar un mordentaje con alumbre. De esta
manera, adquiere carácter fuertemente electropositivo y t iende a reaccionar con
los componentes acídicos tisulares, como los ácidos nucleicos y los grumos de
Nissl, de forma equivalente a las lacas de hematoxil ina . La laca férrica de galo -
c¡ e ~N:u)
C:H
HJC"'e~
N O
_¿;:, ·OH
HC/
3
OH
Figura 7.9. Fórmula de la galocianina.
H,C"~~O~OH
H,c/ ~~
C-NH 2
11
o
Figura 7.10. Fórmula del azul de celestina B.
cianina es poco soluble en agua, donde se forma exclusivamente tras ebullición

de la mezcla, y colorea los núcleos de color púrpura, lo cual provoca escaso
contraste con la eosina. Por ello, la laca crómica de galocianina es de elección
en estos casos, así como para teñir los núcleos celulares sobre material inclui,do
en gelatina, ya que es el único colorante que no impregna inespecíficamente a
esta sustancia.
La preparación de los reactivos y el procedimiento de tinción se encuentran
desarrollados en el capítulo sobre coloraciones específicas para tejido nervioso
en el caso de la galocianina, y en el de coloraciones de conjunto en lo que
respecta al azul de celestina B.
ROJO NUCLEAR EXTRA O RAPIDO (KERNECHTROT)

Este colorante es una antraquinona sulfonada (fig. 7.11) que se utiliza en
forma de laca de aluminio de gran apetencia por los núcleos celulares y con
escasa reactividad frente a otras estructuras hísticas. La tinción roja que determi -
na, hace de este el procedimiento de elección para realizar coloraciones de
contraste nuclear (fig . 7.12, véase páginas en (!Olor) cuando la demostración de
los resultados de una técnica histoquímica provocan color azul (caso de las
técnicas de Perls o de Turnbull para iones férricos o ferrosos) o negro (hemato-
xilina de Verhoeff para fibras elásticas).
OH
SO,Na
Figura 7.11 . Fórmula del rojo nuclear extra.
Preparación de la solución de rojo nuclear extra:

- Rojo nuclear extra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.1 g
-Solución acuosa de sulfato alumlnico al 5 por 100 . . . . . . 100.0 mL
Llevar a ebullición la solución de sulfato alumlnico. Retirar del calor y añadir el

rojo nuclear. Disolver en caliente (tiempo medio de 1O minutos). Dejar enfriar y
filtrar. Añadir algunos cristales de timol para su preservación.
• Observaciones:
El tiempo de tinción oscila entre 2 y 5 minutos. Lavar muy bien en agua
destilada, si el lavado no es peñecto, la preparación puede adolecer de
falta de nitidez. Los núcleos se tiñen de color rojo.
8. COLORANTES CITOPLASMATICOS
En general, los colorantes citoplasmáticos son menos específicos que los nu-
cleares, pues se fijan a los componentes extracelulares de los tejidos provocando
su tinción simultánea. Aunque existen muchos, en este capítulo analizaremos los
que se emplean específicamente en las coloraciones rutinarias de conjunto,
como los distintos derivados xanténicos, entre los que sobresalen la eosina, la
floxina y el cromotropo SR.
8.1. Colorantes xanténicos
Entre ellos destacan por su importancia la eosina (fig. 7.13) y la floxina, que .
son derivados hidroxixanténicos halogenados con tres grupos arilo. Las diferen-
cias de coloración que existen entre ellos están motivadas por el tipo y número
de átomos de halógeno que contiénen (eosina Y: cuatro átomos de bro-
mo; eosina B: dos átomos de bromo; floxina: dos átomos de cloro y cuatro de
bromo por molécula). En general, todos ellos tienen autofluorescencia espontá-
nea y colorean los tejidos de diversas tonalidades entre rojo y rosa. Por lo
común, se difunden fácilmente en las estructuras hísticas, sobre todo en las más
compactas, a las cuales tiñen debido a que, por su carácter ácido, son atraídos
fuertemente hacia los radicales básicos de la histidina, lisina y arginina presentes
en las proteínas tisulares.
Aunque pueden emplearse en solución tanto acuosa como alcohólica, son
más solubles en la primera. No obstante, la adición de etanol a las disoluciones
de trabajo retarda el proceso de diferenciación del colorante y lo hace, por tanto,
menos dificultoso.
Figura 7.13. Fórmula de la eosina Y.

EOSINA ALCOHOLICA
PROCEDIMIENTO TECNICO .
Preparación de la solución de eosina alcohólica:
a) Solución «stock,,:
- Eosina Y (C. l. 45 380) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.0 g
Disolver calentando suavemente y dejar enfriar. Añadir:
- Etanol al 95 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80.0 ml
-Solución «stock» . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25.0 ml
-Etanol al 80 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75.0 ml
• Observaciones:
Filtrar antes de su uso. La adición de 0.5 ml de ácido acético glacial a cada 100
ml de solución refuerza la tonalidad roja del tejido a colorear.
EOSINA ACUOSA
Preparación de la solución de eosina acuosa:

a) Solución «stock,,:
- Eosina Y (C. l. 45 380) .. . ..... . . . . . . ... .. . ... . . ... . 5.0 g
-Agua destilada .. ...... . . . . ... . ... ..... . .... .. .. . . 100.0 ml
-Solución «stock» . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 parte
-Agua corriente o destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 partes
• Observaciones:
Estll comprobado que el empleo de agua corriente provoca una coloración mlls
profunda de las estructuras eosinófilas. En este caso debe añadirse a la solución
«stock» algunas gotas de formaldehfdo puro para garantizar la conservación.
EOSINA PRECIPITADA
Preparación de la solución de eosina precipitada:

- Eosina Y (C. l. 45 380) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.0 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 000.0 ml
• Observaciones:
Disolver calentando suavemente. Enfriar. Añadir gota a gota 8 ml de ácido
clorhídrico concentrado. Dejar precipitar durante 24 horas y decantar el sobrena-
dante. Lavar el precipitado en seis cambios de agua destilada de 500 ml cada uno.
Secar el precipitado a 37 oc y disolver en 800 ml de etanol al 95 por 100. En este
momento la solución esté lista para su uso. Tiempo medio de coloración entre 30
y 60 segundos. La coloración obtenida con la solución de eosina precipitada es
més brillante que la obtenida con la eosina acuosa estándar.
8.2. Cromotropo 2R
Junto con el naranja G, pertenece al grupo de los colorantes azoicos y

produce una característica coloración rojo brillante. Se utiliza en solución
alcohólica al 1 por 100 y constituye de entre las coloraciones rutinarias de
conjunto la mejor alternativa a los derivados xanténicos.
GlOSARI O
Alumbres: son sales dobles de sulfato de un metal trivalente y de otro monovalente.
Su fórmula general es (S0,) 3 · M~ 11 • SO,Mi · 24H 2 0 .
Coloración topográfica: es la que proporciona una visión de conjunto del tejido
coloreado de forma que es posible separar todos sus componentes arquitecturales.
Coloración estructural: es la tinción que se realiza para resaltar determinadas
estructuras tisulares (núcleos, fibras elásticas, reticulares, mitocondrias, etc.) .
Coloración histoquímica : es la utilizada para teñir estructuras tisulares mediante
colorantes o precursores de éstos que reaccionan químicamente y de forma unívoca con
ellos.
Mordiente: es toda sustancia que actúa como eslabón o vínculo entre el tejido y el
colorante acrecentando la unión específica entre ambos, de forma que sin su presencia,
este último no es capaz de unirse a la estructura a teñir. Existen numerosos mordientes y
de muy distinta naturaleza, aunque los más importantes son :
- Ciertos ácidos y sales metálicas como el sublimado mercúrico, ácidos fosfotúngsti-
co, fosfomolíbdico, crómico, pícrico, etc. --
-Sustancias que favorecen la oxidación tisular, como el tetróxido de osmio, perman-
ganato potásico, etc.
- Sales de alumbre o metálicas dobles, de las cuales el único representante natural es
el sulfato aluminicopotásico. Sin embargo en el laboratorio se ha conseguido
sustituir el aluminio por hierro, cromo y manganeso y el potasio por sodio, amonio
o rubidio .
142 lABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA
Acentuadores de la tinción: son sustancias que provocan un incremento en la

selectividad o intensidad de la tinción sin actuar como eslabón intermediario entre el
colorante y el tejido. Al no tomar parte directa en la coloración este último paso podría
ocurrir sin su presencia aunque más débilmente. Un ejemplo característico es la acción
(!el fenal en la técnica de Ziehi-Neelsen . En ocasiones, la actuación del acent ador
provoca una reacción más rápida con el tejido, por lo cual estas sustancias también
reciben la denominación de aceleradores.
Coloración directa: es la producida por un colorante simple que tiñe el tejido sin
necesidad de mordientes y en tonos variables de un mismo color.
Coloración indirecta: es aquella en la cual el colorante necesita de la acción de un
acentuador o un mordiente para provocar la tinción .
Coloración sucesiva: es aquella en la cual se emplean diversos colorantes uno tras
otro, es decir, sin mezclarlos.
Coloración simultánea: es aquella en la cual se emplean a la vez todos los coloran-
tes que componen el método.
Coloración indirecta en un tiempo: es aquella en la que el tratamiento del tejido
con el colorante y el mordiente o acentuador se realiza simultáneamente en una misma
solución, que recibe, en este caso, el nombre de laca (lacas de hematoxilina, por ejem -
plo) .
Coloración indirecta en dos tiempos: es aquella en la cual el colorante y el
mordiente o acentuador actúan separadamente.
Coloración progresiva: así se denomina a toda tinción en la que los colorantes,
acentuadores o mordientes se aplican siguiendo una secuencia definida con estricto
control de los tiempos de aplicación , de forma que se dejan actuar durante el lapso
necesario para alcanzar la intensidad deseada de tinción . Comúnmente no se realizan
lavados de diferenciación ulterior, ya que el punto exacto de tinción es controlado
directamente en el microscopio.
Coloración regresiva: es aquella en la cual primero se sobrecolorea y luego se
elimina el exceso de colorante a través de un proceso denominado diferenciación que,
habitualmente, debe ser controlado al microscopio hasta obtener la intensidad deseada
de tinción . Los principales agentes diferenciadores son disoluciones alcohólicas de áci-
dos o álcalis, disolventes como el etanol o la acetona, mordientes en solución diluida,
tampones o aclarantes como el aceite de anilina.
Coloración terminal: es aquella en la cual la intensidad de coloración no depende
del tiempo de actuación del colorante.
Coloración en bloque: en ella, el tejido se tiñe en fresco o inmediatamente después
de su fijación para, con posterioridad, realizar su inclusión y corte. Hoy día este tipo de
métodos se encuentran en la base de la inmunohistoquímica ultraestructural, donde el
marcaje de los antígenos a determinar se realiza sobre tejido fresco y de forma previa a la
inclusión en plástico.
Impregnación: aunque no es una coloración en sentido estricto, recibe este nombre
cualquier método de opacificación tisular basado en el depósito de precipitados de sales
de metales pesados (oro, plata, plomo, osmio, etc.) sobre o en el interior de las células y
constituyentes tisulares.
Alocromasia: es el fenómeno por el cual se obtienen diversas tonalidades de col01
tras el empleo de un colorante salino que tiñe diferencialmente distintas estructura~
tisulares (coloración de Giemsa, por ejemplo). Este fenómeno no debe confundirse con e1
de metacromasia, propio de colorantes químicamente puros y no de combinacione~
salinas de los mismos (véase, posteriormente, colorantes metacromáticos).
CAPITULO 8
El microscopio
GUION DE CONTENIDOS
1. MICROSCOPIO OPTICO
1.1. Introducción
1.2. Microscopio simple.
1.a.Microscopio compuesto.
1.4. Microscopia de campo oscuro.
1.&. Microscopia de contraste de faae.
,. 1.8. Microscopia de polarización
1.7. Reglas generales para el uso del microscopio
2. MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION
2.1. Generalidades
2.2. Partes del microscopio electrónico
2.3. Funcionamiento del microscopio electrónico
1. MICROSCOPIO OPTICO
1 .1 . Introducción
El microscopio es un instrumento óptico que, como su nombre indica (del

griego mikrós, «pequeño», y skopein, «examinar») , permite ver objetos que por
su pequeño tamaño escapan a la percepción del ojo humano.
Los microscopios ópticos o fotónicos se dividen en los siguientes tipos:
microscopio simple, estereoscópico o lupa y microscopio compuesto, también
llamado común .
1 .2 . Mi c roscopio simple
Está constituido por una lente o sistema de lentes convergentes dispuestas

de tal modo que suministran una imagen virtual, derecha y mayor que el objeto;
éste se encuentra situado entre la lente y su foco .
Las lupas amplían 2, 4, 8, 1 O ó 20 veces, o algo más, la imagen del objeto
observado. Existen lupas monoculares y binoculares, montadas en un soporte
cuya lente se acerca Ó aleja del objeto, depositado sobre una platina, mediante
un mecanismo de cremallera accionado por un piñón. Sus aplicaciones son
bastante limitadas; suelen utilizarse para la disección de pequeños animales o
para la disociación de piezas histológicas (fig . 8.1).
A B
Figura 8.1. Microscopio simple: A) Lupa estereoscópica de 4 x de máxi-
mo aumento . B) Esquema del sistema de lentes.
EL MICROSCOPIO 145
1.3. Microscopio compuesto
En este tipo de microscopio se combinan los poderes amplificantes de dos

lentes o sistemas de lentes, ambos convergentes, que se encuentran colocados
en los extremos de un tubo: el objetivo, situado cerca del objeto que se observa,
y el ocular, colocado cerca del ojo.
Con este instrumento se logran aumentos de 50, 1 00 ó 1000 veces, o algo
más, según la combinación de lentes y la longitud de onda que se emplea para
su iluminación . La imagen resultante es virtual e invertida .
Al igual que el microscopio simple, el microscopio compuesto posee una
parte mecánica y otra óptica.
PARTE MECANICA
Está constituida por el estátivo, o montura del microscopio, y consta de pie,
columna, platina, tubo y revólver.
a) Pie. Sirve como base del microscopio y tiene el peso suficiente para dar
estabilidad al aparato. Antiguamente tenía forma de herradura; en la actualidad
es una plataforma rectangular. En él va integrada la fuente luminosa.
b) Columna. Es un vástago perpendicular al pie. Puede ser arqueada o
vertical con una charnela . El brazo, o parte superior de la columna, sustenta el
tubo del microscopio.
e) Platina. Plataforma horizontal con un orificio circular central, sobre el
que se coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes del
foco de iluminación situado por debajo de ella. Es paralela al pie y perpendicular
a la columna, a la cual va unida. Puede deslizarse a lo largo de la columna
mediante un tornillo situado en ella que se denomina macrométrico, de cremalle-
ra o de avance rápido; existe otro más pequeño que realiza U R movimiento más
lento: el tornillo micrométrico o de ajuste fino del enfoque.
Dos láminas elásticas o pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la
platina y evitar que se desplace accidentalmente cambiando el campo de obser-
vación . Un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento
permite mover la preparación deslizándola de delante hacia atrás o de izquierda a
derecha, y viceversa.
En la parte posterior de uno de los laterales se encuentra un nonius que
permite fijar las coordenadas de cualquier campo óptico; de esta forma se puede
acudir directamente a él cuando interesa (fig . 8.2).
Figura 8.2. Diferentes tipos de platinas.

d) Tubo . Es una cámara oscura unida a la columna por medio de una

cremallera. Presenta el objetivo en su extremo inferior y el ocular en el superior.
e) Revólver. Es una pieza metálica en forma de casquete, situada en el
extremo del tubo, que lleva atornillados los objetivos de distintos aumentos, los
cuales se distinguen por su diferente longitud, siendo el más corto el de me nor
aumento. Al hacer girar el revólver, los distintos objetivos se sitúan sucesiva-
mente en el eje óptico. (fig. 8.3) .
Columna
.l;,l¡liJ...-n.,.--'1'fTi!IJI;=_......,
...-- Tornillo
macrométrico
....,,..-.:~.r - Tornillo
micrométrico
- Pie
Figura 8.3. M icroscopio compuesto binocular.
PARTE OPTICA
Comprende los objetivos, los oculares y el aparato de iluminación .
a) Objetivo. Está compuesto por un sistema de lentes convergentes mon -
tadas en un tubo metálico que constituye el soporte del objetivo. Este sistema
óptico proporciona una imagen real , aumentada e invertida, del objeto que se
observa .
Actualmente los objetivos de foco muy corto (fuerte seco, inmersión) llevan
lo que se denomina montura telescópica o en resorte, que consiste en que la
parte central puede deslizarse en el interior del objetivo. De esta manera, al no
ser rígido el objetivo se evita su deterioro en caso de choque con la preparación.
El aumento primario del objeto es producido por la lente objetiva; la imagen
se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final. Por tanto, el aumento
de la imagen será mayor cuantas más lentes formen parte del objetivo. Dicho
aumento viene grabado en el tubo ·soporte; así, por ejemplo, 1 O x significa que
aumenta la imagen 1O veces con respecto al objeto.
Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su
EL MICROSCOPIO 147
poder de resolución (o de separación) , es decir, la capacidad de mostrar

distintos y separados dos puntos muy próximos. Por consiguiente, cuanto mayor
sea el poder de resolución mayor será la definición de un objeto. El poder de
resolución del microscopio radica en el objetivo. Se denomina como límite de
resolución (R) la distancia mínima a la que pueden estar situados dos puntos
para su perfecta discriminación . El límite de resolución depende de la longitud
de onda de la luz utilizada durante la observación y de la apertura numérica del
objetivo (AN), cuyo valor es AN = n sen a. La apertura numérica aparece
indicada en la montura de los objetivos modernos.
0.61 · A.
R = ---
n sen a
siendo:
0.61 : constante de contraste mínimo.
n: índice de refracción del medio circundante.
a: ángulo de semiapertura.
(El ángulo de apertura de un objetivo es el limitado a los rayos más peri-
féricos que penetran en el sistema óptico y contribuyen a formar la imagen de un
punto cualquiera del objeto) (fig. 8 .4).
El poder de resolución del microscopio será tanto mayor cuanto menor sea el
valor del límite de resolución; de aquí que el aumento de la resolución de una
lente pueda conseguirse disminuyendo la longitud de onda de la luz incidente o
aumentando la apertura numérica . Como habitualmente la longitud de onda
viene fijada, la resolución de un objeto es función de la apertura numérica . Hay
una correspondencia aproximada entre el aumento de un objetivo y su apertura
numérica, de tal modo que las lentes con mayores aumentos tendrán mayores
aperturas numéricas. Esto es debido a que el ángulo de semiapertura «a» aumen-
ta al disminuir la distancia del objeto O a la lente, cuyo diámetro de apertura es
AB. Un factor que afecta a la apertura numérica, además de la construcción de la
o
Figura 8.4. Angulo de semiapertura (a) . Angulo de apertura (2a) .
148 LABORATORIO DE ANATOM IA PATOLOGICA
lente, es el medio a través del cual pasa la luz. Si el medio interpuesto es el aire
(objetivo a seco) , el valor del índice de refracción es 1; si es de aceite de cedro
(objetivo de inmersión) , será 1.515. Esto explica por qué los objetivos de inmer-
sión tienen mayor apertura numérica que los objetivos a seco.
La tabla 8.1 proporciona una idea del límite de resolución de los objetivos
corrientemente empleados cuando se observa con luz común amarillo-verde de
unos 550 nm de longitud de onda .
Tabla 8 .1
R Aumento AN
1.34 ll 10 x 0.25
0.83 ll 20 x 0.40
0 .51 11 40 x 0.65
0.26 11 100 x 1.30
Atendiendo a las condiciones de su empleo y al mecanismo de construcción,

los objetivos se clasifican en :
Objetivos a seco. Son aquellos que no requieren que se interponga ninguna
sustancia entre el objetivo y la preparación, es decir, preparación y lente están
separados por aire (n = 1 ). Según su capacidad de aumento se clasifican en
débiles y fuertes .
Objetivos de corrección. Tienen por función corregir el defecto que poseen
los objetivos a seco debido al empleo en la preparación de cubreobjetos de
distintos espesores. Uno de los modos de corregir este defecto consiste en
separar más o menos el sistema superior de lentes del sistema inferior; esto se
consigue a voluntad en cada caso, según el espesor del cubreobjetos que posea
la preparación .
Objetivos de inmersión. Se designan así aquéllos que requieren que entre la
lente frontal y la preparación se interponga un líquido transparente con un índice
de refracción superior al del aire. Cuando se trata de obtener grandes aumentos
hay que recurrir a esta clase de objetivos. Pero la principal razón de su uso es la
propiedad descubierta por Amici de que, a igualdad de aumento, son mucho
más luminosos, pues el líquido interpuesto impide la desviación de los rayos más .
oblicuos y la lente frontal recoge así muchos más rayos para la formación de la
imagen . Pueden ser de inmersión en agua (n = 1.33) , de inmersión en aceite (n
= 1.515) y de inmersión en monobromuro de naftaleno (n = 1.66) . El objetivo
de inmersión en aceite es el más utilizado. En las primeras técnicas de inmersión
se empleó aceite de cedro, una sustancia natural que a menudo se endurecía .
Los nuevos aceites sintéticos tienen índices de refracción uniformes conocidos
(fig. 8.5) .
b) Ocular. Consta de dos lentes o sistemas de ellas que se encuentran

montadas en los extremos de un tubo adaptado a la parte superior del microsco -
pio. El ocular recoge la imagen suministrada por el objetivo transformándola en
una imagen virtual , aumentada y derecha. La lente superior se denomina lente
ocular, y la inferior, colectora o lente de campo .
EL MICROSCOPIO 149
Lente frontal del objetivo
'
' Aceite
Portaobjetos
'
''
''
''
'
Figura 8.5. Diagrama que ilustra el uso del objetivo de inmersión en
aceite. Nótese que el lado izquierdo está sin aceite y que la luz es refractada
hacia fuera de la lente frontal del objetivo .
Existen diversos tipos de oculares:

Ocular de Huyghens o negativo. Está constituido por dos lentes plano-
convexas separadas por un diafragma . Las caras convexas de las lentes están
dirigidas hacia el objeto que se examina.
Ocular de Ramsden o positivo. Constituido, como el anterior, por dos lentes
plano-convexas, pero con caras convexas dirigidas hacia dentro y el diafragma
situado por encima de ellas.
Ocular de compensación. Está constituido por tres lentes, dos de las cuales,
llamadas doblete, están fíjas y en contacto (fig. 8.6). ·•
Los oculares cubren una gama de aumentos de 6 a 25 x, si bien los más
utilizados son los de 1 Ox .
Para conocer el aumento total con que se está observando en un momento
determinado basta con multiplicar el aumento debido al objetivo por el corres -
pondiente al ocular. Así, por ejemplo, si·trabajamos con un objetivo de 40 x y un
ocular de 1 Ox , el aumento total es de 400 x. En el caso de disponer de sistemas
A B e
Figura 8.6. Corte vertical en esquema del ocular de Huyghens (A) . Ocular
de Ramsden (B) . Ocular de compensación (C) .
Figura 8.7. Microscopio convencional con sistema de vídeo incorporado

que permite ver las imágenes en un monitor de televisión y grabarlas.
de captación por cámara de vídeo, se debe multiplicar por el aumento de la lente

intermedia entre objetivos y cámara, y no por el ocular (fig. 8 .7) .
Como ya se ha mencionado, la resolución del objeto está a cargo del objeti-
vo; por ello el usuario obtiene mayores ventajas con objetivos de gran aumento
que con objetivos de poco aumento unidos a oculares de gran aumento, pues
estos últimos no tienen gran poder de resolución.
Los microscopios modernos son generalmente binoculares y permiten una
observación prolongada sin producir cansancio, a la vez que proporcionan una
mayor calidad de imagen.
e) Sistema de iluminación. El sistema de iluminación de un microscopio
es también de considerable importancia, sobre todo cuando se utilizan grandes
aumentos. En los microscopios modernos la luz la emite una lámpara halógena
situada en la base del microscopio, y es reflejada internamente por un espejo
localizado en el eje óptico del microscopio. Esta luz debe recogerse y enfocarse
en el objeto depositado sobre la platina. El condensador es una combinación de
lentes colocadas bajo la platina que no sólo enfoca la luz sobre el objeto, sino
que suministra también un cono de luz suficiente para la apertura numérica del
objetivo. Para las lentes de poco aumento no se necesita condensador, o basta
un condensador simple de dos lentes de Abbé. Como en el caso de las lentes del
objetivo y del ocular, para una microscopia óptima el condensador debe ser
correcto. Al servicio de las lentes condensadoras existe un diafragma-iris cuya
función es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando
los rayos demasiado desviados. Este diafragma consiste en una apertura regula-
ble manualmente cuyo centro coincide con el eje óptico.
1 .4. Microscopia de campo oscuro
El microscopio de campo oscuro es un microscopio óptico ordinario cuyo

sistema condensador ha sido modificado para obtener una iluminación oblicua
extrema, de forma que ningún rayo directo penetre en el microscopio. Esto se
EL MICROSCOPIO 151
consigue reemplazando el condensador común por otro de campo oscuro que

sólo deja pasar un cilindro hueco de luz. No obstante, los rayos periféricos y
paralelos que constituyen este cilindro se reflejan, y se pueden visualizar objetos
brillantes sobre el campo oscuro.
La microscopía de campo oscuro es particularmente útil en bacteriología con
preparaciones húmedas, para detectar espiroquetas u otros microorganismos
con movilidad.
1.5. Microscopia de contraste de fase
El método llamado de «contraste de fase» tiene por objeto variar los contras-
tes de la imagen utilizando diferencias de absorción y de marcha de los rayos en
el sistema óptico del microscopio, al tiempo que permite examinar las prepara -
ciones con plena apertura del objetivo, es decir, utilizando al máximo su poder
de resolución.
A diferencia del microscopio ordinario, el microscopio de fase hace visible
objetos transparentes y no coloreados aprovechando, mediante dispositivos es-
peciales, las pequeñas diferencias de espesor e índice de refracción entre el
objeto y el medio que lo rodea , así como las diferencias de densidad óptica y
espesor entre las diversas partes del objeto.
Para convertir un microscopio óptico ordinario en uno de fase debe usarse un
condensador de fase con objetivos de fase provistos de sus correspondientes
placas.
Debido a la difracción incompleta de la luz, aparecen a menudo aureolas en
los márgenes entre muestras y medio, y en áreas de diferente densidad óptica del
tejido. Para evitarlo puede emplearse una forma de microscopia de fase denomi-
nada microscopia de interferencia.
MICROSCOPIA DE INTERFERENCIA
En el microscopio de interferencia la luz se polariza y se divide en rayos
principales y de interferencia, separados por medio de una placa birrefringente o
de prismas. Un rayo pasa a través del objeto y el otro a través del medio. Cuando
se unen los dos rayos en condiciones adecuadas, se originan interferencias y se
obtiene en las imágenes variaciones de color.
La microscopía de contraste de fase y sus modalidades permiten el estudio
de material vivo no teñido, así como de muestras fijadas. En cultivos de tejidos
es muy útil para examinar células sin dañarlas (fig. 8.8) .
1.6. Microscopia de polarización
Para convertir un microscopio ordinario en un microscopio de luz polarizada

es necesario colocar un polarizador entre la fuente de luz y el condensador, y un
analizador entre el objetivo y el ocular.
Cuando un objeto isotrópico se mira a través de dos filtros polarizadores
cruzados (polarizador y analizador), se produce un campo oscuro. En cambio si
está presente un objeto birrefringente, al hacerlo rotar con relación a los filtros
Figura 8.8. Microscopio invertido para la observación de muestras no

teñidas. Nótese la disposición del revólver de oculares y la epiluminación.
cruzados el objeto se ve brillante sobre un campo oscuro. El brillo varía según el

ángulo formado con los polarizadores. En una rotación completa de 360° hay
cuatro áreas de brillo máximo y cuatro de oscuridad .
La mejor aplicación clínica de la polarización es la identificación de «cuerpos
extraños» tales como partículas de talco, suturas y pelos en los tejidos así como
para la identificación de la sustancia amiloidea .
1.7. Reglas generales para el uso del microscopio
El microscopio debe estar colocado sobre una mesa de trabajo sólida y

encima de un grueso fieltro que evite vibraciones y movimientos. El observador
tia de sentarse cómodamente frente a él, con la espalda recta y la cabeza
inclinada sobre el ocular.
Una vez dispuesta la preparación sobre la platina, se procede al enfoque
utilizando un objetivo de pocos aumentos. Es regla general enfocar la prepara-
ción de abajo arriba : es el modo más seguro de conseguir el enfoque y de evitar
daños en la preparación y en los objetivos. Para ello se aproxima el objetivo a la
preparación colocándolo a menor distancia de la correspondiente al foco mirado
por fuera del aparato. Luego, mientras se observa por el ocular, se va separando
lentamente, utilizando el tornillo macrométrico, hasta que se vea la preparación .
El enfoque se completa mediante el tornillo micrométrico.
Para cambiar de objetivo se gira el revólver sin modificar la posición del tubo
y procurando que la lente frontal no roce el cubreobjetos. Cuando se va a usar
un objetivo de inmersión, tras desplazar el objetivo a seco que se utilizó se pone
una gota de aceite de inmersión sobre la preparación y se completa luego el
desplazamiento del revólver hasta conseguir que el objetivo de inmersión quede
en su sitio .
Si al enfocar la preparación se observa la imagen de la lámpara de donde
procede la luz, se bajará un poco el condensador. Si hay un exceso de luz se
cerrará un poco el diafragma; en caso necesario se disminuirá la intensidad de la
fuente luminosa o se utilizarán filtros de color azul claro.
EL MICROSCOPIO 153
Cuando se usen técnicas de inmersión se evitará ensuciar las lentes secas, la

platina y el condensador, y se limpiará bien el objetivo. Los objetivos de inmer-
sión y el condensador pueden limpiarse con unas gotas de xilol y una tela suave
o papel de lente. Los objetivos secos, simplemente con agua destilada. El exte-
rior del aparato se puede limpiar con un paño húmedo (no se debe usar alcohol
ni acetona) .
Cuando haya que trasladar el microscopio, se tomará por el brazo. Cuando
no se esté utilizando debe quedar guardado en un sitio seco, cubierto por su
funda de plástico .
2. MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION
2.1. Generalidades
A diferencia del microscopio óptico, el microscopio electrónico utiliza como

fuente de luz un haz de electrones de longitud de onda 1 00.000 veces inferior a
la de la luz empleada habitualmente. Como se ha mencionado anteriormente, de
la menor longitud de onda utilizada depende en gran parte el mayor poder de
resolución del microscopio. Por ello este instrumento permite obtener aumentos
muy superiores a los del microscopio óptico (1 00.000 a 300 .000 diámetros) y
con un límite de resolución de hasta 5 A. Además, permite dilucidar estructuras
complejas o niveles de organización de la materia viva y de cada uno de sus
componentes que no pueden ser estudiados con el microscopio óptico.
2.2. Partes del microscopio electrónico
Esquemáticamente las partes del microscopio electrónico son (fig. 8.9) :

T: tubo.
P: pantalla de proyección .
F: filamento (situado en la extremidad superior del tubo) .
L: lentes.
P: portamuestras.
BP: brazo articulado para manejo de muestras.
CF: cámara fotográfica o de TV.
Instrumentos anejos al microscopio:
- transformador,
- bombas de vacío.
2.3. Funcionamiento del microscopio electrón ico
En primer lugar hay que conseguir un haz de electrones a partir de un

filamento metálico de tungsteno . Al aplicarle una corriente eléctrica de alto
voltaje, este filamento emite electrones desde la corteza de sus átomos en forma
de flujo continuo. Para ello el filamento va conectado al transformador, que
Figura 8.9. A) Columna de vacío del microscopio electrónico de transmi -

sión. 8) Imagen esquemática de sus componentes.
eleva la tensión de la corriente eléctrica desde 220 voltios a 200.000-600.000

voltios. Para que el haz de electrones discurra por el tubo es necesario realizar el
vacío en su interior.
La pantalla está formada por una sustancia fluorescente y posee un sistema
de comunicación directa con la cámara fotográfica o de TV situada debajo.
Como es sabido, los tejidos muestran una distribución irregular de la materia,
potenciada por el contraste suplementario que proporciona la impregnación
previa con osmio y plomo. Así, al atravesar el objeto el haz de electrones quedará
retenido por las zonas donde existe mayor densidad y en cambio pasará libre-
mente por las áreas restantes hasta incidir sobre la pantalla y originar allí fluores-
cencia .
Todo ello determina que al observar el objeto aparezca un juego de sombras
y fluorescencia verde brillante que compone la imagen proyectada en forma de
sombra geométrica del tejido. Como la imagen así obtenida es ligeramente
defectuosa, el diagnóstico o análisis definitivo de la preparación se hace a partir
de las fotografías realizadas con aparición de una imagen en blanco y negro.
El microscopio consigue gran parte del aumento debido a que lleva incorpo-
radas unas lentes electromagnéticas denominadas condensadora, amplificadora
y proyectara u ocular, que concentran los electrones en un punto, amplificando
así su acción.
CAPITULO 9
Coloraciones
histopatológicas rutinarias
de mayor interés
GUION DE CONTENIDOS
1. COLORACIONES HISTOLOGICAS DE CONJUNTO
1.1. Método de la hematoxilina-eosina
1.2. Método de la hematoxilina ácida fosfotúngstica (PTAH)
1 .3. Coloraciones de conjunto que simultáneamente
demuestran metacromasia
2. ALGUNAS TECNICAS DE COLORACION PARA LA
IDENTIFICACION DE SUSTANCIAS
2.1. Coloraciones para grasas
2.2. Coloraciones para glucógeno: Método del carmín
de Best
2.3. Coloraciones para la mucina y fibrina
3. CONTRASTADO DE LOS CORTES EN MICROSCOPIA
ELECTRONICA
1. COLORACIONES HISTOLOGICAS DE CONJUNTO
Aunque existen múltiples técnicas de tinción que colorean en conjunto los

tejidos, los histopatólogos emplean rutinariamente desde antiguo una sola de
ellas: la de hematoxilina-eosina . La· razón estriba en la extraordinaria riqueza' de
matices rosados y rojos que provoca la coloración con eosina, a lo que se une la
excelente definición nuclear originada por la hematoxilina . Sin embargo, las
diferencias en la elección del tipo de eosina así como en la preparación de las
soluciones por parte de los distintos laboratorios hace difícil obtener resultados
completamente idénticos.
Con todo, en determinadas circunstancias es preciso realizar coloraciones de
conjunto alternativas a la hematoxilina-eosina, ya sea para resaltar algunos
detalles arquitecturales del tejido (por ejemplo, azur-eosina o giemsa para meta-
cromasia) o debido a circunstancias extremas de pH, en que las lacas alumínicas
de hematoxilina tienden a perder su estabilidad (caso del azul de celestina
B- cromotropo 2R).
1.1. Método de la hematoxilina-eosina
Existen múltiples variantes, según se emplee un tipo u otro de eosina y de

hematoxilina (generalmente la de Harris, aunque también se emplean la de
Mayer y la de Ehrlich) . Por lo común , este método siempre consta de una fase
inicial, en la que se colorean los núcleos celulares con la hematoxilina, y una
fase ulterior de contraste citoplasmático y de los componentes extracelulares
con la eosina .
Fijación: puede utilizarse tejido fijado en cualquier solución fijadora excepto

aquellas que contienen tetróxido de osmio.
Soluciones:
1. Solución de hematoxilina de Harris (véase capítulo 7).

2. Etanol ácido al 1 por 1 OO.
3. Solución de azuleamiento:
a) Por lo general se utiliza agua corriente si es lo suficientemente alcalina.
En otro caso pueden emplearse alternativamente.
b) Solución acuosa de carbonato de litio al 1 por 1OO.
e) Solución acuosa de amoníaco al 2 por 1OO.
4. Solución acuosa o alcohólica de eosina (véase capítulo 7).
Modo de operar:
1. Oesparafinar e hidratar.
2. Teñir con hematoxilina de Harris durante 2 minutos.
3. Lavar en agua corriente.
COLORACIONES HISTOPATOLOGICAS RUTINARIAS DE MAYOR INTERES . 157
4. Diferenciar en alcohol llcido al 1 por 100 durante 5 a 30 segundos. contro-

lando el microscopiQ.
5. Azular en agua corriente o en cualquier otro agente de azulamiento durante
5 minutos. En este último caso. lavar abundantemente en agua corriente
tras el azulado.
6. Colorear con eosina durante 20 a 60 segundos.
7. Lavar en agua corriente (en caso de eosina alcohólica. lavar y diferenciar en
etanol al 70 por 100) hasta obtener la intensidad deseada de coloración.
8. Deshidratar. aclarar y montar.
Resultados (fig. 9.1. véase pllginas en color):

-Núcleos .................... Azul/negro
-Eritrocitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Naranja a rosa
-Restantes estructuras . . . . . . . . . . Rosado a rojo
• Observaciones:
La causa mlls común de una tinción inadecuada en la técnica de hematóxili-
na-eosina es la mala fijación tisular. Otras causas a considerar son el exceso o
defecto de oxidación de la hematelna o de diferenciación de la coloración y el
empleo de una hematoxilina vieja o utilizada excesivamente.
1.2. Método de la hematoxilina ácida fosfotúngstica (PTAH)
Se trata de un método de tinción introducido por Mallory. en el año 1900.

para colorear selectivamente las estriaciones musculares y la fibrina. Pese a la
antigüedad de la técnica. aún no se ha descubierto el mecanismo por el que se
produce una tinción diferencial polícroma entre distintas estructuras.
La disolución de PT AH es químicamente heterogénea por albergar un com-
ponente azul y otro rojo. El complejo azul contiene más ligantes de hemateína y
es menos estable que el rojo en el cual se convierte con facilidad. La solución de
PTAH recién preparada contiene exclus~vamente complejo azul y con el tiempo
va adquiriendo progresivamente mayor cantidad de componente rojo. Por otra
parte. parece demostrado que la fracción azul del colorante tiende a desaparecer
con el calentamiento. Así pues. merced a los cambios en temperatura. ambos
componentes invierten sus proporciones. predominando el quelato rojo en ca-
liente y el azul a la temperatura ambiental. Después de mantener 1 ó 2 días el
calentamiento, la solución de PTAH se deteriora irreversiblemente. Por ello. tras
haberse realizado una coloración en caliente no deben emplearse los restos de
colorante para realizar tinciones ulteriores.
La solución de hematoxilina ácida fosfotúngstica es estable durante mucho
tiempo, de forma que la coloración mejora tras un período de oxidación espon-
tánea de entre 1 y 18 meses. Por este motivo puede producirse una coloración
pálida de los tejidos en el caso de que se empleen soluciones insuficientemente
maduras.
En lo que respecta al mecani~mo básico de coloración. la mezcla de quelato
azul y rojo es la responsable del efecto policrómico de tinción provocado por la
PTAH: las tonalidades de color azul serían debidas a la unión. mediante puentes
de hidrógeno. entre los compuestos tisulares y los dos grupos hidroxilo de cada
residuo de colorante, mientras que el componente rojo sería captado mayorita -

riamente por las estructuras hísticas menos basófilas.
Fijación: puede utilizarse cualquier solución fijadora aunque los mejores resulta-
dos se obtienen con aquellas que contienen sublimado (B - 5 o líquido de Zenker) .
Soluciónes:
1. Solución de hematoxilina ácido fosfotúngstica (PTAH) :
- Hematoxilina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 .O g
- Acido fosfotúngstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20.0 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000.0 mL
Disolver independientemente la hematoxilina y el ácido fosfotúngstico
en agua destilada. Calentar suavemente la solución de hematoxilina hasta
su disolución completa . Enfriar a temperatura ambiente y mezclar con la
solución de ácido fosfotúngstico. Para conseguir una rápida maduración
añadir:
- Permanganato potásico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 .117 g
Completar la maduración mediante oxidación espontánea al menos du -
rante un mes. Almacenar a temperatura ambiente. Los resultados de la
coloración mejoran con el envejecimiento del reactivo, de forma que son
óptimos pasados 6 a 18 meses.
2. Solución yodada de Langeron :
-Yodo metálico ... ... .... . ... . . .. . .... . ...... . 1.0 g
-Yoduro potásico . ............... . ...... ... ... . 2.0 g
- Agua destilada . .. . . . . . ....... . . . . . ... . .... . . . 200.0 mL
3. Solución de tiosulfato sódico al 5 por 1OO.
Modo de operar:
1. Desparafinar e hiclratar.
2. Tratar durante 1 O minutos con la solución iodada de Langeron.
3. Lavar durante 5 minutos o hasta la decoloración completa con la solución
de tiosulfato sódico.
4 . Lavar durante 5 minutos en agua destilada .
5. Colocar en la solución de PTAH a temperatura ambiente. Teñir durante 2
horas a 60 oc. No recalentar la solución de PTAH antes de situar en ella el
tejido ya que podría alterarse el resultado final de la coloración.
6. Deshidratar rápidamente en dos cambios de etanol al 95 por 1 00 y tres de
etanol absoluto. Aclarar y montar.
Resultados (fig. 9.2, véase páginas en color) :

- Núcleos. tonofibril/as y citoplasmas ... . Azul oscuro
- Fibrina y estriaciones musculares ..... . Azul oscuro
- Fibras musculares ............... . . . Diversos tonos de azul
- Fibras musculares degeneradas De rojo a púrpura
- Colágena y membranas basales Diversos tonos de rojo
- Amiloide. cartílago y plaquetas Diversos tonos de rojo
COLORACIONES HISTOPATOLOGICAS RUTINARIAS DE MAYOR INTERES 159
- Mitocondrias en hfgado y riñón . . . . Azul intenso

- Centriolos y cromosomas en mitosis . Azul
-Matriz ósea y cartilaginosa . . . . . . . . De amarillo a rojizo
• Observaciones:
De manera semejante a la fibrina y estriaciones musculares, otros elementos
histicos como las fibrillas neurogliales o la mielina, también colorean de azul. En
estos casos, el procedimiento técnico sufre algunas modificaciones que se detallan
en el capítulo correspondiente a las coloraciones neurohistológicas.
1 .3. Coloraciones de conjunto que simultáneamente demuestran

metacromasia: técnica de Giemsa para cortes histológicos
En general, todos los colorantes de la gama azur (azur A -dimetiltionina-,

B - trimetiltionina- y C - metiltionina-) junto con la tionina (fig. 9.3) el azul
de metileno (tetrametiltionina) y el de toluidina, son iminas quinónicas deriva-
das de las tiacinas. Como ya se ha indicado, en condiciones normales la mayor
parte de los tejidos tienden a teñirse con una tonalidad semejante a la del
colorante utilizado para su demostración . Esta propiedad recibe la denominación
de ortocromasia. Sin embargo, cuando se utilizan ciertos colorantes básicos
derivados de la anilina, algunas estructuras tisulares se tiñen con tonos total -
mente distintos de los que cabría esperar por el colorante empleado (p. ej .,
gránulos de los mastocitos de coloración roja con el azul de metileno o de
toluidina). Este efecto se conoce con el nombre de metacromasia . La explicación
más comúnmente aceptada para dicho fenómeno es que tiene lugar una polime-
rización entre las moléculas de colorante situadas adyacentes a las estructuras
aniónicas sobre las cuales se produce la fijación del colorante catiónico. Este
hecho provocaría un empaquetamiento de las moléculas del cromógeno y la
aparición de picos absortivos de radiación luminosa en la parte inicial del espec -
tro visible (entre 475 y 550 nm) , con visualización de los colores complementa -
ri os correspondientes -gama del violeta al rojo púrpura- (para más detalles,
véase «Fundamentos de la reacción metacromática» en capítulo 13).
La propiedad de metacromasia, que caracteriza a determinadas estructuras
tisulares (ciertas mucinas, gránulos de los mastocitos, sustancia fundamental del
~N~
CH"e~.
N S
~ N/ CH 3
CH 3 / Azul de metileno ~H 3
Figura 9.3. Fórmulas de la tionina, azur A y B y azul de metileno.
cartílago, etc.). puede ser demostrada al mismo tiempo que la configuración

arquitectural hística mediante el empleo de técnicas mixtas de coloración como
el método del azur- eosina o mediante colorantes polícromos complejos con
componente metacromático como el reactivo de Giemsa.
COLORACION DE GIEMSA PARA SECCIONES HISTOLOGICAS

La tinción de Giemsa emplea como colorante fundamental una mezcla de
derivados tiacínicos catiónicos (concretamente azur A , B y azul de metileno)
destinados a teñir los núcleos celulares, y de eosina como colorante citoplásmi -
co de carácter aniónico. Esta mezcla es soluble en a.lcohol metílico, de forma que
en disolución, los componentes moleculares electropositivos y electronegativos
se combinan entre sí para constituir derivados salinos (eosinatos de azur A. B y
de azul de metileno) . La estabilización final del reactivo se consigue añadiendo
glicerina, que por una parte aumenta la solubilidad en el alcohol del colorante y,
por otra, facilita la ulterior mezcla con el agua en el momento de realizar la
coloración . Un hecho interesante es la pérdida del carácter metacromático que
experimentan las sales de eosinato; este carácter se recobra al inestabilizar la
solución colorante en el momento de la tinción.
Precisamente el fundamento de la técnica radica en la disociación controlada
de las sales de eosinato que ocurre al insolubilizar la mezcla de Giemsa por
dilución en agua destilada; la eosina así liberada colorea el componente extra-
celular y determinadas estructuras acidófilas (esencialmente, gránulos de los
leucocitos polinucleares eosinófilos) y los derivados de azur, las estructuras de
carácter basófilo. Curiosamente, la cromatina nuclear adopta una tinción azul
violácea algo distinta a la habitual para los colorantes tiacínicos y que recibe la
denominación de efecto de Giemsa.
La utilización de tampones para estabilizar y controlar el pH de la solución
colorante de trabajo es fundamental en el caso de la tinción de Giemsa, ya que la
presencia de álcalis descompone el azul de metileno y el azur B en violeta de
metileno (fig . 9.4) y otros azures escasamente activos, que precipitan en exceso
y contaminan la coloración . El pH más aconsejable para tejido fijado en formali -
na al 1 O por 100 es de 4 .0, lo cual obliga a realizar una diferenciación ulterior
deshidratando en acetona.
~N~
O
~. Á_A/cH. S N
"-eH 3
Figura 9.4. Fórmula del violeta de metileno.
Fijación: puede utilizarse cualquier método qulmico, que mcluya formalina y

líquidos que contengan sublimado. Es importante ajustar con exactitud el pH de
las soluciones para cada caso.
COLORACIONES HISTOPATOLOG ICAS RUTINAR IAS DE MAYOR INTE RES 161
Soluciones:
1. Solución A:
- Acido acético glacial . . . . .... . ... . ..... . ....... . 1.2 ml
-Agua destilada .. ... ... ...... .. . . . . .... . .. .. . . . 100.0 ml
2. Solución B:
- Acetato sódico ....... . ...................... . 2.7 g
- Agua destilada . ... . .. . .. .. . .. .. . . . . .. . ....... . 100.0 ml
3. Tampón acetato a pH 4.8 (para fijación en B- 5 o Zenker) :
- Solución A ... . .. . ... .. . . ................ . .. . 40.0 ml
- Solución B ................ .. . . ...... . ... . .. . 60.0 ml
4. Tampón acetato a pH 4 .0 (para fijación en formalina) :
-Solución A .... . ... . ... . ..... .. . . . . .. . ...... . 80.0 ml
- Solución B .. .. . . ...... ........ . ....... . .. . . . 20.0 ml
5. Solución de trabajo de Giemsa :
-Agua destilada . . . . . ... ..... . . . . , .. . . . ..... .. . . 47.5 ml
- Solución tamponada (véase anteriormente) . . ...... . 1.5 ml
- Solución comercial de Giemsa .. ..... .. .. . . . . . .. . 2.0 ml
-Acetona .. . .... . . . .. . ........... . .. . . . .. . ... . 2.5 ml
Modo de operar:
1. Desparafinar e hidratar en agua destilada.
2. Si el tejido no se ha decalcificado, tratar con alcohol ácido entre 1 y 5
minutos. Lavar bien en agua destilada.
3. Teñir con la solución de trabajo de Giemsa 2 horas.
4. Diferenciar y deshidratar en acetona, aclarar acetona-xileno y xileno, montar.

-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul-violáceo
- Citoplasmas y tejido conjuntivo .. Tonos de rosa
- Eritrocitos ......... . .... . .. . . Salmón
- Rickettsias ... . ............. . Violeta
- Gránulos de los eosinófilos Rojo-anaranjado
• Observaciones:
Los reactivos deben añadirse en el orden señalado. Tanto la solución
comercial de Giemsa como el conjunto de la solución de trabajo deben
agitarse antes de su uso. Aunque es preferible utilizar la solución comer-
cial de Giemsa, en caso necesario puede fabricarse en el laboratorio
mezclando 50 mg de eosinato de azur A. 250 mg de eosinato de azur 8,
200 mg de eosinato de azul de metileno, 75 mg de cloruro de azul de
metileno, 50 ml de glicerina y 50 ml de alcohol metílico.
2. ALGUNAS TECNICAS DE COLORACION PARA

LA IDENTIFICACION DE SUSTANCIAS
2.1. Coloraciones para grasas
Se consideran lípidos todas aquellas sustancias orgánicas insolubles en agua

total o parcialmente, pero solubles en acetona, alcohol, cloroformo, éter, etc. , y
que en general son untuosas al tacto. Aunque desde el punto de vista químico,
los lípidos se clasifican en lípidos simples o complejos, desde el punto de vista
histoquímico es mejor dividirlos en:
1. Lípidos homofásicos. Son aquellos que se encuentran en los tejidos
en estado puro y, precisamente por ello, están concentrados en un terri-
torio particular de la célula . Por ejemplo: una gota de grasa en el cito -
plasma de la célula . Su determinación histoquímica es muy sencilla .
2. Lípidos heterofásicos . Son lípidos que no están en estado puro, sino
mezclados con otras sustancias, como ocurre con ciertas lipoproteínas.
No están concentrados en un territorio concreto sino dispersos por de -
terminadas estructuras. Por ejemplo: lípidos que forman parte de las
membranas celulares. Su determinación histoquímica es muy difícil.
TECNICAS DE COLORACION PARA IDENTIFICACION DE LIPIDOS

Sirven para determinar principalmente lípidos homofásicos e incluyen las
tinciones con sudanes y oil red O. Estos métodos se basan en que el colorante es
más soluble en los lípidos que en el propio disolvente en el que va contenido.
En el caso de la determinación de lípidos heterofásicos, tal y como ocurre
con los glicolípidos, se utilizan algunos métodos histoquímicos de coloración
(véase más adelante), como la técnica del PAS y ciertos métodos para ésteres
del colesterol.
PROCESAMIENTO HISTOLOGICO PARA LA DETECCION DE LIPIDOS

Como se ha indicado, las grasas son insolubles en agua, pero solubles en
ciertos disolventes orgánicos como cloroformo, benceno, xileno, tolueno, alco -
holes, etc.
Por ello, en la técnica histológica habitual las grasas se disuelven en los
líquidos intermediarios propios de la inclusión de parafina, quedando exclusiva -
mente en el tejido los huecos donde éstas se encontraban.
Para evitar este problema, es necesario incluir los tejidos en gelatina o
polietilenglicol, a menos que se prefiera realizar cortes en congelación (mi -
crótomo de congelación o criostato) .
Para la fijación previa del tejido el mejor fijador es el formol, que si bien fija
totalmente las grasas neutras, actúa de manera variable sobre el resto de las
estructuras lipídicas (colesterol y derivados, fosfol ípidos, esfingolípidos, etc.) .
El formol es aún mejor fijador de grasas si se emplea como formol cálcico
que se prepara del siguiente modo:
- Formol al 1 O por 100 (puede no estar tamponado) .

- Cloruro cálc ico al 1 por 1 OO .
De esta forma los iones de calcio estabilizan los lípidos y el formol los fija más
eficazmente.
Otros fijadores que poseen la propiedad de insolubilizar las grasas neutras
son el tetróxido de osmio (Fieming) y aquellos que llevan cromo (Helly, Zen -
ker), que pueden emplearse en lugar del formol.
COLORACION PARA LAS GRASAS NEUTRAS

(LIPIDOS HOMOFASICOS)
Son coloraciones por mecanismos físicos de disolución . En general, los
colorantes para grasas son más solubles en las propias grasas que en el medio en
el que van disueltos. Así, al bañar la grasa con la solución del colorante éste
tiende a disolverse en la grasa, que se va cargando del colorante. Por regla
general estos colorantes siempre van en disolución alcohólica o bien en una
mezcla de alcohol/acetona o alcohol/agua.
Todos estos métodos producen coloraciones progresivas, es decir, que a más
tiempo de exposición al colorante mayor es la intensidad de tinción.
La inestabilidad de las soluciones colorantes es el principal problema de esta
técnica, pues la evaporación de parte del disolvente provoca la precipitación del
colorante sobre el tejido e induce a error de interpretación (falsos positivos) .
Para evitar estos falsos positivos deben seguirse los siguientes pasos:
1. Almacenar el reactivo en lugar fresco y en recipientes cerrados
herméticamente.
2. Emplear, si es posible, soluciones diluidas filtradas, aunque estas solu-
ciones no pueden emplearse en muchas técnicas que requieren solucio-
nes saturadas de colorante.
3. Teñir los cortes flotantes antes de rescatarlos del agua -lo cual
no es difícil ya que su espesor oscila entre 15 y 20 micras-.
4. No prolongar la tinción más de 1 O minutos.
5. Agitar con cierta frecuencia durante la coloración.
Técnica del Sudán IV (escarlata R)

Esta técnica plantea los siguientes problemas:
1. Los cortes han de ser en congelación (1 O ,um de espesor) .
2. El colorante puede precipitar si no se tiene cuidado .
Fijación: formol. Cortes en congelación, pueden ser usadas secciones en para -

fina.
Soluciones:
a) Solución de Sudán IV variante de Herxheimer:
- Sudán IV ....................... . .. . .... .. . .. . . 1.0 g
-Acetona ................................... . . . . 50.0 ml
-Alcohol al 70 por 100 ........... . .. ... .. . .... . . . . 50.0 ml
Esta solución stock debe filtrarse antes de usar.

b) Solución de dicromato potásico:
-Gelatina . .... .............. . . .... .............. . 0.2
- Dicromato potásico .............................. . 0 .2 g
-Agua destilada .................................. . 1000.0 mL
Modo de operar:
1. Congelar el tejido y realizar secciones de 1 O micras.
2. Colocar los cortes en la solución de dicromato potásico y montar sobre
portaobjetos.
3. Dejar secar al aire.
4. Sumergir en alcohol de 70 por 1 OO.
5. Teñir con Sudán, durante 5 minutos (cortes en congelación) y 30 minutos
para los cortes en parafina.
6. Sumergir en alcohol d~; 70 por 1 OO.
7. Lavar con agua destilada.
8. Contrastar con hematoxilina de Harris 30 segundos, o 3 minutos con la Hx
de Mayer.
9. Lavar con agua destilada, 1 O minutos.
1 O. Montar en medio acuoso.
11 . Sellar el cubreobjetos con bálsamo.
Resultados (fig. 9 .6, véase páginas en color) :

- Lípidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo intenso a naranza-rojizo.
-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul
• Observaciones:
1. Con colorante Sudán IV se obtienen mejores resultados disolviendo
al 1 por 100 en una mezcla de alcohol de 70 por 100/acetona, a
partes iguales (variante de Herxheimer).
2. Se puede emplear cualquier colorante nuclear; el que se utiliza normalmen-
te es la hematoxilina; tras ello se lava y se monta en medio acuoso. No
se deshidrata, ni se aclara en xilol porque se disuelve la grasa.
3. Las preparaciones obtenidas no son imperecederas: quedan inutili-
zadas al cabo de 1O ó 15 dias por evaporación del medio de montaje,
excepto si se han sellado los cubreobjetos con parafina o cera .
TECNICA DEL SUDAN NEGRO PARA LIPIDOS
Fijación: formalina tamponada al 1O por 1 OO. Cortes en congelación a 1 O micras.
Soluciones:
a) Solución de Sudán negro:
- Sudán negro B (C. l. 26150) ..... .. . ............. .. . 0.5 g
- Propilenglicol .... .. ... ..... .... .. ........ .... . .. . 100.0 mL
Añadir una pequeña cantidad de propilenglicol al colorante y mezclar. Agregar

el propilenglicol restante lentamente; calentar de forma gradual hasta 95 agi- oc.
tando constantemente. Filtrar a través del papel de filtro doble Whatman número
2 mientras está caliente la solución. Dejar enfriar. Esta solución se conserva indefi-
nidamente. Filtrar antes de usar.
b) Solución de propilenglicol al100 por 100.
e) Propilenglicol al 85 por 100 en agua destilada.
d) Rojo neutro (C.I. 50040) en solución acuosa al 1 por 100.
Modo de operar:
1. Llevar los cortes a agua destilada.
2. Propilenglicol al 1 00 por 1OO. 3 minutos.
3. Solución de Sudán negro, 5 minutos.
4. Propilenglicol al 85 por 1 00, 2 minutos.
5. Lavar en agua destilada.
6. Rojo neutro al 1 por 100, 30 a 60 segundos.
8. Colocar los cortes en portaobjetos.
9. Drenar el exceso de agua y montar en medio acuoso.
Resultados:
-Núcleos y citoplasmas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo
- Lípidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
- Mielina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
Coloración con el azul de Nilo (método de Lillie)

Esta coloración permite distinguir las sustancias grasas neutras de las que
poseen un carácter ácido .
El azul de Nilo es un colorante que siempre viene contaminado por rojo
Nilo, en la proporción aproximada de un 2 por 100 de rojo por cada 98 por 100
de azul.
Para teñir lípidos se aprovecha la ·.Propiedad del azul de Nilo de ser química -
mente impuro, de forma que éste es soluble en las grasas de carácter ácido
mientras que el rojo Nilo se disuelve exclusivamente en las de carácter neutro.
Con este método es posible identificar dos t ipos de lípidos mediante una técnica
no histoquímica.
PR OCEDIMIENTO TECNICO
Fijación:
a) - Azul de Nilo (C.I. 51180) ..... . . . ..... . .. . . .. .. .. . 0.10 g
-Disolver en agua destilada ....... .. .. . . . .... . ... .. . 198.00 ml
b) - Acido sulfúrico ...... . .. . .. .. . .... . .......... .. . 2.00 ml
Modo de operar:
1. Rescatar las secciones del agua.
2. Teñir con azul de Nilo, 20 minutos.
3. Lavar con agua del grifo, 1 O minutos.
4 . Montar en medio acuoso.
Resultados:
-Acidos grasos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul oscuro
-Grasas neutras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . De rosa a rojo
2.2. Coloraciones para el glucógeno: método del carmín de Best
El glucógeno es un hidrato de carbono (polisacárido} compuesto por múlti -

ples moléculas de glucosa que se unen entre sí formando largas cadenas linea-
les. El peso de una molécula media oscila entre 1 0 5 y 2 x 107 , o incluso más.
(PM de glucosa = 180) .
El glucógeno constituye la reserva energética inmediata del organismo, en
tanto que las grasas son la reserva retardada de más difícil movilización . El
glucógeno se sintetiza en el hígado, siendo éste el órgano donde se halla en
mayor cantidad, seguido del músculo estriado y endometrio (2.a fase de ciclo o
fase secretora) .
Para la demostración histológica del glucógeno pueden emplearse dos tipos
de técnicas:
1. Técnicas histoquímicas: reacción del PAS.
2. Técnicas no histoquímicas: técnica del carmín de Best.
En el presente capítulo se considerará exclusivamente la segunda.
PROBLEMAS GENERALES QUE PLANTEA LA TINCION

DEL GLUCOGENO
1. El glucógeno es soluble en agua; por ello nunca deberán utilizarse para

su coloración soluciones que contengan agua en abundancia. Así pues,
el fijador debe elegirse de entre aquellos no vehiculados en solución
acuosa: el más empleado es el etanol al 80 por 100, aunque se obtie-
nen mejores resultados con el líquido de Carnoy o con el Bouin
alcohólico. En ocasiones puede utilizarse el Bouin normal, preferente-
mente enfriado a 4 oc.
2. Durante el proceso de hidratación de los cortes y para evitar que el
glucógeno se disuelva en el agua es necesario realizar el llamado colo-
dionado de los portaobjetos.
Este proceso consiste en introducir las secciones de tejido en colodión
elástico (celoidina al 2 por 100 en alcohol-éter), que es permeable al agua y
a los colorantes e impermeable al glucógeno, por ser una molécula de tamaño
mucho mayor. De esta manera, el colodión forma una especie de película sobre
el corte impidiendo la difusión del hidrato de carbono.
El colodionado se realiza inmediatamente después de la desparafinación de

la siguiente manera:
Modo de operar:
1. Desparafinación en xilol según sistemética habitual.
2. Alcohol absoluto: tres baños para eliminar el xilol.
3. Alcohol-éter al 50 por 100 (la celoidina es soluble en esta mezcla).
4. lnmersion del porta en celoidina al 2 por 100 (colodión eléstico).
5. Endurecimiento de la celoidina adherida al porta en alcohol de 70 por 1 OO.
METODO DEL CARMIN DE BEST
Fundamento y generalidades sobre la técnica

El método del carmín de Best es una técnica no histoquímica que se utiliza
casi exclusivamente para la detección del glucógeno, sobre todo en biopsias
endometriales, en las cuales la presencia de secreción glucogénica es esencial
para determinar si se ha iniciado o no la fase secretora postovulatoria. Es un
método puramente descriptivo cuyo mecanismo de tinc ión es desconocido.
Presenta el inconveniente de ser una coloración regresiva, es decir, que primero
se sobrecolorea y después se diferencia hasta alcanzar la tonalidad justa .
La especificidad del método no es total, pues tiñe otros productos distintos al
glucógeno. Este inconveniente puede subsanarse realizando preparaciones con -
tro l o testigo que permitan determinar si lo coloreado es o no glucógeno.
Fijadores:
- Bouin alcohólico o normal (preferentemente a 4 °C).
-Carnoy.
-Alcohol de 80 por 1OO.
Soluciones:
a) Solución stock de carmin de Best:
Hacer hervir en un matraz, durante unos 5 minutos:
- Carmin (C.l. 75 470) ... ... ... .. .. . . . .. .. . . . .... .. . 2g
-Cloruro de potasio .. .. .. .. .. ... . ..... . .. ... . . . . .. . 5g
- Carbonato de potasio . .. ... . . .. ... . . .. .. . ... . . . .. . 1g
- Agua destilada . .. . ..... .. .. . . ... .. .. . .... .. . . . .. . 60 ml
Dejar enfriar, filtrar y añadir:
-Amoniaco concentrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 ml
Se conserva en el refrigerador en frasco oscuro durante 3 meses aproxima -

damente.
b) líquido de dilución:
-Amoníaco . . .. ..... . .............. . .. . .. .. . .. . . . 2 vol.
-Alcohol metílico absoluto ... . .... . . . ....... .. ..... . 3 vol.
e) líquido de diferenciación:
-Alcohol metílico absoluto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 ml
-Alcohol etílico absoluto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 ml
d) Hematoxilina férrica de Weigert o hematoxilina de Harris.
e) Solución de trabajo (Carmín de Best):
-Solución stock de carmín .................. .. ..... . 2 partes
-Líquido de dilución .. . . . .. .. . .. .. . ... . ..... . . .. .. . 2 partes
Mezclar en el momento de su uso.
Modo de operar:
1. Desparafinar, colodionar, hidratar.
2. Colorear con hematoxilina de Weigert durante 15 minutos o con hema -
lumbre durante 3 minutos.
3. Lavar bastante tiempo en agua corriente.
4. Colorear durante 20 a 30 minutos con la solución de carmín de Best.
5. Sin lavar con agua, diferenciar en la solución C hasta el cese de toda
extracción de rojo.
6. Deshidratar directamente con el alcohol absoluto. El paso por este alcohol
debe ser prolongado suficientemente, al objeto de que no quede vestigio
alguno de alcohol metílico.
Resultados (fig. 9.7, véase páginas en color):

-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul negruzco
-Glucógeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo
• Observaciones:
Antes de deshidratar podemos eliminar el colodión mediante alcohol-éter al 50
por 1 OO.
- Problemas que plantea la técnica del carmín de Best: como ya se

ha mencionado, el carmín no es totalmente específico del glucógeno sino
que además puede colorear el moco, la fibrina, los gránulos de los
mastocitos, etc. Para solucionar este problema hay que realizar sistemá-
t icamente preparaciones control o testigo.
Otra dificultad que presenta este método es el llamado «fenómeno de
desplazamiento de sustancias», debido a la rápida penetración de los fijado -
res alcohólicos uti lizados, que irrumpen bruscamente en el interior de las células
creando un gradiente de concentración capaz de desplazar al glucógeno del sitio
donde originariamente se localiza, provocando errores en la interpretación . '
CONTROLES PARA LA IDENTIFICACION DE GLUCOGENO

Hay dos variantes, basadas en un mismo principio:
1. Digestión por ptialina (enzima presente en la saliva, que descompone
el glucógeno en maltosa), cuyo procedimiento se expone a continua-
ción :
Modo de operar:
1. Desparafinar, no colodionar, hidratar.
2. Cubrir los cortes de la preparación testigo con saliva durante 30 minutos
a 37 C.
3. Lavar cuidadosamente con agua.
4. Practicar la reacción de detección del glucógeno (deberá ser negativa para
-:
confirmar la naturaleza glucogénica de lo teñido en la preparación no
sometida a control).
2. Digestión por la maltasa o diastasa comercial (enzima purificada y

por lo tanto con posibilidades de ser cuantificada exactamente al realizar
el control).
a) Solución tamponada a emplear como disolvente de la enzima:

-Cloruro de sodio .... . ...... . ............... . 8.0 g
- Fosfato monopotásico monohidratado ........... . 0.8 g
-Fosfato disódico anhidro ..................... . 1.3 g
-Agua destilada .... ................... ...... . 1000 ml
b) Solución de enzima:
-Tampón anteriormente indicado ................ . 10 ml
-Diastasa ................................ · · · 0.1 g
e) Operar igual que en el caso de la ptialina, sometiendo los cortes a la acción de
la enzima durante 1 hora a 37 C.
2.3. Coloraciones para la mucina y fibrina
La técnica para mucina analizada en este capítulo tiene un interés indudable

porque es bastante específica para el moco, aunque no desvela su composición
exacta . Con ella se trata de identificar globalmente la mucina más que de
conocer su naturaleza bioquímica, para lo cual es imprescindible utilizar técnicas
histoquímicas (véase posteriormente coloraciones para mucopolisacáridos y gli -

coproteínas) .
TECNICA DEL MUCICAAMIN DE MAYEA

Es una técnica muy antigua (data de 1896) en la que se han ido produciendo
modificaciones con el paso del tiempo. En ella el colorante fundamental es el
carmín de origen natural.
Su mecanismo de actuación es desconocido, pero se cree que al no encon -
trarse puro el ácido carmínico, sino estabilizado con sales de magnesio y alumi -
nio, estos cationes le conferirán carácter básico. Dado que los mucopolisacári-
dos ácidos son componentes de las mucinas, la coloración sería posible por la
interacción de las cargas negativas de los segundos con el carmín, que poseería
cargas positivas (mecanismo electrostático de tinción) .
METODO DEL MUCICAAMIN DE MAYEA MODIFICADO
Fijación: formalina tamponada al 1 O por 1 OO.
Soluciones:
a) Hematoxilina de Harris.
b) Solución de alcohol (70°)-clorhídrico al1 por 100
e) Solución de mucicarmín:
- Carmín (C.I. 75 470) ............................. . 2g
- Hidróxido de aluminio ....... ... ................. . 2g
-Alcohol etílico al 50 por 100 . ... ... ......... .... .. . 200 mL
Disolver y añadir 1 g de cloruro alumínico anhidro. Hervir durante 2 minutos y
medio exactamente, enfriar y filtrar.
d) Solución de trabajo:
- Mucicarmín ................... ... ... .... ...... . 1 parte
- Agua destilada . ... ........ . .... ... .. ..... .. .... . 9 partes
Modo de operar:
1. Desparafinar e hidratar.
2. Colorear con el hemalumbre durante 5 minutos.
3. Lavar durante bastante tiempo, con agua corriente.
4. Colorear de 15 a 30 minutos con mucicarmín.
6. Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
-Mucina Rojo
- Núcleos Azul
-Cápsula del criptococo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo
COLORACION DE LA FIBRINA (SEGUN WEIGERT)

La fibrina es el producto de la polimerización del fibrinógeno del plasma
sanguíneo. En fases tempranas de formación se observa como delicada trama
fibrilar o como masas amorfas intensamente fucsinófilas con el tricrómico de
Masson . La fibrina más antigua se tiñe, en cambio, como la colágena.
En el curso de las colagenosis y enfermedades reumáticas se ha observado en
las paredes de los vasos sanguíneos una sustancia similar a la fibrina, que ha
sido denominada «fibrinoide», habiéndose postulado que se trata de fibrina en el
último estadio de su desarrollo.
Tanto la fibrina como el fibrinoide se colorean fuertemente de rojo con la
eosina y de amarillo con el Van Gieson, son moderadamente PAS positivos y
pueden demostrarse con la hematoxilina ácida fosfotúngstica de Mallory.
FUNDAMENTO DE LA COLORACION DE WEIGERT PARA LA FIBRINA

La técnica es una variable particular de la coloración de Gram para bacterias.
Como colorante se utiliza fundamentalmente el violeta de metilo o de genciana .
Este colorante es un derivado de la parafucsina y por lo general contamina al
verde de metilo.
El mecanismo de la coloración no es bien conocido: al parecer, tras el
tratamiento con yodo que sigue a la aplicación del colorante, se constituirán
abundantes enlaces disulfuro (S-S) a partir de los grupos sulfihidrilos (-SH)
adyacentes a la tirosina y el triptófano, a los cuales se ligarían los restos de
colorante atrapados en la malla fibrilar. La utilización de un agente de diferencia -
ción tendría por objeto retirar el violeta de genciana del tejido conjuntivo adya -
cente, donde podría quedar retenido de forma semejante, todo ello procu rando
no sobrediferenciar la fibrina mediante un control microscópico de la coloración .
La técnica plantea otro problema añadido: su especificidad es muy relativa, y
puede colorear otras sustancias como la queratina o el amiloide.
Fijación: formalina al 1 O por 100, alcohol-formol , líquido de Carnoy o alcohol

absoluto.
Solución:
a) Solución de eosina acuosa (C.I. 45 380) al 5 por 100
b) Solución de violeta de genciana en aceite de anilina (Solución de
Weigert):
Solución 1:
-Violeta de metilo (C. l. 42 535) .. . .......... . .. . .. . . . 5g
- Alcohol etílico absoluto ........................... . 10 ml
- Machacar el colorante en un mortero y añadir el alcohol
gradualmente.
Solución 2:
-Aceite de anilina ................. . .............. . 2 ml
-Agua destilada .............................. . ... . 88 ml
Mezclar la solución 1 y 2, dejar reposar 24 horas y filtrar.

e) Solución yodada de Gram:
-Yodo ......................................... . 1g
-Yoduro potésico .................... .. .......... . 2g
-Agua destilada .................................. . 300 ml
Disolver el yoduro potésico en una pequeña cantidad de agua destilada, añadir
el yodo y disolver. Añadir después el agua destilada restante.
d) Solución de aceite de anilina-xilol
-Aceite de anilina ................................ . 50 ml
-Xileno .. . ..................................... . 50 ml
Modo de operar:
2. Eosina acuosa al 5 por 100, 5 minutos.
4. Recubrir los cortes con la solución de Weigert durante 5 minutos.
5. Solución iodada de Gram, 5 minutos.
7. Secar con papel de filtro.
8. Diferenciar con aceite de anilina-xilol hasta que cese la extracción de color,
agitar la preparación durante todo este paso. Controlar al microscopio. La
preparación debe presentar un color rosado.
Resultados (fig. 9.8, véase péginas en color):

-Fibrina y bacteria Gram . . . . . . . . Diversas tonalidades azules
-Restantes tejidos . . . . . . . . . . . . . De color rosado
• Observaciones:
Los núcleos pueden ser contrastados con rojo nuclear extra al 1 por 100; en
este caso debe suprimirse la coloración citoplasmática con eosina.
3. CONTRASTADO DE LOS CORTES EN MICROSCOPIA

ELECTRONICA
Como las células están compuestas por áreas de distinta densidad, al tratar
los tejidos con ciertas sales de metales pesados éstos quedan desigualmente
retenidos por las células en función de su carga electrostática, potenciada por el
efecto de filtro que realizan las membranas celulares. Así, es mayor la impregna -
ción de las estructuras más densas, ya que la existencia de una trama molecular
espesa retiene en mayor proporción los átomos de metal pesado, de igual
manera que las estructuras finamente fibrilares del sistema nervioso retienen los
átomos de plata en la impregnación argéntica .
El primer paso del contraste lo realiza el tetróxido de osmio durante el
proceso de refijación.
Para el contrastado suplementario hay que tener en cuenta que:

1. Se realiza con los cortes incluidos en resina-epon y no en meta -
crilato, con el que el tetróxido de osmio permite obtener contraste sufi-
ciente.
2. En general, la impregnación se realiza por flotación de los cortes inver-
tidos, previo montaje de éstos en su correspondiente rejilla .
Como agentes de contraste se utilizan el acetato de uranil-magnesio y el
citrato de plomo según técnica de Reynolds, aunque este último puede ser
sustituido por el acetato de plomo.
PROCEDIMIENTO TECNICO DE CONTRASTE
Soluciones:
1. Solución de acetato de uranilo:
-Acetato de uranilo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 ml
Contrastar los cortes por flotación entre 1 O y 60 minutos, salvo que se hubiese
realizado impregnación con acetato de uranilo previa a la inclusión (véase capi-
tulo 3) .
Esta técnica puede suplementarse con un tratamiento mediante:
1 .1 . Solución de acetato de plomo:
Solución 1 o de Mil/onig:
-Hidróxido de sodio . .. . . ... .. ........ ........ . 20 g
-Tartrato doble de sodio y potasio ............... . 1 g
-Agua destilada .... . . ........ . . .. .... . ...... . 50 ml
Solución 2:
-Acetato de plomo ..... ... . ... .............. . . 2g
-Agua destilada ............................. . 8 ml
Antes de su uso mezclar:
-Solución 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 ml
-Solución 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 ml
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . 40 ml
• Observaciones:
Presenta inconvenientes derivados de la posible reacción del anhídrido carbó-
nico de la atmósfera con el acetato de plomo ya que lo inactiva y destruye la
solución. Para evitarlo, se prepara la solución en un recipiente cerrado en el que
se han depositado varias lentejas de hidróxido sódico, las cuales tienen mayor
afinidad por el anhídrido carbónico que el propio acetato de plomo.
1.2. Solución de Reynolds: citrato de plomo:
-Nitrato de plomo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.66 g
-Citrato de sodio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.52 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60.00 ml
1. Disolver simultáneamente el nitrato de plomo y el citrato de sodio. Agitar

a intervalos de 5-1 O minutos durante 30 minutos.
2. Añadir 16 ml de hidróxido sódico 1 N.
3. Se disuelve el precipitado blanco.
4. Completar 100 ml con agua destilada.
En ambos casos el tiempo de impregnación es del orden de 4 minutos.
CAPITULO 10
Coloraciones para fibras

colágenas y elásticas
del tejido conjuntivo.
Coloraciones para
sustancia amiloidea
GUION DE CONTENIDOS
1. PROCEDIMIENTOS PARA LA DEMOSTRACION DE FIBRAS
COLAGENAS: METODOS TRICROMICOS
1.1. Fundamentos técnicos
1.2. Método tricrómico de Masson
1.3. Método tricrómico de Mallory
1.4. Picro-fucsina de Van Gieson
1.5. Método del rojo sirio para fibras colágenas
1.6. Método tricrómico de Gomori
2. COLORACIONES PARA FIBRAS ELASTICAS
2.1. Método de la orceína
2.2. Método de la hematoxilina de Verhoeff
3. COLORACIONES PARA SUSTANCIA AMILOIDE
3.1. Naturaleza de la sustancia amiloide
3.2. Importancia clínica y papel del histotecnólogo
en el diagnóstico de la amiloidosis
3.3. Coloraciones simples y aspectos generales
del procesamiento histológico de la sustancia amiloide
3.4. Técnica del rojo Congo
3.5. Reacción de permanganato potásico en el diagnóstico
de la amiloidosis
3.6. Técnica de la tioflavina T
1. PROCED IMI ENTOS PARA LA DEMOSTRACION DE FIBRAS

CO LAGENAS : M ETODOS T RICROMICOS
Las fibras de colágena son los elementos más frecuentemente hallados en el

tejido conjuntivo . Tienen una función básica de soporte y son sintetizadas por
múltiples elementos celulares del organismo, entre los que destacan los fibro-
blastos. Se han descrito cuatro tipos principales de fibras de colágeno, así como
numerosos subtipos, cuya producción se halla bajo control genético; cada uno
de ellos presenta ligeras variaciones en la composición de las cadenas peptídicas
alfa que constituyen las fibras .
Desde el punto de vista de la histología convencional, todas las técnicas para
tinción de fibras de colágena que se agrupan clásicamente bajo la denominación
de coloraciones tricrómicas (se recogen en este manual aquellas técnicas de uso
más frecuente), tiñen el colágeno de tipo 1, que forma las gruesas fibras de
colágena existentes en los espacios extracelulares y estromas orgánicos. Estos
elementos poseen afinidad por los colorantes ácidos debido a su riqueza en
grupos fuertemente catiónicos dependientes de los aminoácidos que componen
la cadena polipeptídica .
1 .1 . Fundam ent os técni cos
Numerosos factores influyen en la coloración específica diferencial que las

diversas tinciones tricrómicas producen sobre los núcleos celulares, los tejidos
epitelial y muscular y el tejido conjuntivo .
Entre esos factores, quizá el de mayor importancia sea el distinto grado de
permeabilidad que ofrecen estas estructuras al paso del colorante, dependiendo
fundamentalmente de su grado de dispersión en la disolución empleada . De esta
manera , y tras el proceso de fijación tisular que provoca una reticularización
proteica general , las proteínas de los citoplasmas celulares se agrupan para
constituir una malla de poro fino, mientras que las fibras del tejido conjuntivo, lo
hacen dibujando una red más laxa .·
Puesto que las partículas de colorante pueden encontrarse también en diso-
lución verdadera (caso de los colorantes más finamente dispersos que se em -
plean para teñir citoplasmas celulares) o coloidal (colorantes del conjuntivo en
forma de partículas más groseras), de su interacción con la red de poros tisulares
se genera un gradiente de penetración distinto para cada grupo de colorantes,
en gran med ida responsable de la diferente coloración de cada estructura . Por
ello, los colorantes utilizados para las diferentes tinciones tricrómicas se clasifi-
can en : colorantes nucleares, habitualmente una laca de hematoxilina férrica ;
colorantes citoplasmáticos en solución finamente dispersa, como es el ácido
pícrico , naranja G, naranja de metilo, ponc;:eau de xilidiha, escarlata de Biebrich,
azofloxina , etc ., y colorantes del conjuntivo derivados del anillo del trifenilmeta-
no, que van en solución coloidal , como la fucsina ácida, el azul de anilina y el
verde luz SF.
Otro factor de importancia a la hora de definir estas coloraciones es el valor
de pH a que se utilizan los colorantes: tienen mayor apetencia por las fibras
colágenas en medio fuertemente ácido (especialmente a un pH óptimo en torno
a 1.5) , mientras que con pH de 2 .5, su afinidad por los aniones decrece hasta el
COLORACIONES PARA FIBRAS COLAGENAS Y ELASTICAS DEL TEJIDO CONJUNTIVO 177
50 por 100, de forma que con este pH se obtiene una coloración difusa e
incompleta del estroma finamente fibrilar.
En la coloración selectiva anteriormente descrita desempeñan un papel fun-
damental los fenómenos de mordentaje previo con los ácidos fosfotúngstico y
fosfomolíbdico. Al parecer, estos ácidos bloquean selectivamente los residuos
básicos existentes en el tejido a excepción de los muy fuertemente catiónicos de
la colágena, donde luego se acoplarán los radicales aniónicos de los derivados
del trifenilmetano. No obstante, conviene subrayar que la coloración de las fibras
de colágena varía según la clase de colorante utilizado: mientras que alguno de
los más comúnmente empleados (fast green FCF, fucsina ácida) tiende a teñir
el conjunto de fibras colágenas, otros, por el contrario, reaccionan solamente
con algunos tipos de estas fibras. Por consiguiente, se deberán tomar las pre-
cauciones oportunas a la hora de interpretar los resultados y patrones de
tinción, procurando realizar las técnicas en condiciones estrictamente contro-
ladas.
Por lo que respecta a la coloración nuclear empleada, el bajo pH con que se
realiza la coloración diferencial hace aconsejable utilizar lacas de hematoxilina
que no sean decoloradas en el proceso de tinción, lo que prácticamente impone
el empleo de hematoxilinas férricas.
1.2. Método tricrómico de Masson
Fijación: cualquier fijador es vélido, si bien es de elección la solución de Bouin.
Soluciones:
e) Solución de Bouin (Ver composición en capitulo 3)
b) Solución de hematoxilina férrica de Weigert (Ver composición en capi-
tulo 7).
e) Solución de escarlata de Biebrich-fucsina lilcida:
-Escarlata de Biebrich (C. l. 26905) al 1 por 100 en agua
destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90.0 ml
-Fucsina llcida en solución acuosa al1 por 100.......... 9.0 ml
- Acido acético glacial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 .O ml
el) Solución acuosa de lilcido fosfotúngstico al 5 por 100 o solución de
lilcido fosfomollbdico
- Acido fosfotúngstico ............................ . . 5g
- Acido fosfomollbdico ................. ... ......... . 5g
-Agua destilada .............. ........ ............ . 200 ml
e,) Solución de verde luz (light green) al 2 por 100:
-Verde luz SF amarillento (C. l. 42095) ............. ... . 2.0 g
-Agua destilada ............ ......... ... .. .... . ... . 99.0 ml
- Acido acético glacial ............................. . 1.0 ml
e2 ) Solución alternativa de azul de anilina

-Azul de anilina ... ....... . ....... . . . .. . .. .. .. ... . 2.5 g
- Acido acético glacial . ... .. . . .... .. .............. . 2.0 mL
- Agua destilada .... . .. ..... ............. .. .... . . . 98.0 mL
f) Solución diferenciadora: solución acuosa de ácido acético glacial al
1 por 100
Modo de operar:
1. Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada de manera habitual.
2. En material fijado en soluciones de formaldehido o alcohólicas se reco -
mienda hacer un mordentaje previo con líquido de Bouin durante 1 hora
a 56 -60 C o toda la noche a temperatura ambiente.
3. Enfriar y lavar en agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo.
4. Teñir con hematoxilina férrica durante 1O minutos. Lavar en agua corriente
durante 1 O minutos.
6. Teñir con la solución de escarlata-fucsina ácida durante 2-5 minutos.
8. Tratar con la solución de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico durante 10-
15 minutos si se va a colorear con la solución de azul de anilina o en la so -
h..lción acuosa de ácido fosfotúngstico al 5 por 1 00 durante 15 minutos si
se desea teñir con verde luz.
9. Teñir con solución de azul de anilina 15 minutos o con solución de verde
luz 5 minutos.
1O. Lavar en agua destilada.
11 . Diferenciar en la solución de ácido acético al 1 por 100 durante 3- 5 mi -
mutas.
Resultados (fig . 10.1 , véase páginas en color) :

- Núcleos ..... . ............................... . .. Azul-negruzco
- Citoplasmas. queratina. fibras musculares y eritrocitos . . . . Rojo
-Colágeno y reticulina ...................... . ..... . . Azul o verde
1 .3 . Método tricrómico de Mallory
Fijación: es imprescindible utilizar fijadores que contengan dicromato. Puede ser

conveniente refijar en dicromato potásico al 3 por 100 entre 30 minutos y 4 horas.
El tiempo de fijación es importante: debe ser superior a las 24 horas aunque se em-
pleen fijadores rápidos como la solución de Zenker.
Soluciones:
a) Solución de fucsina ácida (C.I. 42685) al 0.1 por 100 en agua desti-
lada.
b) Solución acuosa de ácido fosfomolíbdico al 2 por 100

e) Solución de Mallory:
Solución de almacenamiento:
- Azul de anilina hidrosoluble (C .I. 42755) ............. . 0.5 g
- Naranja G (C. l. 16230) ........ . ......... . .. . ..... . 2.0 g
- Acido oxál ico ..... . .................. . ......... . . 2.0 g
- Agua destilada .................. . ...... . .... .. .. . 100.0 mL
Llevar a ebull ición y filtrar.
- Solución de almacenamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 parte
- Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 partes
Preparar en el momento de su uso.
Modo de operar:
2. Solución de fucsina ácida de 5 a 1 O minutos (coloración nuclear) .
4. Tratar con la solución de trabajo de Mallory durante 5 minutos.
6. Diferenciar en alcohol etílico al 96 por 1 OO.
7. Deshidratar, aclarar con alcohol isopropílico y montar.
Resultados:
- Núcleos . . .. . ... . . . . . .. .. ... .. ......... . ....... . Rojo
- Citoplasmas, eritrocitos y fibras musculares estriadas .... . Naranja -rojizo
-Músculo liso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Violáceo
- Tejido conjuntivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul claro
1.4. Picro-fucsina de Van Gieson
Se trata de una coloración tricrómica compuesta de una co loración nuclear

(h ematoxilina férrica). una coloración citoplásmica por un colorante ácido
(amari llo de metanilo o ácido pícrico) y una coloración «electiva» de la colágena
por otro colorante ácido (fucsina ácida) . Está considerada como la coloración
más selectiva de las fibras colágenas.
El mecanismo por el que se produce la colorac ión no es conocido, pero se
cree que los mecan ismos de difusión selectiva de cada colorante desempeñan
un papel fundamental , sobre todo si se tiene en cuenta que el problema principal
de la técnica es la sobrecoloración.
Fijación: cualquier fijador es válido.
Soluciones:
a) Hematoxilina férrica de Weigert (véase capitulo 7).
b) Picro-fucsina de Van Gieson:
Solución 1:
- Fucsina ácida (C. l. 75290) ........................ . 1 g
-Agua destilada .................................. . 100 mL
Solución 2:
-Solución acuosa saturada de ácido picrico
-Solución 1 .......... .... . .. ..... . ........... . .. . 10 mL
-Solución 2 .. . ... . .. . ....... . .. . . .. . ... ........ . . 90 mL
La solución actúa mejor si se deja madurar durante algunas semanas o si está
recién preparada, se le agrega inmediatamente antes de su uso 0.25 mL de ácido
clorhldrico concentrado.
Modo de operar:
2. Colorear los núcleos con hematoxilina férrica de Weigert durante 1O mi-
nutos.
3. Lavar en agua corriente durante 5 minutos.
4. Aclarar en agua destilada.
5. Teñir en la solución de trabajo de Van Gieson durante 30 segundos a
1 minuto.
6. Secar con papel de filtro.
7. Lavar rápidamente en etanol al 70 por 1 OO.
8. Completar la deshidratación con rapidez; aclarar y montar.
Resultados:
-Núcleos ... ........ . ... .. . . .. .......... . .. . ..... Azul-negruzco
-Citoplasmas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Amarillo
-Colágena ....................................... Rojo intenso
• Observaciones:
a) Los lavados en agua tras la solución de Van Gieson están proscritos porque
la coloración empalidece, salvo que las secciones estén colodionadas.
b) La tendencia de las preparaciones a decolorarse con el tiempo puede ser
contrarrestada con el montaje en los medios sintéticos habituales hoy dla.
e) La sustitución de la fucsina ácida por el rojo sirio F3BA no incrementa la
especificidad de la coloración, pero hace el procedimiento más sencillo y
reproducible y permite el empleo adicional de la luz polarizada en la in-
terpretación de resultados (véase más abajo) .
1 .5. Método de rojo sirio para fibras colágenas
El método de rojo sirio-ácido pícrico no es una reacción químicamente

específica para las fibras colágenas, pero al igual que el método de Van Gieson
proporciona una tinción bastante selectiva de estas fibras. Otras · estructuras
(membranas del Pneumocistis carinii y amiloide) con propiedades semejantes a
las de la celulosa también pueden ser teñidas, para lo cual existe una modifica -
ción de este método no recogida en este manual.
Combinada con el microscopio de polarización , suministra información ad i-
cional sobre la estructura del tejido conectivo analizado; esta propiedad se
incrementa en la colágena patológica neoformada de la cirrosis hepática, arte -
riosclerosis, glomeruloesclerosis y variante esclerosis nodular de la enfermedad
de Hodgkin . Como el método es técnicamente simple y no requiere equipamien-
to especial (sólo filtros de polarización) resulta recomendable para estudios
anatomopatológicos.
Soluciones:
a) Solucion de rojo sirio-ácido pícrico:
-Rojo sirio F3BA (C. l. 35780) al 1 por 100 10.0 mL
-Solución acuosa saturada de ácido pícrico 90.0 mL
Mezclar, añadiendo a continuación cristales de ácido pícrico para saturar bien
la solución colorante. A fin de asegurar la saturación, deberán permanecer algunos
restos de ácido pícrico sin disolver. Dejar reposar la solución 48 horas antes de
usarla. El envejecimiento excesivo de la solución se manifiesta por la pérdida de
sus propiedades tintoriales. Una tinción de fondo color naranja pálido indica que
la saturación con ácido pícrico es incompleta, por lo que se recomienda añadir más
cristales del ácido y dejar reposar otras 48 horas.
Modo de operar:
1. Desparafinar e hidratar meticulosamente.
2. Lavar durante 1 O minutos en agua corriente.
3. Teñir con la solución de rojo sirio durante 30 minutos a temperatura am -
biente.
4. Deshidratar rápidamente en alcohol absoluto, aclarar y montar.
Resultados (fig 1 0.2):

-Fibras del tejido conectivo (excepto elásticas) .. ........ Rojo intenso
- Otros elementos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Amarillo
-Núcleos en caso de contraste opcional con H. de Weigert . Azul-negruzco
Mediante luz polarizada , la colágena y la reticulina son estructuras anisotró-
picas en cortes longitudinales e isotrópicas en cortes transversales, por lo que en el
primer caso, muestran birrefringencia amarillenta . Las láminas basales y sarcolema
premanecen isotrópicas.
Figura 1 0.2. Identificación de puentes fibrosos que delimitan nódu-

los regenerativos de hepatocitos en un hlgado afecto de cirrosis (Rojo
Sirio x 10).
• Observaciones:
Opcionalmente pueden contrastarse los núcleos con hematoxilina férrica de
Weigert
1 .6 . Método tricrómico de Gomori
En el método tricrómico en un solo paso de Gomori , el pH a que se realiza la

coloración se encuentra entre 2 .5 y 2.7 ligeramente por encima del óptimo para
la tinción de la colágena , por lo que suele presentar una tinción incompleta y
difusa del componente fibrilar más fino (membrana basal y finas fibras reticula-
res) . En cambio el método es idóneo para colorear fibrina, tejido muscular y
citoplasmas celulares, donde destaca esencialmente el condrioma como un fino
granulado rojizo.
Emplea un agente colorante derivado del trifenilmetano (fast green FCF).
que tiende a teñir todas las variedades de colágena, y un colorante azoico
(cromotropo 2R) con apetencia especial por citoplasmas celulares.
Fijación: cualquier fijador es válido, si bien es de elección la solución de Bouin.
Soluciones:
a) Solución de Bouin (véase capitulo 3).
b) Solución tricrómica:
- Cromotropo 2R .... . ... ... .. . .. ... . . ......... . .. . 0.6 g
-Verde luz (fast green FCF-C.I. 42053) ...... ... ...... . 0.3 g
- Acido acético glacial . . .. . ... .. . . . . .. . . .. .. . ... . .. . 1.0 ml
-Agua destilada ...... .. . . .. ..... . . .. ... . ......... . 100.0 mL

- Acido fosfotúngstico .. . . . ......... . . . .... .. ..... . . 0.8 g
e) Solución de verde luz:
-Verde luz (C. l. 42053) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.0 g
- Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250.0 g
- Acido acético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.0 mL
d) Solución acuosa de ácido acético al 0.5 por 100.
Modo de oparar
2. Realizar mordentaje en líquido de Bouin durante 1 hora a 56 C 6 24 horas
a temperatura ambiente.
3. Lavado en agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo.
4. Teñir en la solución tricrómica durante 15 minutos (previamente es posible
contrastar núcleos con hematoxilina de Weigert durante 13 minutos segui-
da de un lavado prolongado en agua corriente).
5. Diferenciar en la solución de ácido acético al 0.5 por 100 durante 15
segundos.
7. Teñir con la solución de verde luz durante 20 a 30 segundos.
Resultados (fig . 1 0.3, véase páginas en color):
- Fibras musculares, fibrina y citoplasmas celulares .. .. . .. . Rojo
-Colágena, cartílago, mucina y membranas basales . . . . . . . Verde
-Núcleos (sin contraste con hematoxilina) . . ..... . . . .. .. . Azul-negruzco
2. COLORACIONES PARA FIBRAS ELASTICAS

Las fibras elásticas del tejido conjuntivo se encuentran fundamentalmente en
determinados 'órganos dotados de especial distensibilidad (vasos sanguíneos,
pulmón , etc .). Están compuestas por un núcleo central de naturaleza proteica
(elastina) rodeado por un componente microfibrilar periférico, o elastomucina,
de naturaleza química similar a la de los mucopolisacáridos. La presencia de esta
capa hace que, en condiciones normales las fibras elásticas sean acidófilas. No
obstante, tras oxidación su componente microfibrilar se torna intensamente ba -
sófilo por formación de grupos ácidos sulfatados sobre su superficie, hecho que
se aprovecha en numerosos procedimientos técnicos para conseguir una colora-
ción selectiva .
2.1. Método de la orceína para fibras elásticas
Se basa en la coloración de las fibras elásticas del tejido conjuntivo con un

colorante débilmente ácido de origen natural , la orceína, que se tija electiva-
mente, aunque sin especificidad absoluta, sobre estos elementos. La gran venta-
ja del método radica en su simplicidad; sin embargo, las acusadas diferencias
entre los distintos lotes de colorante pueden originar resultados muy variables. A
continuación se expone la modificación realizada por Un na-Tanzer sobre el
método original.
Soluciones:
a) Solución de orceína:
-Orceína ....................................... . 1.0 g
-Alcohol etílico al 70 por 1 00 . ......•... ..... .. ... . . . 99.0 mL
- Acido clorhídrico concentrado ... .. .... . ..... ..... .. . 0.6 mL
b) Solución de picrocarmín de índigo:
-Solución acuosa saturada de ácido pícrico . . . . . . . . . . . . . 100.0 mL
-Carmín de índigo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.25 a 0.4 g
Modo de operar:
2. Colorear con la solución de orceína de 15 a 30 minutos.
3. Lavar rápidamente en agua destilada.
4. Teñir durante 20 segundos con picrocarmín de índigo.
5. Diferenciar el exceso de orceína mediante una deshidratación prolongada
en etanol absoluto.

- Fibras y membranas elásticas ............. . .. ... Pardo-negruzco
-Citoplasmas y otras estructuras . . . . . . . . . . . . . . . . . Verde-amarillo
2.2. Método de la hematoxilina de Verhoeff para fibras elásticas
Se trata de un antiguo método de coloración que proporciona muy buenos

resultados en manos de histotecnólogos experimentados. Se fundamenta en
realizar una coloración diferencial no muy selectiva de las fibras elásticas (sobre
todo de los elementos más groseros, como las láminas elásticas vasculares) con
una laca de hematoxilina férrica a través de fenómenos electrofísicos de atrac -
ción entre la laca catiónica y la elastomucina. Debido a la escasa selectividad de
la coloración se tiñen otras muchas estructuras (entre ellas la mielina, de forma
análoga a la descrita para la coloración de Weigert) . Por ello, la fase esencial
del método es la diferenciación, en la que es fácil excederse, produciendo
así una tinción elástica muy deficiente.
Soluciones:
a) Solución acuosa de cloruro férrico al10 por 100.
b) Solución yodo-yodurada de Lugol:
-Yodo metálico ........ .. ..... .. ...... . .......... . 2g
-Yoduro potásico ............... . ................ . 4g
- Yoduro potásico .. ....... . ... . ................ . . . 100 mL
e) Solución de Verhoeff:
Se disuelven 1.5 g de hematoxilina en 30 mL de alcohol absoluto aplicando
calor suave, se enfría y filtra. Se añaden, por este orden:
- 12 mL de la solución de cloruro férrico al 1 O por 1 OO.
·~
-12 mL de la solución de Lugol.
Mezclar en agitación continua .
d) Solución diferenciadora acuosa de cloruro férrico al 2 por 100.
Modo de operar:
2. Teñir con la solución de Verhoeff hasta que los cortes aparezcan de colo-
ración negruzca (15-45 minutos).
3. Diferenciar con la solución de cloruro férrico al 2 por 100 durante algunos
minutos y verificando mediante lavado en agua destilada y examen al mi-
croscopio que solamente están coloreadas de negro las fibras elásticas y los
núcleos, y que el resto del tejido queda de color gris. Si la diferenciación
resulta excesiva, el corte vuelve a tratarse con la solución de Verhoeff.
5. Aclarar en etanol al 96 por 100 para eliminar la tinción debida al yodo.
6. Lavar en agua destilada durante 5 minutos.
7. Contrastar con la coloración de Van Gieson durante 1 ó 2 minutos.
8. Diferenciar con alcohol etílico al 96 por 1 OO.
Resultados (fig . 1 0 .5, véase páginas en color) :

-Fibras elásticas . . . . . . . . . . . . . . . ......... .. .... Negras
- Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......... .. .... De gris a negro
- Fibras colágenas . . . . . . . . . . . . . ......... .. .... Rojas
-Citoplasmas celulares . . . . . . . . . . ......... .. .... Amarillos
3. COLORACIONES PARA SUSTANCIA AMILOIDEA
El amiloide, una sustancia que naturalmente no está presente en el organis -

mo humano, es insoluble en agua, alcohol, éter y ácidos fuertes. En las colora -
ciones rutinarias con hematoxilina-eosina aparece como un material rosado
acelular, amorfo y homogéneo indistinguible de la hialina, aunque se fracciona

más fácilmente al paso de la cuchilla del microtomo.
En fresco aparece como una sustancia blanquecina y firme que se deposita
tanto en el tejido conjuntivo como en el parénquima de los órganos, confirién-
doles una apariencia característica (bazo en sagú o lardáceo).
Los lugares donde se encuentra con mayor frecuencia son: hígado, piel,
ganglios linfáticos, riñones, bazo y páncreas, formando parte, en general, de la
enfermedad denominada amiloidosis, caracterizada por el depósito de esta sus -
tancia .
Tradicionalmente se ha distinguido la amiloidosis primaria, propia de
pacientes cuya única enfermedad conocida era precisamente la acumulación
orgánica de amiloide, y la amiloidosis secundaria asociada a otras enferme-
dades, generalmente de índole autoinmunitaria o neoplásica. Desde la descrip-
ción de distintas variedades de moléculas f ibrilares que en microscopia óptica
pueden adoptar aspecto amiloide, ha cobrado fuerza la teoría de que la amiloi -
dosis no debe ser considerada una entidad anatomoclínica diferenciada, sino un
conjunto de enfermedades que tienen en común el depósito de proteínas fibri -
lantes de aspecto similar.
3.1. Naturaleza de la sustancia amiloide
Pese a presentar un aspecto amorfo en microscopia óptica, la complejidad

estructural de las fibras de amiloide queda hoy fuera de toda duda . En general, la
sustancia amiloidea está formada por largas cadenas proteicas no ramificadas de
longitud indefinida, con un diámetro de entre 7 y 1 O nm (fig. 10.6 junto a la
1 0 .7) y dispuestas en agregados fisicoquímicos que adoptan una configuración
en lámina beta plegada (fig. 1 0 .7) .
Figura 10.6. Imagen ultraestructural diagnóstica de la sustancia amiloide

con su disposición fibr ilar característica ( x 20 000) .
COLORACIONES PARA FIBRAS COLAGENAS Y ELASTICAS DEL TEJIOO CONJUNTIVO 187
Figura 10.7. Esquema de la conformación en lámina {J plegada de las

cadenas proteicas de amiloide y los lugares de unión de las moléculas de
rojo congo .
Desde el punto de vista químico, el 90 por 1 00 de las fibril/as amiloideas está

compuesto por proteínas fibrosas de naturaleza diferente y el 1O por 100 restan -
te por una glucoproteína denominada sustancia P, al parecer estrechamente
relacionada con la proteína C reactiva, un reactante de la fase aguda de numero-
sas enfermedades inflamatorias. En relación con las proteínas fibrilares, se han
descrito varios tipos principales de cadenas:
1. Cadena AL (amiloide ligera), que procede de la desnaturalización de
las cadenas ligeras que componen las moléculas de inmunoglobulinas.
Está producida por las células plasmáticas secretoras de anticuerpos y su
depósito se relaciona con algunos tipos de neoplasias derivadas de linfo-
citos B transformados (discrasias de células plasmáticas, cuyo prototipo
es el mieloma múltiple).
2. Cadena AA, derivada de un precursor de mayor tamaño (proteína
SAA). que es producida por el hígado en condiciones patológicas. Este
tipo de cadena caracteriza a la denominada tradicionalmente amiloidosis
secundaria .
3. Cadena de transtiretina o proteína transportadora de tiroxina y
retino!. antiguamente denominada prealbúmina. Un mutante de esta
molécula se deposita en un amplio grupo de enfermedades neurológicas
hereditarias conocidas como amiloidosis polineuropáticas, así como en
el envejecimiento.
4. Cadenas degeneradas de beta-2-microglobulina, una proteína de
membrana celular relacionada con el complejo de histocompatibilidad de
clase l. Se deposita en algunas formas de amiloidosis relacionadas con la
hemodiálisis crónica a que se someten los pacientes con insuficiencia
renal.
5. Cadenas de proteína A4, derivada de una glicoproteína de membrana
de mayor tamaño, que se depositan en enfermedades degenerativas del
sistema nervioso central, como la enfermedad de Alzheimer.
6. Cadenas degeneradas de hormonas o sus precursores, que se
depositan localmente en ciertos tumores (proinsulina en tumores endo-
crinos del páncreas, calcitonina en el carcinoma medular de tiroides,
etc.).
3.2. Importancia clínica y papel del histotecnólogo

en el diagnóstico de la amiloidosis
Desde el punto de vista clínico, todavía conserva interés la distinción clásica

entre amiloidosis primaria y secundaria. Por otra parte, según que los depósitos
de amiloide sean generalizados o estén restringidos a un órgano específico,
también debe diferenciarse entre amiloidosis sistémica y amiloidosis locali-
zada.
En la práctica, lo que el clínico habitualmente solicita al laboratorio de
anatomía patológica es que se distingan los depósitos de amiloide AA, propios
de las formas secundarias, de los restantes (amiloidosis primarias), sobre todo
por las diferentes implicaciones etiológicas e incluso terapéuticas que supone.
En segundo término, y si ello es posible, también tiene interés la identificación
exacta de la molécula .
El primer objetivo puede cumplirse como se indicará más adelante, introdu -
ciendo determinados controles sobre la técnica del rojo Congo, que es el proce-
dimiento más clásico para colorear la sustancia amiloidea. El segundo objetivo
puede realizarse desde la introducción de anticuerpos específicos para cada tipo
de sustancia amiloide, a través de tecnología inmunohistoquímica, que no será
analizada en este capítulo.
3.3. Coloraciones simples y aspectos generales del procesamiento

histológico de la sustancia amiloide
El término de «amiloide» con que es designada fue propuesto por Virchow en

1854 a causa de la afinidad de esta sustancia por el yodo de manera análoga a lo
que ocurre con el almidón . De hecho, su peculiar estructura cristalina demostra -
da mediante microscopia electrónica, que recuerda parcialmente a la de las fibras
de celulosa, explica el peculiar comportamiento tintorial de esta sustancia frente
a las soluciones yoduradas. Probablemente el mecanismo íntimo de esta colora-
ción se relaciona con la formación de complejos múltiples de yodo en el interior
de la estructura en lámina beta plegada.
Por todo ello, las soluciones yodadas de gram o lugol (véase solución de
yodo para deszenkerización en el capítulo 3) constituyen excelentes métodos de
tinción para el amiloide fresco (sin fijar), que adopta una coloración pardorrojiza
(rojo caoba) susceptible de cambiar a azul -violáceo después de un tratamiento
con ácido sulfúrico al 3 por 1 00 durante algunos minutos.
Tras una fijación formólica prolongada, la sustancia amiloide pierde progresi-
vamente sus propiedades tintoriales. Por ello son más recomendables los
fijadores no oxidantes que contengan sublimado o estén vehiculados
en disoluciones alcohólicas.
En lo que respecta a las coloraciones rutinarias, el amiloide se fragmenta de
forma característica tras la sección del material incluido en parafina, es PAS
positivo aunque de forma muy variable, y se colorea de verde con las tinciones
tricrómicas para el conjuntivo.
COLORACIONES PARA FIBRAS COLAGENAS Y ELASTICAS OEL TEJIDO CONJUNTIVO 189
3.4 . Técnica del rojo Congo para sustancia amiloidea
Fue introducida por Benhold en 1982 y desde entonces ha experimentado

numerosas modificaciones.
El rojo Congo es un colorante diazoico tetrazoado (fig. 1 0.8) utilizado en la
industria textil como colorante del algodón. Aunque clásicamente se ha consi-
derado específico para la sustancia amiloidea, en realidad tiñe de forma variable
la colágena y las fibras elásticas. Así, mientras que la tinción de la sustancia
amiloide por el rojo Congo carece de especificidad cuando los cortes se obser-
van con luz blanca, si se observan bajo un haz de luz polarizada la sustancia
amiloide muestra intensa birrefringencia verde-manzana muy característica,
efecto que no ocurre con la colágena u otras sustancias por las cuales tiene
apetencia este colorante (véanse posteriormente, conceptos de birrefringencia y
dicroísmo).
SO,Na SO,Na
Figura 1 0.8. Fórmula del rojo Congo.
En lo que respecta al mecanismo interno de la tinción, se creía que el rojo

Congo se fijaba al componente glúcido de la sustancia amiloide (sustancia P) a
través de la formación de puentes de hidrógeno entre los grupos alcohólicos del
hidrato de carbono y los grupos aminos del colorante, los cuales, debido a la
especial estructura molecular de amiloide y del rojo Congo, se encontrarían en
condiciones de aparearse.
Desde que se ha sabido que el amiloide posee una estructura en lámina beta
plegada parece más probable que la formación de los enlaces específicos entre
el colorante y la sustancia amiloidea esté relacionada con la creación de puentes
de hidrógeno entre las moléculas de rojo Congo atrapadas en la red fibrilar y los
propios aminoácidos de la cadena AA o AL, más bien que con una disposición
particular del componente glucopeptídico.
También abogan por esta última hipótesis dos hechos: el rojo Congo se
utiliza siempre en disolución coloidal de partículas moderadamente gruesas, por
lo que el efecto de malla que realiza la trama fibrilar del amiloide parece funda -
mental para la efectividad de la tinción, y que la intensidad de la coloración no
varía tras el bloqueo histoquímico de los mucopolisacáridos de la sustancia P.
En lo que respecta a sus propiedades ópticas tras la realización de las colora-
ciones específicas como las del rojo Congo y el rojo Sirio, el amiloide es una
sustancia caracterizada por presentar birrefringencia y dicroísmo específicos.
La propiedad de birrefringencia aparece en todas las sustancias cristalinas
con estructura laminar asimétrica suceptible de interaccionar de forma específica
con el rayo de luz polarizada vibrando en un solo plano que selecciona el
polarizador. En este sentido, se dice que una sustancia posee birrefringencia

positiva cuando el plano de vibración del rayo es paralelo al eje de la fibra o
cristal, y que posee birrefringencia negativa si el plano de vibración del rayo es
perpendicular al de la sustancia birrefringente.
Como el ojo humano no es capaz de distinguir entre luz polarizada y 1uz
blanca, para percibir el fenómeno de birrefringencia debe interponerse un cristal
analizador entre el polarizador y el ocular del microscopio. De esta forma, cuan -
do el eje de ambos prismas está cruzado los elementos birrefringentes brillan
sobre un fondo oscuro. En el caso del amiloide, la birrefringencia positiva verde
manzana inducida tras la tinción con determinados colorantes (fundamental -
mente con rojo Congo y rojo Sirio) es altamente selectiva y específica para dicha
sustancia . Esta propiedad es característica de los complejos formados entre las
fibrillas con plegamiento en lámina beta y los complejos de colorante.
Por otra parte, el amiloide teñido con rojo Congo presenta también un
dicroísmo específico. Dicroísmo es la propiedad que poseen algunos colorantes
de molécula lineal por la cual cambian de color al ser visualizados bajo un rayo
de luz con una longitud de onda determinada. Este hecho se debe a las diferen -
cias de absorción lumínica que aparecen cuando se dispone regularmente el
colorante sobre las estructuras por teñir. En el caso de la sustancia amiloide el
fenómeno dicroico consiste en una decoloración del rojo cuando se observa el
tejido con el rayo de luz polarizada seleccionado solamente con el analizador del
dispositivo de polarización . Con todo, este fenómeno es muy sutil y difícilmente
apreciable sobre las secciones histológicas convencionales.
Método del rojo Congo alcalino de Puchtler (1962)
Fijación: formol tamponado al 1O por 100 (con las salvedades expresadas ante-
riormente). alcohol absoluto o líquido de Carnoy.
Secciones en parafina o congelación .
Soluciones:
a) Solución de hematoxilina de Harris.
b) Solución de rojo Congo:
1. Solución de almacenamiento :
-Rojo Congo (C . l. 22120) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g
-Cloruro sódico al 1 por 100 en alcohol de 80 por 100 . 200 ml
Agitar hasta disolución . Filtrar. Esta solución es estable durante meses.
2. Solución de trabajo :
- Solución de almacenamiento de rojo Congo . . . . . . . . . 100 ml
- Hidroxido sódico al 1 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 ml
Modo de operar:
2. Hematoxilina de Harris, 2 minutos.
3. Aclarar rápidamente en agua corriente.
4. Lavar en la solución salina en alcohol al 80 por 1OO.
5. Solución de rojo Congo alcalino, 20 minutos.
Resultados:
-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azules
-Amiloide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Naranja rojizo (fig. 10.9,
véase páginas en color) .
-Fibras elásticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Naranja rojizo
En la observación con luz polarizada, amiloide en verde manzana brillante sobre
fondo oscuro (fig. 10.10, véase páginas en color).
• Observaciones:
1. No debe utilizarse material que haya sido fijado con agentes oxi-
dantes tales como Zenker. dicromato. ácido crómico, tetróxido de osmio,
etc., ya que introducen en las proteínas grupos OH que posteriormente al
retenerse los grupos ami nos del rojo Congo se colorean y dan lugar a falsos
positivos.
2. El rojo Congo en medio ácido o neutro tiñe también las fibras de
colágena del tejido conjuntivo, originando falsos positivos. Para evitar
este fenómeno es preferible utilizar las técnicas de rojo Congo alcalino.
3. La utilización de un agente de diferenciación que contenga cloru-
ro sódico a saturación potencia la fijación del colorante al ami-
loide, produciendo una coloración progresiva de gran selectividad.
3.5. Reacción del permanganato potásico en el diagnóstico

de la amiloidosis
La diferenciación de la sustancia amiloide de tipo AA respecto a los restantes

tipos (o lo que es igual, la distinción histoquímica entre las amiloidosis
secundarias y primarias). de indudable interés clínico, puede realizarse fácil-
mente empleando el método descrito en 1977 por Wright y colaboradores a
partir de la modificación del método de la tripsina elaborado por Romhanyi en
1972. La técnica se fundamenta en la desnaturalización que provoca la acción
del permanganato potásico sobre la cadena AA de amiloide que pierde su
plegamiento en lámina beta y, por tanto, su apetencia por el colorante rojo
Congo. Por causas desconocidas, tal fenómeno no ocu rre en el caso de la
cadena AL o en cualquiera de los restantes tipos de sustancia amiloidea .
Fijación: idéntica a la del rojo Congo convencional salvo que el efecto de la
prueba del permanganato se amortigua de forma notable cuando el fijador contiene
sublimado. Cortes en parafina.
Soluciones:
a) Solución de permanganato potésico:
-Solución acuosa de permanganato potásico al 5 por 100 50 ml
-Solución acuosa de ácido sulfúrico al 0.3 por 1 00 .. .. .. . 50 ml
b) Solución acuosa de ácido oxélico al 2 por 100.
e) Soluciones empleadas en el rojo Congo alcalino.
Modo de operar:
2. Tratar con la solución de permanganato durante 2 a 3 minutos.
3. Aclarar hasta decoloración completa con la solución de ácido oxálico.
5. Realizar la técnica del rojo Congo alcalino.
Resultados:
-Amiloide de tipo AA . . . . . . . . . . . Deja de colorearse con el rojo Congo
-Amiloide de tipo AL . . . . . . . . . . . Rosa a rojo con persistencia del fenó-
meno de brirrefringencia a la luz polari-
zada.
• Observaciones:
Simultáneamente a la prueba del permanganato debe desarrollarse una prepa-
ración paralela sobre la que se realiza una coloración normal de rojo Congo
para control de los resultados.
3.6. Técnica de la tioflavina T para sustancia amiloide
Constituye la alternativa más plausible a las técnicas de birrefringencia para

la tinción de la sustancia amiloide. Su principal problema radica en que no es
absolutamente específica de la sustancia amiloidea, de forma que también pre -
senta un fenómeno de fluorescencia inducida muy similar el material fibrinoide,
la hialina arteriolar, las queratinas y algunas estructuras celulares como las
células de Paneth, las células principales del páncreas y el aparato yuxtaglome -
rular. El fundamento de la t inc ión no es conocido, de forma que la tioflavina T
probablemente se una a los mucopolisacáridos que forman parte del amiloide
por un mecan ismo físico -químico. Con posterioridad, este colorante posee la
propiedad de emitir fluorescencia verde amarillenta cuando es iluminado con un
haz de rad iación ultravioleta (para más detalles sobre fluorocromos, véase el
capítulo específico de inmunofluorescencia) . El hecho de que la coloración sea
muy intensa a pH 1.4 aboga a favor de que el mecan ismo fundamental de la
coloración es la unión específica del colorante a los mucopolisacáridos fuerte -
mente ácidos.
COLORACIONES PARA FIBRAS COLAGENAS Y ELASTICAS DEL TEJ IDO CON JU NTIVO 193
METODO DE LA TIOFLAVINA T PARA SUSTANCIA AMILOIDE
Fijación : deben evitarse los fijadores que contengan mercurio ya que este provo -
ca autofluorescencia espontánea de múltiples estructuras. Pueden utilizarse cortes
por congelación o en parafina .
Soluciones:
a) Solución de hematoxilina de Harris.
b) Solución acuosa de tioflavina T (C.I. 49005). al1 por 100.
e) Solución de ácido acético al 1 por 100.
Modo de operar:
2. Teñir durante 2 minutos con hemalumbre de Harris para suprimir la fluo -
' rescencia espontánea del núcleo (el DNA es fluorescente y podría ser ori-
gen de falsos positivos).
5. Teñir con la solución de tioflavina T durante 3 minutos.
6. Enjuagar en agua destilada.
7. Diferenciar en ácido acético al 1 por 100 en dos cambios de 1 O minutos
cada uno.
8. Lavar en agua destilada y montar en medio acuoso o deshidratar, aclarar y
montar en medio no fluorescente.
Resultados:
- Amiloide Amarillo o verde amarillento sobre un
fondo oscuro o azul. dependiendo del
filtro utilizado.
• Observaciones:
1. Para la observación de la tinción debe utilizarse un foco de luz ultravio-
leta con filtro de excitación BG-12. asociado a otros de barrera de tipo
OG -4 y OG - 5, o bien un excitador de tipo UG - 1 o UG -2 con filtro anti -
rradiación ultravioleta.
2. La realización del método a pH 1 .4 realza los resultados, incrementando
la selectividad de la tioflavina T por el amiloide. Para ello basta con preparar
la solución de tioflavina en .concentración de 0.5 por 100 en una disolu -
ción acuosa de ácido clorhídrico 0.1 N.
CAPITULO 11
La impregnación argéntica
GUION DE CONTENIDOS
1. INTRODUCCION GENERAL
2. FORMAS DE IMPREGNACION ARGENTICA
2.1. Impregnación argéntica por mecanismos
predominantemente físicos y físico-químicos
2.2. Impregnación argéntica por mecanismos histoquímicos
2.3. Impregnación argéntica no histoq.uímica o por métodos
3. MANIOBRAS COMPLEMENTARIAS A REALIZAR
USUALMENTE EN LA IMPREGNACION ARGENTICA
4. TECNICAS PARA FIBRAS DE RETICULINA DEL TEJIDO
CONJUNTIVO (GOMORI Y GORDON-SWEET)
4.1. Generalidades
4.2. Método de impregnación argéntica de Gomori para
fibras reticulares
4.3. Técnica de impregnación argéntica de Gordon-Sweet
para fibras reticulares
5. CONCEPTOS DE ARGENTAFINIDAD Y ARGIROFILIA
5.1. Argentafinidad
5.2. Argirofilia
6. PRECAUCIONES GENERALES EN LA REALIZACION
DE TECNICAS DE ARGENTAFINIDAD
6.1. Técnica de Masson-Fontana para argentafinidad
6.2. Método de Grimelius para argirofilia
1. INTRODUCCION GENERAL
En histotecnología se denomina impregnación a toda coloración especial en

la que se utilizan sales metálicas (cloruro de oro, nitrato de plata, sales de
cromo, etc.) para originar precipitados metálicos en las estructuras que van a ser
teñidas. El objetivo de la impregnación argéntica es precipitar plata metálica a
partir de sus sales para conseguir que se deposite sobre los tejidos.
La sal argéntica más utilizada es el nitrato de plata, que tiene la propi-edad de
ser muy soluble en agua. Como la impregnación argéntica se fundamenta
en la reducción del nitrato de plata hasta obtener plata metálica y la
fotografía en blanco y negro se basa en hechos similares, creemos que una breve
exposición de los principios básicos de ésta puede servir como aproximación
inicial a la impregnación argéntica.
En general, los rollos d~ película fotográfica van impregnados por una de sus
caras de una sal inestable de plata, el bromuro argéntico, muy sensible a la luz y
que por acción de ésta es precipitada de forma parcial a plata metálica constitu-
yendo la denominada «imagen latente».
Al añadir luego un agente reductor potente, como el pirogalol o la hidroqui-
nona, la sal no precipitada libera gran cantidad de partículas de plata que se
asocian a las liberadas anteriormente, que actúan como núcleos de precipita-
ción. Este proceso se denomina «revelado de la imagen latente».
Finalmente se emplean sales sódicas como el tiosulfato, que al retirar la plata
no reducida mediante la formación de un ion argéntico complejo, a través del
proceso denominado «fijación», estabiliza la imagen revelada impidiendo la for-
mación ulterior de nuevas imágen~s .
El proceso de impregnación argéntica que se explica a continuación se basa
en mecanismos semejantes a los descritos, aunque en él la acción de la luz no
suele ser determinante en el proceso, salvo casos aislados.
2. FORMAS DE IMPREGNACION ARGENTICA
Existen dos tipos de impregnación argéntica:

1. Impregnación argéntica por mecanismos predominantemente
físicos y físico-químicos.
2. Impregnación argéntica por mecanismos histoquímicos.
2.1. Impregnación argéntica por mecanismos predominantemente

físicos y físico-químicos
En ella sólo se producen fenómenos de tipo físico y físico-químico, y

no reacciones químicas concretas entre los tejidos y la sal de plata
utilizada. Se produce, por tanto, la coloración de las estructuras por un meca-
nismo puro de impregnación en el que determinadas estructuras histológicas
electronegativas atraen, por un mecanismo electrostático, a los iones de plata
cargados positivamente (Ag+) que existen en la solución de impregnación.
Posteriormente estos iones se hacen precipitar como plata metálica sobre las
LA IMPREGNACION ARGENTICA 197
estructuras hísticas mediante reducción externa. Esta propiedad de los tejidos de

atrapar los iones argéntlcos existentes en una solución de impregnación recibe
el nombre de argirofilia.
En general, la plata metálica en forma de finos precipitados tiene especial
apetencia por depositarse sobre estructuras fibrilares finas y por superficies
celulares dotadas de delgadas prolongaciones tales como células de la glía,
neuronas, fibras reticulares del tejido conjuntivo, etc., que por este motivo
reciben la denominación de argirófilas.
Las consecuencias fundamentales que deben extraerse de lo expuesto son:
a) El tejido no interviene activamente en el mecanismo de libera-
ción de la plata metálica a partir de su sal soluble.
b) No todos los tejidos tienen idéntica apetencia por la plata; co-
mo en toda impregnación, tanto la carga eléctrica como la tex-
tura de las células por teñir (rugosidad superficial. presencia de
prolongaciones o vellosidades, etc.). intervienen de manera
decisiva.
2.2. Impregnación argéntica por mecanismos histoquímicos
Se basa en la actuación de algún componente del tejido sobre el nitrato de

plata o sus derivados a raíz de la cual ocurre la precipitación de plata metálica a
partir de sus correspondientes iones. Por tanto, el tejido interviene activa-
mente en el depósito de plata metálica a través de una reacción quími-
ca de reducción.
En general son coloraciones discriminatorias que permiten separar compo-
nentes de las células en función de que descompongan o no el nitrato de plata o
sus derivados (véase más adelante el concepto de argentafinidad).
2.3. Impregnación argéntica no histoquímica o por métodos

Los aspectos esenciales de este tipo de impregnación son los siguientes:

1. La fijación ha de hacerse fundamentalmente en formol, aunque se puede
utilizar también el líquido de Bouin, que además actúa como mordiente.
2. La impregnación argéntica puede dividirse en:
a) Impregnación argéntica en dos tiempos.
b) Impregnación argéntica en un tiempo.
Ambas tienen en común la reducción del nitrato de plata a plata metálica: los
métodos en dos tiempos lo hacen en varias fases sucesivas, mientras que los
métodos en un tiempo realizan una reducción más severa .
-Impregnación argéntica en dos tiempos

Utiliza procedimientos químicos para obtener plata metálica a partir del nitra-
to de plata mediante varias reacciones sucesivas.
En una primera fase es necesario tratar el nitrato de plata con bases fuertes
como hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido amónico, etc., con lo cual
se obtiene óxido de plata que precipita en forma de granulaciones parduzcas.
Mediante la adición de amoníaco a la solución anterior se obtiene un com-

plejo iónico de plata y amonio, el denominado óxido diaminoargéntico o plata
amoniacal, soluble en agua aunque muy inestable.
El óxido diamino-argéntico se reduce al añadirle formol al 1 O por 100, el cual

tiene la capacidad de captar oxígeno hasta precipitar la plata dando como
productos de la reacción plata metálica, ácido fórmico y amoníaco.
Esta plata metálica es la que se deposita sobre el tejido en forma molecular

muy estable.
Las técnicas de coloración para fibras de reticulina son el ejemplo más
característico de esta forma de impregnación .
-Impregnación argéntica en un tiempo

En ella se suele partir del nitrato de plata (AgN0 3 ), aunque en ocasiones se
emplean otras sales argénticas.
Esta impregnación se fundamenta en la reducción severa y directa de la sal
de plata a plata metálica a través de la acción de un agente reductor potente, que
suele ser el pirogalol o la hidroquinona.
AgN0 3 + agente reductor potente ~ Ag + producto de oxidación
Es una técnica más lenta que la de los dos tiempos, ya que el nitrato de plata
es más estable que el óxido diamino-argéntico, a partir del cual se precipita la
plata metálica.
La técnica de Bodian para neurofibrillas y la de Grimelius para
argirofilia son las que emplean más a menudo la impregnación argéntica en un
tiempo.
3. MANIOBRAS COMPLEMENTARIAS A REALIZAR USUALMENTE

EN LA IMPREGNACION ARGENTICA
1. La limpieza del material de vidrio ha de ser escrupulosa, ya que

cualquier impureza en él o en el agua destilada utilizada para lavarlo hace
precipitar la plata amoniacal.
Por idénticos motivos no se deben emplear objetos metálicos en la
manipulación .
2. En la mayor parte de las técnicas es conveniente realizar un mordentaje

previo con algún fijador, en particular líquido de Bouin, dicromato
potásico, etc., o con agentes oxidantes como el permanganato potásico.
Ello hace que aparezcan en las estructuras grupos químicos particulares
que favorecen la coloración (principalmente grupos aldehídicos) .
Cuando se emplea permanganato deben blanquearse los cortes a
continuación con una solución de metabisulfito sódico o ácido oxálico.
3. Tras la impregnación argéntica suele ser tamb ién conven iente realizar el
llamado viraje, que se realiza con una disolución acuosa de cloruro de
oro a partir de la cual se produce el depósito de moléculas de oro
metálico sobre los precipitados de plata .
De esta manera, el color pardo negruzco que confiere la plata a los
tejidos se transforma en un color negro azulado intenso. Al mismo tiem -
po, la disolución de oro contribuye a retirar los posibles precipitados de
plata que hayan ocurrido anómalamente en el citoplasma y núcleos
celulares.
4. Tras el viraje puede ser conveniente realizar un blanqueamiento con
metabisulfito sódico o ácido oxálico.
5. Por último, siempre hay que fijar la coloración con tiosulfato sódico,
que retira la sal de plata no reducida y la metálica que no ha impregnado
las estructuras por colorear.
4. TECNICAS PARA FIBRAS DE RETICULINA DEL TEJIDO

CONJUNTIVO (GOMORI Y GORDON-SWEET)
4.1. Generalidades
Uno de los principales problemas que plantean las técnicas de impregnación

argéntica es la fijación del corte al portaobjetos. Al real izarse múltiples lavados y
tratamientos sobre los cortes, es muy frecuente que se desprendan, sobre todo si
son de grosor elevado o si no se utilizan portaobjetos albuminados para su
montaje. Por ello, el corte ha de ser lo más delgado posible y ha de
montarse necesariamente en portaobjetos albuminados o gelatinados
previamente.
4.2. Método de impregnación argéntica de Gomori para fibras

reticulares
Se trata de una técnica de impregnación argéntica en dos tiempos que

utiliza como base fuerte el hidróxido potásico y como agente reductor el formol.
Antes de la impregnación se realiza una oxidación con permanganato potásico
al 1 por 1 00 seguida de blanqueamiento con metabisulfito potásico al 2 por 1 00
y un mordentaje con alumbre férrico al 2 por 1 OO.
Fijación: formalina al 1O por 1OO.
Cortes: en parafina, congelación o en celoidina .
Soluciones:
a) Solución acuosa de permanganato potásico al 1 por 100.
b) Solución acuosa de metabisulfito potásico al 2 por 100.
e) Solución acuosa de alumbre férrico al 2 por 100 preparada antes de
usar.
d) Complejo de plata amoniacal diluido, durante tiempo limitado, en un
volumen igual de agua destilada. Se toman 1O mL de una solución de nitrato
de plata al 1O por 100, se añaden 2 mL de hidróxido potásico al 1 O por 100; el
precipitado que se forma se disuelve con amoníaco concentrado, después se
añade nitrato de plata hasta que empiece a formarse de nuevo el precipitado;
diluir con agua a partes iguales.
e) Formol al 10 por 100.
f) Solución acuosa de hiposulfito sódico al 2 por 100.
Modo de operar:
1. Desparafinar, no colodionar, hidratar.
2. Oxidar durante 1 a 2 minutos con el permanganato potásico.
3. Lavar con agua corriente.
4. Blanquear con metabisulfito.
5. Lavar con abundante agua corriente.
6. Tratar con una solución de alumbre férrico durante 1 minuto.
7. Lavar con agua corriente durante 5 minutos.
8. Lavar dos veces con agua destilada.
9. Tratar durante 1 minuto con el complejo argéntico.
1O. Lavar con agua destilada, como máximo 1 O segundos.
11 . Reducir con formol.
1 2. Lavar con agua corriente.
13. Pasar rápidamente por la solución de hiposulfito.
14. Lavar con abundante agua corriente.
15. Deshidratar y montar.
Resultados:
-Fibras reticulares Negro
- Fibras colágenas Amarillento
• Observaciones:
1. En caso de un viraje con el oro, como en el método de Ramón y Cajal, las
fibras colágenas muestran una tonalidad más purpúrea.
2. Hay que resaltar que el resultado óptimo de este método depende
del lavado que precede a la reducción por el formol, debiendo
determinarse empíricamente la duración de este lavado.
4.3. Técnica de impregnación argéntica de Gordon-Sweet

para fibras reticulares
Se trata de una impregnación argéntica en dos tiempos que emplea como

base fuerte el hidróxido sódico y como agente reductor el formol. Antes de la
impregnación se realizan manipulaciones semejantes a la de la técnica de Go -
mori, sustituyendo el metabisulfito por ácido oxálico. Finalmente se realiza un
contrastado suplementario con cloruro de oro al 2 por 1 OO.
Fijadores: varios líquidos fijadores (carnoy, formol, etc.) .
Soluciones:
Solución A : baño argéntico de Wilder. Se prepara :
1. -Nitrato de plata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.0 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O ml
2. -Hidróxido sódico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 .3 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O ml
Se toman 5 ml de solución de nitrato de plata; añadir amoniaco gota a gota
hasta que el precipitado casi se disuelva.
Se precipita de nuevo la solución con 5 ml de hidróxido sódico y a continuación
amoníaco gota a gota hasta que la solución quede clara .
Completar con agua destilada hasta 50 ml.
Solución 8 :
-Cloruro de oro 0.02 g
-Agua destilada 10 ml
Solución C:
-Acido oxálico 0.5 g
-Agua destilada 10 ml
Solución D:
-Alumbre de hierro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.2 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O m L
Solución E:
- Tiosulfato sódico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 ml
Solución F:
1. -Permanganato potásico . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 g
-Aguadestilada .. .. .. .................. 100ml
2. - Acido sulfúrico al 3 por 1 00
-Mezclar 47.5 mi de la primera con 2.5 ml de
la segunda
Solución G: formol al 1 O por 100, 100 m l.
202 LAB 0'RATORIO DE ANATOM IA PATOLOG ICA
Modo de operar:
Cortes muy bien adheridos al portaobjetos con albúmina de huevo y muy
calientes.
2. Oxidar con permanganato potásico (solución F) durante 5 minutos.
4. Blanquear con ácido oxálico durante 1 minuto.
5. Lavar en tres cambios de agua destilada.
6. Trata con mordiente de alumbre de hierro en solución acuosa al 2 por 100
durante 30 minutos.
7. Lavar bien en dos cambios de agua destilada.
8. Tratar con el baño argéntico de Wilder durante unos segundos.
9. Lavar brevemente y a fondo en agua destilada.
1 O. Tratar con formol al 1O por 100 durante 1 O minutos.
11 . Lavar en agua. Si los cortes aparecen poco impregnados, repetir desde el
paso séptimo.
12. Contrastar suplementariamente en cloruro de oro al 2 por 1 00 durante 5
minutos.
14. Fijar en tiosulfato sódico durante 1O minutos.
1 5. Lavar en agua destilada.
Resultados (fig. 11.1 ):

- Fibras reticulares .... . ......... . ... . ... . ..... . . . Negro azulado
- Resto de estructuras . .... . .. . ... . .. ... ..... . . . .. Sin teñir
Figura 11.1. Técnica de reticulina (Gordon-Sweet) para visualizar la tra -

ma reticulínica en el ganglio linfático de un enfermo con el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA) .
lA IMPREGNACION ARGENTICA 203
5. CONCEPTOS DE_ARGENTAFINIDAD Y ARGIROFILIA
5.1. Argentafinidad
Es la propiedad que tienen algunos tejidos de reducir el nitrato de

plata amoniacal a plata metálica sin intervención de agentes reducto-
res externos. Esta propiedad es característica de determinadas granulaciones
citoplasmáticas presentes en células cutáneas como los melanocitos, que secre-
tan melanina, y en ciertas células de secreción endocrina presentes en el tubo
digestivo y que reciben el nombre de células argentafines, entero-cromafines o
células de Kultschitzky. Estas células se encuentran sobre todo en las glándulas
pilóricas del estómago, criptas de Lieberkun y mucosa del apéndice. La reduc-
ción de la plata amoniacal a plata metálica depende esencialmente del contenido
de sus gránulos de secreción, por lo cual la imagen que aparece tras la impreg -
nación es una imagen granular citoplasmática.
El mecanismo preciso que desencadena esta reacción no se conoce con
exactitud, aunque parece depender de la presencia de 5-hidroxitriptamina (5-
TH} , que es convertida en tetrahídro - 4 -carbolina por el formol. La técnica más
empleada para demostrar esta propiedad es la de Masson - Fontana .
5.2. Argirofilia
Es, como ya se ha mencionado, la propiedad que poseen determinadas
estructuras tisulares de unirse a los iones de plata derivados del nitra-
to de plata o pla~a amoniacal. de forma que, posteriormente, los iones de
plata atraídos por el tejido son precipitados a plata metálica por acción de un
agente reductor externo como el pirogalol o la hidroquinona. Las técnicas util i-
zadas para la determinación de fibras de reticulina pueden considerarse, en
sentido amplio, como técnicas de argirofilia . Sin embargo, para demostrar argi-
rofilia en granulaciones intracitoplamáticas se emplean otros métodos como el
de Grimelius o el de Sevier-Munger.
6. PRECAUCIONES GENERALES EN LA REALIZACION DE TECNICAS

DE ARGENTAFINIDAD
a) Todas las aconsejadas para cualquier impregnación argéntica (limpieza

escrupulosa del material, no utilizar instrumentos metálicos, etc.).
b) Fijación. No deben emplearse líqu idos fijadores que contengan alcohol,
pues las granulaciones argénticas son solubles en él. El fijador de elec-
ción es la formalina tamponada al10 por 100. Sin embargo, hay que
tener en cuenta que tras esta f ijación los gránulos muestran autofluores-
cencia, lo que puede ser de utilidad para su demostración tras observa -
ción con microscopio de fluorescencia, filtro excitador Scott UG - 2 y
secciones incluidas en parafina y montadas en med io de Apathy.
6.1 . Técnica de Masson-Fontana para argentafinidad
Se trata de una impregnación argéntica en dos tiempos, en la cual el

amoníaco realiza la primera reducción del nitrato de plata a óxido diaminoargén -
tico y el tejido la segunda, precipitándose plata metálica sobre las granulaciones

dotadas de capacidad reductora.
Es de destacar que la incubación del tejido con la plata amoniacal es
prolongada (24 horas) y debe realizarse en la oscuridad para evitar precipita-
dos a causa de la acción de la luz solar.
La principal dificultad de la técnica se encuentra en la preparación de los
reactivos, ya que hay que llevar la solución de plata hasta un momento en
que esté a punto de precipitar sin que llegue a hacerlo en realidad (solución
de apariencia nubosa).
Fijación: formalina al 1 O por 1OO.
Soluciones:
s) Solución de nitrato de plata (Fontana):
Disolver:
- Nitrato de plata ................................ . 5g
-Agua destilada ................................. . 100 mL
Añadir a 95 mL de esta solución hidróxido amónico hasta obtener una solución
clara sin precipitados. Luego añadir gota a gota lo necesario de los restantes 5 mL
de la solución de nitrato de plata hasta que la solución se vuelva ligeramente turbia
(opalescente).
Dejar reposar 1 ó 2 horas en la oscuridad antes de usar.
b) Solución de cloruro de oro:
-Cloruro de oro acuoso al 1 por 1 00 ..... ... ... . ... .. . 10 mL
-Agua destilada .................................. . 40 mL
e) Solución de tiosulfato sódico al 5 por 100:
- Tiosulfato sódico ................................ . 5 mL
d) Solución de rojo nuclear rápido (Kernechtrot)
Modo de operar:
Usar cortes de control. Emplear material de vidrio quimicamente limpio. Evitar
el contacto con metales.
1. Desparafinar y rehidratar los cortes hasta agua destilada.
2. Incubar en solución de nitrato de plata a 56 oc durante 1 hora o bien de
24 a 48 horas a temperatura ambiente (en oscuridad). Los cortes deben
ser de color marrón claro.
4. Colocar en solución de cloruro de oro durante 5 minutos.
5. Lavar tres veces en agua destilada.
6. Colocar en solución de tiosulfato sódico durante 5 minÚtos.
8. Contrastar con solución de rojo nuclear rápido durante 5 minutos. Lavar
bien.
9. Lavar en agua destilada dos veces.

1 O. Deshidrata(, aclarar y montar.
Resultados (fig. 11.2) :

-Sustancias reductoras de la plata, incluidos gránulos argen-
tafines y melanina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rosa
Figura 11.2. Técnica de Masson- Fontana para identificar células argenta-

fines en las glándulas del intestino delgado.
• Observaciones:
Este procedimiento es inespecífico, ya que muchos pigmentos, incluidos el
formol , hierro, pigmento lipofucsínico y gránulos argentafines, pueden ser positi-
vos. Aunque se usa con frecuencia para demostrar melanina, es preciso realizar
otras técnicas para confirmar los resultados positivos. Como otros pigmentos no
reaccionan con la plata a pH 3.3, se puede demostrar selectivamente la melanina
usando un método de Warthin - Starry modificado a este pH . La prueba histoquí-
mica crucial para las melaninas es la reducción del nitrato de plata (0.1 M o 1.7 por
100) en tampón acetato (0 .1 M pH 4) , en 1 hora o menos, a temperatura ambiente
en la oscuridad .
6.2. Método de Grimelius para argirofilia
Se trata de una impregnación argéntica en un tiempo con reducción del

nit rato de plata mediante la hidroquinona .
Las piezas fijadas en formol tamponado al 1 O por 1 00 deben ser refijadas
toda la noche en líquido de Bouin antes de su tinc ión .
Procesamiento normal. Inclusión en parafina .
Soluciones:
a) Solución de tampón acetato 0.1 M a pH 5.8: ~
Solución 1:
-Acetato de sodio puro ................... .. ....... . 1.64 g
-Acetato de sodio tri hidrato .. . ............. .. ...... . 2.72 g
-Agua destilada ............................... . .. . 100 ml
Solución 2:
- Acido acético glacial ............................. . 1.2 ml
-Agua destilada . ...... .. .... . ......... . .......... . 98.2 ml
-Solución 1 ................................ . ... . . 95.0 ml
-Solución 2 ..................................... . 5.0 ml
-Agua destilada .......................... . . . ..... . 100 ml
b) Solución de impregnación:
-Tampón acetato 0.1 molar a pH 5.8 ................. . 100 ml
-Nitrato de plata ................................. . 0.05 g
e) Solución reductora de Bodian:
-Sulfito de sodio anhidro ......... . ................ . 5g
- Hidroquinona ................................... . 1g
-Agua destilada ........ . ... . ............... . ..... . 100 ml
d) Solución fijadora:
- Tiosulfato sódico ................... . ............ . 2g
Modo de operar:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
2. Lavar cuatro veces en agua destilada.
3. Colocar en la solución de impregnación durante 3 horas a 60 oc (los
portaobjetos y la solución han de ir alcanzando progresivamente la tempe-
ratura) .
4. Transferir durante 5 minutos a la solución reductora de Bodian recién
preparada y previamente calentada a 60 °C. Examinar al microscopio. Si no
aparece color negro, lavar en cuatro cambios de agua destilada. Fijar en
tiosulfato sódico al 2 por 100 de 30 segundos a 1 minuto. Volver a colocar
en la solución de impregnación recién preparada a temperatura ambiente
durante 30 minutos. Transferir a la solución reductora de Bodian recién
preparada durante otros 5 minutos.
6. Fijar en tiosulfato sódico al 2 por 1 00 durante 30 segundos.
Resultados (fig. 11.3):

- Células argirófilas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
- Células alfa 2 de los islotes pancreáticos . . . . . . . . . . . . . . Negro
Figura 11.3. Técnica de Grimelius para identificar las células argirófilas

del intestino delgado.
• Observaciones:
1. Es fundamental emplear soluciones tamponadas, pues el resultado de la
técnica depende del correcto equilibrio del pH.
2. Se utiliza nitrato de plata en muy pequeña cantidad para evitar que los
iones de plata en exceso saturen la proliferación.
3. Se obtiene un resultado excelente tratando los cortes, una vez desparafina-
dos con fijador de Bouin, durante 1 hora a 37 oc. y pasándolos luego por
alcohol de 70° hasta que desaparezca el color amarillo. La incubación se
realiza en una solución de nitrato de plata al 0.1 por 100 aproximadamente
(casi el doble de la recomendada) durante 4 horas a 60 oc. El resto de la
técnica es igual a la descrita. (Modificación realizada en el departamento de
anatomía patológica del Hospital universitario de Granada) .
CAPITULO 12
Coloraciones para estudios

neurohistológicos
GUION DE CONTENIDOS
1. COLORACIONES NO ARGENTICAS PARA TEJIDO NERVIOSO

1.1. Coloración para neuronas y grumos de Nissl
1.2. Métodos de coloración para glía
1.3. Coloraciones para vainas de mielina
2. METODOS DE IMPREGNACION METALICA PARA SISTEMA
NERVIOSO
2.1. Importancia del tipo de material utilizado y fijación
2.2. Técnicas de impregnación argéntica para la observación
de neurofibrillas
2.3. Otras técnicas de impregnación metálica para
tejido nervioso
1. COLORACIONES NO ARGENTICAS PARA TEJIDO NERVIOSO
Se clasifican en:
1. Coloraciones para neuronas o grumos de Nissl.
2. Coloraciones para glía.
3. Coloraciones para vainas de mielina.
1.1. Coloraciones para neuronas y grumos de Nissl
Los grumos de Nissl, o sustancias tígroíde, son acúmulos de R.E.R. (retículo

endoplásmico rugoso) que se encuentran en el citoplasma de las neuronas, y
están compuestos por ARN ribosómico y ARN mensajero.
Para teñir los grumos de Nissl se utilizan, en general, colorantes básicos de
anilina --como azul de r'netileno, azul de toluidina, tionina y violeta de cresilo u
otros colorantes básicos- como la galocianina.
Estos colorantes se unen a los ácidos nucleicos por un mecanismo físicoquí-
mico de atracción electrostática, y además de colorear los grumos de Nissl tiñen
los núcleos, ya que éstos contienen ADN.
Para que la coloración sea adecuada se precisa un pH ácido, a fin de que los
colorantes mencionados tiñan por un mecanismo de coloración terminal, al igual
que ocurre con la hematoxilina.
La diferenciación se realiza siempre con alcohol etílico, que por disolver muy
bien los colorantes retira el exceso de éstos. Sin embargo, es necesario fijar
luego la coloración con molibdato amónico, pues de lo contrario el proceso de
diferenciación continúa durante la deshidratación y la intensidad de la colora-
ción disminuye.
TECNICA DE NISSL
En su versión clásica no se emplea en la actualidad porque es de realización
muy lenta y requiere necesariamente material fijado en alcohol. En su lugar se
utiliza una modificación de este método, de mayor rapidez y estabilidad en
cuanto a resultados.
Fijación: formalina tamponada al 1 O por 1 OO.
Soluciones:
a) Tampón acetato:
-Acetato sódico al 2.721 por 100 ..................... 1 parte
- Acido acético al 1 .201 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 partes
b) Solución de cresilo extra:
-Violeta de cresilo extra o tionina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 g
-Tampón acetato a pH 3.8-4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100.0 ml
COLORACIONES PARA ESTUDIOS NEUROHISTOLOGICOS 21 1
Modo de operar:
2. Solución de violeta de cresilo en tampón, 1O minutos.
3. Lavar en solución tampón de acetato.
4. Deshidratar, aclarar en xilol (muy corto tiempo) y montar.
Resultados:
- Grumos de Nissl y núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Violeta
- Células nerviosas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul tenue
-Estructuras restantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . No se tiñen
TECNICA DEL AZUL DE TOLUIDINA PARA GRUMOS DE NISSL
Fijación: formol al 1O por 1 OO.
Soluciones:
a) Tampón ácido acético-acetato a pH 4.2 (véase apéndice).
b) Azul de toluidina en solución al 0.5 por 100 en el tampón de ácido
acético-acetato a pH 4.2.
e) Solución acuosa de molibdato amónico al 4 por 1 OO.
Modo de operar:
2. Teñ ir con azul de toluidina de 5 a 1 O minutos.
3. Lavar con tampón acetato.
4. Tratar los cortes durante 1 O minutos con molibdato amón ico.
5. Lavar con agua corriente durante 1O minutos.
6. Deshidratar y montar en medio acuoso.
Figura 12.1. Azul de toluidina en neuronas para grumos de Nissl en el

bulbo olfatorio del gato. Nótese la mayor densidad que poseen las ram ifica -
ciones intraglomerulares de los axones de las células bipola res olfatorias (A.
toluidina x 20) .
Resultados (fig . 12.1 ):

- Nucleolo, ergastoplasma y grumos de Nissl ........ . . . Azul violeta
- Mucinas (metacromasia) ...... . .. .... .... . . . . .... . Rojo púrpura
METODO DE LA GALOCIANINA DE EINARSON PARA GRUMOS

DE NISSL
Fijación: formol tamponado al 1O por 100, líquido de Carnoy o líquido de Zenker.
Soluciones:
a) Solución de galocianina:
- Galocianina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.3 g
-Alumbre de cromo (sulfato de cromo y potasio) . . . . . . . . . 10.0 g
Disolver el alumbre en el agua calentando. Añadir el colorante, llevar a ebulli-
ción y hervir de 15 a 20 minutos. Dejar reposar de 16 a 24 horas y filtrar. La solu-
ción es estable durante un mes, aproximadamente.
Modo de operar:
2. Solución de galocianina de 16 a 48 horas a temperatura ambiente, o de 2
a 4 horas a 60 oc.
Resultados:
-Grumos de Nissl Azul intenso
-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul intenso
1.2. Métodos de coloración para glía
Desde la introducción de la inmunohistoquímica para determinar la proteína

ácida g :1 al fibrilar (PAGF) , característica de los astrocitos fibrosos, estas técnicas
han perdido vigencia. Por ello sólo se mencionarán las que aún conservan algún
interés, como la coloración de Holzer o de la PTAH o, .POr su interés histórico,
algunas impregnaciones metálicas introducidas por la escuela española de Neu -
rohistología . Estas últimas se analizan, junto con otras impregnaciones metá-
licas, al final del capítulo.
COLORACION DE HOLZER PARA NEUROGLIA

Utiliza como colorante fundamental el violeta cristal, derivado de la parafuc-
sina, que posee la particularidad de mostrar un grado variable de dispersión
COLORACIONES PARA ESTUDIOS NEUROHISTOLOGICOS 213
según que la disolución se realice en agua o en algún solvente orgánico. En el

primer caso, el colorante se dispersa poco y queda en forma de gruesas partícu -
las, actuando como si fuese un colorante del tejido conjuntivo. Si, por el contra-
rio, el violeta cristal se disuelve en una mezcla de alcohol -cloroformo, la disper-
sión es muy fina, por lo que se comporta como si fuese un colorante citoplásmi -
co y penetra en profundidad hasta las finas prolongaciones de las células gliales.
Fijación: formol neutro o tamponado al 1 O por 100 y líquido de Bouin. Cortes

de parafina de 6 micras.
Soluciones:
Solución A: mordiente
Una parte de solución acuosa de ácido fosfomolíbdico 31 0.5 por 100 más dos
partes de alcohol de 96°.
Solución B: colorante . Solución de violeta cristal
- Violeta de cristal (C .l. 42555) . ...... . ... . . . ....... . . 1 g
- Alcohol absoluto . . .. .. ...... . ... . ... . ...... ... .. . 4 ml
-Cloroformo ........ . .. . .. .. ... ..... .. .. .... . ... . 16 ml
Solución C: diferenciador
-Aceite de anilina . ... ... . . . ..... . . . .. . . . ... . ... . . . 8 partes
-Cloroformo ............ . ...... . .... .. . .. . . . ... . . 12 partes.
Solución D: solución de alcohol-cloroformo
-Alcohol etílico absoluto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 partes
-Cloroformo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 partes
Solución E: solución de bromuro potásico al10 por 100
Modo de operar:
2. Mordiente durante 3 minutos.
3. Eliminar el mordiente y lavar con alcohol etílico absoluto.
4. Aclarar en solución de alcohol -cloroformo durante 30 segundos.
5. Solución colorante 30 segundos.
6. Lavar en una solución de bromuro potásico a 1 O por 1 00 (los cortes ad -
quieren un color negro azulado) .
7. Diferenciar en anilina-cloroformo hasta que desaparezcan las nubecillas
que empañan los portaobjetos (el tejido adquirirá una tonalidad lila) . Con -
trolar al microscopio.
8. Interrumpir la diferenciación con xilol, en varios cambios .
9. Montar.
Resultados:
- Fibras de la glía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul violeta
-Núcleos y citoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul tenue
214 LABORATORIO OE ANATOMIA PATOLOGICA
METODO DE LA HEMATOXILINA ACIDA FOSFOTUNGSTICA

PARA GLIOFIBRILLAS
Fijación : formol neutro tamponado al 1O por 1OO. Secciones en parafina a 5-1 O

micras.
Soluciones:
a) Solución de permanganato potásico acidificado:
-Permanganato potásico al 0.3 por 100 . .............. . 100.0 mL
- Acido sulfúrico concentrado ... . ................. . . . 0.1 mL
Preparar en el momento de usar.
b) Solución de acido oxl:llico al 5 por 100.
e) Solución de sulfato férrico amónico al 4 por 100.
el) Solución de hematoxilina ácida fosfotúngstica (PTAH):
- Hematoxilina (C.I. 75290) .. . . ... .... .. .. . .. . ...... . 1g
- Acido fosfotúngstico .............. .. . . .. . ........ . 20 g
-Agua destilada ............. .. . ... . . ... .. . . .... . . . 1000 mL
Disolver ambos solutos en porciones separadas de agua destilada, mezclar las
soluciones y madurar a la luz varias semanas. Puede realizarse una maduración es-
pontánea añadiendo 0 .177 g de permanganato potásico.
Modo de operar:
2. Oxidar en permanganato potásico 15 minutos.
4. Blanquear en ácido oxálico hasta decoloración.
5. Lavar en tres cambios de agua corriente.
7. Realizar mordentaje en sulfato férrico amónico, 2 horas.
8. Lavar en tres cambios de agua destilada.
9. PTAH, 2 horas.
1O. Lavar en alcohol etllico absoluto.
11 . Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
- Neurofibrillas . .............. . .. . . .... .. .. . Azul negruzco
- Miofibrillas . . .............. . .. . . .... .. .. . Azul negruzco
-Axones .. . . . . . ....... .. . ." . . .. . . .... .. .. . De azul pálido a negro
-Colágena. . . . . .... . .. . . .... . .. . . .... .. .. . Roja
-Astrocitos . . . .............. . .. . . .... .. .. . Rojo pálido
1.3. Coloraciones para vainas de mielina
GENERALIDADES
La mielina está formada por grasas complejas del tipo de los fosfolípidos y
esfingolípidos. Se .origina a partir de una diferenciación de la membrana de los
oligodendrocitos que va envolviendo en espiral las fibras nerviosas procedentes
del soma neuronal.
Los procedimientos más clásicos de tinción para la mielina incluían la fijación
en formalina al 1 O por 1 00 -que reduce la mielina, insolubilizándola frente a la
actuación de determinados disolventes orgánicos-, seguido de un mordentaje
con derivados crómicos y una tinción de carácter físico-químico con algún
derivado de la hematoxilina. La introducción de los colorantes derivados de las
ftalocianinas cúpricas y los diversos métodos para la tinción de las neuronas han
abierto nuevas perspectivas a las coloracione:; clásicas. De igual forma, la inmu-
nohistoquímica está desplazando a todas las coloraciones descritas, ya que
mediante anticuerpos específicos (esencialmente proteína S-100 y Leu-7) se
identifican con claridad la mielina y los oligodendrocitos que la producen.
METODO DE LAS FTALOCIANINAS CUPRICAS SULFONADAS

DE TIPO LUXOL FAST BLUE (METODO DE KLÜVER-BARRERA, 1953)
Los colorantes de luxol, al igual que el azul alcián, proceden del grupo de las
ftalocianinas (véase en pág . 122, estructura general en el capítulo dedicado a
generalidades sobre coloración) .
El luxol fast blue es insoluble en agua, pero muy soluble en ciertos disolven -
tes orgánicos (alcoholes, cloroformo, etc.).
Las técnica de coloración para mielina se fundamenta, según ciertos autores,
en la atracción físico-química entre esta sustancia (ion amonio cuaternario de la
colina) y la función ácida sulfonada del luxol. Para otros autores, el luxol fast
b/ue tendría gran apetencia por los fosfolípidos y la tinción ocurriría por un
mecanismo de disolución del primero en la mielina. Conviene destacar que la
especificidad del colorante varía en función del disolvente utilizado en su prepa-
ración . Así:
a) En solución de etanol. el luxol fast b/ue forma precipitados insolubles
con la fosfatidilserina y fosfadilcolina (lecitina) .
b) Disuelto en isopropanol colorea todos los fosfolípidos.
e) Disuelto en metanol no colorea ninguno.
d) Utilizando isobutanol, como disolvente, colorea todos los fosfolípidos
salvo la esfingomielina.
e) Finalmente, disuelto en cloroformo colorea la esfingomielina.
Este efecto depende principalmente de que el producto resultante de la
interacción entre colorante y tejido sea o no soluble en el disolvente empleado:
en el segundo caso quedará retenido tras la diferenciación .
Fijación: formalina neutra o tamponada al 1 O por 1 OO. Cortes en parafina celoi-
dina o congelación.
Soluciones:
a) Luxol fast blue al 0.1 por 100:
- Luxol fast blue M .S.S. . . ........... . ..... . . 0 .5 g
-Alcohol de 96° 500.0 ml
Disolver el colorante en el alcohol y añadir:
- Acido acético glacial al 1 O por 1 00 2.5 ml
Esta solución es estable durante años .
b) Violeta de cresilo al 0.1 por 100:
-Violeta de cresilo ..... . ... .. . . .. . . .. . . . . .. . 0 .5 g
-Agua destilada ........ . .. .. ... . .... . .... . 500.0 ml
Añadir inmediatamente antes de usar:
- Acido acético glacial al 1 O por 100 75 gotas
Filtrar.
e) Carbonato de litio al 0.50 por 100:
-Carbonato de litio ...... . ..... . ... . ....... . 0 .25 g
-Agua destilada .... .. .. . .. . ....... . .... . . . 500.0 ml
d) Alcohol etílico al 70 por 100:
-Alcohol 1 00 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350.0 ml
- Agua destilada . .. ... . .... . ........... . ... 150.0 ml
Modo de operar:
Desparafi nar.
1.
2.
Llevar hasta alcohol de 96°.
3. Dejar en solución de luxol toda la noche, a 56-60 oc de temperatura .
4. Aclarar en alcohol de 96° para eliminar el exceso de colorante .
5. Aclarar rápidamente en agua destilada.
6. Comenzar la diferenciación con breve inmersión en la solución de carbo-
nato de litio.
7. Continuar la diferenciación en alcohol de 70° hasta que se pueda distin-
guir la sustancia gris de la blanca.
9. Terminar la diferenciación aclarando brevemente en la solución de carbo-
nato de litio. Pasar a continuació'n por varios cambios de alcohol de 70°
hasta que el azul verdoso de la sustancia blanca contraste netamente con
la sustancia gris incolora.
1O. Aclarar rápidamente en agua destilada.
11 . Mantener la preparación 1 O minutos en la solución de violeta de cresilo.
Para ello, filtrar y precalentar la solución violeta de cresilo a 57 oc inme-
diatamente antes de usar.
-
12. Deshidratar en alcohol de 96 oc en varios cambios.
13. Deshidratar en alcohol de 100° (2 recipientes) .
14. Aclarar en xileno (2 recipientes) y montar.
Resultados (fig . 12.2, véase páginas en color) :

- Vainas de mielina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul o verde-azulado
-Neuronas y grumos de Nissl . . . . . . . . . . . . . . . . . Violeta o rosado
2. METODOS DE IMPREGNACION METALICA

PARA SISTEMA NERVIOSO
Las técnicas de impregnación argéntica para el sistema nervioso, por su

fundamento absolutamente empírico, constituyen uno de los campos de la his -
totecnología con mayor número de variantes y subvariantes de procedimientos
de tinción.
En consecuencia, para poder actuar con seguridad es preciso observar algu -
nas reglas generales:
2.1 . Importancia del tipo de material utilizado y fijación de éste
La elección de una técnica de impregnación específica dependerá del órgano

nervioso que se vaya a teñir: en general, los procedimientos de util idad en el
estudio del sistema nervioso central no proporcionan idénticos resultados en el
análisis del sistema nervioso periférico, principalmente debido a la abundancia
de mielina en este último. Además, en la mayor parte de los casos será conve -
niente ajustar el tiempo de impregnación a cada uno de los territorios escogidos.
En cuanto a los agentes fijadores, salvo en algunas técnicas concretas ( méto -
dos del carbonato de plata e impregnaciones metálicas de Cajal y Golgi) la
fijación debe hacerse en formol tamponado como agente de elección .
Para una actuación correcta deben observarse alguna.s precauciones:
a) Siempre que sea posible, el sistema nervioso debe fijarse en su
conjunto, es decir, debe operarse sobre cerebro, cerebe lo y tronco encefál ico
si n realiza r secciones de ellos.
b) El cerebro no debe apoyarse sobre el fondo del recipiente que
lo contiene, porque puede deformarse. Pa ra evitarlo puede emplearse algu -
no de estos procedimientos:
1. Suspender el cerebro de los vasos del polígono de W ill is mediant e una
cuerda .
2. Añadir sal (cloruro sódico) al formol, hasta que se consiga en la solución
un grado de densidad que permita que el cerebro se mantenga suspend i-
do sin tocar el fondo del recipiente.
3. Colocar en el fondo del recipiente gran cantidad de algodón para evitar
el aplastamiento .
e) Los cortes deben realizarse preferentemente sobre tejido incluido en
celoidina y tener entre 1 O y 14 micras de espesor. En ocasiones también
pueden utilizarse cortes en congelación o parafina .
Para determinadas coloraciones puede ser útil realizar una fijación con líqui-
dos especiales, como el fijador compuesto por formalina y bromuro amónico
diseñado por Cajal.
FIJADOR FORMOLICO DE CAJAL

Se compone de:
- Formaldehído al 40 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 O ml
-Bromuro amónico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g
d) Para obtener resultados adecuados es imprescindible utilizar reactivos

puros y material de vidrio perfectamente limpio, así como agua destilada de
calidad. En ocasiones, a ' pesar de haberse realizado correctamente el procedi -
miento técnico los resultados no responden a lo previsto (nótese que la mayor
parte de los mecanismos de coloración permanecen desconocidos), y debe
ensayarse otra variante técnica. Este hecho justifica en parte su gran número.
2.2. Técnicas de impregnación argéntica para

la observación de neurofibrillas
Pueden realizarse en forma de coloraciones en bloque o sobre cortes. Su

fundamento radica en impregnar el tejido con un complejo argéntico y realizar
luego una reducción que precipita la plata metálica y la hace depositarse, por un
mecanismo eminentemente físico, sobre las neurofibrillas.
Los numerosos métodos descritos se diferencian entre sí por los distintos
fijadores, tipo de impregnación y soluciones empleadas. Estas últimas puede
clasificarse genéricamente en tres grandes grupos:
a) Soluciones de nitrato de plata, ya sea al 1 ó 2 por 100, o bien muy
diluidas en tampón borato. En general, las soluciones son estabilizadas con
diversos reactivos y se ajustan a pH en torno a 8.
b) Complejos amonio-argénticos, casi todos derivados de la solución de
Bielschowsky, que se prepara añadiendo amoniaco, y a veces hidróxido sódico,
a una solución de nitrato de plata. Todos ellos representan una impregnación
argéntica en 2 tiempos.
e) Solución de proteinato de plata (protargol) .
METODO DE BIELSCHOWSKY PARA CELULAS "'ERVIOSAS

Y SUS PROLONGACIONES
Fijación: formalina neutra al 1 O por 1 OO. Cortes en congelación a 1 0-15 micras.
Tinción sobre secciones flotantes.
Soluciones:
a) Solución de nitrato de plata al 4 por 100
b) Solución de nitrato de plata amoniacal de Bielschowsky:
-Nitrato de plata al 20 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 mL
-Hidróxido sódico al 40 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 gotas
Añadir amoniaco gota a gota hasta el momento justo de disolver el precipitado
formado (aproximadamente 5 ml) :
-Amoniaco concentrado.
Filtrar antes de usar. Esta solución es de un solo uso.
e) Solución de formol neutro al 4 por 100.
d) Solución de cloruro de oro al 0.2 por 100.
e) Solución de tiosulfato sódico al 5 por 100
Modo de operar:
1. Poner los cortes de congelación en agua destilada.
2. Nitrato de plata al 4 por 100, durante 24-48 horas en la oscuridad.
4. Solución de nitrato de plata amoniacal de Bielschowsky durante 3-1 O mi-
nutos, hasta que los cortes adquieran una tonalidad marrón.
5. Lavar rápidamente en agua destilada.
6 . Formol neutro al 4 por 100 durante 1O minutos.
7. Lavar con varios baños de agua destilada durante 15-20 minutos.
8. Contrastar con cloruro de oro al 0.2 por 100 hasta que los cortes viren a
color gris.
1 O. Tiosulfato sódico al 5 por 100 durante 1 minuto.
11. Montar los cortes sobre portaobjetos limpios.
Resultados (fig . 12.3) :
Figura 12.3. Tinción de Bielschowsky para demostración de astroglia ( x40).

-Cilindros axónicos . . ......................... Negro

- Neurofibrillas . . . . . . ......................... Negro
-Dendritas . . . . . . . . . ......................... Negro
- Otras estructuras . . . ......................... Marrón claro a gris
METODO DE BIELSCHOWSKY PARA NEUROFIBRILLAS

MODIFICADO POR GLESS Y MARSLAND PARA CORTES
EN PARAFINA
Fijación: formalina tamponada al 1 O por 1OO.
Soluciones:
a) Solución nitrato de plata al 20 por 100 en agua destilada.
b) Formol al 20 por 100.
e) Solución de plata amoniacal:
-Nitrato de plata al 20 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 mL
-Alcohol etílico absoluto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 mL
Agregar amoníaco (gota a gota) hasta que se disuelva el precipitado de color
marrón negruzco que se forma :
-Amoniaco concentrado.
d) Solución de cloruro de oro al 0.2 por 100.
e) Solución de tiosulfato sódico al 5 por 100.
Modo de operar:
2. Nitrato de plata al 20 por 100, 30 minutos a 37 oc.
4. Formol al 1O por 1 00, 2 baños de 1O segundos cada uno
5. Solución de plata amoniacal durante 30 segundos.
6. Retirar la solución de plata amoniacal y tratar con 2 baños de formol al 1 O
por 100 de 1 minuto cada uno.
7. Examinar al microscopio. Si la impregnación es insuficiente, repetir los
pasos 5 y 6.
9. Cloruro de oro al 0.2 por 100, durante 1 O minutos.
1O. Lavar en agua destilada.
11. Tisulfato sódico, 5 minutos.
1 3. Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
-Axones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
-Dendritas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
-Otras estructuras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . De gris suave a gris pardusco
TECNICA DE BODIAN PARA NEUROFIBRILLAS

Esta técnica tiene la ventaja de que puede realizarse sobre tejido incluido en
parafina, y el inconveniente de que requiere un reactivo muy difícil de conseguir
y de calidad no homogénea: el protargol o albúmina argéntica. Los resultados de
la técnica dependen de la calidad del protargol, y por ello suelen ser variables.
En cuanto a su fundamento, se trata de una técnica de impregnación argéntica
en un tiempo en la que se realiza una reducción de la Sé!l orgánica de plata
mediante hidroquinona.
Fijación: formalina neutra al 1 O por 100,
Soluciones:
a) Solución de protargol:
- Protargol ...................................... . 1g
-Agua destilada . ............ . ............ .. ..... . . 100 mL
Rociar el protargol sobre la superficie del agua y dejar que se disuelva sin agitar
ni mezclar.
b) Solución reductora:
- Hidroquinona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g
-Sulfito sódico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 mL
Disolver la hidroquinona en el agua y añadir el sulfito sódico.
e) Solución de cloruro de oro al1 por 100.
Añadir 3 gotas de ácido acético glacial por cada 1 00 m l.
d) Solución de ácido oxálico al 2 por 100.
e) Solución de tiosulfato sódico al 5 por 100.
Modo de operar:
2. Añadir aproximadamente 2.5 g de granos de cobre «limpio» a 50 mL de
protargol al 1 por 1OO. Dejar los portaobjetos en esta solución durante 48
horas a 37 oc.
3. Lavar con tres cambios de agua destilada.
4. Colocar en la solución reductora durante 1 O minutos.
5. Lavar con 3 cambios de agua destilada.
6. Contrastar en solución de cloruro de oro al 1 por 1 00 durante 1O minutos.
7. Lavar en 3 cambios de agua destilada.
8. Revelar en ácido oxálico al 2 por 100 hasta que el fondo sea gris y las
neurofibrillas destaquen en color negro, aproximadamente 3-5 minutos.
Controlar al microscopio.
9. Lavar en 3 cambios de agua destilada.
1 O. Tiosulfato sódico al 5 por 100 durante 5 minutos.
11 . Lavar en agua destilada.

1 2. Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
-Fibras y terminaciones nerviosas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
- Otras estructuras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sin teñir
2.3. Otras técnicas de impregnación metálica para tejido nervioso
METODO DE IMPREGNACION AURICA DE RAMON Y CAJAL

PARA ASTROCITOS
Como la mayor parte de las impregnaciones desarrolladas por este histólogo
español, su fundamento teórico es desconocido.
Fijación: formol salino o tamponado, o fijador formólico de Ramón y Cajal. Cor-
tes en congelación de 20 micras.
Soluciones:
a) Solución de impregnación: Aunque existen múltiples modificaciones, úni-
camente se expone, por su interés histórico, la fórmula desarrollada por Cajal.
-Cloruro mercúrico AR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 g
-Cloruro de oro al 1 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 O mL
Disolver el cloruro mercúrico en 1O mL de agua destilada calentando suave-
mente y mezclar en caliente con el cloruro de oro.
Modo de operar:
1. Lavar los cortes en varios cambios de agua destilada.
2. Incubar en la solución de impregnación, a temperatura ambiente y en la
oscuridad, entre 4 y 6 horas (los cortes deben adquirir una tonalidad púr-
pura). Para facilitar la impregnación puede ser de utilidad mantener el baño
entre 25-30 oc de temperatura . Controlar los resultados al microscopio.
4. Fijar en solución de tiosulfato sódico durante 5 minutos.
Resultados:
-Astrocitos fibrosos y protoplásmicos . . . . . . . . . . . . . Pardo-negruzco
TECNICA DE GOLGI RAPIDO

Esta técnica contribuyó a que Ramón y Cajal formulara su teoría de la
individualidad neuronal.
Características generales:
1. Se trata de una técnica de impregnación en bloque (no se colorea el
tejido después de cortarlo, sino antes) .
2. Su fundamento estriba en la formación de un depósito de cromato
argéntico sobre las neuronas, obtenido por reacción entre el diera-
mato potásico y el nitrato de plata .
3. Su ventaja fundamental reside en que, por causas desconocidas, no se
tiñen todas las neuronas, sino sólo un número restringido de
ellas, por lo que es posible seguir sus prolongaciones con mayor facili-
dad (no se pierden entre las de otras adyacentes no teñidas).
4. Su principal inconveniente es que sobre los tejidos se forman
fácilmente precipitados que contaminan la preparación, sobre todo
en áreas próximas a la superficie del bloque. Este fenómeno se debe a la
inestabilidad propia del cromato argéntico, que tiende a precipitar rápi-
damente.
5. Es obligada la fijación en dicromato potásico mezclado con te-
tróxido de osmio, pues la presencia de esta mezcla es imprescindible
para la subsiguiente reducción del nitrato de plata.
6. El corte debe hacerse sobre material incluido en celoidina. Las
secciones muy gruesas ( 40 - 100 micras) se dejan sin cubreobjetos, recu-
briéndolas exclusivamente con bálsamo de Canadá, que se deja secar
durante unos días.
Fijación: solución fijadora de dicromato potásico y tetróxido de osmio. Impreg-
nación en bloque, cortes en celoidina.
Soluciones:
a) Solución de dicromato potásico al 3 por 100.
b) Solución de tetróxido de osmio al 1 por 100.
e) Solución de trabajo:
Mezclar 40 ml de la solución de dicromato potásico con 1 O ml de la solución
de tetróxido de osmio completando hasta 1 00 con agua destilada.
d) Solución acuosa de nitrato de plata del 0.57 al 1 por 1 OO.
Modo de operar:
1. Fijar pequeños fragmentos de los órganos en la solución de tetróxido de
osmio-dicromato, de 4 a 7 días a temperatura ambiente (el tiempo debe
determinarse experimentalmente).
2. Pasar rápidamente por agua destilada.
3. Tratar de tres a cinco días, según los casos, con la solución de nitrato de
plata.
4. Eliminar con pincel empapado en agua destilada el exceso de precipitado
localizado en la superficie de la muestra.
5. Deshidratar en alcohol etílico de gradación creciente, tres baños de 70,
80, 96 por 1 00, respectivamente, dos de 100 por 100, y otro de alcohol
100 por 100/éter, de 15 minutos de duración cada uno.
6. Rea l1zar la 1nclus1ón en celoidma de la muestra según el esquema conven -
Cional (pág. 79 )
7. Adherir la muestra con celoidina a un bloque de madera (en estas condi~
ciones es posible conservar el bloque en alcohol de 70 por 1 00 hasta que
se corte).
8. Colocarlo sobre el portabloques de un micrótomo. Hacer cortes gruesos
mojando constantemente entre corte y corte, con alcohol de 70 por 1 00,
la cuchilla y la superficie de corte. Recoger los cortes y dejarlos en alcohol
de 70 por 100 hasta efectuar las manipulaciones siguientes.
9. Deshidratar en alcohol de 80 por 100 seguido de dos pases de alcohol de
100 por 100.
1O. Aclarar con creosota (debido a su olor particular pueden emplearse en su
lugar otros aclarantes como el aceite de clavo o el winter green) .
11 . Xilol durante 1O minutos.
12. Colocar unas gotas de bálsamo del Canadá sobre las secciones y ejercer
presión con un cubreobjetos sobre el que se coloca un pequeño peso
(que se retira a las 24 horas), para quitar las ondulaciones debidas al
grosor del corte.
13. Recubrir con bálsamo del Canadá y dejar sol idificar.

- Neuronas, astroglia y microglia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
- Restantes estructuras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . No se tiñen
Figura 12.4. Técnica de Golgi rápido para visualizar células nerviosas

individualizadas y sus prolongaciones ( x 40) .
CAPITULO 13
Histoquímica de hidratos
de carbono o glúcidos
GUION DE CONTENIDOS
1. INTRODUCCION AL ESTUDIO HISTOQUIMICO DE LOS
HIDRATOS DE CARBONO
2. POLISACARIDOS COMPLEJOS
2.1. Mucopolisacáridos
2.2. Mucoproteínas
2.3. Mucolípidos
3. REACCIONES HISTOQUIMICAS BASADAS EN LA
DEMOSTRACION DE GRUPOS CARBONILO FORMADOS
SOBRE LOS HIDRATOS DE CARBONO POR OXIDACION
PREVIA
3.1. Reacción del PAS (Periodic Acid Schiff)
3.2. Técnica de plata metenamina
4. TECNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACARIDOS
ACIDOS
4.1. Técnica del hidrato de hierro coloidal de Hale
4.2. Técnica del azul alcián para mucopolisacáridos
ácidos
4.3. Reacción metacromática
5. TECNICAS PARA DIFERENCIAR
SULFOMUCOPOLISACARIDOS.
... CARBOXIMUCOPOLISACARIDOS. MUCOPOLISAC.AR1DOS
NEUTROS Y GLUCOPROTEINAS
5.1. Técnicas derivadas de la reacción metacromática
5.2. Técnicas derivadas de las ftalocianinas cúpricas
5.3. Asociación entre técnicas para la determinación de
mucopolisacáridos ácidos y neutros y glucoproteínas:
técnica del azul alcián-PAS
1. INTRODUCCION AL ESTUDIO HISTOQUIMICO DE LOS HIDRATOS

DE CARBONO
Los hidratos de carbono o glúcidos son polialcoholes oxidados (polihidro-

xialdehídos y polihidroxicetonas) que están compuestos por carbono, oxígeno e
hidrógeno, estos dos en idéntica proporción a la del agua, es decir 2:1. Esta
última condición no es totalmente indispensable puesto que algunas sustancias
se clasifican hoy día como hidratos de carbono en ausencia de ella y en base a
su parecido estructural con éstos.
Los polisacáridos son glúcidos de molécula muy voluminosa, formada por
la condensación de muchas moléculas de monosacáridos (más de diez), con la
correspondiente pérdida de moléculas de agua y constituyen el grupo de hidra-
tos de carbono de mayor interés para el técnico de laboratorio. Entre ellos, y
además de los polisacáridos simples c:omo el glucógeno, destacan los polisacári-
dos complejos.
2. POLISACARIDOS COMPLEJOS
Se subdividen en tres grandes grupos: mucopolisacáridos, mucoproteínas y

mucolípidos.
2.1. Mucopolisacáridos
Los mucopolisacáridos pueden dividirse en dos grupos:
MUCOPOLISACARIDOS NEUTROS
Constituidos por un azúcar (generalmente galactosa) y acetilglucosamina,
que con frecuencia se hallan unidos a una proteína formando glucoproteínas o
mucoproteínas. Estas sustancias son PAS positivas y, por lo anteriormente ex-
puesto, se comportan de manera semejante a las mucoproteínas.
MUCOPOLISACARIDOS ACIDOS
Por hidrólisis originan siempre, además de monosacáridos, hexosaminas
(glúcidos aminados), a veces ácido urónico (monosacárido con un grupo car-
boxílico en posición 6: ácido glucurónico, ácido galacturónico, etc.) y casi
siempre ácido sulfúrico o fosfórico. El mucopolisacárido ácido más simple es el
ácido hialurónico (fig. 13.1 ), que consta de unidades de disacárido polimeriza-
das (ácido D-glucurónico y N-acetilglucosamina).
Los mucopolisacáridos ácidos (MPA) se clasifican, a su vez, en : a) MPA
sencillos, carboximucopolisacáridos o mucopolisacáridos no sulfata-
dos, y b) MPA complejos o sulfatados (sulfomucopolisacáridos).
a) Mucopolisacáridos ácidos no sulfatados

(carboximucopolisacáridos)
Entre ellos deben diferenciarse:
- Carboximucopolisacáridos epiteliales o sialomucinas, ricas en ácido siálico
como radical en combinación con los grupos carboxílicos propios. Casi
HISTOQUIMICA DE HIDRATOS DE CARBONO O GLUCIDOS 227
--------0 o
0 -----._
H OH
n
Figura 13.1. Fórmula del ácido hialurónico.
todas ellas son lábiles frente a la neuraminidasa y resistentes a la acción de

la hialuronidasa . Además son PAS positivas, reaccionan con el azul alcián
a pH 2 .5, se tiñen con el método del hierro colo idal y son metacromáticas
frente al azul de toluidina.
- Carboximucopolisacáridos conjuntivos, ricos en ácido hexurónico y que
pueden contener ácido siálico. Por su elevada proporción de ácido hialu -
rónico son lábiles frente a la hialuronidasa. Todos ellos son PAS negati -
vos, reaccionan frente al azul alcián a pH 2.5, se colorean con el método
del hierro coloidal y son metacromáticos frente al azul de toluidina.
b) Mucopolisacáridos ácidos sulfatados (sulfomucopolisacáridos)

Al igual que los carboximucopolisacáridos, pueden dividirse en : a) epitelia-
les (sulfomucinas epiteliales), y b) conjuntivos.
- Mucopolisacáridos ácidos sulfatados epiteliales. Contienen ésteres sulfa -
tados y son resistentes a la acción de la hialuronidasa. Se localizan en las
glándulas salivares submandibulares y en las células caliciformes del colon.
Este grupo de sulfomucopolisacáridos es por lo general PAS negativo,
reacciona frente al azul -alcián a pH 1, se tiñe con la fucsina-aldehído y es
metacromático frente al azul de toluidina .
- Mucopolisacáridos ácidos sulfatados conjuntivos. Contienen ácidos glu-
curónicos sulfatados como el coñdroitín -sulfato: heparín -sulfato y quera-
tosulfato. Los ricos en condroitín - sulfato son lábiles frente a la hialuron i-
dasa, mientras que los que no lo contienen resisten su acción.
Este grupo de mucopolisacáridos es el que posee ·un mayor carácter
ácido así como la más elevada proporción de radicales sulfatos, localizán -
dose electivamente en el tejido cartilaginoso, válvulas cardíacas, aorta y
piel. En general, son PAS negativos, reaccionan con el azul alcián a pH
0 .5, se colorean con el hierro coloidal y fucsina aldehído y son meta -
cromáticos frente al azul de toluidina .
e) ... Distinción entre sulfomucopolisacáridos

y carboximucopolisacáridos
Puede realizarse genéricamente por metilación y saponificación .

La metilación consiste en bloquear los grupos ácidos sulfatados y carboxila -
dos por desulfatación y esterificación, respectivamente, con la correspondiente
pérdida de la tinción del azul alcián .
La saponificación deshace la esterificación en los carboximucopolisacáridos
restaurando la coloración con azul alcián, mientras que los sulfomucopolisacári-

dos no se colorean .
2.2. Mucoproteínas
Son complejos de proteínas y polisacáridos en los que predomina el primer

componente. Son similares a las glucoproteínas, pero se diferencian en su mayor
contenido de hexosamina (superior al 4 por 1 00) .
Este tipo de sustancias, que suelen asociarse, pueden ser halladas en células
beta de la hipófisis, membranas basales, reticulina y fibras de colágena. Todas
ellas son PAS positivas y no experimentan metacromasia frente al azul de tolui-
dina .
2.3. Mucolípidos
Son una mezcla de pol isacáridos y ácidos grasos complejos que se encuen-
tran normalmente en forma de cerebrósidos y gangliósidos. Suelen ser PAS
positivos y se tiñen selectivamente con ciertas coloraciones para grasas.
3. REACCIONES HISTOQUIMICAS BASADAS EN lA

DEMOSTRACION DE GRUPOS CARBONilO FORMADOS SOBRE
lOS HIDRATOS DE CARBONO POR OXIDACION PREVIA:
TECNICAS DEl PAS Y DE lA PlATA METENAMINA
3.1. Reacción de PAS (Periodic Acid Schiff)
Es la reacción más comúnmente utilizada en histoquímica debido a que:

a) Es de amplia aplicación en el diagnóstico histopatológico rutinario.
b) Puede colorear numerosos componentes bioquímicos (hidratos de car-
bono o sustancias relacionadas con ellos).
e) Siendo una reacc ión poco específica, puede convertirse en enorme -
mente selectiva mediante los correspondientes controles.
Esta técnica fue descubierta, de forma independiente y prácticamente simul-
tánea, por Hotchkiss, McManus y lillie (1948) .
FUNDAMENTO DE lA REACCION DEl PAS

Consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido periódico para incrementar el
número de grupos carbonilos (aldehídos o cetonas) presentes en ellos, de forma
que puedan ser demostrados posteriormente mediante el reactivo de Schiff.
Los hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente aislados,
en una proporción aproximada de uno por molécula de monosacárido. Precisa-
mente por ello es necesario oxidarlos con el fin de incrementar dichos grupos,
que sólo pueden ser detectados por el reactivo de Schiff si se encuentran
situados en carbonos contiguos y delimitados por grupos alcohólicos o amino.
Para los grupos aldehídos que aparecen en posición 1 ,2 glicol estas condiciones
se cumplen exclusivamente tras la oxidación de los correspondientes radicales
hidroxilo.
El agente oxidante es generalmente el ácido periódico, aunque en alguna
variante puede utilizarse el ácido crómico.
Reactivo de Schiff
Se obtiene a partir de la fucsina básica, la cual es tratada con ácido sulfuroso,
que hace desaparecer un doble enlace existente en el centro de la molécula,
transformándose en una sustancia incolora -ácido sulfofucsínico o reactivo de
Schiff- (fig . 13.2) .
O OH O
"\.\/ H O
H N~S»~-S/' oH
2
1 J
_.¿::;. _.¿::;.
e
Q NH 2
Figura 13.2. Fórmula del reactivo de Schiff.
Cuando el reactivo de Schiff reacciona con dos grupos aldehídicos contiguos

flanqueados por los correspondientes radicales OH, aparece de nuevo el doble
enlace (grupo cromóforo) y, con él , la coloración rojo fucsia característica .
Mediante estudios de espectrofotometría se ha podido concluir que, para un
correcto desarrollo de la reacción, es necesario que ambos grupos aldehídos se
encuentren a una distancia cifrada entre 1 y 1.1 nm, similar a la que separa a los
dos radicales bencénicos de la fucsina .
Fijación: formol tamponado al 1 O por 100, liquido de Carnoy o líquido de Bouin.
Soluciones:
a) Acido periódico al 0.5 por 100.
b) Reactivo de Schiff:
Puede adquirirse comercialmente o fabricarse según el siguiente procedimiento:
- Fucsina básica (C. l. 42 51 O) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1g
-Agua destilada .. . .... . . .. . . ... . ·.... ... .. . ..... . .. 200 ml
Llevar hasta ebullición el agua destilada y añadir la fucsina . Disolver y enfriar

a 50 oc, filtrar y añadir:
- Metabisulfato sódico anhidro .. ... ... . . .... . . . . ... . 19
- Acido clorhídrico 1 N .... . . . . . . ..... . ............ . 20 ml
Dejar en reposo 24 horas (la solución debe tomar un color rosa pálido) y filtrar
a través de carbón activado, lo cual debe decolorarla.
Almacenar en refrigerador.
e) Baño de ácido sulfuroso:
- Acido clorhídrico 1 N ........ .. . . .. . . . ... . . . ..... . 5 ml
- Metabisulfito sódico al 1O por 100 ..... . ... ... ...... . 6 ml
-Agua destilada . . .. ... .. ... .. . . . .. ...... .. . . . . . . . . 100 ml
d) Hematoxilina de Harris.
Modo de operar:
1. Desparafinar e hidratar,
2. Acido peryódico al 0.5 por 100, 5 minutos.
3. Lavado en agua destilada.
4. Reactivo de Schiff, 15 a 30 minutos.
5. Aclarar en tres cambios de baño sulfuroso, 2 minutos en cada uno.
7. Hematoxilina de Harris, 30 a 60 segundos.
Resultados
-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul
-Material PAS positivo . . . . . . . . . . Rojo oscuro a magenta (fucsina)
COMPUESTOS PAS ( + )
1. Polisacáridos simples: glucógeno, celulosa, etc.
2. Mucopolisacáridos neutros (fig . 13.3, véase páginas en color) : pre-
sentes sobre todo en glándulas de Brunner del duodeno, epitelio gástrico
y cápsulas bacterianas.
3. Mucoproteínas, que incluyen: ciertas mucinas del tubo digestivo y del
árbol respiratorio o bronquial, tiroglobulina, hormona TSH , gonadotrofi-
nas, cuerpos de Russell de las células plasmáticas y megacariocitos.
4. Glucoproteínas del suero, membrana basal (fig. 13.4, véase pági -
nas en color) y fibras de reticulina.
5. Glucolípidos como gangliósidos y cerebrósidos.
6. Determinados pigmentos, como pigmento ceroide y ciertas lipofuc-
sinas.
COMPUESTOS PAS ( - )QUE, SIN EMBARGO, SON HIDRATOS

DE CARBONO
Mucopolisacáridos ácidos: que tienen bloqueados los enlaces 1 y 2 glicol
por grupos -S0 3 H o -COOH y no pueden ser oxidados por el ácido periódico.
HISTOOUIMICA DE HIDRATOS DE CARBONO O GLUCIDOS 231
COLORACIONES DE CONTRASTE
Son diversas:
1. Si se espera un resultado débilmente positivo de la técnica, se utilizará
un contraste citoplásmico con amarillo de Marso bien el simple con-
traste nuclear con hematoxilina de Harris.
2. Si se espera un resultado fuertemente positivo, podrá colorearse con
azul de toluidina, picrocarmín de índigo o verde de metilo.
CONTROLES DE LA TECNICA DEL PAS

Como puede comprobarse en los resultados de la técnica del PAS, su especi-
ficidad es relativa y, por tanto, es imprescindible realizar preparaciones testigo o
de control que confirmen los resultados obtenidos. Para ello suelen ser muy
útiles las técnicas de bloqueo, tales como la del bloqueo de grupos aldehídos en
general y la de acetilación específica para grupos 1 -2 glicol.
a) Técnica de bloqueo para grupos aldehídos en general

Se realiza tratando los grupos aldehídos presentes en el tejido, tras la oxida-
ción con ácido peryódico, con una solución al 5 por 1 00 de ácido acético
saturado con dimedona (5,5'dimetil-1 ,3-ciclohexadona) entre 1 y 16 horas a
60 °C, para seguir con lavado de la preparación con agua destilada y continuar
con el PAS normal. Unicamente se teñirá el material PAS positivo formado a
expensas de grupos aldehídos situados en posición 1 -2 glicol.
b) Técnica de bloqueo mediante acetilación para grupos 1,2 glicol

Se fundamenta en la negatividad de la reacción del PAS después de la
acetilación de los grupos 1 ,2 glicol presentes en los hidratos de carbono. Este
proceso es total o parcialmente reversible por saponificación ulterior mediante
tratamiento con hidróxido potásico.
Si no se ha realizado el bloqueo de los grupo aldehídos preexistentes como
habitualmente ocurre en la práctica diaria, el primer prdblema que se plantea en
esta técnica es la posibilidad de reacciones falsamente positivas debidas a la
existencia de dichos grupos.
En tal caso debe realizarse un control no oxidando el tejido; todo lo colore-
do en esta preparación no serán enlaces 1 ,2 glicol oxidados, sino grupos aldehí-
dos que ya estaban presentes antes de la oxidación. Después se realiza un PAS
oxidando y se comparan los resultados de ambas preparaciones.
El segundo problema en la técnica del PAS se plantea cuando se trata de
diferenciar si los grupos aldehídos aparecidos tras la oxidación lo han hecho
sobre grupos alcohólicos situados en posición 1 ,2 glicol o si los oxidados han
sido .,g rupos hidroxiamino primarios, hidroxiamino secundarios e incluso hidroxi-
cetonas no presentes habitualmente en los hidratos de carbono que son PAS
positivos. Esta distinción puede realizarse mediante acetilación reversible y sa-
ponificación .
o
11
Acetilar es introducir un radical acetilo CH 3-C-C- en un compuesto orgá-
nico. El anhídrido acético es un reactivo que tiene gran aplicación para acetilar,
de forma que con este reactivo se bloquean todos los grupos alcohólicos en
general existentes en el tej ido.
o o o o
/ / / /
CH 3-C- 0 - C- CH 3 +
ROH -----+
CH 3- C-OR +
CH 3-C-OH
anídrido acético alcohol éster ácido acético
La reacción se lleva a cabo frecuentemente en piridina, por lo que la mezcla

más usada para acetilación contiene ambas sustancias (anhídrido acético y
piridina anhidra) .
Saponificar es romper un enlace de tipo éster de forma que en condiciones
idóneas reaparezca el grupo químico que existía antes de la acetilación .
De lo expuesto se deduce que la acetilación es totalmente reversible tras
saponificación para los grupos alcohólicos en posición 1,2 glicol, totalmente
irreversible para los grupos hidroxiamino secundarios y moderadamente reversi -
bles para los hidroxiamino primarios.
ACETI LACIO N -SAPO N 1FICACION
Soluciones:
1. Mezcla para la acetilación:
- Anhidrido acético . . . . .. . ..... . . . . .. . . . . .. . ... ... . 13 ml
- Piridina anhidra .. . .. . ... .. . .... .. . . ....... . . . . ·. . . 20 ml
2. Mezcla para la saponificación:
- Hidróxido potásico 1 N en solución acuosa o en alcohol de 80°, o bien:
-Alcohol de 95° . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 ml
-Amoniaco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 ml
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 O ml
Modo de operar:
a) Acetilación:
1. Desparafinar, introducir los cortes en alcohol absoluto, secarlos y pasarlos
a la piridina.
2. Tratar con la mezcla de acetilación, a 37 6 58 °C, durante un tiempo que
depende del material biológico (30 minutos a 24 horas).
3. Pasar los cortes a la piridina; después, al alcohol absoluto.
4. Hidratar.
b) Acetilación + saponificación:
1 a 4. Igual que en el caso anterior.
5. Tratar con la mezcla de saponificación: 45 minutos para la potasa 0.1 N, o

24 horas a 37 oc para la mezcla amoniacal.
6. Enjuagar en agua en el caso de la potasa, o bien con alcohol y luego con
agua en el caso de la mezcla amoniacal.
Lotes de preparaciones y resultados en los controles de la técnica del

PAS
1. Preparación en la que se realiza un PAS normal.
2. Preparación en la que se hace un PAS sin oxidar para detección de grupos
aldehídos preexistentes o un método de bloqueo especifico para dichos
grupos.
3. Un lote de cortes que lleva sólo acetilación (negatividad de los compuestos
PAS [ + )) .
4. Un lote de cortes que lleva acetilación más saponificación.
Resultados:
Al acetilar desaparecen todos los grupos PAS ( + )menos los aldehídos preexis-
tentes.
Al acetilar y saponificar, los grupos alcohólicos en posición 1,2 glicol quedan
como estaban (recuperan la PAS positividad), los hidroxiamino primarios reapa-
recen mucho más débilmente y los secundarios permanecen bloqueados al ser su
acetilación irreversible.
3.2. Técnica de la plata metenamina
Radica en la reducción que sobre las sales complejas de plata realizan los
radicales carbonilo formados por oxidación previa de los hidratos de carbono, de
forma que la plata metálica obtenida precipita sobre las estructuras que se van a
teñir.
Como agentes oxidantes se emplean el ácido crómico y el ácido peryódico
que, como es sabido, oxidan exclusivamente los enlaces 1 ,2 glicol y similares.
La sal de plata para reducir es el complejo metenamina argéntica, que es
inestable y sólo se mantiene como tal a pH alcalino entre 8.3 y 9 .2; fuera
de éste se disocia en sus dos componentes: hexametileno tetramina e iones de
plata .
Por todo ello, la técnica debe realizarse con un control continuo de
pH, de modo que la precipitación de la plata métalica no ocurra anti-
cipadamente.
Por sus características especiales, está técnica se emplea para visualizar
membranas basales, sobre todo en el riñón (glomerulonefritis) , compuestas en
g ran.~ medida por hidratos de carbono del tipo glucoproteínas y que, por tanto,
son además PAS positivas.
3.3. Método de Gomori modificado
Fijación: formol tamponado al 1O por 1 OO.
Soluciones:
1. Acido peryódico del 0.5 al1 por 100 en agua destilada.
2. Solución de plata metenamina (fórmula de Gomori):
a) Hexametileno-tetramina al 3 por 100 en agua destilada.
b) Nitrato de plata al 5 por 100 en agua destilada.
e) Borato de sodio al 5 por 100 en agua destilada.
-Solución concentrada de plata metenamina:
-Solución A ... . . . . . .... ... . .... . . .. . .. . . . . .. . 100.0 mL
-Solución 8 ..... . . . . . ...... . ... . .... . .. . .... . 5 mL
-Solución C .. . . . . . .. . . . .. .. . ....... . .. . . . . .. . 1.5 mL
Esta solución debe prepararse en este orden para evitar la formación
de precipitados. Cuando se mezcla la solución A con la 8 se forma un
precipitado que desaparece fácilmente por agitación.
-Solución diluida o de trabajo de plata metenamina:
-Solución concentrada . .. . ........... . ....... . . . 25 mL
-Agua destilada . ..... . .. . .. . . . ....... .. .... . .. . 25 mL
El pH de la solución debe ser alcalino, de 8.5 aproximadamente.
4. Cloruro de oro al 0.2 por 100 en agua destilada.
5. Tiosulfato sódico al 2 por 100 en agua destilada.
Modo de operar:
1. Desparafinar e hidratar los cortes hasta el agua destilada.
2. Oxidar con ácido peryódico durante 20 minutos.
3. Lavar con agua destilada, tres baños consecutivos de 2 minutos cada uno.
4. Incubar en la solución diluida de plata metenamina, durante 2 horas a
60 oc. hasta que los cortes tengan un color pardo amarillento. Se deben
controlar al microscopio los cortes cada 15 minutos pasada la primera
media hora de incubación.
5. Lavar con agua destilada, tres baños consecutivos de 2 minutos cada uno.
6. Tratar los cortes con cloruro de oro de 20 segundos a 1 minuto.
8. Fijar con tiosulfato sódico de 3 a 5 minutos.
1O. Realizar contraste nuclear.
Resultados:
- Glucógeno, mucinas . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
-Hongos . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
-Membranas basales (fig. 13.5) .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
-Fibras de reticulina y elásticas ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
Figura 13.5. Identificación de membranas basales a nivel tubular y en

capilares glomerulares renales mediante la técnica de plata metenamina
( X1 Ü).
4. TECNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACARIDOS ACIDOS
Los mucopolisacáridos ácidos (MPSA) son una variante de polisacáridos

que no contienen grupos alcohólicos en posición 1,2 glicol, sino grupos ácidos
carboxílicos o sulfatados. Este hecho los diferencia de los mucopolisacáridos
neutros (MPSN) con grupos hidroxilo en posición 1,2 glicol y que, por consi-
guiente, son PAS (+) .
REACCIONES GENERALES PARA DETERMINAR MPS ACIDOS

Son principalmente tres:
a) Técnica del hidrato de hierro coloidal de Hale.
b) Técnica de azul alcián.
e) Reacción metacromática.
4 .1. Técnica del hidrato de hierro coloidal de Hale
Es una técnica histoquímica introducida por Hale en 1946. En su primera

parte, específica de esta técnica, se liga el hierro férrico a los mucopolisacáridos
ácidos mediante un mecanismo de atracción electrostática. La segunda parte,
histoquímica, consiste en la realización sucesiva de la técnica del azul de Perls
para el revelado de los depósitos férricos.
El reactivo principal de la técnica es el hidrato de hierro coloidal , que puede
adquirirse en el comercio o ser preparado en el laboratorio a partir de solución de
cloruro férrico al 29 por 1OO.
Este reactivo es un coloide rico en moléculas de agua ligada que hidratan a
los iones férricos (Fe +++ ) en virtud del carácter ligeramente di polar de la
primera .
Durante el paso inicial del procedimiento técnico se produce una atracción

electrostática entre las cargas positivas de la superficie de las micelas del hidrato
de hierro coloidal y las cargas negativas presentes en los M PS ácidos, con lo
que se establece una unión de carácter físico-químico entre ambas. Una vez
producida la reacción físico-química, se realiza la determinación histoquímica
específica del hierro férrico por medio de la técnica del azul de Perls. Dicha
técnica , de la cual nos ocuparemos en el capítulo 15, se basa en la reacción
específica que realizan el ferrocianuro potásico y los iones férricos en preseAcia
de ácido clorhídrico para originar moléculas de ferrocianuro férrico coloreado o
azul de Prusia .
TECNICA DE HIERRO c;oLOIDAL

MODIFICADA POR MOWRYS
Fijación: formol tamponado al 1O por 1OO. Deben evitarse los fijadores con
bicromato.
Soluciones:
a) Hidrato de hierro acético:
-Solución stock
• Agua destiiada en ebullición . . .. . .. . .......... . .. . 250 mi
• Solución acuosa de cloruro férrico al 29 por. 1 00 .. . .. . 4.4 mi
(La solución debe adoptar una coloración rojo cereza).
- Solución de trabajo:
• Solución stock ... ..... .. ... . ... ... ... ..... ... . . 20 mi
• Acido acético ..... .. . . .............. ..... . . .. . . 5 mi
• Agua destilada . ........... ... .... . ...... .. . .. . . 15 mi
b) Ferrocianuro clorhídrico:
- Ferrocianuro potásico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 por 100.
- Acido clorhídrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 por 1 00
Mezclar justo antes de su empleo a partes iguales.
Modo de operar:
2. Enjuagar rápidamente durante 30 segundos en ácido acético al 12 por 1OO .
3. Tratar durante 1 hora con la solución de hidrato de hierro acético.
4. Lavar en cuatro baños de ácido acético al 12 por 100, de 3 minutos de
duración cada uno.
5. Tratar las secciones con ferrocianuro clorhídrico, durante 20 minutos.
7 . Coloración de contraste (de forma opcional) .
Resultados:
Los mucopolisacáridos ácidos se colorean de azul (fig. 13.6, véase páginas en
color) .
Coloraciones de contraste
Es preciso evitar las lacas que se fijan sobre determinadas mucinas, como el
hemalumbre o el carmín de alumbre, así como ciertos colorantes azules como el
azul de anilina .
El método más sencillo consiste en colorear los núcleos con rojo nu-
clear sólido, seguido o no de picrocarmín de índigo; puede realizarse también
un tricrómico en un solo tiempo.
Controles
Como la existencia previa en los tejidos de depósitos de hierro férrico (por
ejemplo, hemosiderina) puede produc ir falsos positivos, es imprescindible reali-
zar secciones dobles, coloreando una de ellas exclusivamente con la técnica
del azÚI de Perls. Así, todo lo que en ella aparezca teñido de azul corresponde-
rá a depósitos férricos que existían previamente en el tejido, y no a M PSA.
Crítica de la técnica de Hale

Esta técnica proporciona imágenes limpias y precisas, en gran parte debido al
lavado que sigue al tratamiento con el hidrato de hierro, pero pueden aparecer
en ella imágenes falsamente positivas .
También tienen afinidad para los metales coloidales y sus hidratos
algunos compuestos distintos a los mucopolisacáridos e, inversamente, pueden
no ser detectados mucopolisacáridos de molécula relativamente sen-
cilla, como el ácido hialurón ico.
Por todo ello, no tiene una verdadera significación histoquímica y sus resul-
tados deben ser confirmados mediante otros métodos.
4 .2. Técnica del azul alcián para M PSA
El azul alcián , al igual que el resto de los colorantes alciánicos, es un com-

puesto químico derivado del grupo de las ftaloc ianinas o, lo que es igual,
moléculas que tienen un átomo de cobre central en torno al cual se disponen,
rodeándolo, cuatro anillos aromáticos nitrogenados.
En general, todas estas sustancias son básicas y se ligan a los grupos ácidos
de los M PS dando lugar a la formación de un compuesto salino entre ambos,
principalmente cuando el nivel del pH es suficientemente ácido.
En relación con este fenómeno se ha comprobado que, utilizado en condicio-
nes de pH en torno a 2.4-2 .6, el azul alcián no sólo colorea los mucopolisacári -
dos ácidos sulfatados sino también, y singularmente, los grupos carboxílicos de
los ácidos urón i co~ . Si por el contrar io se emplea a un pH muy bajo (en torno a
1 ), los grupos sulfatados siguen siendo fácilmente ionizables, mientras que los
MPSA no sulfatados pierden esta capacidad, de forma que únicamente se colo -
rean los primeros.
Si se sigue disminuyendo el valor del pH hasta alcanzar 0.5, se incrementa la
selectividad de la coloración : en este caso sólo siguen tiñéndose los MPSA
sulfatados más fuertemente, y por ello, dotados de mayor capacidad de ioniza-
ción .
Fijación: formalina tamponada al 1O por 1 OO.
Soluciones:
a) Azul alcián a pH 2.5:
-Azul alcián (C. l. 74 240) . ...... . . . .. . . ..... . . . .... . 1 g
- Acido acético al 3 por 100 ... .. .. .. ...... . .. . . . . . . . 100 ml
b) Azul alcián a pH 1:
-Azul alcián . . . . . .. . . . . .. ... .. ... .. ..... . . . . . . . .. . 1 g
- Acido clorhldrico 0.1 N . .. . . . ... . . . . .. .. . . . . . . . .. . . 100 ml
e) Azul alcián a pH 0 .5:
-Azul alcián . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1g
- Acido clorhldrico 0.5 N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 00 ml
Filtrar antes de usar. Las soluciones son estables durante 2 semanas apro-
ximadamente.
d) Solución de rojo nuclear al 1 por 100
Modo de operar:
2. Solución deseada de azul alcián durante 30 minutos.
3. Si se utilizó la solución a pH 2.5, lavar en agua destilada. Si por el contrario
se empleó cualquiera de las otras dos, secar simplemente con papel de
filtro.
4. Contrastar si se desea con rojo nuclear.
5. Deshidratar rápidamente, aclarar y montar.

-Azul alcián a pH 2.5 . Mayor parte de MPSA . . . . . .. Azul
-Azul alcián a pH 1 . . MPSA sulfatados . . . . . . . . . . . Azul
-Azul alcián a pH 0.5 . MPSA fuertemente sulfatados . Azul
4 .3 . Reacción metacromática
Como ya se ha señalado, el término metacromasia indica un cambio de color

Cuando un colorante químicamente puro tiñe selectivamente una estructure
tisular de color diferente al de la solución diluida de colorante, se dice que he
ocurrido una reacción metacromática. La estructura responsable del cambie
recibe el nombre de cromotropa, para distinguirla de las restantes que se colo ·
rean normalmente (ortocromáticas).
Los colorantes metacromáticos, muy numerosos, son casi todos de carácte
básico. Deben ser mencionados por su importancia el azul de toluidina, e
azur A, el azul de metileno y la tionina.
Para explicar adecuadamente el fenómeno de la metacromasia, convien1
destacar algunas de las peculiares propiedades que muestran estos colorantes er
disolución. Cuando el disolvente no es agua sino alcohol, acetona, etc., todos

ellos poseen un tinte constante y se comportan como ortocromáticos; pero en
solución acuosa, la coloración de la solución se torna variable en función de la
temperatura y la concentración. En soluciones muy diluidas o a temperatura
elevada, los colorantes se comportan como ortocromáticos; en soluciones más
concentradas, como metacromáticos. Estos hechos demuestran que el paso de la
forma ortocromática de un colorante a la metacromática (variación en la absor-
ción de determinadas longitudes de onda de la luz blanca) puede ser provocado
por pequeños factores, entre lo cuales figura la unión de determinadas sustan-
cias a través de mecanismos de atracción electrostática .
SIGNIFICACION HISTOQUIMICA DE LA METACROMASIA

Puede afirmarse que la metacromasia está ligada esencialmente a la presen -
cia de cargas electronegativas dispuestas con un determinado patrón de densi-
dad en la superficie de las estructuras cromotropas. La distancia mínima entre
éstas debe ser de 0.5 nm.
La orientación de las moléculas de colorante ejerce también cierta influencia,
ya que al alinearse sobr.e la superficie electronegativa del cromotropo se consti -
tuirán entre ellas nuevos enlaces a través de fuerzas de Van der Waals y puentes
de hidrógeno que darían origen a la polimerización del colorante metacromático
y a un aumento de su concentración local.
Por otra parte, la metacromasia resulta influida de forma variable por la
presencia de sales y proteínas, de manera que las primeras tienden a inhibir el
fenómeno por un mecanismo de competición entre el propio colorante básico y
el catión salino sobre los grupos aniónicos del cromotropo.
Un fenómeno semejante puede observarse con las proteínas básicas, aunque
en este caso la mayor o menor inhibición está ligada a las modificaciones del pH
del medio en que se realiza la co loración . Para evitarlo, se ha propuesto el
tratamiento previo de los cortes con enzimas proteolíticas (pepsina, tripsina ,
colagenasa, etc.), que actuarían en ciertos casos desenmascarando la meta-
cromasia de algunos componentes cromotropos de los tejidos.
SUSTANCIAS CROMOTROPAS
Pertenecen en general a alguno de los siguientes tipos:
1. Mucopolisacáridos ácidos.
2. Acidos nucleicos.
3. Lípidos de carácter ácido.
4 . Partículas de sílice.
Todas ellas poseen o bien grupos amon1cos sulfatados, que son los más
fu~~temente metacromáticos, o grupos semejantes de naturaleza carboxílica o
fosfatada .
GENERALIDADES SOBRE TECNICAS HISTOOUIMICAS

DE METACROMASIA
Teniendo en cuenta las grandes variaciones que experimenta el fenómeno
metacromático ante las más pequeñas modificaciones del medio donde se pro -
duce, no es de extrañar que la metacromasia sea de interpretación difícil e

incluso que proporcione resultados contradictorios. Entre los numerosos facto -
res de técnica histológica convencional susceptibles de influir sobre la meta-
cromasia merecen destacarse:
...
1. Fijación
Es un importante factor de influencia. Los cortes de tejido congelado o fijado
por liofilización son los que menores problemas de interpretación ofrecen . En el
caso de los MPSA pueden emplearse tejidos fijados en alcohol. Bouin alcohóli-
co o incluso en formol , y deben evitarse los fijados en agentes oxidantes.
2. Colorantes
Los más utilizados son el azul de toluidina y el azur A habitualmente en
concentraciones en torno al 0 .1 por 1 OO. Es preferible utilizar soluciones aún
más diluidas para colorear estructuras fuertemente metacromáticas (mastocitos,
sustancia fundamental del cartílago). y más concentradas para las débilmente
cromotropas (sustancia fundamental del tejido conjuntivo) .
3. Disolventes y pH de la disolución
Como disolvente se suele emplear agua destilada o alcohol etílico al 30 por
100, aunque Lison recomienda una solución tampón . El pH de la disolución
puede variar de 0 .5 a 7, lo que tiene gran interés en especial para la caracteriza -
ción de los distintos tipos de M PSA.
4. Montaje de las preparaciones
Si se considera que las características de los colorantes metacromáticos
varían en función del disolvente utilizado, se comprenderá fácilmente que la
deshidratación alcohólica modificará los resultados de la reacción. Por ello es
imprescindible contrastar la observación de cortes montados convencionalmente
y montados en medio acuoso. Así :
a) Una metacromasia en medio acuoso significa :

-Si es intensa (gamma-metacromasia), presencia de ésteres sulfatadm
u otros grupos ácidos.
-Si es débil (beta-metacromasia), presencia de grupos fosfato o gru ·
pos carboxílicos en concentración elevada .
b) Una metacromasia resistente a la deshidratación etílica indica:
-Si es intensa (gamma-metacromasia), presencia de ésteres sulfatados
aunque algunos pueden ser eliminados por el alcohol.
-Si es débil (beta-metacromasia), presencia exclusiva de nucleoproteí ·
nas.
TECNICA DEL AZUL DE TOLUIDINA
Fijación: puede aplicarse todo lo mencionado anteriormente al respecto.
Soluciones:
1. Tampón acetato acético a pH 4.2:
-Solución A:
• Acetato de sodio . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . 2. 7 g
• Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 mL
-Solución 8 :
• Acido acético 0.5 M . . . . ... .. . .... . . . . ... . ... . 1.1 mL
•Agua destilada .... ....... .. . ...... .. . ... . .. . 100 mL
-Mezclar:
• Solución A (pH 4.2) .. . . . ... . .. . .. ......... .. . 30 mL
• Solución 8 .. .. . . . .. . . . . . . . .... .. . .. .. .. . .. . 90 mL
2. Solución al 0.2 por 100 de azul de toluidina en tampón a pH 4.2.
3. Solución acuosa al4 por 100 de molibdato de amonio.
Modo de operar:
2. Colorear con azul de toluidina 2-5 minutos.
3. Lavar con tampón acetato acético a pH 4.2
4. Tratar los cortes durante 1O minutos con molibdato.

-Elementos de carllcter metacromlltico . . . . . . . . . . De rojo a púrpura
-Fondos y núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azules
CONTROLES GENERALES EN LA REACCION METACROMATICA

Como ya se ha mencionado, el primer problema que se plantea es que los
baños en alcohol etílico inhiben la metacromasia .
Deben realizarse, pues, preparaciones testigo:
1. Una.preparación se observa tras su paso por el agua acética antes de fijar
la coloración con molibdato, y que tiene por objeto evaluar el efecto
metacromático inmediato en fase inestable. A continuación se sigue el
procesamiento normal.
2. Otra preparación no se deshidrata y se monta en medio acuoso para
evitar el paso por alcohol etílico (medio de Von Apathy).
3. La última preparación se confecciona normalmente, es decir, deshidra-
tando y montando según el método habitual (bálsamo).
Comparando las tres preparaciones se puede seguir la evolución del efecto

metacromático y la influencia del procesamiento histológico realizado sobre
ellas. Normalmente la intensidad de la coloración irá disminuyendo, siendo
menor la del último (deshidratado), en el cual deberá anotarse el porcentaje de
pérdida de color inducida por el alcohol etílico. ..
El problema señalado puede solventarse a través de las modificaciones pro-
puestas por Lison en el procesamiento final de los cortes. La primera de ellas
consiste en emplear como deshidratante alcohol butílico terciario en lugar de
alcohol etílico, seguido de aclarado en tolueno y montaje en bálsamo: con ello
se evita un 80 por 1 00 del problema .
El inconveniente de esta técnica reside en el manejo del alcohol butílico
terciario que es muy inflamable, y a temperatura ambiente cristaliza y solidifica
por lo que debe ser calentado a 37 oc.
El segundo procedimiento propuesto por Lison estriba en no desparafinar ni
secar los cortes a temperaturas superiores a 40 oc. Una vez secos, los portaobje-
tos se tiñen sin desparafinar con azul de toluidina, entre 1 y 24 horas, y se dejan
secar al aire; luego se desparafinan con tolueno y se montan en bálsamo, lo que
elimina los inconvenientes del alcohol butílico terciario.
CONTROLES DE ESPECIFICIDAD EN LA REACCION METACROMATICA

Se utilizan esencialmente para distinguir entre los sulfomucopolisacáridos y
los carboximucopolisacáridos. Son principalmente de dos tipos:
1. Vacunación de pH:
Consiste en realizar la coloración en torno a pH 3.5, a cuyo valor la mayoría
de los carboximucopolisacáridos pierden su metacromasia, mientras que los
sulfomucopolisacáridos la conservan. De esta forma , se hacen dos lotes de
cortes; el primero se tiñe a pH 4 .5 y el segundo a pH 3.5. Los M PS que siguen
siendo metacromáticos en el lote segundo corresponden a sulfomucopolisacári-
dos y los que pierden la metacromasia, a carboximucopolisacáridos.
2. Meti/ación reversible:
Consiste en tratar un grupo de cortes con una mezcla de alcohol metílico -,
ácido clorhídrico, con lo que se bloquean por metilación los grupos ácidos de
los MPS.
Después se realiza metilación seguida de saponificación en otro lote de
cortes, reapareciendo la metacromasia exclusivamente en los carboximucopoli -
sacáridos.
5. TECNICAS PARA DIFERENCIAR SULFOMUCOPOLISACARIDOS,

CARBOXIMUCOPOLISACARIDOS, MUCOPOLISACARIDOS
NEUTROS Y GLUCOPROTEINAS
5.1 . Técnicas derivadas de la reacción metacromática
Todas ellas se fundamentan en la realización de la técnica de metacro

masia en condiciones muy bien definidas de pH. Así, a pH 4 la técnica e
bastante específica para las sialomucinas y el ácido hialurónico (ambos so
MPSA carboxilados), aunque pueden surgir algunos falsos positivos derivados

de la presencia de grupos ácidos semejantes en citoplasmas celulares, colágena
y ciertos lípidos.
Entre valores de pH 2 y 3 se colorean algunas mucinas ácidas no sulfatadas
fuertemente disociadas, así como algunas sulfatadas con grupos so; parcial-
mente enmascarados.
A pH 1 .5 se colorean todos los M PSA sulfatados sin excepción y a pH 0.5,
sólo aquellos fuertemente sulfatados propios de la matriz cartilaginosa, los mas-
tecitos y células caliciformes superficiales del colon.
5.2. Técnicas derivadas de las ftalocianinas cúpricas
Además del azul alcián 8 GS, existen otros colorantes ftalocianínicos como el
verde alcián 3 BX, el amarillo alcián y el azul astral. que no sólo presentan
diferentes tonalidades, sino que muestran diferente grado de apeten~ia por las
distintas clases de MPSA. De todos ellos, los más utilizados son el azul alcián y
el amarillo alcián, porque el primero es selectivo de los MPSA sulfatados a pH
0.5 y el segundo lo es de los carboximucopolisacáridos a pH 2.5, lo que hace
posible una coloración diferencial entre ambos tipos empleando exclusivamente
colorantes de composición química semejante.
En esta técnica combinada los M PSA sulfatados se colorean de azul, los
MPSA carboxilados, de amarillo y las mezclas de ambos, en diversas tonalidades
de verde.
5.3. Asociación entre técnicas para la determinación de MPSA

y MPS neutros y glicoproteínas: técnica del azul alcián-PAS
Es quizá la técnica de diferenciación entre hidratos de carbono más empleada

en la práctica habitual, sobre todo por su posible asociación con la técnica más
compleja del azul-amarillo alcián.
Fijación: formalina al 1O por 100 tamponada.
Solucionas:
s) Solución de azul alcián a pH 2.5 (véase anteriormente).
b), Solución de ácido peryódico al 0.5 por 100.
e) Reactivo de Schiff (véase anteriormente).
d) Solución de ácido sulfuroso (véase anteriormente).
Modo de operar:
1. Aplicar una tinción de azul alciltn a pH 2.5 (véase anteriormente y a
continuación) .
20 Realizar la tinción del PASO
Resultados:
- Mucopolisacáridos ácidos o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o Azul
- Mucopolisacáridos neutros y glicoprotelnas (figo 1309, véase
páginas en color) o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o Rojo intenso
CAPITULO 14
Histoquímica de proteínas,
aminas biógenas y ácidos
nucleicos
GUION DE CONTENIDOS
1. FIJACION DE LAS PROTEINAS

2. APLICACION DE LOS METODOS DE DIGESTION
ENZIMATICA AL ESTUDIO HISTOQUIMICO DE LAS
PROTEINAS
2.1. Digestión enzimittica de las proteinas
3. METODOS HISTOQUIMICOS PARA LA COLORACION
DE PROTEINAS
3.1. Reacciones de grupo
3.2. Reacciones especificas para aminoitcidos particulares
4. METODOS PARA LA DETERMINACION DE ACIDOS
NUCLEICOS
~ 4.1. Procedimientos para extracción de itcidos nucleicos
4.2. Técnicas histoquimicas que permiten separar el ADN de
otras estructuras
4.3. Técnicas para la distinción entre ARN y ADN: método
del verde metilo pironina
5. METODOS PARA LA DETECCION DE AMINAS BIOGENAS
5.1 . Reacción cromafin
1. FIJACION DE LAS PROTEINAS
Como el estudio histoquímico de las proteínas suele realizarse sobre material

fijado e incluido en parafina, hay que ter.er en cuenta las modificac iones que
dichos métodos pueden determinar sobre las cadenas polipeptídicas.
Podría pensarse, por ello; que la fijación formólica está contraindicada a
causa de su acción reticularizadora sobre las cadenas polipeptídicas y bloquean-
te de numerosos grupos activos. Sin embargo, no ocurre así, ya que dichos
bloqueos suelen ser reversibles tras el tratamiento con alcoholes y líquidos
intermediarios en el proceso de inclusión, sobre todo cuando el tiempo de
fijación no se ha prolongado en exceso.
Por el contrario el alcohol etílico, que fija las proteínas por precipitación y
mantiene intacto su potencial químico, no es aconsejable porque conserva muy
pobremente la arquitectura t isular.
Los fijadores que contienen metales pesados como tetróxido de osmio, subli -
mado, etc., están igualmente contraindicados, pues bloquean numerosos gru-
pos químicos activos de las proteínas.
2. APLICACION DE LOS METODOS DE DIGESTION ENZIMATICA AL

ESTUDIO HISTOOUIMICO DE LAS PROTEINAS
Las proteasas son enzimas susceptibles de realizar, en condiciones adecua-

das, la degradación pcr vía hidrolítica de las moléculas proteicas a polipéptidos
más sencillos. Estos suelen presentar mayor proporción de rad icales químicos
libres que la molécula original, sobre todo teniendo en cuenta que la fijac ión
reticulariza las cadenas y enmascara total o parcialmente los grupos químicos
particulares de cada uno de los aminoácidos que constituyen la proteína.
El empleo de la digestión enzimática es, por tanto, de gran utilidad, pues
permite incrementar de forma notable la intensidad de la reacción de ciertos
grupos específicos de las proteínas, así como desenmascarar determinantes
antigénicos ocultos en tejidos fijados e incluidos en parafina.
Las principales proteasas utilizadas en histoquímica son :
-PEPSINA: es la enzima proteolítica del jugo gástrico, segregada por las
células principales de las glándulas fúndicas del estómago. Su pH de
actuación óptimo se sitúa entre 1 .5 y 2. Ataca a la mayor parte de las
proteínas, incluidas la elastina y la colágena, pero no a las queratinas y
protaminas.
-TRI PSI NA: es la proteasa característica del páncreas. Su pH óptimo de
actuación es 7 -8. Actúa sobre casi todas las proteínas, aunque su efecto
hidrolítico mejora si se encuentran previamente desnaturalizadas.
- PRONASA: es una proteasa aislada del «estreptomyces griseus», con un
espectro de actuación semejante al de la tripsina, a la cual sustituye con
ventaja en la mayor parte de los procedimientos técnicos.
HISTOQUIMICA DE PROTEINAS, AMINAS BIOGENAS YACIDOS NUCLEICOS 247
2.1. Digestión enzimática de las proteínas
TRIPSINA:
Como método general se recomienda incubar las secciones, una vez hidratadas,
a 37 oc de 5 a 20 minutos en una solución acuosa de tripsina al 0.1 por 100 (tipo
11 de Sigma) y cloruro cálcico al 0.1 por 100, ajustada a pH 7 .8 mediante hidróxi-
do sódico 1 M.
PEPSINA:
Incubar los cortes una vez hidratados en una solución de pepsina al 0.4 por
100 en tampón clorhidrico 0.01 M (pH = 2), a 37 oc. entre 15 y 100 minutos.
PRONASA:
Tratar las secciones antes de la tinción con solución de pronasa (tipo XXIV de
Sigma) en tampón fosfato 0 .1 M a pH 7.4 a 37 oc durante 15-120 minutos.
3. METODOS HISTOQUIMICOS PARA LA COLORACION

DE PROTEINAS
Desde la introducción de los métodos inmunohistoquímicos que permiten

caracterizar antigénicamente a la mayor parte de las proteínas, todos los méto -
dos de coloración puramente histoquímicos para proteínas han perdido vigenc ia.
Por ello, se exponen de forma muy resumida, haciendo énfasis en algunos
aspectos generales de interés histórico, sobre todo en lo que se refiere al desa-
rrollo de las técnicas de coloración que emplean sales de diazonio, hoy masiva -
mente empleadas para poner de manifiesto numerosas reacciones inmunoenzi -
máticas.
De forma genérica, las técnicas histoquímicas para colorear proteínas pueden
cl asif icarse en tres grupos:
a) Reacciones generales: pretenden colorear globalmente a las proteínas
presentes en un tejido, identificándolas como tales. En general t ienen una pro -
yección esencialmente bioquímica como ocurre en la clásica reacción de biuret,
en la cual el tratamiento de una disolución proteica con sulfato de cobre muy
dilu ido en medio básico (NaOH) , determina la aparición de un color rosa-malva
por formación de un complejo cupro-alcalino a nivel del enlace peptídico.
b) Reacciones de grupo: pretenden caracterizar no la molécula proteica
globalmente, sino un corto número de grupos reactivos específicos de dichas
sustancias. El ejemplo más característico por su trascendenc ia actual como base
de numerosos procedimientos histoenzimológicos e inmunoh istoquímicos es la
tetrazorreacción .
e) Reacciones específicas para grupos qu ímicos particu lares, propios de
determinados aminoácidos como grupos sulfhidrilo, fenal , indol , guanid il, etc.
Cada uno de ellos puede estar presente o ausente en una proteína concreta, por
lo que estas reacciones pueden ser utilizadas para investigar su composición

exacta .
3.1. Reacciones de grupo
Como se ha señalado, tratan de establecer la naturaleza proteica de una

determinada sustancia a partir de la demostración en ellas de ciertos grupos
químicos, que se encuentran de forma casi exclusiva en los polipéptidos. Las
reacciones más utilizadas son las de la ninhidrina-Schiff y tetrazorreacción.
REACCION DE LA NINHIDRINA-SCHIFF
Esta técnica se basa en un proceso de desaminación oxidativa de las cadenas
polipeptídicas provocado por la ninhidrina, por el cual los grupos aminos de las
cadenas son sustituidos por grupos carbonilos. Tras este proceso se realiza la
determinación de los carbonilos neoformados mediante el reactivo de Schiff. al
igual que en la técnica del PAS.
Fijación: alcohol o acetona . El formol tamponado y el fijador de Zenker también
pueden utilizarse, pero en tal caso la incubación con ninhidrina debe ser superior
a 20 horas. Secciones en congelación o parafina.
Soluciones:
a) Solución de ninhidrina:
- Ninhidrina (tricetoninhidrina hidrato) . .. .... . .. .. . . . . . 0.5 g
-Alcohol absoluto ....... . .. . . . ... ... ... .. .. . . . . . . . 100.0 mL
b) Reactivo de Schiff (véase reacción del PAS).
Modo de operar:
1. Desparafinar e hidratar las secciones.
2. Tratar los cortes con alcohol etílico al 70 por 1OO.
3. Incubar a 37 oc con la solución de ninhidrina entre 6 y 24 horas (habitual-
mente toda la noche).
4. Lavar bien las secciones en agua corriente .
5. Teñir con reactivo de Schiff, 30-45 minutos.
6. Contrastar con hematoxilina de Harris.
7. Lavar con agua corriente 1 O minutos.
Resultados:
- Grupos aminos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo-púrpura
Controles:
La ninhidrina sólo oxida los grupos aminos cuando están próximos a un radical
metilo o en vecindad a un radical ácido. Además, es posible la aparición de falso-
HISTOOUIMICA DE PROTEINAS, AMINAS BIOGENAS YACIDOS NUCLEICOS 249
positivos en caso de preexistencia de grupos aldehídos en el tejido . Por ello debe

incluirse siempre un lote de preparaciones sin desaminar por la ninhidrina que se
colorea exclusivamente con el reactivo de Schiff.
ALGUNAS GENERALIDADES SOBRE AZOCOMPUESTOS

Y COLORANTES AZOI~OS
Las sales de diazonio aromáticas (C 6 H 5 - N; ) son compuestos muy reactivos
que sirven de sustancias intermedias para sintetizar una gran variedad de estruc -
turas aromáticas. Se preparan tratando las disoluciones frías de aminas aromáti-
cas en ácidos acuosos con nitrito sódico (fig. 14.1) estas disoluciones suelen
utilizarse de forma inmediata para la siguiente reacción, pero sin aislar la sal de
diazonio, que es sumamente explosiva en estado sólido. De esta forma las sales
de d iazonio pueden copularse con compuestos aromáticos muy reactivos, tales
como fenoles y aminas aromáticas, para dar lugar a azocompuestos del tipo
C6 H 5 - N = N- C6 H 5 , muchos de los cuales son sustancias coloreadas que reciben
la denominación de colorantes azoicos (fig . 14.2).
óAn ilina
HONO, HCI
NaN0 2 0 -5 oc
Cloruro de bencenodiazon io
Figura 14.1. Obtenc ión de una sal de d iazonio.
ON
, +
OH
ó
el -
+ oN~NoOH
Cloruro de benceno - Fen ol p - hi droxiazobenceno
d iazon io
Copulació n con aminas

/ CH 3
ON
, Cr +
+
e¡ - N"
NaOAc
Cloruro de ben ceno - N, N -dimetilanilina p- d imeti lam inazo -

diazonio benceno
(a marillo )
Figura 14.2. Reacc ión de copulación del grupo d iazon io.

La copulación con sales de diazonio se utiliza en histoquímica para poner de

manifiesto ciertos aminoácidos aromáticos o heterocíclicos mediante su conju-
gación con distintas sales de diazonio (véase tabla 14.1 ).
Tabla 14.1 . Principales sales de diazonio utilizadas en histoquímica
Denominación Características Coloración del Utilidad

fisicoquímicas producto final práctica
FAST RED SALT • Solubilidad: 1 O por • Células enterocroma- [ +]

GG 1 OO. fines: rojo oscuro.
• Estable. • Naftoles: rojo .
• Coloración muy rá -
pida : 0 .3 -6 seg .
FAST RED SALT • Solubilidad : 20 por • Células enterocroma- [ + +]

B 1 OO. fines: rojo pardo .
• Estable.
• Copulación muy rá -
pida 1 -7 seg.
FAST RED SALT • Solubilidad: 16 por • Naftol alfa : rojo par- [+/- ]
RC 100 do.
• Muy estable. • Naftol As: rojo
• Copulación rápida .
FAST RED SALT • Solubilidad: 20 por • Naftol alfa : rojo par- [+]
TR 1 OO. do.
• Muy estable.
• Copulación rápida . ¡-
FAST RED VIO- • Estable. • Naftol As: rojo a púr- [+]

LET SALT LB • Copulación rápida . pura .
FAST VIOLET • Solubilidad: 1 O por • Naftol As: azul viole - [+]

SALT B 1 OO. ta .
• Estable. • Células enterocroma-
• Copulación lenta. fines: naranja pardo .
FAST GARNET • Solubilidad: 5 por • Naftol alfa : rojo pardo [ + +]

SALTGBC 100. • Naftol beta : rojo.
• Estable. • Naftol As: rojo oscu -
• Copulación muy rá - ro .
pida : 8-29 seg . • Células enterocroma -
fines: de rojo a rojo
anaranjado .
FAST BLACK • Solubilidad : 4 por • Naftol As: azul ne - [ + +]

SALT K 100. gruzco.
• Poco estable. • Células enterocroma -
• Copulación lenta fines: negro o azul
negruzco.
Tabla 14.1. Principales sales de diazonio utilizadas en histoquímica
Denominación Características Coloración del Utilidad

Fisicoquímicas producto final práctica
FAST BLUE SALT • Solubilidad: 1 O por • Naftol alfa : negro [ ++ ]

B 1 OO . pardo.
• Estable. • Naftol As : azul os-
• Copulación rápida : curo .
0 .9-8 seg . • Células enterocroma -
fines: pardo .
FAST BLUE SALT • Naftol alfa: negro. [+ ]

RR • Naftol beta : rojo púr-
pura .
• Naftol As: violeta .
• Células enterocroma-
fines: rosa .
FAST BLUE SALT • Solubilidad : 4 por • Naftol alfa : negro. [+/ - ]

BB 100 • Naftol beta : rojo púr-
• Estable. pura .
• Copulación lenta. • Naftol As: violeta .
• Células enterocroma -
fines: rosa .
METODO DE LA TETRAZORREACCION
El método de la tetrazorreacción, descubierto por Danielli, es un método
general para detectar proteínas que utiliza como reactivo fundamental la benci-
dina tetrazoada. Esta sustancia, a pH 9.2, se une selectivamente a las proteí-
nas a través de su copulación con ciertos aminoácidos de carácter cíclico pre-
sentes en las cadenas polipeptídicas de las proteínas, tales como tirosina, histidi-
na, prolina y otros. De esta manera se constituye un colorante azoico cuya
intensidad cromática es muy baja.
Posteriormente se realiza una segunda copulación con un naftol que deter-
mina la aparición de un colorante diazoico de fuerte tonalidad cromática rojo -
pardusca (en caso de utilizar un beta-naftol) o púrpura (ácido H o ácido - 1-
amino-8-naftol 3, 6 disulfónico) (fig . 14.3).
En cuanto a su especificidad, si bien la tetrazorreación de Danielli no es
absolutamente precisa a la hora de identificar ciertos aminoácidos aromáticos
como el triptófano, la tirosina e histidina, etc., presenta un gran interés como
método para la caracterización general de las proteínas debido a la gran variedad
de aminoácidos que intervienen en la reacción .
Por su escasa estabilidad, la bencidina tetrazoada ha sido sustituida ventajo -
samente por algunas sales de diazonio.
252 LABORATORIO DE ANATOM IA PATOLOGICA
Bencidina tetrazoada ó CH,

1
H , N- CH
1
HO,S
ÁÁ
~
A ci d o H
SO, H
COO H
Ti ros in a
ÁÁr"~"-o-o-"~"A
HO,S~SO,H y CH,
1
Co lorante diazoico H 2N- CH

1
COOH
Figura 14.3. Fórmula de la benc idina tetrazoada . de la tirosina, del ácido
H y del posible colorante d iazoico obtenido por doble copulación .
Fijación: evitar las mezclas fijadoras en cuya composición intervenga el formol.
Soluciones:
a) Tampón veronal a pH 9.2.
b) Solución de fast blue B salt al 0.2 por 100, en tampón veronal a pH 9.2.
e) Solución de ácido 1-amino-8, naftol-3, 6 disulfuro (ácido H al 2 por
100, en tampón veronal de pH 9.2. Reajustar el pH después de añadir el ácido.
Modo de operar:
2. Solución de fast blue B salt, 5 minutos a temperatura ambiente.
4. Sumergir en tampón tres veces, 2 minutos cada vez.
5. Solución de ácido H, 15 minutos.
6. Lavar en agua destilada .
Resultados:
-Proteínas Color violeta
• Observaciones :
Si el pH de la solución de ácido H es insuficiente, la coloración puede ser
parda .
HISTOQUIMICA DE PROTEINAS, AMINAS BIOGENAS YACIDOS NUCLEICOS 253
3.2. Reacciones específicas para aminoácidos particulares
Estos métodos, muy numerosos, han perdido utilidad en anatomía patológi-

ca, sobre todo desde que, a partir de 1968, empezaron a aplicarse las técnicas
inmunohistoquímicas, que no sólo permiten la caracterización de proteínas es-
pecíficas. sino que diferencian sus diversos componentes antigénicos.
Por este motivo no se realiza una exposición detallada de los mismos.
4. METODOS PARA LA DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS
Los ácidos nucleicos están compuestos por largas cadenas de unidades

llamadas nucleótidos, enlazadas por uniones covalentes. En general, los nucleó-
tidos están formados por:
- Acido fosfórico, implicado en el mecanismo de coloración fisicoquímico
por el cual los núcleos se tiñen intensamente con colorantes básicos como
la hematoxilina.
-Una pentosa, la ribosa (ARN) o desoxirribosa (ADN).
-Bases nitrogenadas, dos púricas -adenina y guanina- y dos pirimidíni-
cas --citosina, timina y uracilo (éste último para el ARN).
En las figuras 14.4 a y b se reflejan la composición química de los tipos de
unión que conforman las moléculas de ADN y ARN.
En el ácido desoxirribonucleico (ADN), las moléculas de polinucleótidos son
dos, en lugar de una única como en el caso del ácido ribonucleico (ARN). Las
dos cadenas del ADN son paralelas entre sí, trazan un recorrido espacial helicoi-
dal y están enlazadas periódicamente por uniones de hidrógeno.
La molécula de ADN es capaz de autorreplicarse y contiene almacenada la
carga hereditaria del individuo, en tanto que la de ARN es la responsable de la
transmisión de la información nuclear al citoplasma.
En condiciones normales, los ácidos nucleicos se conjugan con proteínas
básicas para formar nucleoproteínas. Por ello la realización de una hidróli-
sis ácida que los separe del componente proteico puede ser útil para demos-
trarlos.
A fin de conseguir una interpretación correcta de los resultados, deben
realizarse siempre preparaciones testigo, por lo general a través de la extracción
previa del ácido nucleico que se desea demostrar.
4.1. Procedimientos para extracción de ácidos nucleicos
EXTRACCION DEL ADN

Suelen utilizarse la hidrólisis ácida con ácido perclórico o tricloroacético. En
el primer caso se emplea en concentración del 5 por 1 00 y a 70 oc durante 20
minutos, seguido de neutralización en carbonato sódico al 1 por 100 durante 5
minutos y lavado en agua corriente también durante 5 minutos. El ácido triclo-
roacético se emplea al 5 por 100, a 90 °C, durante 1 5 minutos; a continuación se
lava en agua corriente otros 5 minutos.
o
11
Aci do fosfórico H,Po. H- 0 - P- 0 - H
1
o
1
H
Pentosas
HC= O OH HC= O OH
1 1 1 1
HCOH H- C- H 0 H CH 2 H- C- H 0 H
HCOH
1
b~~b 1
HCOH b~~b
1 1""1C - - C1/1OH 1
H
1""-1C - - C1/1OH
HCOH H HCOH
1
1 j. .... 1
1 1
OH H
CH 2 0H OH ~~-~: CH 2 0H
(c.o.H,0 )
Ribosa Desoxirribosa
(en el ARN) (en el ADN)
Bases nitrogenadas
Bases púricas
NH 2
1
/"e"'.
N e
/ N\
1 11 CH
HC ~ / C /
'\N "'.N
H
Adenina Guanina
Bases pirimidínicas
~H 2 o
1
# e, / e"'.
N~ ' eH
HN C-CH,
1 11 1 11
O= C"'. / CH O= C"'. / CH
N N
H H
Citosina Timina
Figura 14.4a. Fórmulas de los componentes de un nucleótido. (Acido

fosfórico, pentosas y bases nitrogenadas.)
CH, O
O
11
' c-e,/'
HOCH, ./0-.........._ (Ol H: /e'- _eH, HC/ \
1 ~. ,,-.........._ ··' H-N 'e N-H
Ho¡~ ~~~-e/~O
0
'"'-1
H Cl - - e
1/ f \\ + H '-
b 11
,/' '-.. N /CH
---+
H,O +~'\. ~ 1/C
1 "- 0 l "
OH H '-......._ --.(~; ~--~
OH OH
Pentosa + base nitrogenada -+ agua + nucleósido
CH, O
' c-e,/'
IH
HO- P= O + {t}Q CH, ./0'--.... H
H/ \
\N-H
j H, O +
~- ~/ 1/.. .:'---...1___.-N--c
(OH'.-~ C H H/ ~
·--' 1"'-1 1 o OH
H c--e 1 e~ o
1 1 HO-P=O '- /
OH H b / c-e\
1 HC N-H
~~o~~
CH H/_.--- . .
i-cl ~
1"'-1 1 o
H c--e
1 1
OH H
Acido fosfórico + nucleósido -+ agua + nucleótido
Figura 14.4b. Formación de un nucleótido.
EXTRACCION DEL ARN

Puede aplicarse la hidrólisis en ácido perclórico al 5 por 1 00 y a 4 oc durante
4 - 18 horas, la cual extrae selectivamente el ARN preservando al ADN, o bien la
extracción mediante ribonucleasa al 0 .01 por 1 00 a 37 oc durante 1 hora.
4.2. Técnicas histoquímicas que permit:en separar

el AD de otras estructuras
Estas técnicas se aplican para visualizar el núcleo. El método más utilizado es

la reacción de Feulgen.
REACCION DE FEULGEN
Este procedimiento de coloración se realiza en dos fases consecutivas:
1. Hidrólisis ácida del ADN: con ella se pretende, mediante la actuación
del ácido clorhídrico, romper la estructura del ADN por el lugar en que la
pentosa se une a la base nitrogenada, de forma que sobre cada molécula

de azúcar reaparezca un grupo carbonilo. Estos grupos se encuentran
situados precisamente a una distancia de entre 1 y 1 .1 nm.
2. Demostración de los grupos carbonilos formados mediante el reac -
tivo de Schiff. de forma análoga a la descrita para la reacción del PAS .
El ARN no puede ser detectado por el reactivo de Schiff tras la realización de
una hidrólisis ácida, puesto que los grupos carbonilos no están situados a una
distancia de entre 1 y 1.1 nm (fig. 14.5) y, por tanto, no se produce la reacción
con el ácido sulfofucsídico .
-0-Co-~ASE -0-CH~::;J~~SE
0
l OH l -11 om
O l OH OH 1~1om
H
.O j lo o 1 BAS E ?
H·o~j
o ¡BASE
o O OH
1 1
O= P- OH O= P- OH
1
H,o~ASE H
,QBASE
1
o
o O OH
1 1
O= P- OH O= P- OH
H,~-
1
o
VO~ BASE H
,QBASE
1
o
0 O OH
1
O= P- OH
1
O= P- OH
o
1 ¿
1 1
Polinucleó tido de A DN . Polinucleótico de ARN.
Figura 14.5. Fragmento de polinucleótido (ADN y ARN) .

HISTOOUIMICA DE PROTEINAS. AMINAS BIOGENAS YACIDOS NUCLEICOS 257
Fijación: cualquiera, excepto el fijador de Bouin; preferentemente, una parte de

formalina neutra o tamponada y diez partes de alcohol o fijadores que contengan
ácido acético.
Soluciones:
a) Solución de almacenamiento de verde claro:
-Verde claro SF (C. l. 42095) ............. . ....... . . . 2.0 g
-Agua destilada ................................ . . . 1000.0 mL
- Acido acético glacial . ... .......... . .............. . 0.2 mL
b) Solución de trabajo de verde claro:
-Solución de almacenamiento de verde claro ......... . . . 50.0 mL
-Agua destilada .... . ....... . ...... . ....... : ...... . 50.0 mL
e) Solución de ácido clorhídrico N (N-HCI)
- Acido clorhídrico concentrado ....... . ....... . .. ... . . 93.5 mL
-Agua destilada ................... . .... . ......... . 916.5 mL
d) Reactivo de Schiff (véase técnica del PAS) .
e) Solución de metabisulfito:
- Metabisulfito potásico al 1 O por 1 00 ... . .... .. . .. .. .. . 5.0 mL
-Solución de ácido clorhídrico N ............... . .... . 5.0 mL
-Agua destilada 90.0 mL
Modo de operar:
2. Lavar en la solución normal de ácido clorhídrico.
3. Hidrolizar en la solución N de ácido clorhídrico precalentada a 60 C du-
rante el tiempo óptimo según el fijador utilizado.
Líquido de Carnoy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 minutos

- Formalina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 minutos
-Líquido de Zenker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 minutos
- Sublimado-formol o B- 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 minutos
-Fijador de Regaud ......................... . ... 14 minutos
-Líquido de Flemming ................. . ........ 16 minutos
4. Lavar en solución normal de ácido clorhídrico a temperatura ambiente du-

rante 1 minuto.
5. Teñir con el reactivo de Schiff entre 30 y 90 minutos.
6. Lavar en tres cambios de solución de metabisulfito de 2 minutos de du -
ración cada uno.
7. Aclarar bien en agua destilada.
8. Contrastar en la solución de trabajo de verde claro .
1 O. Deshidratar, aclarar y montar.

-ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo-púrpura
-Citoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Verde
Problemas generales de la reacción de Feulgen

1. Hidrólisis excesiva
El ácido clorhídrico es un ácido fuerte y, si se prolonga excesivamente el
tiempo de hidrólisis disgrega la molécula de ADN en su totalidad impidiendo su
ulterior detección, además de romper los enlaces que unen las bases nitrogena -
das a la pentosa . Por ello el aspecto más importante de la técn ica es el tiempo de
hidrólisis, que varía mucho según el fijador utilizado (véase procedimiento técn i-
co) .
2. Envejecimiento del reactivo de Schiff
En condiciones normales, el reactivo de Schiff es incoloro; la aparición de

una tonalidad rosada por liberación de fucsina indica envejecimiento y, por
tanto, que debe desecharse, puesto que el envejecimiento lo hace inservible para
detectar grupos carbonilos.
Controles de la técnica de Feulgen

Por lo general se trata de una técnica muy segura, pero presenta el inconve-
) niente de que una hidrólisis prolongada puede producir falso - negativos que no
es posible detectar.
Para eliminar los falso - positivos (grupos aldehídos preexistentes no conteni-
dos en el ADN) , las preparaciones control no son sometidas al proceso de
hidról isis.
Importancia de la técnica de Feulgen

Este procedimiento de t inción, que en sentido amplio puede ser considerado
de carácter estequiométrico (es decir, cada molécula fijada de reactivo de Schiff
se corresponde con una porción constante y equivalente de molécula de ADN) ,
permite conocer la cantidad de ADN que contienen las diferentes células que
componen una muestra . Si una célula está en reposo (fase GO). poseerá una
cantidad simple de ADN , tiñendose de color rosado o rojo débil ; si por el
contrario la célula se encuentra en proceso de duplicación del ADN o en división
activa, contendrá el doble de ADN y se coloreará de rojo intenso.
La gran ventaja del procedimiento es que sobre él puede realizarse la objeti -
vación de esta información mediante espectrofotometría o técnicas de análisis
digital de imágenes por densitometría de ADN (véase el capítulo sobre análisis
digital de imágenes) . En este último supuesto, no deben realizarse coloraciones
de contraste: para evitar errores y favorecer el resalte de la tinción sólo deben
impregnarse los núcleos.
4.3. Técnicas para la distinción entre ARN y ADN:

método del verde metilo-pironina
Este procedimiento técnico se utiliza fundamentalmente para distinguir las

células dotadas de una gran capacidad secretora de proteínas y, por tanto, ricas
en ARN ribosómico, como, por ejemplo, las células plasmáticas productoras de
inmunoglobulinas y sus precursores inmediatos. Desde que fuera introducido
por Unna en 191 O, el método del verde de metilo - pironina ha experimentado
numerosas modificaciones, principalmente a causa de la gran irregularidad de la
coloración que produce.
Fundamento del método: la basofilia de los ácidos nucleicos está ligada a la
presencia de grupos ácidos ionizables pertenecientes al ácido fosfórico. Con pH
adecuado, dichos grupos tienen la propiedad de fijar los grupos electropositivos
de ciertos colorantes básicos, entre los cuales destacan el verde de metilo y la
pironina.
Por este motivo, la técnica del verde de metilo pironina no es una coloración
histoquímica en sentido estricto, aunque la utilización de controles adecuados
puede hacerla muy específica para la coloración discriminativa de ácidos nuclei-
cos. (
El verde de metilo es un colorante derivado del trifenilmetano (fig. 14.7) y se
prepara a partir del violeta cristal, que debido a ello aparece siempre como
contaminante. Se fija selectivamente sobre el ADN; no obstante, la especificidad
de tal unión es variable.
HC
3
"N
-f C\ o ~
HC/
3
H3 C
He) _ f
3/
H3 C
a ·C-
-
-
~
- -
2 Cl 9
e/CH 3
N" CH
3
Figura 14.7. Fórmula del verde de metilo.
La pironina Y o G es un colorante rojo derivado del xanteno (fig. 14.8) que

tiene apetencia por el ARN, aunque su especificidad no es absoluta.
El mecanismo de tinción radica en la atracción electrostática que se produce
entre los colorantes básicos verde de metilo y pironina y los ácidos nucleicos, en
unas condiciones adecuadas de pH.
CH 3
+/
o N
" CH 3
Figura 14.8. Fórmula de la pironina Y.

Esta técn ica t iene un fundamento sencillo, pero es de realización muy dificul -
tosa por la complejidad de la preparación de los reactivos y el engorroso modo
de operar. Otro de sus inconven ientes es la inconstancia de los resultados. Por
todo ello se han int roducido multitud de variantes: Papenhein -Unna, Brachet,
Lison. Jordan -Baker y otras.
Problemas de la preparación y manejo de los reactivos

1. Para que ocurra una coloración diferencial (es decir, para que cada
colorante tiña el ácido nucleico correspondiente) es fundamental que la
técn ica se real ice con un pH constante en torno a 5 (de 4 .8 a 5.2,
según la variante) .
2. Como el verde de metilo es un colorante no puro, pues está contam i-
nado en mayor o menor grado por el violeta cristal, hay que eliminar este
último de la solución . La separación se produce decantando el verde de
metilo en solución acuosa mediante cloroformo, ya que el violeta de
cristal es soluble en éste y el verde de metilo, no.
3. El alcohol etílico tiene la propiedad de disolver la pironina, por lo
que pueden surgir problemas de amortiguación del color rojo de la
pironina en el momento de deshidratar los cortes.
Modificación personal de la variante de Brachet del método

del verde de metilo-pironina
) Fijación: cualquiera .
Soluciones:
a) Solución de tampón acetato de sodio 0.2 M:
-Acetato de sodio ......................... . ...... . 16.4 g
-Agua destilada . . ..................... . .......... . 1000.0 mL
b) Solución de ácido acético 0.2 M :
- Acido acético puro .......... . ............. . ..... . 12.0 mL
- Agua destilada hasta . ........... . .. ... ...... . .... . 1000.0 mL
Mezclar: Solución A ... . ... . ....... .. .............. . 13.2 ml
Solución 8 ............ . . . . . .............. . 36.8 mL
Agua destilada ............................. . 50.0 mL
El pH de la disolución será 4.2; ajustar con hidróxido sódico o ácido acético si
es necesario.
d) Solución de verde de metilo:
- Disolver 0 .5 g de verde de metilo en 1 00 mL de tampón .
Lavar con cloroformo (se necesita un mínimo de 4 a 6 decantaciones) .
Dejar la solución así purificada en un recipiente abierto y en frigorífico hasta
la eliminación de los vapores de cloroformo.
e) Solución de verde de metilo-pironina:

- Solución de verde de metilo en tampón . . ............ . 100.0 ml
- Pironina gamma o Y .. .. . . . .......... . . . ..... . ... . 0 .2 g
Esta solución, conservada en frasco opaco bien cerrado y en nevera, puede
durar meses.
Antes de usar debe llevarse a temperatura ambiente.
Modo de operar:
2. Solución de verde de metilo-pironina, durante 1 O minutos a temperatura
ambiente .
3. Lavar muy rápidamente en agua destilada.
4. Diferenciar y deshidratar en 2 baños breves de alcohol absoluto.
5. Sumergir brevemente en xileno agitando.
6. Dos baños de xileno de 5 minutos cada uno.
7. Montar.
Resultados:
-Núcleos Verde (ADN)
-Citoplasmas . . ........... .. .... . .... . ........... . Rojo (ARN)
• Observaciones:
1. No se seca con papel de filtro.
2. Pese a sus inconvenientes, se emplea el alcohol etílico como deshidratante.
3. Se duplica la cantidad de pironina para compensar la pérdida de color.
Controles en las técnicas de verde de metilo-pironina

1. Hidrólisis clorhídrica: pretende destruir los ácidos nucleicos mediante
el ácido clorhídrico, con lo que se descartan los falso - positivos (sustan-
cias que se colorean sin corresponder a ácidos nucleicos) .
2. Test de Brachet: digestión de ARN con ribonucleasa, según técnica
expuesta con anterioridad (véanse procedimientos para la extracción de
ácidos nucleicos) .
5. METODOS PARA LA DETECCION DE AMINAS BIOGENAS
La adrenalina, la noradrenalina y la serotonina son hormonas que se caracte -

rizan por tener ciertos radicales químicos similares, siendo la estructura básica de
las dos primeras un difenol que recibe la denominación de pirocatequina y la de
la tercera un indol oxidado en posición 5 (- OH) (fig . 14.9) . Las tres hormonas
actúan regulando los mecanismos de reacc ión inmediata ante el estrés y ante
c iertas agresiones del medio, pero sus funciones no sólo no son idénticas, sino
que pueden llegar a ser contrapuestas. La adrenalina y la noradrenalina se
producen en la médula suprarrenal e intervienen en la regulación de la circula -
ción sanguínea y en los mecanismos de reacción ante las agresiones del medio.
HOA HO~ HO()or

y y ~
1
N
1
H2- CH 2- NH 2
OH OH
CH - CH - NH- CH CH- CH -NH H
1 2 3 1 2 2
Serotonina
Adrenalina Noradrenalina
Figura 14.9. Fórmula de adrenalina , noradrenalina y serotonina.
Su actuación se pone de manifiesto cuando se pasa rápidamente de la situación

de reposo a la de alerta, con aparición de broncodilatación, sudoración, taqui-
cardia, palidez por vasoconstricción, etc.
La serotonina o 5-hidroxitriptamina es un mediador fundamental en los
mecanismos alérgicos y produce vasodilatación, exudaci.ón y activación de la
reacción inflamatoria.
Estas tres hormonas pueden detectarse histoquímicamente a través de una
reacción, como es la reacción cromafín .
5.1. Reacción cromafín
La adrenalina y la noradrenalina son sustancias reductoras que en contacto

con un agente oxidante como el dicromato potásico se oxidan, originando como
productos de reacción óxido de cromo e hidróxido potásico. El óxido de cromo
es un pigmento pardo, insoluble en agua y que, por tanto, precipita sobre el
tejido.
Por ello, los tejidos que contienen estas hormonas intervienen directamente
en la reacción reduciendo el dicromato potásico. La coloración de contraste se
realiza fundamentalmente con hematoxilina, aunque se puede hacer con verde
de metilo.
Si se quiere intensificar la reacción, puede aplicarse un PAS sin oxidación
previa, con la cual se tiñen los grupos carbonilo formados con el reactivo de
Schiff. El hecho de que numerosos fijadores (Zenker, Helly, etc.) contengan
dicromato potásico explica que la reacción cromafín sea una técnica histoquími-
ca sencilla en la que la fijación y la coloración son simultáneas.
Si el tejido está fijado en formol , se trata con diera~ potásico y el efecto
de tinción ocurre de la misma forma .
Fijación y soluciones: la fijación coincide habitualmente con el procedimiento
de coloración . En ocasiones el tejido puede ser fijado previamente en formalina.
El reactivo para la reacción cromafín se compone de:
-Solución acuosa de dicromato de potasio al 5 por 100 . . . 60 ml
- Formaldehído al 40 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 ml
-Acetato de sodio 1 M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 ml
-Agua destilada.. ............ .... ................. 18 ml
HISTOOUIMICA OE PROTEINAS. AMINAS BIOGENAS YACIDOS NUCLEICOS 263
El pH debe quedar ajustado a 5.8, ya que a este nivel los gránulos cromafines
muestran mayor estabilidad
Modo de operar:
1. Fijar el tejido, fragmentado en pequeñas porciones, en la solución de tra-
bajo durante 48 horas. En caso de trabajar con médula adrenal, que es muy
suceptible a la autolisis, la glándula suprarrenal debe ser fijada de inme-
diato.
2. Tratar las piezas con formalina neutra al 1O por 1 00 durante 24 horas.
3. Cortar por cof'{íelación o en parafina, en este último caso reduciendo a
30 minutos como máximo la duración total de los baños de parafina.
4. Desparafinar e hidratar en el caso de los cortes con parafina.
5. Contrastar con rojo nuclear o verde de metilo durante algunos minutos (op-
cional).
6. Enjuagar con agua corriente.
Resultados:
-Células cromafines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Coloración parda
.,
CAPITULO 15
Métodos para la
identificación y tinción
de pigmentos e iones
metálicos
GUION DE CONTENIDOS
1. TIPOS DE PIGMENTOS
2. TECNICAS PARA LA DETERMINACION DE PIGMENTOS
HEMOGLOBINOGENOS
2.1. Técnica histoquímica para determinar hemoglobina
2.2. Métodos histoquímicos para la demostración del hierro
y pigmentos que lo contienen
2.3. Técnicas para la detección de hematoidina y bilirrubina
NO HEMOGLOBINOGENOS
3.1. Métodos para detectar melanina
3.2. Técnicas para determinar lipofucsina y pigmento
ceroide
3.3. Métodos para la determinación de calcio
3.4. Técnicas para la determinación de cobre
Aunque los pigmentos son sustancias coloreadas que existen de forma natu-
ral, es decir, que por sí mismas tienen color, los técnicos de laboratorio deben
realizar con frecuencia técnicas específicas para identificar un determinado pig -
mento detectado en una preparación histológica teñida con hematoxilina-eosi-
na.
1. TIPOS DE PIGMENTOS
ARTEFACTUALES
Son aquellos que aparecen a consecuencia de la aplicación, generalmente

incorrecta, de determinadas técnicas histológicas como efecto indeseable de
éstas; por ejemplo: el pigmento formólico, depósitos de sales de mercurio, depó -
sitos de cromo, precipitados de plata, etc .
PIGMENTOS EXOGENOS
Son aquellos que, procedentes del medio ambiental, penetran en el organis -
mo y originan una coloración particular de los tejidos, que puede acompañar o
no a una patología subyacente en ellos. Ejemplo: pigmentación por inhalación
del humo del tabaco, polvo de carbón, de metales, sílice, etc. En los dos prime -
ros casos, la sustancia depositada se suele denominar pigmento antracótico.
Otros tipos de pigmentación exógena ocurren por ingestión de carotenos -que
están presentes en las zanahorias y verduras y a cuyo grupo pertenece la vitami-
na A, responsable de la coloración amarillenta de la piel de los esquimales,
indios, etc.- , o por acción de ciertos agentes terapéuticos como sales de oro,
ciertas inyecciones de extractos hepáticos, etc. Los ejemplos más corrientes de
pigmentación exógena son los tatuajes.
PIGMENTOS ENDOGENOS
Son sustancias coloreadas presentes en los tejidos y elaboradas por el propio
organ ismo a partir de materiales procedentes del catabolismo, degradación o
síntesis de diferentes elementos. Estos pigmentos pueden clasificarse en dos
grupos:
a) Pigmentos hemoglobinógenos: proceden de la degradación y des-
trucción fisiológica o patológica de la molécula de hemoglobina, a saber:
- La propia hemoglobina.
- La hemosiderina.
- La hemofucsina.
- La hematoidina.
- La bilirrubina.
b) Pigmentos no hemoglobinógenos:
- Melanina .
- Lipofucsina.
- Ceroide.
- Cobre.
~
METODOS PARA LA IDENTIFICACION Y TINCION DE PIGMENTOS E IONES METALICOS 267
El problema que plantean la mayor parte de los pigmentos, a excepción de la

hemoglobina, es la similitud de su color, normalmente pardo. Esta contingen-
cia hace imprescindible su identificación mediante diferenciación histoquímica.

HEMOGLOBINOGENOS
HEMOGLOBINA
Es el pigmento de este grupo que aparece con mayor frecuencia en los

tejidos normales, principalmente en el interior de los hematíes. En condiciones
patológicas se observa en forma de granulaciones amarillo-doradas, sobre todo
formando parte de cilindros tubulares del riñón . Es soluble en agua y se diluye
fácilmente en alcohol etílico.
2 .1 . Técnica histoquímica para determinar hemoglobina: técnica

de la bencidina
Es también conocida con el nombre de reacc1on pseudoperoxidásica

porque la hemoglobina se comporta de forma parecida a esta enzima.
Fundamento de la técnica:
Está basado en que la hemoglobina es capaz de liberar oxígeno naciente a
partir de agua oxigenada, de forma que el primero oxida a la bencidina incolora
hacia benzo-purpurina de color verde. La reacción se representa en la figura
15.1. En la actualidad ha sido sustituida por el método de la diaminobencidina
(véase, posteriormente, método de la peroxidasa en capítulo 17) .
HND - - 0 NH + 2H, O
Bencidina Benzopurpurina
Figura 15.1. Esquema de la reacción de bencidina.
Soluciones:
Una pequeña cantidad de bencidina (1 0-15 mg) disuelta en 2 ml de etanol al
90 por 1 OO. Esta solución se mezcla con 4.5 ml de etanol al 70 por 100, donde se
habrán añadido previamente 0.5 ml de peróxido de hidrógeno concentrado.
Modo de operar:
1. Solución de bencidina durante 2 minutos.
2. Lavar en etanol al 50 por 1 OO.
4. Coloración de núcleos con hematoxilina.
Resultados:
-Núcleos Azules
-Hemoglobina y eritrocitos Verde
Controles de la técnica
El problema principal surge al tener que diferenciar la auténtica actividad pero-
xidásica debida a la presencia de esta enzima, de la pseudoperoxidásica propia de
la hemoglobina, objeto de la técnica de la bencidina. Teniendo en cuenta que la
actividad peroxidásica es termolábil, es decir, que la peroxidasa se inactiva
por acción del calor, y que la actividad de la hemoglobina es termoestable, el
método de control más indicado consistirá en someter el corte a la tempera-
tura de 100 oc durante 20 minutos: con esta maniobra se consigue que sólo
persista la actividad de la hemoglobina.
2.2. Métodos histoquímicos para la demostración del hierro

y pigmentos que lo contienen
En el interior de los tejidos el hierro puede depositarse de dos formas : 1)

iónica o formando sales ferrosas y férricas, por lo común en forma de cloruros o
hidróxidos, y 2) como hierro ligado a proteínas o hierro enmascarado.
El hierro ligado a proteínas no puede detectarse directamente: es necesario
someterlo a un proceso previo de desenmascaramiento por el cual lo trans-
formamos en hierro iónico.
Entre los procedimientos para detectar hierro iónico merecen destacarse fun-
damentalmente tres técnicas: la del azul de Perls para hierro férrico, la del azul de
Turnbull para hierro ferroso y la de Tirmann-Schmeltzer para ambos en general.
HEMOSIDERINA
Es un pigmento proteico de color amarillo dorado o pardusco que contiene
hidróxido férrico y aparece en forma de acúmulos o granulaciones generalmente
situadas en el interior de macrófagos. Es soluble en ácidos, incluso tras su
fijación, e insoluble en álcalis, alcohol y agua.
Por contener hierro férrico libre puede colorearse mediante la técnica del azul
de Perls.
TECNICA PARA DETECTAR IONES FERRICOS

Técnica del azul de Perls
Es la técnica de mayor importancia para detectar hierro. ya que el hierro
férrico es el más frecuente en los tejidos.
Se basa en la propiedad que tiene el ferrocianuro potásico o prusiato amarillo
para transformarse, en presencia de hierro férrico (cloruro férrico o similar), en
ferrocianuro férrico o azul de Prusia, de color azul por acción del ácido clorhídri-
co que actúa como desencadenante de la reacción .
3K 4 [ Fe ++ (CN) 6 ] + 4Fe +++ cl 3 HCI Fe 4 +++ [ Fe ++ (CN) 6 ] 3 + 12KCI

---+
Prusiato amarillo Azul de Prus ia
Fijación: cualquier fijador es válido . Secciones en parafina o improntas.
Soluciones:
1. Solución de ferrocianuro potásico al 1 O por 100:
- Ferrocianuro potásico ......................... . 10 g
- Agua destilada . . . ... ... . . ...... . ............. . 100 mL
2 . Acido clorhídrico al 2 por 100:
- Acido clorhídrico concentrado . ..... . . .......... . 2 mL
-Agua destilada .............. .... ........... .. . 98 mL
3. Solución de ferrocianuro potásico. Acido clorhídrico. Preparar a
partes iguales de la solución 1 y 11 (v/v), inmediatamente antes de su uso.
Modo de operar:
2. Colocar los cortes en la solución de ferrocianuro.
3. Tratar los cortes con la mezcla ferrocianuro potásico-ácido clorhídrico du-
rante 1O minutos.
5. Contrastar, si se desea, con solución estándar al 1 por 1 00 de rojo nuclear
de 2 a 3 minutos.
Resultados (fig . 15.2 a y b, véase páginas en color):

-Hierro férrico incluida hemosiderina . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul
-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo
• Observaciones:
1. El tiempo de coloración depende de la cantidad de hierro existente en el
tejido.
2. Siempre deben utilizarse preparaciones positivas de control.
TECNICA PARA DEMOSTRAR HIERRO FERROSO

Aunque de escasa utilidad práctica, se realiza mediante el método del azul
de Turnbull. Se basa en la reacción que ocurre al poner en contacto el prusiato
rojo o ferricianuro potásico y el ácido clorhídrico en presencia del cloruro ferroso
existente en el tejido, de forma que se produce ferricianuro ferroso o azul de
Turnbull, también de color azul.
2K 3 [Fe +++ (CN) 6 ] + 3Fe ++ cl 2 HCI Fe 3 ++ [Fe +++ (CN) 6 ] 2 + 6KCI

------+
Prusiato rojo Azul de Turnbull
Es de mayor utilidad práctica la técnica de Tirmann-Smeltzer para hierro

total, basada en la anterior y que se expone a continuación .
TECNICA PARA DETECTAR HIERRO EN GENERAL
Método de Tirmann-Smeltzer
Fundamento :
Consiste en transformar el hierro férrico, por acción del sulfuro de amonio, en
hierro ferroso para realizar después la técnica de Turnbull y colorear simultánea-
mente ambos iones.
Fijación: cualquier fijador es válido. Secciones en parafina o improntas.
Modo de operar:
2. Tratar con sulfuro de amonio al 1 O por 1 00 durante 2 horas.
3. Lavar en varios cambios de agua destilada.
4. Realizar una técnica convencional de azul de Turnbull, tratando los cortes
con una solución v/v de CIH al 2% y ferricianuro potásico al 20%.
5. Lavar en varios cambios de agua corriente.
6. Contrastar con rojo neutro por el método convencional.
Resultados:
-Hierro iónico total Azul
-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo
Métodos para detectar hierro ligado a proteínas
Estas técnicas se basan en desenmascarar el hierro mediante tratamiento del

tejido con ácido sulfúrico al 4 por 100 en etanol de 96 por 100, de 30
minutos a 2 horas, de forma que el hierro ligado a las proteínas pasa a hierro
férrico o ferroso, que a continuación es determinado normalmente.
2 .3. Técnicas para la detección de hematoidina y bilirrubina
La hematoidina y la bilirrubina son dos pigmentos muy similares y, por tanto,

difíciles de diferenciar si bien es fácil separarlos conjuntamente de los demás
pigmentos.
La hematoidina es un pigmento derivado de la descomposición de la hemo-
globina que no contiene hierro y es de color amarillo pardusco.
La bilirrubina procede de la desintegración de la hematoidina y otros pig-
mentos intermediarios producidos en la degradación de la hemoglobina, de la
cual es resultado final.
El método de coloración más simple para la determinación conjunta de
ambos pigmentos es la técnica de Gmelin. Además, la bilirrubina puede
determinarse de forma específica mediante el método de Hall .
TECNICA DE GMELIN
Se fundamenta en hacer reaccionar la hematoidina o la bilirrubina con ácido
nítrico para producir otros pigmentos diferentes: estos pigmentos siguen la
secuencia degradativa normal de los pigmentos hemoglobinógenos hasta pro-
ducir bilicianina y biliverdina, que tienen un color verde azulado característico.
Fijación: cualquiera es válida .
Soluciones:
-Solución de ácido nítrico.
Modo de operar:
1. Desparafinar e hidratar. •
2. Colocar un cubreobjetos sobre el portaobjetos sin montar con bálsamo.
3. Poner unas gotas de ácido nítrico diluido en el límite entre el portaobjetos
y el cubreobjetos; eliminar el excElso de solución y observar inmediatamente
al microscopio.
Resultados
La bilirrubina y la hematoidina se van transformando y cambian de color, de
amarillo pardusco a verde, azul y, finalmente, rojo-púrpura .
TECNICA DE HALL PARA BILIRRUBINA
Fijación: preferiblemente, formalina . Secciones en parafina.
Solución:
a) Reactivo de Fouchet:
- Acido tricloroacético al 25 por 1 00 ...... . . . ....... .. . 100 mL
-Cloruro férrico al 1O por 100 ................ . . . .. .. . 25 mL
b) Picrofucsina de Van Gieson.
Modo de operar:
2. Solución de Fouchet recién preparada durante 5 minutos.
3. Lavar con agua corriente, durante 2 minutos.
5. Coloración de Van Gieson durante 3 minutos.
7. Deshidratar rápidamente, aclarar y montar.

-Bilirrubina . . . . . . . . . . . . . . . ... ... .. ... ... .. .. .. .. . Verde
-Colágena . . . . . . . . . . . . . . . . ... ... .. ... ... .. .. .. .. . Roja
-Músculo y células epiteliales . ... ... .. ... ... .. .. .. .. . Amarillo
-Eritrocitos . . . . . . . . . . . . . . . ... ... .. ... ... .. .. .. .. . Amarillo
• Observaciones:
Si se desea, pueden contrastarse los núcleos con hematoxilina.
3. TECNICAS PARA LA DETERMINACION DE PIGMENTOS NO

H EMOG LOBINOG ENOS
3.1. Métodos para determinar melanina
Los fundamentales son :

1. Técnica de argentafinidad de Masson-Fontana (véase impregna -
ción argéntica en el capítulo 11) (fig . 15.4).
2. Técnica de decoloración de la melanina. Es más sencilla. Utiliza
agentes oxidantes que decoloran la melanina, por lo que también recibe
la denominación de blanqueamiento de la melanina.
3. Métodos histoenzimáticos que determinan DOPA-oxidasa, una
enzima característica de los melanocitos.
4. Métodos que emplean fluorescencia. Se basan en la propiedad de
las células con granulaciones citoplasmáticas que contienen derivados
Figura 15.4. Demostración de pigmento melánico en un melanoma malig -

no mediante la técnica de Masson- Fontana ( x 20) .
de los aminoácidos fenilalanina y triptófano (5-hidroxitriptamina, dopa-

mina, adrenalina, histamina, etc.), de mostrar autofluorescencia tras
un tratamiento previo con paraformaldehído. De esta forma, los elemen -
tos celulares mencionados (melanocitos, células argentafines y cromafi -
nes y las células C del tiroides), muestran una fluorescencia amarilla
característica.
TECNICA DEL BLANQUEAMIENTO DE LA MELANINA

Emplea la propiedad que poseen los agentes oxidantes fuertes, como el
permanganato potásico, el ácido perfórmico y el agua oxigenada, para decolorar
el pigmento melánico.
Aunque existen múltiples procedimientos prácticos, los más utilizados son el
del agua oxigenada y el del permanganato.
METODO DEL AGUA OXIGENADA
Fijación: cualquier fijador es válido . Secciones en parafina .
Solución:
-Agua oxigenada comercial de 1 5-20 volúmenes. •
Modo de operar:
2. Tratar los cortes con la solución de agua oxigenada hasta decoloración
completa (control microscópico) . Como tiempo de referencia puede utili -
zarse el de 30 minutos.
3. Lavar abundantemente en agua corriente .
4. Colorear con hematoxilina -eosina .
Resultados:
El pigmento melánico deberá decolorarse. Deben utilizarse preparaciones posi-
tivas de control.
METODO HISTOENZIMATICO DE LA DOPA-OXIDASA

Los fundamentos generales de los métodos para determinar actividad enzi-
mática sobre secciones histológicas o improntas celulares se describen en el
capítulo 17. Pero se ha considerado conveniente incluir aquí, por su especifici -
dad, la técnica de la DOPA-oxidasa para la determinación de las granulaciones
citoplásmicas (melanosomas) que caracterizan a las células productoras de me-
lanina.
Fijación: formalina tamponada a 4 oc, de 4 a 8 horas. Cortes en congelación .
Soluciones:
Medio de incubación:
- D-L. 3,4 dihidroxifenilalanina . ...... . . . ... . ........ . . 0.1 g
- Tampón fosfato a pH 7 .4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 mL
Modo de operar:
1. Lavar las secciones de congelación en agua destilada.
2. Incubar en el correspondiente medio durante 45 minutos a 37 oc.
3. Cambiar el medio de incubación por otro recién preparado y reincubar
entre 2 y 4 horas a 37 °C.
5. Contrastar núcleos con carmín o verde de metilo.
Resultados:
- Actividad DOPA-oxidasa Negro pardusco
-Núcleos ... . .. . ...... . .. . . .. .............. . Rojo o verde
3.2. Técnicas para determinar lipofucsina y pigmento ceroide
La lipofucsina es un pigmento de desgaste pardo-amarillo que aparece fun-

damentalmente en las células envejecidas del sistema nervioso periférico,
músculo cardíaco, hígado, testículo y glándulas suprarrenales.
Existen tres métodos de coloración de carácter no específico que permiten
diferenciar ambos pigmentos:
METODOS PARA lA IDENTIFICACION Y TINCION DE PIGMENTOS E IONES METALICOS 275
1. Técnicas de lípidos, como el método del Sudán negro y el del azul de

Nilo, con los que, debido a su alto contenido en lípidos, la lipofucsina es
positiva (véase capítulo de coloraciones para grasas) .
2. Técnica del PAS, puesto que la lipofucsina es PAS positiva por contener
restos de hidratos de carbono (fig. 15.5, véase páginas en color) .
3. Técnica de Schmorl, que, además de colorear la lipofucsina, tiñe melani -
na, pigmento biliar y células argentafines y cromafines.
TECNICA DE SCHMORL
Fijación: cualquier fijador es válido. Secciones en parafina.
Soluciones:
a) Solución de incubación (preparar inmediatamente antes de su uso) :
- Cloruro férrico al 1 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37.5 mL
- Ferricianuro potásico al 1 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.0 mL
- Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 .5 mL
Modo de operar:
2. Incubar en la solución de trabajo entre 30 segundos y 5 minutos, contro -
lando la coloración al microscopio.
3. Lavar bien en agua corriente.
4. Tratar durante 5 minutos con ácido acético al 1 por 1 OO.
5. Contrastar con solución estándar de rojo neutro.
Resultados:
- Lipofucsina, melanina, pigmento biliar, hematoidina
células argentafines y cromafines y grupos sulfhidrilo . . . . Distintos tonos
de azul
El pigmento ceroide es una lipofucsina en fase inicial de formación, aunque

con caracteres diferenciales propios. En las preparaciones histológicas conven -
cionales adopta un color pardusco y muestra negatividad para el PAS, Sudán
negro y azul de Nilo, a diferencia de la lipofucsina completamente formada. Sin
embargo, posee autofluorescencia espontánea amarilla y .se tiñe con la técnica
de Zieh/-Neelsen, la cual identifica además el bacilo de la tuberculosis y bacilos
ácido -alcohol resistentes. Esta técnica se desarrolla en el capítulo 16, dedicado a
los métodos para la determinación de microorganismos bacterianos.
3.3. Métodos para la determinación de calcio
Las sales de calcio están presentes normalmente en los huesos y dientes,

aunque en ocasiones también aparecen áreas de calcificación en tejidos despro-
vistos de ellas. En general, las sales que con mayor frecuencia se depositan son
carbonatos, oxalatos y fosfatos, cuya característica común es una intensa ape -
tencia por los hemalumbres que las colorean de azul.
Los métodos específicos para la identificación de sales de calcio se funda-
mentan en dos tipos de mecanismos: 1) sustitución de los iones de calcio sobre
sus sales por otros iones metálicos, esencialmente plata o cobalto (métodos de
Von Kossa y del sulfuro de cobalto); 2) coloraciones selectivas como la del
rojo de alizarina S.
METODO DE IMPREGNACION ARGENTICA DE VON KOSSA

PARA IONES CALCICOS
Fundamento:
Existen numerosas modificaciones de la técnica clásica de Von Kossa para la
determinación de calcio. En general, todas ellas se basan en un proceso análogo
al de la fotografía en blanco y negro, por el cual se produce la sustitución de los
iones cálcicos intratisulares en forma de fosfatos o carbonatos, por iones de
plata en solución acuosa sometidos a un proceso simultáneo de exposición a la
luz solar. La exposición a la luz solar puede ser sustituida por una incubación
con la solución de plata en la oscuridad, para realizar después una severa
reducción externa con un agente químico, · de tal forma que se deposita gran
cantidad de plata metálica sobre los núcleos de precipitación donde los iones
argénticos han sustituido el calcio. Debido a ello, los depósitos iniciales de
calcio se colorean de negro. Puede decirse, en consecuencia, que lo detectado
mediante la técnica de Von Kossa son los iones fosfatos y carbonatos, que en el
organismo humano se encuentran ligados casi exclusivamente al calcio. Por
analogía, la técnica se considera específica del ion calcio, aunque en realidad
no lo sea .
Las variantes que contemplan una reducción química en lugar de la produci -
da por la radiación solar acrecientan por lo general el depósito de plata métalica
cuando la cantidad de iones cálcicos es mínima . Por este motivo, el primer
método (Von Kossa original) se prefiere para realizar la coloración de tejido óseo
sin decalcificar, y el último, más sensible, para la determinación de microcalcifi -
caciones.
Método original de Von Kossa
Fijación: preferiblemente formalina al 1 O por 1 OO. Secciones en parafina.

Soluciones:
a) Solución acuosa de nitrato de plata al1 por 10.
b) Solución de tiosulfato sódico al 2.5 por 100.
e) Solución de rojo neutro al 1 por 1 OO.
Modo de operar:
2. Tratar con la solución de nitrato de plata a plena luz entre 30 y 60 minutos.
4. Lavar en tiosulfato durante 5 minutos.
6. Realizar la coloración de contraste con rojo nuclear.
Resultados (fig. 15.6)

-Hueso mineralizado y calcificaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
- Osteoide y núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo
Figura 15.6. Demostración de los depósitos de calcio sobre las vellosida-

des placentarias mediante la técnica de Von Kossa ( x 10).
Método de impregnación argéntica de Von Kossa en la oscuridad
Fijación: preferiblemente formalina al 1 O por 1 OO . Secciones en parafina .
Soluciones:
a) Solución acuosa de nitrato de plata al 1 por 1 OO.
b) Solución acuosa de pirogalol al 1 por 100.
e) Solución de tiosulfato sódico al 2.5 por 100.
d) Solución de rojo neutro al 1 por 100.
Modo de operar:
2. Nitrato de plata al 5 por 100 durante 10-60 minutos en la oscuridad .
4. Revelado con pirogalol al 1 por 100 durante 2 minutos.
5. Fijación en tiosulfato sódico al 5 por 100 durante 3-5 minutos.
7. Coloración en contraste con rojo neutro o verde de metilo.
Resultados:
-Depósitos cálcicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
- Restantes tejidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Amarillo dorado
• Observaciones:
Cuando se trata de demostrar carbonato cálcico, los tiempos de exposición
deben prolongarse.
METODO DEL ROJO ALIZARINA S PARA LA DETECCION DE SALES

CALCICAS
Se fundamenta en la formación de lacas complejas poco solubles y colorea -
das entre algunos colorantes (rojo de alizarina S; purpurina, etc.) y metales en
estado iónico, como el calcio. En este proceso, el pH de la solución coloran-
te es crítico para asegurar una identificación positiva de las sales
cálcicas, y debe encontrarse entre 4.1 y 4.3. A pesar de estas precauciones,
las sales de oxalato cálcico no se colorean más que con el método de Van Kossa .
La presencia de iones férricos puede interferir el mecanismo de coloración
provocando falsos positivos, que se evitan realizando adecuadas preparaciones
de control mediante decalcificación de los cortes y realización paralela de uña
tinción para demostrar hierro (técnica de Perls, etc.) .
Fijación: formalina o fijadores alcohólicos. Secciones de parafina.
Soluciones:
a) Rojo de alizarina S:
- Rojo de alizarina S (C. l. 5800) . .... . ......... . ..... . 2g
-Agua destilada .... . . . ...... . .......... . ......... . 100 mL
Ajustar el pH de la solución entre 4.1 y 4.3 mediante la adición de amoníaco
concentrado gota a gota. La solución debe adquirir un color rojo vinoso in-
tenso, permaneciendo estable durante meses.
Modo de operar:
2. Incubar con la solución de rojo de alizarina durante 1 a 5 minutos, contro-
lando al microscopio.
3. Secar y deshidratar en acetona durante 30 segundos.

4. Aclarar en acetona-xileno 1 :1 durante 15 segundos.
5. Aclarar en xileno y montar.
Resultados:
-Depósitos de calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Naranja-rojizo
3.4. Técnica para la determinación de cobre
Este metal se encuentra presente de forma casi exclusiva en el hígado y otros

órganos, fundamentalmente córnea y ganglios nerviosos de pacientes con enfer-
medad de Wilson . En ocasiones se encuentra presente en algunas cirrosis hepá -
ticas, aunque en muy escasa proporción.
Puede determinarse a través de su unión con el ácido rubeánico, por el que
presenta gran apetencia .
Método del ácido rubeánico para la determinación de cobre
Fijación : cualquiera . Secciones en congelación o parafina.
Soluciones:
a) Solución madre de ácido rubeánico (ditiooxamida):
-Acido rubeánico ............... .. ... .. ........ . . . 0.1 g
- Alcohol etílico absoluto ..... .. .... . ... . .... . ...... . 100 ml
b) Solución de acetato sódico:
- Acetato sódico ...... . .. . . . .. . .. . . .. ..... . ....... . 10 g
- Agua destilada . . ... ... ......... . . .. ............. . 100 ml
-Solución A . ... . ................. ... ... . . . .. . . . . . 2.5 ml
- Solución B . . ....... . ............. . ......... . ... . 50 ml
Modo de operar:
2. Solución de colorante durante toda la noche a 37 °C.
3. Alcohol etílico al 70 por 100, durante 15 minutos.
4. Alcohol etílico absoluto, 6 horas.
Resultados:
-Depósitos de cobre Granulaciones verdes a negras
CAPITULO 16
Métodos para la detección

de microorganismos
GUION DE CONTENIDOS
1. TINCIONES PARA BACTERIAS
1.1. Técnica de Gram (modificación de Jensen)
1 .2. Métodos para bacterias ácido-alcohol resistentes
2. COLORACIONES PARA HONGOS
3. COLORACION PARA DEMOSTRACION DE VIRUS
4. COLORANTES PARA PARASITOS
1. TINCIONES PARA BACTERIAS
Las técnicas histológicas no permiten identificar específicamente las bacte -

rias, pero sí poner de manifiesto su presencia en el tejido y demostrar algunas de
sus características morfológicas básicas. Mediante estas técnicas es posible
precisar si son cocos (cuerpos esféricos), bacilos (cuerpos alargados) o espi-
roquetas (cuerpos enrollados en espiral) e incluso si, una vez teñ idos, son
Gram positivos (azules/negros) , Gram negativos (rojo) o ácido -alcohol resisten-
tes.
Las espiroquetas se demuestran generalmente mediante impregnaciones ar-
génticas, aunque algunas se colorean con la tinción de Giemsa.
1.1. Técnica de Gram (modificación de Jensen para secciones

histológicas)
Su fundamento es semejante al de la técnica de Weigert para fibrina , de

forma que las bacterias Gram positivas poseerían una cápsula rica en grupos
sulfhidrilo, susceptibles de formar enlaces estables con el violeta de metilo
previ o tratamiento con lugol (véase capítulo 9) .
TECNICA DE GRAM
Fijación: formalina al 1 O por 1 OO.
Soluciones:
a) Solución acuosa de violeta de metilo al 1 por 100 (C.I. 42535).
b) Solución yodada de Gram:
- Yodo sublimado .......... .... . . ..... .. .. . . . . . . . . . 1 g
-Yoduro potásico ....................... .. . . ... . . . 2g
-Agua destilada ............................. .. .. . . 100 ml
Disolver el yoduro potásico en una pequeña cantidad de agua, añadir el yodo y
disolver. Agregar el agua restante. .__
e) Tintura de yodo:
-Yodo sublimado ..... . .... . ...... .. . . .. . .. . . . . . . . . 2g
-Yoduro potásico .. .. .............. . .. ..... .. . . . . . 2g
-Agua destilada ............................... .. . . 2g
-Alcohol etllico 90 por 100 . ... . . .. . . . . .... . ... . .... . 74 ml
Disolver el yoduro potásico en el alcohol en caliente. Añadir el yodo y disolver.
el) Solución alcohólica yodada:

-Tintura de yodo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 ml
- Alcohol etílico absoluto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 ml
METODOS PARA LA DETECCION DE MICROORGANISMOS 283
e) Rojo neutro (C.I. 50040) al 1 por 100 en agua destilada.
Modo de operar:
2. Violeta de metilo al 1 por 100, durante 3 minutos.
3. Solución yodada de Gram, durante 3 minutos.
4. Lavar bien en agua corriente.
5. Diferenciar en solución alcohólica yodada hasta que cese la extracción de
color.
7. Rojo neutro al 1 por 100 durante 2 minutos.
8. Lavar en agua corriente .
9. Aclarar rápidamente en alcohol absoluto hasta eliminar el exceso de rojo
neutro. Secar con papel de filtro. Repetir hasta que el corte quede claro.
Montar.

-Gérmenes Gram (+) .. . .... . .... . . . .. . .... .. ...... Azul/Negro
-Gérmenes Gram (-) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo
-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo
• Observaciones:
1. Aunque existen múltiples variantes de la coloración de Gram para secciones
histológicas, el punto crucial de todos los métodos estriba en la diferen-
ciación en alcohol o acetona, de forma que es necesario ensayar cada
método en el laboratorio hasta precisar con exactitud los tiempos de dife-
renciación para cada uno de ellos.
2. Es conveniente la utilización de preparaciones de control que con-
tengan gérmenes tanto Gram positivos como Gram negativos, para
lo que en ocasiones debe utilizarse material biológico procedente de la ino-
culación intramuscular de animales de experimentación con cultivos micro-
biológicos.
1.2. Métodos para bacterias ácido-alcohol resistentes
Todos los microorgan ismos englobados bajo la denominación de micobacte-

rias ( «mycobacterium tuberculosis», «mycobacterium leprae», etc.) se demues-
tran con gran dificultad mediante la técnica de Gram, porque poseen una gruesa
cápsula protectora. Sin embargo, cuando se fuerza la entrada en su interior de
colorantes derivados de la fucsina utilizando calor, las micobacterias demuestran
una apetencia mayor de lo común por ellos resistiendo la diferenciación del
ácido, mientras que el resto de los tejidos, a excepción de los eritrocitos, se
decoloran por completo (técnica de Ziehi-Neelsen para bacilos ácido-alcohol
resistentes) .
Con todo, la tinción de Ziehl es en ocasiones negativa por la escasez de
bacilos presentes en la mayor parte de las muestras. En tal caso, puede optarse
entre demostrar su presencia mediante fluorescencia específica con auramina-
rodamina o con reacciones inmunohistoquímicas más específicas.
TECNICA DE ZIEHL-NEELSEN
Fijación: cualquier fijador, excepto líquido de Carnoy.
Soluciones:
a} Solución de Ziehl. Puede adquirirse en el mercado.
b} Solución diferenciadora:
- Alcohol de 70 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 00 mL
-Acido clorhídrico puro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 mL
e} Azul de metileno (C . l. 52015) al 1 por 1 OO.
Modo de operar:
1. Desparafinar e hidratar, o utilizar cortes en congelación .

2. Colorear con fucsina de Ziehl a 60 ce
durante 5 minutos o 1 hora a tem-
peratura ambiente.
3. Enjuagar con agua destilada .
4. Diferenciar en alcohol -ácido, hasta la decoloración casi completa del cito -
plasma (rosa pál ido) aproximadamente 5 minutos.
5. Lavar con agua corriente, durante 5 minutos.
6. Azúl de metileno al 1 por 1 00, 30 segundos.
7. Aclarar en agua destilada .
8. Deshidratar. aclarar y montar.
Resultados (fig . 16.2, véase páginas en color):

- Pigmento ceroide y bacilos ácidos-alcohol resistentes Rojo
- Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul
• Observaciones
1. La técnica, además de hacerse en tejidos, puede realizarse sobre secre-
ciones, esputos, orina, etc.
2. Siempre deben utilizarse preparaciones control positivas.
3. Para bacilos de la lepra:
- Diferenciar en ácido sulfúrico al 1 por 100 en alcohol de 70 por 100,
de 1 a 2 minutos.
- Tras lavar en agua corriente, dejar secar al aire . Aclarar en xileno. Montar.
J
METODO DE LA AURAMINA-RODAMINA PARA BACILOS

DE LA TUBERCULOSIS (KUPER Y MAY. 1960)
Fijación: formalina al 1 O por 1 OO.
Soluciones:
a) Solución de auramina-rodamina:
-Auramina O ........... . .... . ........ ...... ..... . 1.5 g
- Rodamina 8 ................... . .......... .. . . . . . 0.75 g
- Glicerina .... . ... . .. .. ................ ... ...... . 75.0 mL
-Cristales de fenol (fundidos a 50 oc) .............. . . . 10.0 mL
-Agua destilada . . . . .. .... .. .... ....... ........... . 50.0 mL
b) Solución de permanganato potásico al 0.5 por 100.
Modo de operar:
1. Desparafinar en xileno . No hidratar.
2. Colorear en la solución de tinción a 60 oc durante 1O minutos.
4. Diferenciar en alcohol ácido al 1 por 1 00 durante 2 minutos.
6. Lavar en solución de permanganato potásico al 0.5 por 100 durante 2
minutos.
7. Lavar brevemente en agua corriente y secar.
8. Lavar rápidamente en alcohol al 80 por 1 00; después, secar.
9. Completar la deshidratación en alcohol absoluto y aclarar en xileno.
1 O. Montar en medio específico para fluorescencia.
11. Examinar la preparación de inmediato.
Resultados:
- Bacilos de la tuberculosis ... ... .. . . . . .. . . Fluorescencia rojo-dorada
-Fondo ... .. .. . .. .. . ................. . Oscuro
- Artefactos ... ... . . .. . . . .. . . . . .. ..... . . Fluorescencia amarilla
1.3. Técnicas para la determinación de espiroquetas
Los microorganismos más importantes de este grupo son Treponema palli-

dum, causante de la sífilis y Leptospira icterohemorrágica. causante de la leptos -
pirosis o enfermedad de Weil. Pese a la gran dif icultad que plantea su demostra -
c ión sobre cortes histológicos, los métodos más útiles si guen siendo los de
impregnación argéntica, fundamentalmente el de Warthin -Starry y, en menor
grado, el de Levaditi.
METODO DE LEVADITI PARA ESPIROQUETAS
Fijación: formalina tamponada al 1 O por 1 OO. Bloques de 1 mm de espesor.
Tinción en bloque previa a la inclusión.
Soluciones:
a) Nitrato de plata al1.5 por 100 (autopsia) ó 3 por 100 (biopsias).
b) Solución reductora :
- Acido pirogálico ............. .. ... .. .... . ....... . 4g
- Formaldehído (37 -40 por 1 00) ..................... . 5 mL
-Agua destilada .... ......... . ....... . . . .......... . 95 mL
Modo de operar:
1. Lavar en bloque el tejido, tras haberlo fijado, en agua corriente durante 6
horas.
2. Etanol de 95 por 1 00, 24 horas.
3. Lavar en varios cambios de agua destilada durante 24 horas.
4 . Solución de nitrato de plata a 37 oc, 3 días en la oscuridad; cambiar la so-
lución de plata diariamente.
6. Solución reductora, 48 horas.
7. Lavar en agua destilada, 30 minutos.
8. Inclusión en parafina .
9. Cortes a 4 11m.
1 O. Montar y secar.
11 . Desparafinar, aclarar en xileno y montar.
Resultados:
-Espiroquetas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
-Fondo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pardo dorado
METODO DE WARTHIN-STARRY PARA ESPIROQUETAS
Fijación: formalina neutra o tamponada. No utilizar fijadores con ácido eró-
mico. Cortes en parafina a 4 micras.
Soluciones:
a) Solución tampón:
-Acetato sódico ............ .... . . .... . ........ . .. . 1.64 g
- Acido acético ............ . . . ... ... .......... . ... . 2.5 mL
-Agua destilada .................................. . 200.0 mL
b) Solución de plata:
-Nitrato de plata . . . .... . .... . .. . ... . ..... . . . ..... . 0.5 g
-Solución tampón . . . ... . . . . .. .. . . ..... . .......... . 50.0 mL
e) Soluciones de desarrollo:
Solución 1:
- Hidroquinona . . . . .. . . . ......... . ..... .. .... · · .. . 0 .3 g
-Solución tampón .... . .. . .... .. ........ . ... . . . .. . 10.0 mL
Se toma 1 mL de esta solución y se mezcla con 15 mL de solución de gelatina
pura al 5 por 100 a 37 oc (5 g de gelatina en 100 mL de solución tampón) . Al -
macenar a 37 oc.
Solución 11:
-Nitrato de plata al 2 por 100 en solución acuosa a 60 oc . 3 mL
Mezclar las soluciones 1 y 11 inmediatamente antes de usar.
Modo de operar:
1. Desparafinar en xileno e hidratar hasta agua destilada.
2. Lavar bien en solución tampón .
3. Teñir en la solución de plata a 1 por 100 (solución B) durante una hora a
60 °C.
4. Desarrollar las secciones en la solución de trabajo durante 3 minutos a
60 °C.
5. Lavar en agua corriente a 60 °C.
6. Lavar los cortes en la solución tampón .
Resultados:
- Espiroquetas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
-Fondo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Amarillo pardusco
• Observaciones
1. El punto esencial de la técnica es el desarrollo de la coloración.
Para evitar sobretinción o defectos en la tinción deben realizarse varias pre-
paraciones modificando el tiempo de desarrollo, así como preparaciones
positivas de control.
2. COLORACIONES PARA HONGOS
Los hongos son microorganismos vegetales que pueden causar enfermeda -

des en determinadas condiciones (hongos patógenos) . Se clasifican de acuerdo
con su morfología en :
1. Filamentosos (hifas) .
2. Con esporas.
3. Filamentosos con esporas.
Cuando en la técnica histológica es necesario demostrar la presencia de
hongos, no suele ser posible su identificación específica . En general, son PAS y
Gram positivos en el caso de formar hitas y PAS positivos y Gram negati-

vos en caso de encontrase en forma de esporas. Un método bastante utilizado
para su demostración en la técnica de la plata metenamina que, junto con el
PAS, colorea los hidratos de carbono presentes en la cápsula .
METODO DE GROCOTT PARA LA IDE'NTIFICACION DE HONGOS
Fijación: formalina al 1O por 1 OO.
Soluciones:
a) Solución de ácido crómico al 5 por 100.
b) Solución de bisulfito sódico 1 por 100.
e) Solución de nitrato de plata metenamina.
- Nitrato de plata al 5 por 100 ...................... . 5 mL
- Metenamina al 3 por 100 ... .. ................... . 100 mL
La mezcla forma un precipitado negro que se disuelve imediatamente por agi-
tación brusca. Debe permanecer almacenado en refrigerador a 4 oc.
- Solución de almacenamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 mL
- Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 mL
- Borato sódico al 5 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 mL -
Reconstituir inmediatamente antes de usar.
d) Solución de cloruro de oro al 1 por 1 OO.
e) Solución de tiosulfato de sodio al 2 por 100.
f) Solución verde luz:
-Verde luz amarillento (C. l. 42095) ............ . ... . . 0.2 g
-Agua destilada ................................. . 100.0 mL
- Acido acético glacial ....... .. ... ................ . 0.2 mL
-Solución de almacenamiento ...................... . 10.0 mL
-Agua destilada .............................. . .. . 50.0 mL
Modo de operar:
1. Desparafinar e hidratar las secciones en agua destilada.
2. Acido crómico al 5 por 100, durante 1 hora .
3. Lavar cuidadosamente con agua corriente .
4. Bisulfito sódico al 1 por 100 durante 1 minuto, para extraer cualquier re -
siduo de ácido crómico.
5. Lavar con agua corriente 5 minutos.

6. Lavar con agua destilada cuatro veces.
7. Dejar en contacto con la solución de trabajo de metenamina a 60 oc du-
rante 1 hora o hasta que las secciones se tornen de color marrón-amari-
lento. Si no ocurre este cambio, fabricar una nueva solución de ácido eró-
mico.
8. Lavar 6 veces con agua destilada.
9. Cloruro de oro al 0.1 por 1OO.
1 O. Lavar en agua destilada.
11. Sodio tiosulfato al 2 por 100 durante 5 minutos para extraer la plata no
reducida.
13. Contrastar con la solución de trabajo de verde luz durante 30 segundos.
Resultados:
-Hongos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Negro
- Tinción de fondo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Verde pálido
- Mucina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gris
• Observaciones
Cuando las secciones se tornan marrones (paso 7). examinar al microscopio el
control para chequear la tinción .
TINCION DE GRIDlEY PARA lA JDENTIFICACION DE HONGOS
Fijación: cualquier buen fijador de tejidos.
Soluciones:
a) Solución de ácido crómico:
-Acido crómico (Cr0 3 ) • • • • . . • • . . • . . . . • . . . . • • • • • • • • • 4g
Precaución: solución cáustica.
b) Solución de metabisulfito y reactivo de Schiff (véase técnica de PAS) .
e) Solución de fucsina aldehído (estable durante 1 mes):
- Fucsina básica (o pararrosanilina) ... .. .... . .... . ... . . 1 g
-Alcohol 70 por 1 00 .. . . . . ...... .. . . ...... .... . .. . . 200 mL
- Paraldehído . . . ... .... . .. .. . . .... . ... . .... . .... . . 2 mL
- Acido clorhídrico concentrado . .. ... . .. ... ... .. . .... . 2 mL
Dejar a temperatura ambiente durante 3 días hasta que vire el color de la
solución a azul intenso. Después. almacenar en un refrigerador. Filtrar y calentar a
temperatura ambiente antes de usar.
d) Solución de metanil amarillo al 25 por 100:

- Metanil amarillo ............. . ......... . .... . .... . 0.25 g
-Agua destilada . .. . . . .. . .. . . . . .. . . . .. .. . ......... . 100.00 mL
- Acido acético glacial ..... . .. . . .. . . ... . . . . .. . . . ... . 0.25 g
Modo de operar:
1. Desparafinar e hidratar los cortes.
2. Oxidar con ácido crómico al 4 por 100, 1 hora a temperatura ambiente.
3. Lavar bien con agua corriente 5 minutos; seguidamente, en agua destilada.
4. Reactivo de Schiff, 15 minutos.
5. Lavar 3 veces con metabisulfito, 2 minutos cada vez.
6. Lavar durante 15 minutos con agua corriente; lavar después con agua des-
tilada.
7. Colocar los portaobjetos en solución de aldehido-fucsina, 30 minutos.
8. Lavar el exceso de tinción con etanol del 50 por 100, un cambio.
9. Lavar bien en agua.
1O. Contrastar ligeramente con solución de metanil amarillo, 1 minuto.
Resultados:
-Micelios Azul oscuro
- Conidias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rosa a púrpura
- Tinción de fondo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Amarilla
-Tejido elástico y mucina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul oscuro a púrpura
-Hongos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo a púrpura.
- Cápsula de levadura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Púrpura intenso
3. COLORACIONES PARA DEMOSTRACION DE VIRUS
La demostración de partículas virales por microscopia electrónica y la de sus

antígenos específicos por inmunohistoquímica han desplazado las técnicas clá-
sicas de coloración, entre ellas al método de la floxina-tartracina de Lendrum
para inclusiones virales y al de la orceína de Shikata para las células hepáticas
infectadas por el virus de la hepatitis B. No obstante, por su interés histórico
desarrollamos a continuación este último procedimiento técnico.
METODO DE LA ORCEINA DE SHIKATA
Fijación: formalina al 1 O por 1 OO. Cortes en parafina .
Soluciones:
a) Solución ácida de permanganato:
- Permanganato potásico .... . ............ . . .. . . .... . 1.5 g
- Acido sulfúrico concentrado .................. . .... . 1.5 mL
-Agua destilada . . ... . . .. .. . .. .. .... . ....... .. .. . . . 100.0 mL
b) Solución de orceína:
-Orceina ... . ...... . . .... ... .. ......... . ... . .... . 1.0 g
- Acido clorhidrico concentrado ....... . .... . .. . ...... . 1.0 mL
- Etanol al 70 por 1 00 .... . ................. .. ..... . 100.0 mL
El pH de la solución debe estar comprendido entre 1 y 2.
e) Solución acuosa de ácido oxálico al 1.5 por 100.
Modo de operar:
2. Tratar con la solución ácida de permanganato durante 1 O minutos (este
tiempo puede ser ajustado según los resultados obtenidos sobre las prepa-
raciones de control).
3. Blanquear en la solución de ácido oxálico hasta aclaramiento total.
4. Lavar durante 5 minutos en agua destilada.
5. Teñir en la solución de orceina durante 4 horas a temperatura ambiente.

- Ce/u/as infectadas por virus hepatitis 8 . . . . . . . . Pardo a negro
- Fondo .. : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Amarillento -pardusco
Figura 16.3. Presencia de depósitos parduscos intracitoplasmáticos en

los hepatocitos infectados con el VHB (Orceína de Shikata x 20) .
• Observaciones:
Para mejorar el resultado se recomienda emplear orceína sintética en lugar de
los complejos naturales.
4. COLORANTES PARA PARASITOS
Los parásitos que más frecuentemente se encuentran en secciones tisulares

son los del paludismo, huevos de helmintos y amebas. Los primeros se colorean
con la técnica de Giemsa,· los huevos de helmintos y las amebas se demuestran
con las técnicas del PAS, hematoxilina férrica de Heidenhain y hematoxilina
ácida fosfotúngstica.
CAPITULO 17
Histoenzimología
GUION DE CONTENIDOS
1. CONCEPTO DE HISTOENZIMOLOGIA
2. CLASIFICACION DE LAS ENZIMAS
3. FIJACION INCLUSION DEL MATERIAL Y CONSERVACION
DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
4. FUNDAMENTO GENERAL DE LAS TECNICAS
HISTOENZIMOLOGICAS
5. PRINCIPALES PROBLEMAS GENERALES QUE PLANTEAN
LAS TECNICAS HISTOENZIMOLOGICAS
6. CONTROLES GENERALES EN HISTOENZIMOLOGIA
6.1. Detección de falso positivos
6.2. Detección de falso negativos
7. APLICACIONES ACTUALES DE LA HISTOENZIMOLOGIA
8. METODOS PARA DETERMINAR HIDROLASAS:
DETERMINACION DE FOSFATASAS Y COLINESTERASA
8.1. Método de la copulación con sales de diazonio para
fosfatasas alcalinas
8.2. Técnicas histoenzimológicas para determinación de
fosfomonoesterasas ácidas
8.3 . Métodos histoenzimológicos para la detección de
fosfatasas específicas: ATPasa, 5-nucleotidasa
y glucosa-6fosfatasa
8.4. Controles para las técnicas de fosfomonoesterasas

9. TECNICAS HJSTOENZIMOLOGICAS PARA DETERMINAR
ESTERASAS CARBOXJLICAS
9.1. Técnica para determinación de Jos tres tipos de
esterasas carboxilicas {actividad esterásica
no especifica)
9.2. Demostración de la actividad esterasa no especifica
sobre material incluido en parafina: método de la
pararrosanilina
9.3. Técnicas histoenzimológicas para determinación
de colinesterasas
10. METODOS PARA LA DEMOSTRACION DE
OXIDORREDUCTASAS
10.1. Métodos para la determinación de dopa-oxidasa
{tirosinasa)
10.2. Técnicas histoenzimológicas para la determinación
de citocromo-oxidasa: método de Seligman y cols.
de deshidrogenasas
10.4. Técnicas histoenzimológicas para la demostración
de diaforasas {NADH y NADPH reductasas)
de peroxidasas
HISTOENZIMOLOGIA 295
1. CONCEPTO DE HISTOENZIMOlOGIA
Como es sabido, las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que se

encuentran en los tejidos cuya misión consiste en catalizar las reacciones bio -
químicas que ocurren en las células para que éstas puedan realizar sus fun-
ciones.
la histoenzimología es la rama de la histotecnología que tiene por
objeto demostrar la actividad enzimática presente en un tejido. Para
ello se emplean diversas sustancias (cromógenos) que, bajo la acción
de la enzima, adquieren una coloración determinada indicativa de la
presencia de dicha enzima.
La actuación óptima de las enzimas se produce en condiciones muy precisas
de pH y temperatura, que varían para cada una de ellas y lejos de las cuales las
enzimas pierden progresivamente actividad, hasta quedar anulada ésta por enci-
ma de 45 oc. Por lo mismo, a temperaturas inferiores a 25 oc la capacidad de
actuación de las enzimas se reduce a niveles muy bajos.
2. ClASIFICACION DE lAS ENZIMAS
Las enzimas se suelen clasificar según el tipo de reacción o sustrato cuya

descomposición catalizan. La enumeración de todos los tipos de enzimas exce-
dería los límites de este capítulo; por ello nos limitaremos a mencionar algunos
de los más importantes:
1. HIDROlASAS: son enzimas que catalizan reacciones de hidrólisis, en
las cuales un compuesto orgánico complejo se escinde en dos compues -
tos más sencillos rompiéndose un enlace en el que se fijan los elementos
de una molécula de agua . Dentro de ellas se distinguen los siguientes
tipos:
- Glucidasas, que intervienen en la hidrólisis de los glúcidos.
- Esterasas, que catalizan la descomposición de los ésteres, como las
grasas.
- Proteasas, que actúan en la hidrólisis de las proteínas y péptidos.
2. OXIDORREDUCTASAS: son enzimas que, como su nombre ind ica,
intervienen en las oxidaciones y reducciones celulares, determinando la
transferencia de oxígeno o hidrógeno de unos compuestos a otros. Den-
tro de este grupo se distinguen, entre otras:
- Deshidrogenasas, que transfieren átomos de hidrógeno de un com -
puesto (dador de hidrógeno} a otro (aceptar de hidrógeno).
- Oxidasas, que catalizan la fijación del oxígeno molecular sobre el
hidrógeno del sustrato.
3. TRANSFERASAS: catalizan la transferencia de un grupo funcional
desde una molécula a otra . A este grupo pertenecen, entre otras, las
siguientes enzimas:
- Transmetilasas, que separan el grupo metilo de una molécula, como
la metionina o la betaína, y lo transportan a otra molécula .
- Transaminasas, que transfieren los radicales ami no de un aminoáci-

do a un ácido cetónico.
- Fosfomutasas, que transfieren un radical fosforilo de una parte a
otra de una misma molécula .
4. LIASAS: son enzimas que catalizan la ruptura de enlaces C-C, C- N, C-0

y C-S dando compuestos sencillos (C0 2 , NH 3 , H2 0 , etc.) . Entre las
principales liasas cabe señalar:
- Descarboxilasas de aminoácidos, que catalizan la transformación de

aminoácidos en aminas.
- Aldolasas, que catalizan la ruptura de las hexosas fosfato dando
origen a dos triosas fosfato .
5. LIGASAS O SINTETASAS: son enzimas que catalizan reacciones de

síntesis de moléculas complejas a través de la unión de dos o más
simples. Así, por ejemplo, las carboxilasas fijan el C0 2 sobre un ácido
cetónico.
6. ISOMERASAS: son enzimas que catalizan una isomerización, es decir,
la transformación de un compuesto en otro con la misma fórmula empíri -
ca pero con distinta estructura . Así, por ejemplo, las racemasas catalizan
la transformación de un aminoácido de la forma L en un aminoácido de
la forma D, mientras que las epimerasas provocan interconversiones en
las hexosas: galactosa en glucosa .
3. FIJACION INCLUSION DEL MATERIAL Y CONSERVACION

DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Como hemos dicho, la actividad enzimática sólo está presente en tejidos

vivos, y ello plantea graves inconvenientes a la hora de su análisis histológico.
Por lo mismo, los métodos ideales de fijación para realizar estudios histoenzimo-
lógicos son la criosustitución y la criodesecación.
En síntesis, la criodesecación consiste en extraer el agua de los tejidos
mediante su exposición al vacío tras congelación previa en nitrógeno líquido
(liofilización) . (Para más detalles, véase el capítulo dedicado a la fijación tisu-
lar) . La criosustitución se fundamenta en sustituir el agua del tejido por un
líquido de sustitución (en este caso, polietilenglicol) a muy baja temperatura,
por lo que la actividad enzimática no se altera y el tejido queda incluido y
dispuesto para ser cortado en congelación.
En determinadas circunstancias es posible realizar la fijación del tejido con
algunos líquidos fijadores como el formol tamponado al 1 O por 100 helado o el
formol cálcico que inactivan escasamente a algunas enzimas. Sin embargo, el 90
por 100 de los estudios se realizan siguiendo un sistema más sencillo: el corte en
congelación mediante criostato a - 20 oc, previa congelación en nitrógeno
líquido o isopentano a - 50 oc. Cuando se realizan cortes criostáticos es
fundamental fijar los cortes con acetona al 100 por 100, la cual sirve además
para deshidratar y favorecer las ulteriores técnicas de colorac ión empleadas
como contraste, sin mod if icar sensiblemente la actividad enzimática .
En relación con la inclusión previa a la obtención de cortes en el micrótomo,

existen tres alternativas principales:
1. Imbibición en algún medio hidrosoluble de tipo OCT antes de la conge-
lación para obtener secciones criostáticas.
2. Inclusión en gelatina o polietilenglicol que no necesitan extracción del
agua tisular ya que ambas sustancias son solubles en ella.
3. Inclusión en parafina de bajo grado de fusión (en torno a 40 °C) : en este
caso la actividad enzimática se conserva relativamente. Como agente
deshidratante se utiliza la acetona .
4. FUNDAMENTO GENERAL DE LAS TECNICAS

H ISTOENZI MOLOGICAS
Como ya se ha mencionado, pese a que las enzimas no se perciben con los

métodos histológicos convencionales, pueden ser detectadas el actuar como
catalizadores de reacciones químicas, pues la acción de la enzima sobre un
sustrato adecuado produce una sustancia insoluble, opaca o coloreada, visible al
microscopio. El producto inicial de la reacción entre enzima y sustrato recibe la
denominación de producto primario de reacción (PPR). Cuando el PPR no es
opaco o está desprovisto de color, necesita ser ligado a otra sustancia o cromó-
foro mediante una segunda reacción, de forma que se genere un producto final
coloreado (PFR). En el primer caso, el mecanismo de coloración recibe el
nombre genérico de método de captura simultánea, y en el segundo, el de
método postcopulación (fig . 17.1 ).
1 ESQUEMA DE LA REACCION ENZIMA-SUSTRATO n
1 ENZIMA ~
'U /EOLOREAOO~
SUSTRATO ~..~PPR ~.,-------:---::-::----,---~ 1
'~O COLOREADq
~
1 CROMOGENO ~-1
CROMOFORO ~ + PPR ~ 1
IPFR h
Figura 17.1 . Representac ión esquemática del fundamento general de las

técnicas de histoenzimología : método de la captura simultánea y método
postcopulación (véase texto) . Abreviaturas: PPR = Producto primario de la
reacción . PFR = Producto final coloreado .
Otras formas de realizar la demostración de la actividad enzimática de un

tejido, empleadas no obstante con mucha menor frecuencia , son el método de
precipitación del colorante (en el cual la enzima provoca el depósito de un
colorante previamente soluble en agua mediante la eliminación del grupo hidro-
fílico de su molécula) y el método de reagrupamiento intramolecular (basado en

la creación, dentro del sustrato y por la propia acción enzimática, de los grupos
cromóforos que originan el color) .
5. PRINCIPALES PROBLEMAS DE LAS TECNICAS

HISTOENZIMOLOGICAS
Los problemas que plantean las técnicas histoenzimológicas son, principal -

mente:
1. La excesiva rigidez de las condiciones en que hay que realizar las técni-
cas, debida a que las reacciones enzimáticas ocurren tan sólo a pH y
temperatura determinados. Ello plantea importantes problemas metodo -
lógicos que exigen al técnico de laboratorio el dominio de los métodos
para realizar soluciones tampón y para manejar el pH neutro.
2. La frecuente aparición de falsos negativos, o preparaciones en las cuales,
a causa de una alteración de las cond iciones de temperatura o pH o de
una mala realización técnica, no se demuestra la actividad enzimática por
encontrarse inactivada.
3. La aparición de falsos positivos, que puede estar motivada por:
a) La difusión de enzimas de unos territorios a otros, por lo que se
desplaza igualmente el área de positividad .
b) La presencia de elementos naturales que interfieren bloqueando el
sustrato, con lo cual la reacción de coloración no ocurre ..
e) Contaminación bacteriana, ya que las bacterias contienen enzimas
que pueden intervenir en la reacción en lugar de sus homónimas
tisulares.
d) Adsorción inespecífica por el tejido de algunos reactivos (funda-
mentalmente metales pesados), debido a una atracción en superficie
similar a la que ocurre en determinadas impregnaciones metálicas.
6. CONTROLES GENERALES EN HISTOENZIMOLOGIA
Se basan en la confección de preparaciones que persiguen específicamente

detectar tanto los falsos positivos como los falsos negativos.
6.1. Detección de falsos positivos
1. Eliminación de la actividad enzimática por acción del calor. Incubando la

enzima a alta temperatura (60-90 oq se produce su inactivación; por
tanto, si en la preparación control la técnica es positiva, lo coloreado en
ella no se debe a actividad enzimática, sino a otra causa .
2. Baño de incubación desprovisto de sustrato: si la técnica es positiva, el
resultado no se debe a la actuación específica de la enzima sobre el
sustrato, sino a un falso positivo.
6 .2 . Detección de falsos negativos
Por lo común se realiza aplicando simultáneamente el procedimiento técnico

al tejido problema en el que se pretende determinar la actividad enzimática y a
un tejido control cuya actividad enzimática es conocida . Esta última preparación
actúa como testigo de una correcta manipulación técnica y confirma la validez
del metodo.
7. APLICACIONES DE LA HISTOENZIMOLOGIA
Desde la introducción de la inmunohistoquímica en la práctica histotecnoló-

gica de rutina, los métodos histoenzimológicos han ido perdiendo terreno. La
razón es que resulta más sencillo determinar la presencia de una enzima aten -
diendo a su estructura antigénica por métodos inmunológicos que determinarla
por su actividad biológica . Sin embargo, las aplicaciones secundarias de la
histoenzimología para demostrar mediante anticuerpos marcados específica-
mente con enzimas la existencia de una reacción inmune previa, constituye la
base de la inmunohistoquímica, técnica hoy día esencial en anatomía patológi-
ca, biología celular e inmunología y a la cual se dedican los capítulos siguientes.
Con todo, la determinación de la actividad enzimática de un tejido todavía
conserva vigencia en :
1. La biopsia de músculo esquelético.
2. La detección de ganglios y tejido nervioso en el diagnóstico de la enfer-
medad de Hirschprung.
3. La demostración de defectos enzimáticos en la biopsia yeyunal.
4. La identificación de células del sistema hematopoyético.
5. La demostración de los mastocitos.
6. La identificación de actividad osteoblástica .
7. La realización de estudios neurohistológicos complejos.
8. METODOS PARA DETERMINAR HIDROLASAS: DETERMINACION

DE FOSFATASAS Y COLINESTERASA
Considerando que los ésteres se originan por la un ión de dos moléculas

orgánicas, una de alcohol y otra de un ácido orgánico con pérdida de una
molécula de agua, las esterasas son enzimas que invierten dicha reacción es
decir, que desdoblan los ésteres en ácido orgánico más alcohol.
o o
11 11
R'-OH + OH-C- R" +-+ R'-0-C- R" + H2 0
alcohol ácido éster
Depend iendo del tipo de ácido que intervenga en la reacc ión, existen dos
grandes grupos de ésteres:
a) Esteres carboxílicos: producidos por la unión de ácidos orgánicos
provistos de grupos carboxilo con diversos alcoholes y
b) Esteres fosfóricos: compuestos de ácido fosfórico y grupos alcohóli-

cos diversos.
En función de ello, se distinguen asimismo dos tipos de esterasas: las carbo-
xílicas, que desdoblan a los primeros: por ejemplo la lipasa, que actúa sobre las
grasas neutras, y la colinesterasa, que lo hace sobre los ésteres de colesterol; y
las fosfomonoesterasas, que reaccionan con los ésteres fosfóricos, como por
ejemplo el glicerofosfato.
FOSFOMONOESTERASAS
El sustrato de actuación para estas enzimas puede ser cualquier éster fosfóri -
co que, por su acción, es desdoblado en alcohol alifático o fenol , incluyendo
una molécula de agua que se consume en la reacción . Se trata, por tanto, de una
enzima hidrolítica.
En los mamíferos existen varias enzimas del tipo de las fosfomonoesterasas,
todas ellas con funciones similares; sin embargo, se dividen según su ámbito de
actuación en fosfomonoesterasas no específicas, capaces de catalizar la hidróli-
sis de múltiples ésteres fosfóricos, y fosfomonoesterasas específicas, que actúan
exclusivamente sobre un sustrato específico. Por otra parte, y dependiendo de
su pH óptimo de actuación, estas enzimas se dividen en:
1. Fosfatasas alcalinas, con pH óptimo entre 8.8 y 9.2.
2. Fosfatasas ácidas, con pH óptimo entre 4 .8 y 5.2.
De entre las fosfatasas no específicas, la fosfatasa alcalina es la que tiene
mayor interés para ser determinada por histoenzimología, ya que constituye uno
de los métodos de elección en el marcaje enzimático de anticuerpos utilizados
en diversas técnicas inmunohistoquímicas.
El método del glicerofosfato, que era el más clásico para la determinación de
fosfatasa alcalina ha sido totalmente desplazado en la actualidad por las técnicas
que emplean la copulación con sales de diazonio.
8.1. Método de la copulación con sales de diazonio

para fosfatasas alcalinas
Las sales de diazonio tienen la propiedad de unirse a aminas o alcoholes

aromáticos, resultando de esta unión un colorante azoico. Así. la fosfatasa
alcalina actúa sobre un éster fosfórico (sustrato) desdoblándolo en alcohol
aromático más ácido fosfórico . El sustrato utilizado es el naftol -fosfato (fig .
17.2a).
En una segunda fase, el naftol se combina con una sal de diazonio para
originar el colorante azoico - fig . 17.2b- (véase, además, técnica general de
copulación con sales de diazonio en el capítulo sobre histoquímica de proteí-
nas) .
A)
Fosfatasa alcalina
H,O
+ Na 2 HPO,
Naftol - fosfato Naftol
B) OH
N= N
Naftol Sal de diazonio Colorante azoico
Figura 17 .2. A) Primera fase de la reacción de la fosfatasa alcalina. B)

Segunda fase de la reacc ión .
METODO DEl NAFTOl-BIFOSFATO
Fijación: formalina tamponada al 1 O por 100 enfriada a 4 oc durante 18-24 horas,
o acetona en idénticas condiciones. Cortes criostáticos.
Soluciones:
a) Solución M de carbonato sódico:
-Carbonato sódico (Na.C0 3 .1 O H 2 0) ............... . . . 28.61 g
-Agua destilada ... . .... . ... . ... .. .. . .... . ...... . . . 100.0 ml
b) Solución Tris-buffer 0 .2 M a pH 8.32.
Solución 1:
- Tris (hidroximetil) -aminometano .... . ........... . .. . 2.42 g
- Agua destilada .. . . ...... . ... . .................. . 100.0 ml
Solución 11: Acido clorhídrico O. 1 N se prepara :
- Acido clorhídrico concentrado .. . . . .... . .. . ........ . 0 .85 ml
- Agua destilada . . ............ . .. . .. .. .... . ...... . 100.0 ml
-Solución 1 .. . . .. . . .. . . . ..•....•... . . . .....•. . .. 25.0 ml
-Solución 11 . . .... ... . . . . .. • ... . •....•........... 20.0 ml
- Agua destilada .............. . ..... . ... . .. . .... . . 55.0 ml
e) Solución de naftol AS-bifosfato .
Solución stock:
- Naftol AS-bifosfato 25.0 mg
-N: N dimetilformamida ... . . ... ................... . 10.0 ml
302 LABORATORIO DE ANATOMIA PATO LOGICA
-Agua destilada ....................... .. ... .. .... 10.0 mL

-Carbonato de sodio M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 -6 gotas
Mezclar en este orden . El carbonato debe añadirse lentamente hasta pH
8.0. Añadir entonces:
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300.0 mL
-Tris-buffer pH 8.32 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180.0 mL
La solución debe ser ligeramente opalescente y estable durante varios meses.
d) Solucion de incubación:
-Solución stock ....... . ........ . ........... . . . . . . 10.0 mL
- Fast red TR (C. l. 37085) ... . ....... . ............. . 10.0 mg
Mezclar bien, filtrar y usar de inmediato. El pH final del medio de incubación
debe estar entre 9.0 y 9.4.
Modo de operar:
1. Hidratar (desparafinar si es necesario) .
2. Solución de incubación 5-15 minutos a temperatura ambiente.
3. Lavar en agua.
4. Contrastar núcleos (Hematoxilina) .
5. Lavar bien en agua.
6. Montar en medio acuoso.

-Lugares con actividad fosfatasa alcalina Rojo
• Observaciones:
El pH final de la solución de incubación estará en torno a 9.2. Si se emplean
cortes de tejido incluido en parafina, el tiempo de incubación debe ser alargado
notablemente.

de fosfomonoesterasas ácidas
Las bases teóricas de estas técnicas son idénticas a las indicadas para las
fosfatasas alcalinas, salvo que el pH de actuación óptimo para las primeras es
ácido.
En cuanto a la fijación e inclusión del tejido, hay que tener en cuenta que las
fosfatasas ácidas son generalmente inactivadas por los alcoholes, los
cuales deben ser eliminados en la fijación y deshidratación de los tejidos. Por
ello, el fijador de elección, y deshidratante ideal, es la acetona a 4 y, alternati - oc
vamente, cortes criostáticos.
Si se real iza inclusión en parafina debe utilizarse la de bajo punto de fusión
(42 °C) ,
TECNICA DEL NAFTOL AS-BIFOSFATO

Este método, establecido por Burnstone tiene la gran ventaja de que el
producto de la hidrólisis enzimática es extremadamente insoluble, lo cual permi -
te la deshidratación en alcohol y el montaje con xileno. Sin embargo tiene el

inconveniente de que su realización es bastante compleja .
Fijación: formalina tamponada al 1 O por 100 (pH 7 .2) a 4 °C, 18-24 horas.
Cortes criostáticos secados al aire durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
Soluciones:
a) Solución de sustrato:
- Naftol AS-bifosfato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 mg
- N:N dimetilformamida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 ml
b) Tampón acetato-veronal (solución stock) :
- Acetato sódico (NaC2 H 3 0 2 .3H 2 0) ... . .. . ... . ... . .. . . . 9.714 g
- Barbiturato sódico ...... . ...... . . . ... . .. .. .... .. . . 14.714g
-Agua destilada . . . .. .... . ......... . ......... .. ... . 500.0 ml
Almacenar en refrigerador.
e) Solución de nitrito sódico al 4 por 100:
-Nitrito sódico ........ . ................... . . . ... . . 0.4 g
-Agua destilada .. ... . . . . ................ . ........ . 10.0 ml
Disolver sólo inmediatamente antes de su uso.
d) Solución de pararrosanilina hexazotizada:
-Cloruro de pararrosanilina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g
- Acido clorhídrico concentrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 ml
Disolver la pararrosanil ina en el agua y añadir el ácido clorhídrico. Calentar,
enfriar y filtrar. Almacenar en refrigerador.
e) Solución de incubación:
- SoluciónA ...................................... 0.5 ml
- SoluciónB.......................... ........... 2.5 ml
-Solución C ......................... 0.4 ml
Tomar .. 0.8 ml
-Solución D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.4 mi
El pH final debe estar entre 4.4 y 5. Si es necesario, ajustar con hidróxido
sódico 0.1 N.
Modo de operar:
1. Incubar en la solución E durante 15-60 minutos a 37 °C.
3. Montar en medio acuoso o deshidratar muy rápidamente: aclarar y montar
en Eukin.
Resultados:
-Lugares con actividad fosfatasa ácida . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo
• Observaciones:
Si se desea contrastar núcleos, puede hacerse tras el paso 2 con azul de meti -
leno al 1 por 100 o verde de metilo al 2 por 1 OO.
METODO DE LA COPULACION DIRECTA CON SALES DE DIAZONIO

Es mucho más simple que el anterior, aunque el producto de la reacción es
poco estable y el precipitado de menor intensidad .
Fijación: formol cálcico a 4 oc. Secciones criostáticas.
Medio de incubación:
- Alfa - naftol fosfato sódico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 O mg
- Tampón acetato 0.1 M a pH 5.0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 O mL
- FastGarnetGBC ... . ....................... ...... 10mg
La solución se realiza disolviendo el naftol fosfato en el tampón añadiendo la
sal de diazonio. Se filtra y se utiliza inmediatamente.
Modo de operar:
1. Incubar a 37 oc durante 15-60 minutos.
3. Contrastar en verde de metilo al 2 por 1OO.
Resultados:
-Actividad fosfatasa ácida Rojo
- Núcleos . .. . . . . .... . .. . . .. .. ... .. . ... . . . .. . . . . . . Verde
8.3. Métodos histoenzimológicos para la detección de fosfatasas

específicas: ATPasa, 5-nucleotidasa y glucosa-6-fosfatasa
METODO DEL CALCIO PARA LA DETERMINACION DE ATPasa

Se fundamenta en el desdoblamiento enzimático del ATP mediado por la
ATPasa, en ADP y ácido fosfórico, el cual reacciona con los iones cálcicos
formando fosfato cálcico insoluble, que es convertido en fosfato de cobalto y
ulteriormente en sulfuro de cobalto (véase capítulo 32) .
METODO DE PLOMO PARA LA DETERMINACION

DE 5-NUCLEOTIDASA
Se fundamenta en la actuación de la 5-nucleotidasa sobre el sustrato
adenosín - 5 -fosfato para, en presencia de magnesio, producir iones fosfato que
son conjugados con plomo iónico a fin de formar precipitados de fosfato de

plomo. Estos últimos son convertidos mediante el sulfuro amónico en sulfu ro de
plomo insoluble.
Fijación: Formalina cálcica a 4 C o secciones criostáticas no fijadas. En el primer
caso debe teñirse según técnicas de cortes flotantes sobre secciones obtenidas en
micrótomo de congelación. Por ello es de elección el segundo método.
Soluciones:
a) Solución de incubación:
- Solución de adenosina-5 fosfato al 1.25 por 100 . . . . . . . . 4 .0 mL
- Solución Tris - buffer 0 .2 M a pH 7 .2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 .0 mL
- Nitrato de plomo al 2 por 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 .6 mL
- Sulfato magnésico 0 .1 M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 .0 mL
- Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 .5 mL
Modo de operar:
1. Incubar en la solución de sustrato entre 30 minutos y una hora a 37 oc.
2. Fijar en formol salino al 1 O por 100 si se han empleado secciones criostáti -
cas no fijadas.
3. Lavar repetidamente en agua destilada.
4. Solución de sulfuro de amonio al 1 por 100 durante tres minutos.
5. Lavar bien en agua destilada.
6. Montar en medio acuoso .

- Actividad 5 -nuc/eotidasa Depósitos pardo -negruzcos
Figura 17.4. Punteado pardo - negruzco que evidencia la actividad 5 - nu -

cleotidasa en linfocitos 8 ( x 60) .
METODO DE PlOMO PARA lA DETERMINACION

DE GlUCOSA-6 - FOSFATASA
Este método se basa en la hidrólisis de la glucosa-6-fosfato para producir el
depósito de sales insolubles de plomo por un mecanismo equivalente al de la
técnica anterior.
Fijación: ninguna. Secciones criostáticas.
Soluciones:
-Solución de glucosa -6-fosfato al 0.125 por 100 ... ..... . 4.0 mL
-Solución tampón de Tris-maleato a pH 6.7 ............ . 4.0 mL
-Solución de nitrato de plomo al 2 por 1 00 . . . ..... ... . . 0.6 mL
-Agua destilada ...... .. .... .. ... ... ....... . .. .... . 1 .4 mL
b) Solución de tampón Tris-maleato.
Solución de stock 1:
-Tris hidroximetilaminometano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.42 g
- Acido maleico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.32 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 00.0 mL
Solución de stock 11:
-Hidróxido sódico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 .8 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 00.0 mL
Solución de trabajo a pH 6. 7:
-Solución 1 •••••••••.••.•.••.••••••••••••••••••• 25.0 mL
-Solución 11 ..... . .•....• ... . . ...... ... .......... 21 .9 mL
Completar con agua destilada hasta 100 m l. Comprobar el pH.
Modo de operar:
1. Incubar en la solución de glucosa-6-fosfato entre 5 y 20 minutos.
2. Lavar en dos cambios de agua destilada de 2 minutos cada uno.
3. Tratar los cortes con sulfuro amónico al 1 por 100 durante 2 minutos.
5. Fijar en formaldehldo al 1O por 100 durante 15-30 minutos.
Resultados:
-Actividad glucosa-6-fosfato . . . . . Coloración pardonegruzca
• Observaciones:
La coloración es más intensa si se utilizan secciones gruesas (más de 1 O micras
de espesor). Por ello puede ser conveniente colorear siguiendo el método de cortes
flotantes.
8.4. Controles para las técnicas de fosfomonoesterasas
1. Preparación en la que se ha destruido la enzima por acción del calor. Si

la técnica es positiva después de eliminar la enzima, lo teñido es un
falso-positivo.
2. Incubación en un baño desprovisto de sustrato. Pueden darse dos situa-
ciones:
a) Que la técnica no dé resultado, lo que confirma que la tinción se
debe a la acción enzimática .
b) Que la técnica dé resultado positivo, en cuyo caso hay que entender
que existe algún otro sustrato en el tejido o que se trata de un
defecto técnico en la manipulación de reactivos (precipitados).
3. Incubación en un baño al que se le ha añadido previamente un inhibidor
de la actividad enzimática, como el cianuro potásico, lo cual confirmará
los resultados obtenidos.
9. TECNICAS HISTOENZIMOLOGICAS PARA DETERMINAR

ESTERASAS CARBOXILICAS
Las esterasas carboxílicas son enzimas que desdoblan ésteres de ácidos

orgánicos. Existen tres tipos de esterasas carboxílicas:
1. Colinesterasas. Desdoblan los ésteres de la colina, como la acetilcolina,
sustancia fundamental como neurotransmisor en el tejido nervioso y
terminaciones neuromusculares, por lo que su determinación es esencial
en patología muscular.
2. Aliesterasas. Desdoblan ésteres de ácidos grasos de cadena corta (me-
nos de 12 átomos de carbono) . Son enzimas lisosomiales muy típicas de
histiocitos. También reciben la denominación genérica de esterasas no
específicas.
3. Lipasas. Desdoblan ésteres de ácidos grasos de cadena larga o grasas
neutras. Son características de la secreción pancreática como medio de
digestión de las grasas.
9.1. Técnicas para determinación de los tres tipos de esterasas

carboxílicas (actividad esterásica no específica)
METODO DEL ALFA-NAFTIL ACETATO ESTERASA

Es una técnica inespecífica, puesto que detecta cualquier tipo de esterasa.
Sin embargo, su mayor utilidad estriba en la determinación de las aliesterasas.
Fijación: lo ideal son cortes en congelación o criostáticos. En determinadas
circunstancias puede utilizarse ACETONA; en tal caso la técnica sólo pondrá de
manifiesto aliesterasas y lipasas, ya que las colinesterasas son inactivadas por la
acetona. En cambio cuando se utiliza el formol como fijador, se inactivan las
aliesterasas, pero no las lipasas ni las colinesterasas.
Fundamento de la técnica: el alfa-naftil acetato es desdoblado por la
308 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOG ICA
o
0-11
l ~-CH 3
~ ///r
_..---~o
--~\\t
CO ~
cx- naftil acetato
(NaOH)
1
1
1 ~
Naftol
~
OH ¡
\
CH 3-COONa
1 Acetato sód ico

1
////CÓ-
/ /
Ell-có
// / / OH
/ _....._..... / OH
1 -:/"" ~
~ ~
t /
( N= N -:/"" 1 '-'::: /---+ 1 N= N- c o ' - ' : : :
', ________
~ ~
'-..._ ,_..,.
Sal de diazonio/
/
Coloran te azo ico
~ ~
Figura 17.5. Reacción alfa - naftil acetato.
acc1on enzimática en acetato sódico más alfa-naftol, que puede ser copulado
con una sal de diazonio originando un colorante azoico (fig . 17.5)
METODO DE ALFA-NAFTIL ACETATO ESTERASA (MODIFICADO

DE GOMORI POR YAM Y COLS., 1964)
Al igual que el método de Burstone, resuelve la mayor parte de los proble -
mas que plantea la técnica clásica de Gomori.
Fijación:
-Alcohol metílico absoluto en caso de improntas.
- Formalina tamponada al 1 O por 100
Soluciones:
a) Tampón fosfato a pH 7.6.
Solución 1:
- Fosfato sódico monobásico (NaH 2 PO,.H 2 0 pM=137 .99) 27 .6 ml
- Agua destilada .. .. .................. .. ..... . . . . . 1000.0 ml
Solución 1/:
-Fosfato sódico dibásico (Na 2 HPO, pM=141,96) . . .... . 28.4 g
-Agua destilada .. . . ........ . .... . . . ........ . .. . . . 1000.0 ml
- Solución 1 ...... . ... . ....... .. ... . ... . ........ . 13.0 ml
-Solución 11 ....... . ... . ............... . . . . . .... . 87 .0 ml
-Agua destilada ................ . . ... . . .... . ..... . 100.0 ml
b) Pararrosanilina hexazotizada (véase Método del naftol AS-81-fosfato)
H ISTO ENZI MOLOG lA 309
e) Solución de alfanaftil acetato:

- Alfanaftil acetato ...... . ....... . ................. . 10.0 mg
- Etilén glicol ............................. . ...... . 0.5 g
d) Solución de nitrito sódico al 4 por 1 OO. Preparar en el momento de su
uso.
e) Solución de incubación:
- Solución A .... . .............. . ................. . 8.9 mL
- Solución 8 ... . ............. .. ....... . .. . ....... . 0.3 mL
Tomar .... . .......... .. ..... . ................. . 0 .6 mL
- Solución D ............ . ...... . ....... . ... . .... . 0.3 mL
- Solución C . . . ... . ......... .. ....... . .......... . . 0 .5 mL
Ajustar el pH a 6 .1 con NaOH 1 N (pueden admitirse variaciones entre 5.8 y
6.5) . Filtrar antes de usar.
Modo de operar:
2. Solución de incubación durante 45 minutos a temperatura ambiente .
4. Contrastar núcleos con hematoxilina de Harris durante 2 minutos.
6. Aclarar en agua destilada y secar con papel de filtro.

-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul
- Actividad esterásica no específica . . . Granulaciones rojo oscuras en el ci-
toplasma de monocitos, histiocitos
y megacariocitos
Figura 17.6. Demostración de actividad esterasa no específica con el

método del alfa - naftil acetato este rasa en monocitos/ macrófagos ( x 60) .
9.2. Demostración de actividad esterasa no específica sobre material

incluido en parafina: método de la pararrosanilina
Este método, que permite la identificación de mastocitos y células mieloides,

aventaja a las técnicas que emplean sales de diazonio derivadas del fast b/ue RR,
porque permite la deshidratación y montaje permanente de las preparaciones
obtenidas.
Fijación: material fijado en formol e incluido en parafina.
Soluciones:
a) Solución de sustrato:
- Naftol AS-O cloroacetato 10.0 mg
- Dimetilformamida . ... ....... ... ... ..... . .. ... . . 1.0 ml
b) Solución tampón (Buffer de Michaelis a pH 6.8-7.6) .
Solución 1 de stock: ácido clorhídrico 0.1 M.
Solución /1 de stock: solución de acetato de veronal:
- Veronal sódico . . ... ... .. .... . ....... . . ... ... . 2.9 g
-Acetato sódico .. ............................ . 1.9 g
-Agua destilada ........... ... ......... . ... ... . 100.0 ml
Solución de trabajo (pH 7.2):
-Solución 1 • • . • • . • . • . . . . . . • . . . . . • . . . . . • • • • . . • • 5.5 ml
-Solución 11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.0 ml
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . hasta 25.0 ml
e) Solución stock de pararrosanilina:
- Pararrosanilina clorhídrica ....................... . 2.0 g
- Acido clorhídrico 2 N .......................... . 50.0 ml
Calentar suavemente hasta disolución completa. Enfriar a temperatura ambien-
te. Filtrar.
d) Solución de nitrito sódico:
-Nitrito sódico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400.0 g
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.0 ml
e) Solución de pararrosanilina hexazotizada:
-Solución stock de pararrosanilina-clorhídrica ...... .. . 0 .4 ml
-Solución de nitrito sódico recién preparada ..... .... . 0.4 ml
Mezclar bien, dejar reposar 30 segundos y utilizar de inmediato.
Preparación del medio de incubación:
Añadir 30 ml de solución tampón de Michaelis a 0.8 ml de solución de
pararrosanilina hexazotizada recién preparada y ajustar con ácido clorhídrico el pH
a 6.3. Añadir la solución A de sustrato. La solución resultante, de aspecto opales-
cente y color rosa pálido, debe filtrarse antes de su uso.
Modo de operar:
1. Desparafinación e hidratación de los cortes.
2. Incubar en la solución de sustrato recién preparada durante 30 minutos.
4 . Colorear núcleos con hematoxilina de Mayer.
5. Azulear en agua corriente.
6. Lavar en agua destilada, deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
-Actividad esterásica no específica . . . . . . . . . . . . . . . . . . Color rojo suave
-Núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azul-negruzco

de colinesterasas
La colinesterasa es una enzima que cataliza la descomposición de la acetilco-

lina en colina y radical acetato. El mecanismo para la detección de dicha activi -
dad enzimática se basa en la utilización de sustratos de tipo éster (concreta-
mente el yoduro de acetiltiocolina o butiriltiocolina), de forma que la tiocolina
liberada se combine con una sal de cobre para ser transformada en sulfuro de
cobre de color negro.
El método más utilizado es el de Karnowsky y Roots (1964).
PROCE.DIMIENTO TECNICO
Fijación: ninguna o solución helada de formol cálcico. Secciones criostáticas o

cortes en congelación .
Soluciones:
-Yoduro de acetil o butiriltiocolina . ... . .... . ... . ..... . 5.0 mg
- Tampón fosfato a pH 6.5 ... .. ......... . .......... . 6.5 mL
Añadir, siguiendo el orden indicado y agitando:
-Citrato de sodio 0.1 M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 mL
-Sulfato de cobre 30 mM . . . . ....................... 1.0 mL
-Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....................... 1.0 mL
- Ferrocianuro de potasio 5 mM ...................... 1.0 mL
Modo de operar:
1. Incubar en la solución A, a 37 oc, de 15 minutos a 2 horas.
2. Lavar y deshidratar.
3. Montar.

-Actividad colinesterásica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Color rojo -pardusco
Figura 17.7. Depósito pardo-grisáceo que demuestra la actividad colines-

terásica sobre un fascículo nervioso. Técnica de Karnowsky y Roots ( x 25) .
(Cortesía del Dr. J . F. Padilla Ruiz .)
10. METODOS PARA LA DEMOSTRACION

DE OXIDORREDUCTASAS
10.1. Método para la determinación de dopa-oxidasa (tirosinasa)
La dopa - oxidasa es una enzima que contiene cobre y cataliza la oxidación

del aminoácido tirosina a dihidroxifenilalanina (DOPA) y , finalmente, la DOPA a
pigmento melánico. Esta enzima también oxida determinados compuestos dife-
nólicos, como la adrenalina . Por todo ello, es característica de las células pro -
ductoras de melanina y de los tumores derivados de ellas (melanomas) .
El fundamento de la técnica radica en la incubación del tejido que supuesta -
mente contiene la enzima con DOPA, la cual será oxidada hasta que se transfor -
me en un pigmento pardo negruzco identificable como melanina. Por este moti -
vo debe ser excluida previamente la presencia de dicho pigmento del tejido.
Fijación : tejido fresco o fijado en formalina tamponada a 5-1 O por 1 OO.
Soluciones:
a) Tampón fosfato 0.1 M a pH 6.8:
- Fosfato sódico monobásico 0.2 M (27 .8 g/1) .. ... ... . . . 51 .0 ml
- Fosfato sódico dibásico 0 .2 M (53.65 g/1) .... .. .. . ... . 49.0 ml
- Agua destilada . ................. . ........ . . . ... . 100.0 ml
b) Solución de incubación :
-Tampón fosfato 0.1 M a pH 6.8 . .. .. ...... . .. . ..... . 10.0 mL
- DL-3,4 DOPA (dihidroxifenilalanina) ... .. ... .. .. ... . . 10.0 mg
Modo de operar:
1. Hidratar.
2. Incubar en el medio durante 12 horas a 37 oc.
• Observaciones:
La solución de incubación se torna roja a las 2 horas y sepia pardusca
a las 3 -4 horas. Si la coloración se hace fuertemente parda podría ocurrir
sobrecoloración, lo cual debe tenerse en cuenta . Después de los primeros
30 minutos suele ser conveniente renovar la solución .
3. Aclarar en agua destilada y controlar al microscopio.
4. Contrastar con violeta de cresilo (opcional) .
Resultados:
-Actividad tirosinásica .. .. .... .. ... .. . . .. . Color pardo-negruzco
-Melanina ..... .... .... . ... . .......... . Color amarillo pardusco
- Melanocitos y leucocitos Gris a negro
• Observaciones:
1. La excesiva lentitud de la incubación puede paliarse añadiendo al medio
una pequeña cantidad de un difenol o incluso ácido ascórbico, que son
oxidados con mayor celeridad que la DOPA por la enzima que se va a
demostrar.
2. La adición de sustancias que reaccionan con el cobre, como cianuro, cis-
teína, glutatión, etc., puede inactivar la enzima e inhibir la reacción .
10.2. Técnicas histoenzimológicas para la detección de

citocromooxidasa: método de Seligman y cols.
Esta enzima transporta electrones en la cadena respiratoria celular y por su

gran actividad en condiciones normales tiene el valor de patrón a la hora de
evaluar el funcionamiento de dicha cadena.
El método de Seligman utiliza la catalasa para desdoblar las moléculas de
peróxido de hidrógeno generadas en la acción de la citocromooxidasa sobre el
citocromo C. El oxígeno naciente liberado oxida, a su vez, la diam inobencid ina
hasta su forma pigmentada insoluble (véase más adelante «Reacción para deter-
minar peroxidasas») .
Fijación: cortes criostáticos sin fijar.
Soluciones de incubación:
-Cata lasa (20 microgramos/ml) 1 ml
(4 mg de catalasa en 10 ml de agua destilada. Se toman 2.5 ml y se vuelven
a disolver en 50 ml de agua destilada).
- Citocromo C (tipo 2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O mg
-Tampón fosfato 0.1 M a pH 7.4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 ml
-3.3'-diaminobencidina tetrahidroclórica (DAB) . . . . . . . . . . 5 mg
Ajustar el pH a 7.4 mediante NaOH 0.1 M o HCI 0.1 M.
Modo de operar:
1. Incubar a temperatura ambiente durante 2 horas.
2. lavar en agua destilada.
3. Fijar en formol cálcico durante 15 minutos.
4. Contrastar en hematoxilina durante 15 segundos.
5. lavar y azulear en agua corriente.
Resultados:
-Actividad citocromo-oxidasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Color pardusco
• Observaciones:
la DAB es sumamente carcinogénica, por lo que deben adoptarse las precau-
ciones necesarias para su manipulación.
1 0.3. Técnicas histoenzimológicas para la determinación

de deshidrogenasas
Las deshidrogenasas o reductasas son enzimas que transfieren hidrógeno

desde un sustrato a un aceptor específico.
Las enzimas más importantes de este grupo son las succinicodeshidrogena-
sas y la NAD-deshidrogenasa o diaforasa.
El ácido succínico (HOOC - CH 2 - CH 2 -COOH) forma parte del ciclo de Krebs,
que es el mecanismo aerobio fundamental para la obtención de energía. Por la
acción de esta enzima, el ácido succínico es transformado en ácido fumárico
(HOOC - CH=CH - COOH + 2H). De esta forma, los dos hidrógenos exceden-
tes son incorporados a un aceptar que puede ser tanto el NAO o NADP como
una flavoproteína . Estas han de ser oxidadas a su vez por las diaforasas hasta
que los átomos de hidrógeno llegan a su aceptor natural, el 0 2 , para formar
moléculas de agua.
METODO PARA LA DEMOSTRACION

DE SUCCINICO-DESHIDROGENASA (SDH)
Se basa en la liberación de hidrógeno que realiza la SDH a partir de un
sustrato adecuado, el succinato sódico. Los hidrógenos liberados reducen sales
de tetrazolio en forma de sustancias no coloreadas hasta azul formazán, que
posteriormente es quelado con iones de cobalto para producir un depósito
insoluble. Si la sal utilizada es el nitro-azul de tetrazolio (NAT) no es preciso
realizar la quelación con cobalto, pues el formazán producido es de por sí
insoluble.
Para obtener resultados válidos es conveniente inhibir las restantes enzimas
de la cadena respiratoria con cianuro potásico (al que no es sensible la succini -
codeshidrogenasa) .
La técnica se utiliza sobre todo para el diagnóstico post-mortem del infarto
de miocardio, a causa de que el músculo cardíaco es normalmente rico en
deshidrogenasas. Puesto que en las áreas de infarto, estas enzimas desaparecen
al necrosarse las células, la zona lesionada se observará como un área negativa
que contrastará con la positividad intensa del miocard io normal.
Fijación: sumergir las preparaciones en un baño de acetona helada . Cortes en
congelación (de 6 a 10 micras) .
Soluciones:
a) Solución sustrato de succinato a pH 7.1:
- Succinato de sodio ...... . . . . .. . . ............. . .. . 6.75 g
-Agua destilada ............ . ..................... . 8.0 mL
- Acido clorhídrico .......... . ...... ... ... .. .... . .. . 0 .05 mL
Disolver el succinato de sodio en agua destilada. Añadir el ácido clorhídrico 1
N y ajustar el pH a 7 .1 si es necesario. Volumen que se debe alcanzar: 10.0 mL.
Mantener la solución helada en el congelador.
b) Solución de MTT:
- 3(4,5 -dimetiltiazol-2)2,5 -difeniltetrazolio bromida (sal de
monotetrazolio) . ......... . ...................... . 2.5 mg
- Agua destilada ..... ... . . ...... . .. . . . ............ . 2.5 mL
Solución stock de MTT tetrazo/io, a pH 7 :
- MTI ( 1 mg/mL de agua destilada) .. . .............. . 2.5 mL
-Tampón Tris a pH 7 .4 ........... . .. . ... . ........ . 2.5 mL
-Cloruro de cobalto 0 .5 M ............... . .... . ... . 0 .5 mL
-Cloruro de magnesio 0 .5 M ....................... . 1.0 mL
-Agua destilada . .. . ...... . ....... . .............. . 2.5 mL
Ajustar el pH, si es necesario, agregando tampón Tris o ácido clorhídrico, según
el caso. Conservar la solución stock a - 20 C.
e) Solucion de incubación de MTT tetrazolio (solución de trabajo) :
- Solución stock de MTI tetrazolio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.9 mL
- Solución sustrato de succinato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 .1 mL
• Observaciones:
Puede sustituirse la sal de monotetrazolio por nitro-azul de tetrazolio, que es
una sal de ditetrazolio.
Solución stock de nitro-azul de tetrazolio (NAT) :
- NAT* (4 mg/ml) .. .. ..... . ........... . .. . ... . . . 2.5 ml
- Tampón Tris o fosfato 0.2 M a pH 7.4 ...... . ..... . . . 2.5 ml
- Cloruro de magnesio 0 .05 M . . .. . .... . . . .... . ..... . 1.0 ml
- Agua destilada .. . ... . . .. ....... . .... . .......... . 3.0 ml
Vigilar el pH y ajustar a 7.0 , si es necesario, usando tampón Tris o ácido
clorhídrico 0.2 M , según el caso. A - 20 oc permanece estable durante 3 meses.
(NAT* : cloruro de ditetrazolio-nitro-azul de tetrazolio) .
e) Formol salino al10 por 100.
d) Rojo nuclear (opcional)
e) Tampón Tris 0.1 M a pH 7 .4:
- Tris 0 .2 M (2.42 g / 1 00 ml) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25.0 ml
- Acido clorhídrico 0 .1 N (0.85 ml/ 100 ml) ............ 42 .5 ml
- Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 .5 ml
• Observaciones:
Para tampón 0 .2, omitir el agua destilada.
Modo de operar :
1. Incubar los cortes en la solución de trabajo de MTT, de 30 minutos a 1 hora
a 37 oc.
2. Pasar a solución C (formol salino) durante 10-15 minutos.
3. Lavar abundantemente con agua corriente durante 2 minutos.
4. Teñir con rojo nuclear (opcional).
5. Enjuagar con agua corriente.
6. Montar en medio acuoso .
Resultados :
- Actividad succinato- deshidrogenasa Depósito de negro
formazán con MTT
o azul con NA T
10.4. Técnicas histoenzimológicas para la demostración

de diaforasas (NADH y NADPH reductasas)
Las diaforasas (NADH y NADPH reductasa) son enzimas que transportan

hidrógeno desde el sustrato propio de la succinicodeshidrogenasa hasta los
aceptares NADH y NADPH , de donde es transferido a la citocromooxidasa , que
contiene el oxígeno como aceptar natural del hidrógeno transportado. Al igual
que las demás, son enzimas mitocondriales capaces de reducir las sales de
tetrazolio a formazanes coloreados tras su quelación con sales de cobalto, para
lo cual suele ser necesario un pH crítico en torno a 8 .
Fijación: ninguna o muy breve en aldehldos frlos (4 °C).
Soluciones:
a) Solución stock:
-Tampón fosfato 0 .1 M o Tris-clorhldrico 0 .2 M, a pH 7.2-
7.4 ................... . .. . ... . .. . ... ......... .. 5.0 ml
-Sal de monotetrazolio (MTI) o nitro-azul de tetrazolio (NAT)
al 1 por 100 y 4 por 100 en agua destilada respectivamente 2.5 ml
-Cloruro de cobalto 0.5 M . . . . . . . . . . . . . ............. 0.5 ml
-Cloruro de magnesio 0.005 M . . . . . . . . . . ............. 1.0 ml
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............. 3.0 ml
Ajustar el pH a 7 utilizando tampón o ácido clorhldrico 0.2 N.
Esta solución permanece estable durante 3 meses y debe conservarse a -20 oc.
b) Solución de incubación:
-Solución stock . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.9 ml
-Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 .1 ml
- Coenzima-NAD o NADP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.2 mg
Añadir el coenzima en el momento de usar. Ajustar el pH a
7.1
Modo de operar:
1. Medio de incubación a 37 oc de 30 ó 60 minutos.
2. Postfijación de los cortes en formol salino al 1 O por 100 durante 10-15
minutos.
3. Lavar bien con agua destilada.
4. Contrastar con verde de metilo al 2 por 100 durante 5 minutos (opcional) .
Resultados (fig. 17.8):

-Fibras musculares tipo 1 y lugares positivos ....... . MTT-negro
-Fibras musculares tipo /1 ........ .. . . . ........ . Tinción más pálida
Figura 17.8. Actividad NADH-reductasa en fibras musculares estriadas.

Se diferencian las fibras tipo 1 (negras) de las tipo 11 (más pálidas) (x40) .

de peroxidasas
Las peroxidasas son enzimas que catalizan la oxidación de diversas sustan -

cias a través de su reacción con el peróxido de hidrógeno o agua oxigenada
(H 2 0 2 ) . Son muy abundantes tanto en vegetales (sobre todo en el rábano pican -
te) como en tejidos animales (mieloperoxidasa de leucocitos); tienen actividad
pseudoperoxidásica la hemoglobina y ciertas enzimas oxidorreductoras (cata -
lasa). En general, las peroxidasas toleran bien la fijación en formalina y, salvo la
catalasa o mieloperoxidasa (leucocitaria), pueden ser inhibidas por cianuro po -
tásico (0.065 por 1 00).
Mediante variaciones en el pH del medio pueden revelarse distintos tipos de
peroxidasas: pH 6 y baja concentración de H 2 0 2 (0.003 por 1 00) para peroxida -
sa de los citocromos; pH 9 y alta concentración de H 2 0 2 (0.0035 - 0.07 por 1 00)
para peroxisomas, etc.
Existen dos métodos clásicos para detección de peroxidasas: el método de
la bencidina y sus derivados y el del alfa-naftol. A ellos deben añadirse otros
procedimientos alternativos que utilizan el 3-amino-9-etilcarbazol y la
N-fenilparafenildiamina. Algunos de ellos se tratan en los capítulos dedica -
dos a las técnicas de inmunoperoxidasa . En el presente capítulo sólo se recogen
los primeros debido a que actualmente son de más utilidad.
METODO DE LA BENCIDINA Y DERIVADOS

La bencidina es un diaminobifenilo que se oxida en presencia de oxígeno
naciente, dando lugar a benzopurpurina de color azul verdoso.
La sustancia o sustrato descompuesta por la enzima para la obtención de
oxígeno es el agua oxigenada o peróxido de hidrógeno ( H 2 0 2 ) (fig . 17 .9) .
Peroxidasa
H,No o - NH, + H,O, HNO ONH + 2H,O
Bencidina Peróxido de hid rógeno Benzopu rp uri na A g ua
Figura 17.9. Método de la benc idina.
En lugar de la técnica original de la bencidina, hoy en día se realiza preferen -

temente el método de Grahm y Carnowsky (1964). Este método emplea un
derivado de la bencidina, la 3.3'diamino bencidina, la cual posee la ventaja de
proporcionar' colores más estables que la benzopurpurina pero tiene el inconve -
niente de que es un potente agente cancerígeno por lo que su manejo ha de ser
muy estricto .
La diamino - bencidina, al oxidarse, da lugar a un pigmento polimerizado de
color pardo.
TECNICA DE LA DIAMINOBENCIDINA (DAB) PARA DETERMINACION

DE PEROXIDASA
Fijación: formaldehído o glutaraldehído al 5 por 100 en tampón cacodilato, for-
mol cálcico, formol neutro.
Soluciones:
a) Medio de incubación:
- Tetrahidroclorhidrato de 3,3 diaminobencidina (DAB - HCI
SIGMA) .. . ....... . . . .......... . . . ....... . ... . . . 5.0 mg
-Tampón Tris-clorhídrico 0.1 M a pH 7.6 . . ... . .... .. . . . 10.0 ml
- H 2 0 2 al 1 por 100 ( H 2 0 2 concentrada 1 :30) .. . .. . . . ... . 1.2 ml
b) Tampón Tris-clorhidrato 0.1 M a pH 7.6:
-Tris [Hidroximetil]aminometano pM = 121 (2.42 g para 100
ml de agua destilada ... ... . .. .. . .. ... . . .. . . .... . 25.0 ml
- HCI 0.1 N (0 .85 ml para 10 ml agua destilada) . . ..... . 37.5 ml
-Agua destilada . . .. ......... ..... .. .... ... ... ... . 37.5 ml
Controlar el pH y ajustar a 7 .6.
Modo de operar:
1. Aclarar los cortes fijados en agua destilada.
2. Medio de incubación, 5 minutos.
3. Aclarar bien en agua destilada.
4. Intensificación de la coloración (opcional) : tetróxido de osmio al 0.1 por
100 en tampón (0.1 M a pH 7.2 - 5 minutos) . Aclarar en agua destilada.
Resultados (fig . 17.1 0):

-Actividad peroxidásica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Granulaciones parduscas
Figura 17.10. Actividad mieloperoxidásica en granulocitos neutrótilos

mediante la técnica de la d iaminobencidina ( x 20) .
CAPITULO 18
Fundamentos biológicos de
· la inmunohistoquímica
GUION DE CONTENIDOS
1. MECANISMOS GENERALES DE DEFENSA. EL SISTEMA
INMUNITARIO
1.1. Inmunidad innata
1.2. Inflamación
1.3. Inmunidad adaptativa
2. ESTRUCTURA GENERAL DE LAS MOLECULAS
DE ANTICUERPOS
3. ANTICUERPOS POLICLONALES
3.1. Respuesta policlonal
3.2. Obtención de anticuerpos policlonales
3.3. Limitaciones de los anticuerpos policlonales
4. ANTICUERPOS MONOCLONALES
4.1. Obtención de hidridomas como fuente de anticuerpos
monoclonales. Características fundamentales de los
hibridomas
4.2. Ventajas de los anticuerpos monoclonales
4.3. Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales
5. MARCAJE DE ANTICUERPOS
1. MECANISMOS GENERALES DE DEFENSA.

EL SISTEMA INMUNITARIO
El sistema inmunitario, encargado de la defensa de nuestro organismo frente

a las agresiones, está integrado por dos subsistemas: el innato y el adaptativo.
La inmunidad innata actúa como una primera barrera frente a las infecciones.
Si esta defensa inicial resulta insuficiente, se pone en marcha el sistema inmuni-
tario adaptativo y aparece una respuesta específica para cada agente infeccioso.
El sistema inmunitario adaptativo posee además la capacidad de memoria, por la
cual reconocerá en el futuro al agente infeccioso e impedirá que ocasione
enfermedad.
Ambos sistemas inmunitarios están constituidos por una serie de moléculas y
células. Las células más importantes son los leucocitos, o glóbulos blancos, que
a su vez se clasifican en: a) elementos con capacidad fagocitaría, o fagocitos,
que forman parte del sistema inmunitario innato, y comprenden a su vez los
granulocitos neutrófilos, los monocitos y los macrófagos, y b) los linfocitos B y
T, responsables de la inmunidad adaptativa. Estos últimos elementos se hallan
organizados en órganos linfoides tales como ganglios linfáticos, timo, amígdalas
y tejido linfoide asociado a mucosas.
Los linfocitos B intervienen en la inmunidad humoral mediada por anti-
cuerpos, mientras que los linfocitos T son responsables de la inmunidad celular.
Conviene señalar que esta clasificación de los linfocitos se basa en criterios
eminentemente didácticos y que los mecanismos de cooperación entre ambos
sistemas son de gran importancia para el correcto funcionamiento del sistema
inmunitario.
1.1. Inmunidad innata
En la inmunidad innata o inespecífica intervienen una serie de barreras físicas

y bioquímicas tales como la piel, cilios de la tráquea, secreción ácida del estóma -
go, secreción mucosa y sebácea, lisozima, etc. Todas estas defensas protegen de
la mayor parte de las infecciones, pues normalmente el agente infeccioso
penetra en el organismo atravesando el epitelio de la piel, nasofaringe, intestino,
pulmones o aparato genitourinario. ·
Si un microorganismo es capaz de atravesar estas barreras, las células de la
serie monocito -macrofágica se encargarán de controlarlo. Estas células, de las
que existen varios tipos, derivan de células madre de la médula ósea y tienen
como misión englobar partículas y gérmenes, fagocitarlos y destruirlos. En la
sangre, los elementos fagocíticos están representados por los granulocitos neu-
trófilos y los monocitos. Ambos elementos pueden emigrar desde la sangre a los
tejidos, donde los granulocitos neutrófilos tienen una vida media más corta y los
monocitos tienden a transformarse en macrófagos.
Las células «asesinas naturalesJJ (NK o natural killer) son leucocitos granula-
res grandes capaces de reconocer las alteraciones producidas sobre la superficie
de las células tumorales o en elementos infectados por un virus, de forma que
pueden unirse a ellos produciendo su destrucción mediante una reacción deno-
minada de citotoxicidad . Este mecanismo destructivo requiere en ocasiones la
fijación simultánea, sobre la célula que se va a destruir, de un anticuerpo especí-
FUNDAMENTOS BIOLOGICOS DE LA INMUNOHISTOQUIMICA 323
fico que activa a la célula N K a través de su receptor específico para la fracción

Fe de las inmunoglobulinas (véase posteriormente) . De igual forma, las células
susceptibles de padecer la acción citotóxica de las células NK o células diana,
pueden hacerse aún más sensibles si se someten a la acción de ciertos factores
sé ricos.
Entre estos factores destacan algunas proteínas que, por aumentar durante
las infecciones, se denominan proteínas de fase aguda, y en las que se encuen -
tran algunos componentes del sistema del complemento y los interferones.
El sistema del complemento está formado por unas veinte proteínas séricas
que se activan de forma sucesiva o en cascada, de modo análogo al de los
factores de la coagulación, y que desempeñan un papel destacado en el control
de los procesos inflamatorios. La activación del sistema del complemento da
origen a diversos péptidos que tienen los siguientes efectos:
-Opsonización de microorganismos (capacidad de unirse a microorga -
nismos, lo que facilita que sean captados por los fagocitos).
-Atracción de los fagocitos a los lugares de infección (quimiotaxis).
- Aumento del flujo sanguíneo y de la permeabilidad capilar.
- Lesión de la membrana plasmática de células enfermas así como de
las cubiertas de los virus y membranas bacterianas.
Los interferones comprenden un grupo de proteínas que son relevantes en
las infecciones víricas. Por lo general, se producen en una fase temprana de la
infección y constituyen la primera línea de defensa frente a muchos virus.
1.2. Inflamación
Se entiende por inflamación la reacc1on de un tejido vivo y vascularizado

frente a una agresión de cualquier origen (infección, traumatismo físico, quími-
co, etc) . Durante el proceso inflamatorio se producen tres hechos fundamentales
que tienen como objetivo dirigir los elementos del sistema inmunitario hacia los
lugares de la agresión :
1. Aumento del riego sanguíneo.
2. Aumento de la permeabilidad capilar. Así, las moléculas de mayor
tamaño pueden atravesar el endotelio y los mediadores solubles de la
inmunidad alcanzan el lugar de la agresión.
3. Los granulocitos y macrófagos migran desde los capilares hacia los
tejidos y partiendo de éstos se dirigen al foco de lesión mediante el
proceso de quimiotaxis. Cuando alcanzan el foco, los fagocitos reco-
nocen al agente infeccioso gracias a receptores de superficie y lo englo-
ban en el curso de un proceso denominado fagocitosis.
1.3. Inmunidad adaptativa
La característica fundamental de este tipo de inmunidad consiste en que, a

diferencia de la innata, es específica. La inmunidad adaptativa puede estar
mediada por anticuerpos (inmunidad humoral) o por células (inmunidad ce-
lular) .
ANTICUERPOS
Son moléculas producidas por las células plasmáticas, que constituyen el
estadio de diferenciación terminal de los linfocitos B del sistema inmunitario
adaptativo. Para que se induzca la producción de anticuerpos es necesario que
el antígeno y los linfocitos B entren en contacto.
Cuando los fagocitos son incapaces de reconocer al agente infeccioso, es
necesario algún elemento que conecte por un extremo con el microorganismo y
por el otro con el fagocito. Esa es una de las misiones que desempeñan las
moléculas de anticuerpos, las cuales se unen por su extremo variable al tipo de
agente infeccioso frente al cual han sido fabricadas y por su extremo constante,
a los fagocitos que poseen un receptor específico para dicha fracción . Este
mecanismo recibe la denominación de inmunidad celular dependiente de anti -
cuerpos o inmunidad ADCC .
Además de las células NK, todas las células de la serie monocito/macrófago y
granulocítica poseen receptores Fe.
De esta forma, en las moléculas de anticuerpos pueden distinguirse dos
zonas con función distinta : a) una porción, denominada variable al ser distinta
para cada tipo de anticuerpo, por la que se unen a la gran variedad de agentes
extraños capaces de invadir nuestro organismo, y b) otra porción, denominada
región constante, por la cual se unen a los receptores Fe de las células y se
activa el complemento (fig . 18.1 ) .
~
0 = Fab. ===1 Fe
lESTRUCTURA BASICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS ~
Figura 18.1. Estructura básica de las inmunoglobulinas.
ANTIGENOS
Las moléculas de anticuerpos no se unen a todas las moléculas del agente
extraño que ha desencadenado su producción, sino solamente a una, que se
denomina antígeno (palabra que significa «generador de anticuerpos») . Se po-
dría definir un antígeno como cualquier sustancia que, introducida en un animal,
es capaz de provocar una respuesta inmune (humoral, celular o ambas a la vez).
Para que una determinada sustancia pueda ser considerada antígeno se requie-
FUNDAMENTOS BIOLOGICOS DE LA INMUNOHISTOOUIMICA 325
ren dos condiciones: a) que provoque la formación de anticuerpos, y b) . que sea

capaz de reaccionar específicamente frente a ellos.
Las moléculas que no cumplen la primera condición se denominan hap-
tenos.
Cada anticuerpo es específico para un antígeno determinado y se une a una
parte específica de éste denominada epítopo o determinante antigénico.
Cada antígeno puede poseer varios determinantes antigénicos iguales o diferen-
tes.
2. ESTRUCTURA GENERAL DE LAS MOLECULAS DE ANTICUERPOS
Las moléculas con actividad de anticuerpo reciben la designación genérica

de «inmunoglobulinas». También han sido denominadas «gammaglobulinas»,
porque emigran electroforéticamente en la región gamma. Todas las moléculas
de inmunoglobulinas poseen una estructura común que consiste en cuatro
cadenas polipeptídicas, dos grandes y dos pequeñas, dispuestas como se mues-
tra en la figura 18.1 . Las cadenas polipeptídicas grandes se denominan cadenas
pesadas oH (de «heavy») y tienen un peso molecular de entre 50 y 77 000 kds.
Las más pequeñas se denominan ligeras o L («light») y poseen un peso molecu-
lar de 22 000 kds. Las inmunoglobulinas humanas y las de la mayor parte de los
mamíferos superiores se dividen en cinco clases, atendiendo a la estructura
primaria de sus respectivas cadenas pesadas; estas clases se designan como lgG ,
lgA, lgM , lgD e lgE, siendo sus respectivas cadenas pesadas las gamma, alfa,
mu, delta y epsilon. En cuanto a las cadenas ligeras, sólo existen dos tipos:
kappa y lambda .
En el suero humano un 65 por 1 00 de las inmunoglobulinas posee cadenas
ligeras kappa, mientras que el 35 por 1 00 tiene cadenas lambda.
Existen cuatro subclases de lgG humana (lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4), cuyas
cadenas pesadas, que presentan sólo leves diferencias, se denominan gamma1,
gamma2, gamma3 y gamma4, respectivamente. Las diferencias entre las subcla-
ses de un mismo tipo de inmunoglobulina son menores que las existentes entre
clases distintas. Hay también dos subclases de la lgA humana (lgA1 e lgA2),
mientras que no se conocen subclases de las lgM , lgD o lgE. Las subclases de
inmunoglobulinas son específicas para cada especie.
Las cadenas de polipéptidos que constituyen las inmunoglobulinas se unen
por fuerzas covalentes y no covalentes formando una estructura de cuatro cade-
nas, con dos pares de cadenas ligeras y pesadas idénticas. Las lgG, lgD e lgE
sólo existen como monómeros de la unidad estructural de cuatro cadenas; en
cambio la lgA se encuentra tanto en forma monomérica como dimérica y la lgM
está constituida por cinco subunidades que se agrupan en un pentámero.
Las dos cadenas ligeras de una misma molécula de inmunoglobulina son
siempre del mismo tipo, sin que existan de forma natural moléculas híbridas.
Las cadenas ligeras pertenecientes al mismo tipo están formadas por dos
regiones diversas: la mitad carboxiterminal (1 07 residuos de aminoácidos) es
prácticamente constante y se denomina región CL (región constante de la
cadena ligera); la mitad aminoterminal muestra gran variabilidad de la secuencia
de aminoácidos, por lo que recibe el nombre de región VL (región variable de la
cadena ligera).
La molécula de lgG puede tomarse como ejemplo característico de la estruc -

tura básica de los anticuerpos (fig . 18.1) . Cada región estabilizada por un
puente disulfu ro intracatenario se llama dominio. Cada molécula de inmuno-
globulina posee dos puentes disulfuro dentro de las cadenas ligeras, uno en la
región variable y otro en la constante, que se corresponden con las regiones VL
y CL. En la cadena pesada existe un dominio en la región variable y tres en la
constante, denominados CH1 , CH2 y CH3. Los puntos de unión del anticuerpo
al antígeno se sitúan en los dominios variables. La región bisagra es un
segmento de la cadena pesada entre los dominios CH1 y CH2; se trata de una
región flexible, lo que hace que pueda variar la distancia entre los dos lugares de
unión con el antígeno y permite que ambas subunidades puedan actuar de
modo independiente.
3. ANTICUERPOS POLICLONALES
3.1. Respuesta policlonal
Un animal es capaz de elaborar millones de moléculas diferentes de anti -

cuerpos que reaccionan con la mayor parte de los antígenos presentes en la
naturaleza . La teoría de la selección clonal, desarrollada por Burnet y colabora -
dores en 1950, explica cómo un animal puede producir anticuerpos que reaccio -
nan de manera específica ante cada uno de los antígenos posibles. Según esta
teoría, cada célula productora de anticuerpos está programada para la produc -
ción de un tipo de molécula de anticuerpo, que tiene la capacidad de reconocer
uno o varios determinantes antigénicos de estructura similar. Por ello, sólo una
•
LIN F. 8 VIRGEN .
CENTROCITO INMUNOBLASTO B.
UF. 8 CON ME MORIA CEL. PLASMATICA

• CEL. PLASMOCITOIDE
Figura 18.2. Esquema de la modulación inmunológica de los linfocitos B

tras tomar contacto con un antígeno.
FUNDAMENTOS BIOLOGICOS DE LA INMUNOHISTOQUIMICA 327
pequeña fracción de células B es capaz de reconocer a un determinado antí-

geno. Este reconocimiento se efectúa a través de la inmunoglobulina de super-
ficie del linfocito B y con la colaboración, directa o mediada por factores solu-
bles, de los linfocitos T colaboradores o he/per.
Después de la unión del antígeno con su linfocito B específico, esta célula
comienza a proliferar y a diferenciarse hacia célula secretora de anticuerpos
(célula plasmática). dando lugar a una clona, es decir, a un grupo de células que
procede de una sola célula madre y produce el mismo tipo de anticuerpo (fig.
18.2).
Cuando un antígeno macromolecular se introduce en un animal, desencade-
na la reacción y proliferación de varias clonas de linfocitos B que reconocen de
forma específica cada uno de sus determinantes antigénicos. El resultado es la
producción de una gran variedad de anticuerpos que difieren en tamaño, carga y
afinidad. Este tipo de reacción se denomina «reacción policlonal».
3.2. Obtención de anticuerpos policlonales
La obtención de anticuerpos policlonales se realiza inmunizando a un animal

huésped con una molécula específica (inmunógeno) en la que se encuentra el
antígeno frente al cual se pretende obtener anticuerpos. El animal desarrollará
una reacción humoral frente al inmunógeno, generando anticuerpos que se
pueden recolectar obteniendo suero. El animal produce numerosas clonas de
células plasmáticas; cada una de ellas es capaz de sintetizar un anticuerpo con
especificidad diferente para· cada uno de los epítopos presentes en el inmu -
nógeno. Algunos de estos anticuerpos pueden reaccionar de forma cruzada con
otras moléculas; en tal caso, será preciso eliminarlos. Además, el animal puede ·
albergar en el suero otros anticuerpos y proteínas capaces de provocar reaccio -
nes cruzadas o tinción no específica.
Si el anticuerpo que se desea obtener está presente en grandes concentracio -
nes, muchas de estas reacciones no deseadas pueden eliminarse mediante dilu-
ción.
3.3. Limitaciones de los anticuerpos policlonales
Los anticuerpos policlonales presentan una serie de inconvenientes en su

empleo diagnóstico o terapéutico:
1. Imposibilidad de reproducir los resultados, ya que la respuesta
inmune varía de unos individuos a otros de la misma especie e incluso en
un mismo individuo según el momento en que se realice la extracción del
suero.
2. Obtención de cantidades limitadas que dependen de los lotes de
animales inmunizados.
3. Purificación laboriosa. La purificación de un antisuero se realiza me-
diante absorción con moléculas o células afines a las empleadas para
inmunizar el animal. Tiene por objeto eliminar los anticuerpos que reac-
cionan de forma cruzada no específica.
Así, para purificar un antisuero que reconoce un determinado antí -

geno del sistema mayor de histocompatibilidad (H LA), se ha de enfrentar
y absorber ese antisuero con un panel de células que contenga el resto
de los antígenos de histocompatibilidad. Si se desea purificar una anti -
inmunoglobulina específica de un determinado isotipo se ha de absorber
con inmunoglobulinas de los otros isotipos.
4. Incapacidad para discriminar determinantes antigénicos dife-
rentes dentro de una misma molécula o célula. Este es el motivo
de que anticuerpos policlonales no puedan establecer diferencias entre
los antígenos que se expresan en la membrana de una misma célula .
Mediante absorciones sólo se determina si el antisuero es específico o
no del tipo celular que se empleó en la inmunización.
4. ANTICUERPOS MONOCLONALES
La técnica de obtención de anticuerpos monoclonales fue desarrollada por

Kohler y Milstein. El objetivo inicial de su trabajo era estudiar el mecanismo
de regulación de los genes que codifican las inmunoglobulinas. Para ello realiza-
ron fusiones celulares entre mielomas murinos. Un mieloma es un tipo de tumor
constituido por células plasmáticas; algunos de ellos son capaces de producir
inmunoglobulinas - mielomas secretantes-, mientras que otros no las producen
-mielomas no secretantes-. Cuando el mieloma es secretante produce un
único tipo de inmunoglobulina: la causa de ello es que las células del tumor son
de origen clona!, es decir, provienen de una única célula madre que sufrió la
transformación maligna.
Algunas conclusiones de estas experiencias fueron:
1. Los híbridos entre células de mielomas murinos diferentes son viables.
2. La expresión de las cadenas de inmunoglobulinas es codominante; los
híbridos continúan sintetizando las cadenas de inmunoglobulinas codifi-
cadas por las dos líneas parentales.
3. No existen factores solubles que repriman la expresión de los genes
codificantes de las inmunoglobulinas, como lo demuestra el hecho de
que el híbrido resultante de la fusión entre un mieloma no productor y
otro que sí lo es sintetice el mismo tipo de inmunoglobulina codificada
por el mieloma productor.
4. El número de cromosomas del híbrido es inferior a la suma de los cromo -
somas de las células parentales, lo que indica pérdida de cromosomas.
Esta pérdida se asocia en ocasiones a la falta de expresión de una o más
cadenas de inmunoglobulina.
4.1. Obtención de hibridomas como fuente de anticuerpos

monoclonales. Características fundamentales de los hibridomas
En 1975, Kohler y Milstein realizaron una fusión entre las células de un

mieloma murino y los esplenocitos (linfocitos procedentes del bazo) de un ratón
inmunizado con hematíes de carnero. Los cultivos celulares resultantes de esta
FUNDAMENTOS BIOLOGICOS DE LA INMUNOHISTOOUIMICA 329
fusión , llamados hibridomas, son capaces de producir inmunoglobulinas que

reconocen a los antígenos empleados en la inmunización .
El hibridoma tiene dos propiedades fundamentales :
a) Capacidad de crecimiento ilimitado, propia de las células tumorales
y que procede del genoma de la célula del mieloma murino.
b) Capacidad de síntesis y secreción de inmunoglobulinas, ya que
posee material genético del linfocito B sensibilizado frente al antígeno proble -
ma. Las inmunoglobulinas que produce son del mismo tipo y especificidad que
las codificadas por el linfocito B.
El híbrido resultante de la fusión entre la célula de un mieloma murino y un
linfocito B específico para un antígeno problema da origen, después de varias
divisiones, a un clon, la totalidad de cuyos híbridos posee el mismo tipo de
inmunoglobulinas. Se puede definir, pues, un anticuerpo monoclonal como el
producto de una sola clona de células secretoras de inmunoglobulinas. Por ello,
todas las moléculas de inmunoglobulina producidas presentan idénticas caracte -
rísticas inmunobiológicas: especificidad , afinidad, carga, peso molecular, isotipo
y propiedades.
4.2. Ventajas de los anticuerpos monoclonales
El empleo de anticuerpos monoclonales es más ventajoso que el de los

policlonales porque:
a) Los anticuerpos monoclonales son homogéneos y, a diferencia de los
policlonales no varían con cada inmunización o sangría realizada al
animal.
b) No se requiere el uso de antígenos purificados para las inmuniza -
ciones; a pesar de ello, se obtienen anticuerpos de gran pureza.
e) Los cultivos permanentes pueden proporcionar el anticuerpo de forma
ilimitada.
4.3. Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales
Las apl icaciones actuales de los anticuerpos monoclonales son amplísimas.

A continuación se recogen , de entre las relacionadas con la biología, algunas de
las más importantes:
1. El hecho de que los anticuerpos monoclonales sean homogéneos y
puedan obtenerse de forma ilimitada los convierte en reactivos funda -
mentales para el diagnóstico de laboratorio. En este sentido, las
pruebas de radioinmunoensayo para la determinación de hormonas, fár-
macos y enzimas se pueden homologar entre los distintos laboratorios,
usando el anticuerpo más adecuado. Asimismo, los anticuerpos mono-
clonales pueden aplicarse al diagnóstico bacteriológico, virológico, para-
sitológico e histológico empleando técnicas inmunohistoquímicas. Ade -
más estos reactivos desempeñan un papel muy relevante en el tipaje de
los antígenos H LA, de importancia capital en el trasplante de órganos y
para conocer la susceptibilidad frente a determinadas enfermedades.
2. La posibilidad de obtener anticuerpos monoclonales frente a antígenos

no purificados se ha apl icado, en investigación básica, al estudio de
los antígenos de membrana y al reconocimiento de diversas estructuras
antígénicas de células o moléculas.
Con estos anticuerpos se han caracterizado antígenos de diferencia -
ción linfoide y, por tanto, ha sido posible identificar todas las subpobla -
ciones linfoides, numerosos marcadores tumorales, etc. Este hecho ad -
quiere aún mayor trascendencia si se considera que con los anticuerpos
policlonales no era posible distinguir entre dos proteínas distintas de
membrana en un mismo tipo celular.
3. En el campo de la terapéutica y diagnóstico clínico los anticuerpos
monoclonales tienen también múltiples aplicaciones; entre ellas las de:
-Protección frente al rechazo de órganos, administrando anticuerpos
monoclonales frente a células T citotóxicas.
-Localización de metástasis de tumores empleando anticuerpos especí -
ficos antitumor marcados radiactivamente.
-Tratamiento de tumores, si se usan unidos a toxinas o citostáticos.
5. MARCAJE DE ANTICUERPOS
Tanto los anticuerpos monoclonales como los policlonales se pueden unir a

moléculas marcadoras o trazadoras que permiten visualizar el lugar de reacción
con sus respectivos antígenos. El uso de estos anticuerpos marcados es el
fundamento de las técnicas de inmunolocalización, de gran utilidad en el campo
de la biología en general y del diagnóstico histopatológico en particular. Las
moléculas que pueden emplearse como trazadoras son de diverso tipo: enzimas,
metales, sustancias fluorescentes, etc . Por sus peculiaridades específicas se
examinan más detalladamente en los capítulos 19 y 20. Los procedimientos
técnicos que permiten la unión de los anticuerpos a los correspondientes traza -
dores son métodos en general laboriosos y poco frecuentes en los laboratorios
dedicados a la histopatología diagnóstica e investigación aplicada, ya que la casi
totalidad de estos anticuerpos marcados se encuentran comercializados.
CAPITULO 19
lnmunohistoquímica (1):
técnicas de
inmunofluorescencia
GUION DE CONTENIDOS
1. GENERALIDADES SOBRE METODOS
INMUNOHISTOQUIMICOS
2. FUNDAMENTOS DE LAS TECNICAS DE
INMUNOFLUORESCENCIA
3. TIPOS DE TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA
3.1. Preparación del tejido para inmunofluorescencia
3.2. Técnica directa para tejido congelado
3.3. Técnica indirecta
3.4. Otras técnicas de inmunofluorescencia
3.5. Dobles tinciones en inmunofluorescencia
4. MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
4.1. Microscopio de luz de transmisión
4.2. Microscopio de luz de incidencia
1. GENERALIDADES SOBRE METODOS INMUNOHISTOQUIMICOS
Los métodos inmunoh istoquímicos sirven para detectar antígenos celulares o

tisulares mediante reacciones antígeno-anticuerpo. Para visualizar el lugar don-
de ocurre la reacción antígeno-anticuerpo es preciso emplear un trazador o
marcador. El marcaje puede realizarse con fluorocromos (técnicas de inmuno-
fluorescencia), enzimas (técnicas inmunoenzimáticas), iones metálicos en forma
coloidal (técnica de inmuno -oro) o isótopos radiactivos.
El antígeno puede detectarse tanto por marcaje directo del anticuerpo (técni -
cas directas) como por alguno de los muchos métodos de marcaje secundario.
2. FUNDAMENTOS DE LAS TECNICAS

DE INMUNOFLUORESCENCIA
Las técnicas de inmunofluorescencia fueron introducidas por Coons y cola-

boradores en 1941 y desde entonces se han utililizado profusamente tanto para
el diagnóstico clínico como en investigaciones básicas.
La fluorescencia es una forma de luminiscencia entendiéndose esta última
como la emisión de luz que se produce a partir de una fuente de energía no
térmica .
la fluorescencia primaria o autofluorescencia es aquella que presen-
tan determinadas sustancias de forma espontánea, sin necesidad de ser modifi-
cadas; por ejemplo, la lámina elástica de las arterias muestra autofluorescencia
en determinadas condiciones. En los tejidos que no poseen esta propiedad se
puede inducir fluorescencia - fluorescencia secundaria- mediante tinción
histoquímica con moléculas fluorescentes denominadas fluorocromos, o unien-
do fluorocromos a anticuerpos dirigidos contra antígenos tisulares: de este últi -
mo procedimiento se sirven las técnicas de inmunofluorescencia.
FLUOROCROMOS
Son sustancias químicas que tienen la propiedad de absorber fotones de alta
energía procedentes de la radiación ultravioleta o del espectro visible. Ello pro-
voca una redistribución de los electrones de las moléculas fluorescentes, puesta
de manifiesto por la emisión de una radiación luminosa de longitud de onda
distinta, aunque dentro del espectro visible. En este proceso siempre existe una
cierta pérdida de energía, ya que la cantidad de energía de la radiación emitida
es inversamente proporcional a su longitud de onda : la luz que provoca el
fenómeno de fluorescencia siempre tiene menor longitud de onda que la luz
emitida por la sustancia fluorescente (ley de Stoke ) .
Si al iluminar una sustancia con luz visible ocurre un fenómeno similar al
descrito y la liberación de energía se produce de forma gradual , prolongándose
la emisión de luz después de cesar la iluminación del objeto, el fenómeno recibe
el nombre de fosforescencia.
Los fluorocromos más utilizados en las técnicas de inmunofluorescencia son
la fluoresceína, la rodamina y la ficoeritrina . La fluoresceína se usa generalmente
en forma de isotiocianato (FITC), absorbe luz azul y emite fluorescencia verde
manzana . La rodamina se emplea en forma de isotiocianato de tetrametilroda-
INMUNOHISTOOUIMICA (1) : TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA 333
mina (TR ITC), absorbe luz verde y emite fluorescencia rojo-anaranjada . Por
último la ficoeritrina (PCE) absorbe luz azul y produce fluorescencia roja .
Un fluorocromo se considera óptimo para las técnicas de inmunofluorescen -
cia si reúne las siguientes condiciones:
a) Mínima interferencia en la reacción antígeno - anticuerpo.
b) Máxima estabilidad para las condiciones de almacenamiento .
e) Disponibilidad sencilla en su forma purificada.
d) Máximo de emisión comprendido dentro del espectro de luz visible.
e) La longitud de onda de la luz excitadora de la fluorescencia y la de la luz
emitida por el fluorocromo deben estar lo suficientemente distantes co -
mo para que puedan diferenciarse fácilmente.
f) El fluorocromo debe descomponerse lo menos posible con la exposición
de la luz.
Aunque no existe un fluorocromo perfecto, el isotiocianato de fluoresceína
es la molécula que reúne mayores ventajas como tal.
Los fluorocromos pueden unirse de forma covalente a los anticuerpos sin
alterar la capacidad de estos últimos para unirse a sus correspondientes antí-
genos. Por ello, los fluorocromos ligados a anticuerpos específicos constituyen
un medio útil de visualizar los lugares donde ocurre la reacción antígeno -
anticuerpo. En consecuencia, la utilización de dos anticuerpos marcados con
fluorocromos distintos permite llevar a cabo dobles tinciones.
UNION DE FLUOROCROMOS A PROTEINAS:

UNION A ANTICUERPOS
El modo de unión depende del tipo de fluorocromo . Los isotiocianatos de
fluoresceína y de rodamina se ligan mediante enlace covalente con los grupos
amino y carboxilo de las proteínas. Esta unión tiene lugar a pH alcalino. Cuando
se trata de conjugar el fluorocromo con anticuerpos deben usarse moléculas
purificadas de estos últimos, evitando así la posibilidad de unión a otras proteí -
nas.
Omitimos el procedimiento técnico de la conjugación porque en la mayor
parte de los laboratorios los anticuerpos marcados con el fluorocromo se obtie -
nen en el comercio. No obstante, puede resultar conveniente que cada laborato -
ri o evalúe algunos parámetros de anticuerpos con los que trabaja, como por
ejemplo el cociente fluorocromo/proteína del conjugado. Este cociente se deter-
mina por análisis espectrofotométricos, de forma que se mide la densidad óptica
del conjugado a 280 nm (dicho valor corresponde al pico de absorción de la
tirosina presente en la molécula de proteína) y se compara con la densidad
óptica a 495 y 415 nm de long itud de onda, que corresponden a los picos de
absorción de la fluoresceína y rodamina, respectivamente. Para la mayor parte de
las aplicaciones de inmunofluorescencia este cociente será óptimo si se encuen -
tra entre 0.5 y 2, o lo que es igual, cuando existen entre 0.5 y 2 moléculas de
fluorocromo por molécula de anticuerpo. Si el resultado de las técnicas se
observa con un microscopio de incidencia (epiiluminación) , la proporción fluo -
rocromo/proteína puede ser más baja. Por otra parte, si se va a investigar un
antígeno presente en grandes cantidades, el cociente debe ser menor que cuan -
do el antígeno aparece en menor proporción.
3. TIPOS DE TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA
3.1. Preparación del tejido para inmunofluorescencia
Las técnicas de inmunofluorescencia se realizan casi siempre sobre tejido

congelado porque el procedimiento de fijación en formol e inclusión en parafi -
na presenta numerosos inconvenientes para el desarrollo de estos métodos.
Entre estos inconvenientes figuran el aumento de los fenómenos de autofluores-
cencia y el bloqueo de gran cantidad de determinantes antigénicos provocado
por los agentes fijadores.
En la técnica de inmunofluorescencia directa se utiliza un anticuerpo
específico frente al antígeno que se desea detectar, conjugado a un fluorocromo
(fig. 19.1 ). En las técnicas de inmunofluorescencia de tipo indirecto, se
emplea en un primer paso el anticuerpo específico no marcado y en una segun -
da fase, un anticuerpo marcado con el correspondiente fluorocromo, que reac -
ciona de forma específica con el anticuerpo primario (fig. 19.1)
1 A) T. tNMUNOFlUOREBCENCIA CHRECTA
1O) T. DE INCUBACION CON COMPLEMENTO ~
Figura 19.1 . Diversos tipos de técnicas de inmunofluorescencia.
La técnica indirecta ofrece algunas ventajas en relación con la directa: es más

sensible y resulta muy útil para detectar en el suero de pacientes enfermos
determinados tipos de anticuerpos, tales como aquéllos que son capaces de
reaccionar con antígenos presentes en los propios tejidos (véase «Procedimiento
técnico y resultados»). Por otra parte, la técnica indirecta permite utilizar un
único anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo frente a muchos anti -
sueros primarios: éstos sólo deben cumplir el requisito de proceder todos ellos
del animal frente a cuyas inmunoglobulinas va dirigido el anticuerpo secundario
(para más detalles, véanse las técnicas homólogas de inmunoperoxidasa en el
capítulo 20) .
INMUNOHISTOQUIMICA (1) : TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA 335
3.2. Técnica directa para tejido congelado
Modo de operar:
1. Se realizan cortes en el criostato de aproximadamente 5 micras de espesor.
2. Se delimita, mediante un círculo realizado con un lápiz de diamante alre-
dedor de cada sección, la superficie de incubación con los anticuerpos
(pueden utilizarse portaobjetos diseñados específicamente para metodolo-
gía inmunohistoquímica).
3. Fijar en acetona fria a -20 oc, entre 5 y 15 minutos.
4. Secar los cortes al ai"re.
5. Realizar 3 lavados en PBS de 1O minutos cada uno.
6. Drenar el exceso de PBS y secar alredador del circulo usando un pañuelo
de papel.
7. Cubrir la sección con el antisuero primario conjugado, a la dilución óptima
determinada previamente. La incubación se realizará en cámara húmeda
preservada de la luz a temperatura ambiente y durante 30 minutos.
8. Realizar otros 3 lavados como en el paso 5 y secar igualmente en torno
al círculo.
9. Montar utilizando un medio hidrosoluble específico para inmunofluores-
cencia, o en su defecto en PBS-glicerol gelatina. Sellar los bordes del cu-
breobjetos con esmalte de uñas o usar en su lugar polivinilalcohol.
1O. Almacenar a 4 oc hasta su lectura en un microscopio de fluorescencia pre-
servando en todo momento de la luz.
Resultados:
-Marcaje con FITC . . . . . . . . . . . . . Fluorescencia verde-manzana
-Marcaje con TRITC . . . . . . . . . . . Fluorescencia rojo-anaranjada
• Observaciones:
La técnica directa de inmunofluorescencia se usa fundamentalmente en el diag-
nóstico de la patología renal (fig. 19.2) y de determinadas lesiones cutáneas (para
más detalles, consúltense los capítulos 29 y 35).
Figura 19.2. Determinación de depósitos de lg G en glomérulos renales

de un enfermo con glomerulonefritis mediante técnicas de inmunofluores-
cencia directa ( x 1O) .
3.3. Técnica indirecta
Este método se emplea sobre todo para detectar autoanticuerpos en el suero

de pacientes con enfermedad autoinmune. Puede ser muy útil fabricar un bloque
que contenga distintos tejidos porque ello permite detectar diferentes autoanti-
cuerpos de forma simultánea y con una única muestra de suero.
A continuación se indican los tejidos recomendados para determinar los tipos
más usuales de autoanticuerpos:
- Anticuerpos antinucleares ANA (hígado y riñón de rata).
- Anticuerpos antimúsculo liso SMA (riñón y estómago de rata) .
- Anticuerpos antimitocondriales AMA (riñón y estómago de rata) .
- Anticuerpos antimicrosomiales frente a hígado y de riñón (hígado y riñón
de rata).
- Anticuerpos antimicrosomas tiroideos (tejido tiroideo humano).
- Anticuerpos antimúsculo estriado (esófago de rata).
- Anticuerpos antineutrófilos ANCA (granulocitos humanos).
Modo de operar:
1. Diluir en PBS el suero que se desee probar. Para la mayor parte de auto-
anticuerpos puede emplearse una dilución a 1 /1 O. Para detectar anticuerpos
frente a los islotes de Langerhans y glándula adrenal se debe emplear el
suero sin diluir.
2. Incubar las secciones de tejido elegidas con el suero problema, durante 30
minutos a temperatura ambiente o bien toda la noche a 4 oc.
3. Realizar 3 lavados en PBS de 1O minutos cada uno.
4. Drenar el exceso de PBS.
5. Incubar con el conjugado de inmunoglobulina anti-lg humana y fluorocromo a
la dilución óptima durante 30 minutos en cámara húmeda preservada de la luz.
Puede usarse un antisuero polivalente frente a todas las inmunoglobulinas.
6. Decantar el antisuero y realizar 3 lavados con PBS de 1O minutos cada
uno.
7. Montar en medio hidrosoluble especifico para inmunofluorescencia.
Resultados (fig. 19.3) :

- Marcaje con FITC . . . . . . . . . . . . . Fluorescencia verde-manzana
-Marcaje con TRITC . . . . . . . . . . . Fluorescencia rojo-anaranjada
• Observaciones:
Los sueros que resulten positivos pueden titularse haciendo diluciones seriadas
del suero problema e indicando la dilución más alta a la que la técnica resulta po-
sitiva. Por ejemplo, si se señala que unos anticuerpos antimicrosomiales son posi -
tivos con un titulo de 1 /1600, quiere decirse que ésta es la dilución más alta a la
que la inmunotinción resulta positiva .
Figura 19.3. Anticuerpos antineutrófilos en el suero de un enfermo con

granulomatosis de Wegener, detectados mediante técnica de inmunofluores-
cencia indirecta ( x 1 O) .
3.4. Otras técnicas de inmunofluorescencia
Otros procedimientos técnicos de inmunofluorescencia, bastante menos uti-

lizados que los anteriores, son la «técnica sandwich» y la técnica de incuba-
ción con complemento (fig. 19.1). La primera de ellas se emplea para detec-
tar la presencia de inmunoglobulinas específicas frente a un determinado antí -
geno en las células plasmáticas de tejidos pertenecientes a un animal previa -
mente inmunizado con ese antígeno. Para ello, se toman secciones de ganglio
linfático procedente del animal inmunizado, se añade el antígeno en un primer
paso y después un anticuerpo marcado con fluoresceína frente a dicho antígeno
(fig . 19.1 ) . Si en el tejido existían anticuerpos frente al antígeno, se unirán a
éste, que quedará a su vez fijado sobre el tejido y podrá ser detectado con el
anticuerpo marcado.
La técnica de incubación con complemento es una modificación de la técni -
ca indirecta, y en ella el anticuerpo que se emplea en el primer paso de la técnica
ha de ser capaz de fijar el complemento. Una vez realizada la primera incubación
con dicho anticuerpo, que a su vez es específico frente a un determinado
antígeno, se añade suero fresco de cobaya como fuente del complemento y se
incuba a 37 oc. En una tercera fase se incuba con un anticuerpo específico
frente a una determinada fracción del complemento marcado con fluorocromo.
Esta técnica se usa generalmente con el fin de conocer la capacidad de determi-
nados anticuerpos para fijar el complemento.
3.5. Dobles tinciones en inmunofluorescencia
La determinación de dos antígenos diferentes puede hacerse de forma

simultánea o secuencial. En el primer caso se incuba el tejido con una mezcla
de dos antisueros específicos frente a los antígenos que se quiere determinar,
marcados con dos fluorocromos distintos. En la técnica secuencial se incuba en
primer lugar con uno de los antisueros marcado con un fluorocromo y se

fotografían los campos más significativos. A continuación se elimina la positivi -
dad destruyendo los grupos fluorescentes mediante la aplicación de luz ultravio-
leta. Una vez comprobado que la destrucción es completa, se elimina el cu-
breobjetos sumergiendo la preparación en una solución buffer y se incuba con
un segundo antisuero marcado con fluorocromo.
Este método presenta una serie de inconvenientes; así, es preciso realizar
fotografías seriadas para identificar las células positivas; además, no pueden
detectarse más de dos antígenos diferentes ya que por encima de una determi -
nada dosis de luz ultravioleta se deteriora el tejido, lo cual repercute en las
ulteriores secuencias técnicas.
4. MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Las técnicas de inmunofluorescencia deben examinarse siempre con un mi -
croscopio especial -microscopio de fluorescencia- (fig. 19.4). Este tipo de
microscopio lleva incorporado: a) una fuente de luz ultravioleta y luz visible; b)
uno o varios filtros que seleccionan la longitud de onda de la luz que incide
sobre la muestra - filtros de excitación o filtros primarios- y e) un filtro que
selecciona las longitudes de onda emitidas dentro del espectro de la luz visible,
dejando pasar sólo la luz emitida por la sustancia fluorescente e impidiendo el
paso de la luz excitadora - filtro secundario o de barrera .
La fuente de luz puede ser una lámpara de vapor de mercurio a alta presión o
una lámpara halógena de cuarzo. La primera produce más energía y es preferible
cuando se espera una inmunofluorescencia de intensidad baja. No obstante,
tiene algunos inconvenientes: es cara, encierra el riesgo de explosión y se
oscurece conforme pasa el tiempo, con progresiva reducción de la luz emitida.
Las lámparas halógenas son más seguras Y. baratas, y la energía que producen
aunque menor, es más constante.
Figura 19.4. Microscopio de fluorescencia de luz de incidencia.

Existen dos tipos fundamentales de microscopio de fluorescencia : en uno de

ellos, la luz de excitación se transmite a través del espécimen - !'llicroscopio
de transmisión- en el otro, la luz se refleja en el tejido procedente de un foco
de iluminación superior -microscopio de luz de incidencia o de epiilumi-
nación.
4.1. Microscopio de luz de transmisión (fig. 19.5)
La luz procedente de la fuente pasa primero por un filtro excitador que

selecciona las longitudes de onda más eficaces para producir fluorescencia
sobre el fluorocromo presente en la muestra. La luz contacta con la muestra y se
transmite a través del objet!vo'. Estos microscopios llevan acoplado un conden -
sador de campo oscuro. La luz que no es absorbida por el espécimen y entra
dentro del objetivo, queda excluida por un filtro de barrera (filtro supresor): de lo
contrario no podría visualizarse correctamente la fluorescencia. Cuando el fluo-
rocromo de la muestra absorbe la luz, emite otra radiación de mayor longitud de
onda, la cual entra en el objetivo. El filtro de barrera, que es impermeable para la
luz de excitación permite sin embargo el paso de luz emitida por el fluorocromo,
fenómeno que puede observarse entonces a través del ocular.
Figura 19.5. Esquema del microscopio de fluorescencia del tipo de trans -

misión . La luz emitida por la fuente luminosa (L) pasa por el filtro primario
(FE) , se refleja sobre un espejo (E) y llega al corte de tejido (C) . La luz
emitida por el fluorocromo en la muestra alcanza el filtro secundario (FB) . se
refleja en espejo (E') y sale por el ocular (0) .
4.2. Microscopio de luz de incidencia (fig. 19.6)
También se denomina de epifluorescencia o de iluminación vertical. La luz de

excitación procedente de la fuente pasa a través de un filtro excitador y contacta
con un espejo dicroico que la refleja sobre el espécimen a través del objetivo.
Este espejo, a su vez, deja pasar la fluorescencia emitida por la muestra hasta el
Figura 19.6. Esquema del microscopio de incidencia. La luz emitida por la

fuente luminosa (L) pasa un filtro primario (FE), se refleja en un espejo
dicroico (ED) y alcanza el corte de tejido (C) . La luz emitida atraviesa el
espejo ED , se refleja sobre un espejo (E) y puede observarse por el ocular
(0) .
ocular. Debido a sus ventajas sobre el microscopio de transmisión, la mayor

parte de los microscopios de fluorescencia que se usan hoy día son de este tipo.
Entre esas ventajas destacan las siguientes: a) existe menor pérdida de luz de
excitación porque ésta atraviesa menos superficie de cristal; b) no es necesario
el uso de aceite de inmersión; e) la visión de la fluorescencia es más brillante, ya
que la luz de excitación incide sobre la superficie de la muestra más próxima al
objetivo; d) la luz excitadora proviene del objetivo y no se necesita, como con el
microscopio de transmisión, que esté centrado el condensador.
CAPITULO 20
Técnicas
inmunohistoquímicas (11)
GUION DE CONTENIDOS
1. FUNDAMENTO TEORICO DE LAS TECNICAS

INMUNOHISTOQUIMICAS
1.1. Técnicas de inmunoperoxidasa
1.2. Técnicas con fosfatasa alcalina y glucosa oxidasa como
enzimas trazadoras
1 .3. Métodos de avidina-biotina
1.4. Técnica de hapteno-antihapteno
1.5. Procedimientos que incluyen dobles tinciones
1.6. Técnicas del oro coloidal y del oro coloidal-plata
1.7. Fundamento y principales aplicaciones del marcaje
celular con lactinas
2. ASPECTOS PRACTICOS PARA EL DESARROLLO DE LAS
TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS
2.1 . Fijación
2.2. Procesamiento histológico
2.3. Restablecimiento de la inmunorreactividad: digestión
enzimática y deslipidización
2.4. Bloqueo de la actividad enzimática endógena
2.5. Bloqueo de la tinción de fondo
2.6. Penetración de los reactivos. Detergentes
2. 7. Controles
342 lABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA
2.8. Tipos de anticuerpos. Dilución de los anticuerpos

2.9. Incubaciones
2.10. Lavados
2.11. Revelado de las técnicas inmunoenzimáticas.
Cromógenos y sustratos
3. PROCEDIMIENTOS TECNICOS
3.1. Técnicas de peroxidasa
3.2. Técnicas con fosfatasa alcalina
3.3. Técnicas de avidina-biotina
3.4. Técnicas con oro coloidal
TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (11) 343
1. FUNDAMENTO TEORICO DE LAS TECNICAS

INMUNOHISTOQUIMICAS
las técnicas inmunohistoquímicas son técnicas de inmunolocalización que

utilizan una enzima como trazador del marcaje. Por este motivo, el lugar de la
reacción antígeno-anticuerpo se visualiza añadiendo al final de la reacción el
sustrato de la enzima más una sustancia denominada cromógeno. El producto
originado al actuar la enzima sobre el sustrato interacciona a su vez sobre el
cromógeno y da lugar a un precipitado insoluble y coloreado, al igual que ocurre
en todas las reacciones histoenzimológicas. Como trazadores 'p ueden emplearse
distintos tipos de enzimas; la más utilizada es la peroxidasa, a la que siguen la
fosfatasa alcalina y, a gran distancia, la glucosa oxidasa.
La enzima peroxidasa, obtenida del rábano picante, es el trazador enzimático

más utilizado. Puede emplearse en técnicas con anticuerpos marcados (técnicas
directa o indirecta o con anticuerpos sin marcar (técnica de peroxidasa anti-
peroxidasa).
TECNICAS CON ANTICUERPOS MARCADOS

En este tipo de métodos el trazador va unido de forma covalente al anti-
cuerpo, pudiendo procederse mediante los métodos directo o indirecto, similares
en su fundamento a los analizados en el capítulo dedicado a la inmunofluores-
cencia.
Método directo
Es el procedimiento más sencillo, pero también el menos sensible para la
detección de antígenos. En él, el anticuerpo o antisuero primario se conjuga
directamente con la enzima peroxidasa (fig. 20.1 ). El método presenta las si -
l T. INMUNOHISTOQUIMICA DIRECTA ~
Ac. ANTIHUMANO OBTENIDO EN CONEJO
~ CONJUGADO CON PEROXIDASA
Figura 20.1. Representación esquemática de la técnica de inmunoperoxi-

dasa mediante el uso de anticuerpos marcados (método directo) .
guientes dificultades: a) puede ser difícil conseguir la conjugación entre el

anticuerpo y el trazador; b) durante el procedimiento de · conjugación puede
destruirse en parte la actividad del anticuerpo, la de la enzima o ambas, y e) es
posible que se produzca una mezcla de anticuerpos conjugados y no conjuga-
dos, de forma que sea casi imposible purificar los primeros.
Método indirecto
En este procedimiento el anticuerpo primario o específico sin conjugar se une
en un primer paso con el antígeno presente en la sección de tejido. En una
segunda fase se añade un anticuerpo marcado con el trazador enzimático, obte -
nido de un animal diferente al primario y específico para el animal y la clase de
inmunoglobulina que constituye el anticuerpo primario (fig. 20.2) . Este anti -
cuerpo recibe también la denominación de secundario. El complejo así formado
puede visualizarse incubando el corte de tejido con un sustrato cromógeno
adecuado.
IT. INMUNOHISTOQUIMICA INDIRECTA~

~ =~~C~~p~~:O'::ENCEROO
J, AI:J. ANnHUIIANO O BTENIDO EN CONEJ O
Figura 20.2. Representac ión esquemática de la técnica de inmunoperoxi -

dasa med iante el uso de anticuerpos marcados (método indirecto) .
En resumen, para la técnica de inmunoperoxidasa indirecta se utilizan dos

anticuerpos:
a) Uno primario sin marcar.
b) Uno secundario dirigido frente al primario, marcado con peroxidasa y
obtenido de un animal distinto.
El método indirecto posee las siguientes ventajas: a) es más sensible que la
técnica directa, y b) el anticuerpo secundario puede utilizarse para todos los
antisueros primarios posibles obtenidos de una misma especie. Por ejemplo, un
anticuerpo de cabra anticonejo puede emplearse siempre que el anticuerpo
primario para múltiples antígenos sea obtenido de este último animal, lo cual
evita tener que marcar sistemáticamente todos los anticuerpos primarios.
Conviene destacar dos características de los métodos directo e indirecto: 1)
en los dos existe una sola molécula de peroxidasa por cada una de anticuerpo,
es decir, se trata de métodos estequiométricos, puesto que los dos reactivos
TECNICAS INMUNOHISTOOUIMICAS (11) 345
están en proporc1on 1 /1, y 2) debido a que cada molécula de peroxidasa es

capaz de desdoblar múltiples moléculas de sustrato, la sensibilidad de ambos
métodos es superior a la de la inmunofluorescencia.
No obstante, el procedimiento de unión de la enzima al anticuerpo secunda-
rio es laborioso y a veces proporciona resultados irregulares. En cambio, las
técnicas con anticuerpos no marcados ofrecen muchas más ventajas y han
supuesto un considerable avance en el desarrollo de las técnicas inmunohisto-
químicas.
Por otra parte, los métodos de marcaje con peroxidasa, encierran dos incon-
venientes principales:
1. En los tejidos existe normalmente peroxidasa endógena que puede dar
lugar a falso-positivos. Por esta razón como fase previa a la realización
de la técnica, es necesario inhibir la actividad endógena de dicha enzima
sobre el tejido objeto de estudio.
2. La gran toxicidad que como agente carcinogénico posee el cromógeno
diaminobencidina (DAB). utilizado para revelar la reacción, hace que
deba ser manipulado con muchas precauciones (véase más adelante).
TECNICAS CON ANTICUERPOS NO MARCADOS.

METODO DE LA PEROXIDASA-ANTIPEROXIDASA (PAP)
Este procedimiento, desarrollado por Sternberger y cols. en 1970, utiliza
como trazador inmunocomplejos formados por la enzima peroxidasa y anti-
cuerpos específicos frente a ella, en lugar de anticuerpos marcados. La peroxida-
sa se obtiene del rábano picante mediante un proceso de purificación y se
inocula a un animal para obtener los anticuerpos dirigidos frente a la enzima. De
este modo, al poner en contacto «in vitro» los anticuerpos con la peroxidasa, se
forman complejos antígeno-anticuerpo (complejo peroxidasa-antiperoxidasa o
complejo PAP) a través de una reacción de precipitación. Estos complejos están
formados por tres moléculas de peroxidasa y dos de anticuerpo antiperoxidasa
(fig. 20.3).
IMETODO Ac NO MARCADO CON EL COMPLEJO PAP~
Figura 20.3. Representación esquemática del método de la peroxidasa-

antiperoxidasa con anticuerpos no marcados.
Para este procedimiento de inmunotinción se utilizan sucesivamente tres

reactivos inmunes diferentes:
1. Anticuerpo primario, semejante a los empleados para los métodos de
inmunoperoxidasa directa e indirecta (p. ej., lgG de conejo frente a un
antígeno humano).
2. Anticuerpo puente o secundario, que unirá el anticuerpo primario al
complejo PAP (p. ej ., inmunoglobulina de cerdo frente a conejo). El
anticuerpo puente se aplica en exceso, de tal forma que uno de los dos
lugares posibles de unión se asocie al anticuerpo primario y el otro quede
libre para fijarse posteriormente al complejo PAP (fig . 20.3) .
3. Complejo PAP, que contiene la enzima que actuará como trazador de la
reacción inmune.
Este procedimiento de inmunolocalización es de 100 a 1000 veces
más eficaz que los métodos indirectos que emplean anticuerpos marca -
dos con fluorocromos o peroxidasa, y 20 veces más sensible que las
técnicas en que el anticuerpo antiperoxidasa y la peroxidasa se aplican
como soluciones separadas.
Con respecto al procedimiento de PAP, es importante tener en cuenta que:
1. El anticuerpo primario se obtendrá siempre del mismo animal (general-
mente conejo o ratón) que el complejo PAP, ya que ambos han de
quedar ligados por el anticuerpo puente.
2. El anticuerpo puente o secundario ha de ser de cabra o cerdo cuando el
primario es de conejo, o de conejo si el primario es un monoclonal de
ratón . Como norma, se aplicará siempre en exceso para que uno de sus
dos lugares activos quede libre y puedan unirse a él los complejos PAP.
3. El complejo PAP se une, por la fracción constante Fe de los anticuerpos
que lo componen, a la porción variable del anticuerpo secundario debido
a que todas las lgG de los anticuerpos primarios de conejo o ratón tienen
una fracción constante idéntica.
4. Cuando la triple reacción inmune se ha completado, se procede al revela-
do de la peroxidasa mediante agua oxigenada y diaminobencidina o
cualquier otro de los cromógenos adecuados para esta enzima .
5. El revelado es el procedimiento histoquímico por el cual se visualizan los
lugares de reacción antígeno -anticuerpo. Se realiza añadiendo el sustrato
natural de la peroxidasa, en este caso agua oxigenada (peróxido de
hidrógeno), más una sustancia denominada cromógeno. Cuando la pe-
roxidasa actúa sobre su sustrato liberando oxígeno naciente, el cromóge-
no se oxida para originar un producto insoluble y de color pardo (para
más détalles químicos, véase «Reacción de demostración de peroxidasa»
en el capítulo 17).
Las ventajas más relevantes del método de PAP son :
1. Con él pueden demostrarse antígenos sin necesidad de marcar los anti-
cuerpos empleados para el procedimiento inmune, de forma que se evita
su manipulación y la consiguiente pérdida de actividad .
2. Por cada molécula de anticuerpo primario ligada al antígeno existen al
menos tres de peroxidasa en el complejo final, lo cual incrementa consi-
derablemente la sensibilidad de la técnica.
TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (11) 34'7
1 .2 . Técnicas con fosfatasa alcalina y glucosa oxidasa

como enzimas trazadoras
La fosfatasa alcalina es una enzima capaz de hidrolizar los ésteres de fosfato

en un medio alcalino. Debido a la mayor dificultad de su manejo, se utiliza
menos que la peroxidasa . La demostración de actividad o revelado de esta
enzima se realiza empleando naftoi-AS-fosfato como sustrato y sales de diazo-
nio tipo fast red TR o fast blue BB como agente de copulación; el resultado de la
reacción es un colorante azoico rojo o azul (para más detalles químicos, véanse
capítulos 14 y 17). El principal inconveniente de los métodos que utilizan la
fosfatasa alcalina como trazador es la necesidad de utilizar un medio de montaje
acuoso para la confección definitiva de las preparaciones. Sin embargo, con los
nuevos procedimientos de revelado mediante neofucsina al 5 por 100 combina-
da con nitrito sódico al 4 por 1 00, se obtiene un compuesto también de color
rojo e insoluble tanto en agua como en disolventes orgánicos.
La mayor ventaja para la utilización de la fosfatasa alcalina como trazador es
que debido a la escasa proporción de tejidos que en condiciones normales la
contienen, no suele ser necesario inhibir su actividad endógena.
La glucosa oxidasa es una enzima aislada del «aspergillus niger» y de la que
no existe actividad endógena en los mamíferos. Histoquímicamente se demues-
tra por oxidación de la glucosa con reducción simultánea de una sal de tetrazolio
incolora que se transforma en un azul formazán estable y no difusible.
Los métodos que utilizan estas enzimas como trazador pueden emplear anti-
cuerpos marcados según procedimiento directo o indirecto o anticuerpos no
marcados, como la técnica de fosfatasa alcalina - antifosfatasa alcalina (APAAP)
equivalente a la de peroxidasa-antiperoxidasa.
1 .3. Métodos de avidina-biotina
Se trata de procedimientos técnicos muy sensibles que utilizan anticuerpos

marcados y se basan en la gran afinidad que entre sí poseen las moléculas de
biotina y las de avidina, de forma que se genera un fuerte enlace no inmune.
La avidina es una glicoproteína de alto peso molecular que está presente en
la clara de huevo y en la bacteria Streptomyces avidinii. En este último caso, la
molécula recibe la denominación de estreptavidina y presenta algunas ventajas
sobre la obtenida del huevo, tales como carecer de residuos oligosacáridos y
poseer un punto isoeléctrico neutro. En ambos casos, la molécula está formada
por cuatro subunidades, que configuran una estructura terciaria con cuatro
regiones hidrofóbicas de unión con la biotina.
La biotina es una vitamina de baje peso molecular perteneciente al complejo
B (vitamina H) que se encuentra en la yema de huevo. Se conjuga fácilmente
con anticuerpos y enzimas trazadoras por ligarse de forma covalente a cadenas
laterales amino o carbonilo de residuos aminoácidos o de azúcares de proteínas
y glicoproteínas. Se considera que pueden unirse hasta 150 moléculas de bioti-
na a una sola molécula de anticuerpo.
Por otra parte, la avidina puede combinarse covalentemente con una gran
variedad de proteínas, glicoproteínas y polisacáridos, y al oro coloidal. Aunque,
como se ha dicho tanto la avidina como la biotina pueden unirse a anticuerpos o
moléculas enzimáticas, es la biotina la que normalmente se conjuga con los

primeros debido a su pequeño tamaño.
En todos los métodos inmunoenzimáticos que utilizan el procedimiento de
avidina y biotina para poner de manifiesto una reacción antígeno-anticuerpo, es
posible realizar el marcaje con biotina del anticuerpo primario (técnica directa)
o, lo que es mucho más habitual. del anticuerpo secundario (técnica indirecta) .
La fase no inmunológica del proceso puede implicar: a) realizar una unión del
anticuerpo biotinilado con avidina sin marcar para ligar a continuación el com-
plejo con una enzima también biotinilada (método puente avidina-biotina), o b)
aplicar un complejo de avidina y trazador enzimático biotinilado que contenga
lugares de unión libres en la avidina para que se produzca la fijación sobre el
anticuerpo primario o secundario biotinilado (método de complejo avidina-
biotina o ABC) -fig . 20.4--. En todas las variantes expuestas puede unirse un
gran número de moléculas de biotina a un anticuerpo único, por lo que la
proporción trazador/anticuerpo es muy elevada. Esto hace que la sensibilidad de
este tipo de métodos sea muy alta y permite que el anticuerpo primario pueda
emplearse muy diluido.
1, METODO AVIDINA-BIOTINA ~
)~ :~~.::,R~~N;;~"'!:IDAEN CONEJO
'J., Ala. ANTIHUMANO OBTENIDO EN R.ATON
Figura 20.4. Representación esquemática del método de la avidina-biotina .
1.4. Técnica del hapteno-antihapteno
En este procedimiento se utilizan en un primer paso el antisuero primario

conjugado con un hapteno -uno de los más empleados es el dinitrofenol; a
continuación se emplea como reactivo inmune secundario un anticuerpo anti-
hapteno; por último, se añade un anticuerpo enzima o complejo PAP marcado
con el hapteno (fig. 20.5). Con este método se consigue disminuir la tinción de
fondo inespecífica y se pueden emplear antisueros primario y secundario obte-
nidos de la misma especie animal, ya que este último va dirigido contra el
hapteno, y no contra el anticuerpo primario.
M. DE HAPTENO ANTIHAPTENO.
1. ~ ANTI ~FRENTE AL HAPTENO. "&- HAPTENO MARCADO.
J~ /Iic. AHTIHUMAHO CONJUGADO CON UN HAPTENO.
Figura 20.5. Representación esquemática de la técnica de hapteno-anti-

hapteno.
1.5. Procedimientos que incluyen dobles tinciones
Si se realiza de forma secuencial cualquiera de los métodos anteriores y se

emplean cromógenos que originen una coloración distinta en cada caso, es
posible determinar más de un antígeno sobre una sola sección tisular.
Para evitar que se produzcan reacciones cruzadas deben emplearse anti-
sueros obtenidos de distinta especie animal o de subclases diferentes. Además,
cuando se lleva a cabo este tipo de técnicas deben tenerse en cuenta ciertas
normas:
1. Se debe realizar siempre en primer lugar el procedimiento que utiliza el
anticuerpo con reacción más intensa. En este sentido, algunos antisueros
originan una inmunotinción mayor que la de otros, como ocurre con el
LeuMI (CD15) o el antígeno epitelial de membrana (EMA).
2. Si se van a emplear simultáneamente anticuerpos de tipo policlonal y
monoclonal, primero se llevará a cabo la técnica con el policlonal.
3. Si se observa que la inmunotinción con el anticuerpo empleado en
segundo lugar es muy débil o negativa, puede repetirse el procedimiento
técnico para este segundo anticuerpo.
1.6. Técnicas del oro coloidal y del oro coloidal-plata
Estos métodos se han utilizado fundamentalmente en inmunoquímica ul-

traestructural ligando el oro coloidal a proteína A o directamente a inmunoglo-
bulinas. La proteína A está presente en la pared bacteriana de «Staphilococcus
aureus», y tiene la capacidad de unirse selectivamente y por un mecanismo no
inmune a la porción Fe de las inmunoglobulinas. Por otra parte, la proteína A
puede unirse a diversos marcadores entre los que destaca el oro coloidal.
El procedimiento técnico puede llevarse a cabo por método directo o indirec-
to equivalente este último al descrito para la inmunoperoxidasa.
La técnica del oro coloidal empezó a generalizarse en microscopia óptica a
raíz del desarrollo de un procedimiento combinado de oro coloidal y plata que
350 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLO.GICA
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~ :)l~ ~
METODO DE INMUNO ORO
1 ANTllgG DE RATON DBlENIDA EN CONEJO

JI. CONJOGADD CON PARTICULAS DE ORO
J,, Ac. ANTIHUMANO OBlENIDO EN RATON
Figura 20.6. Representación esquemática de la técnica de proteína A-oro

coloidal.
incrementaba de forma notable su sensibilidad (fig . 20.6) . En este último caso,

se usa un método indirecto en el cual el anticuerpo secundario está marcado con
partículas de oro coloidal que, por reflexión de la luz, provocan una suave
coloración roja . Si las partículas de marcaje son de gran tamaño, pueden visuali -
zarse histológicamente pese a que penetran poco en los tejidos; si por el contra -
rio son pequ~ñas, originan un marcaje más nítido en color, pero por su tamaño
no son visibles con el microscopio óptico a menos que se utiliceo iones de plata
para intensificar la coloración . En tal caso, la plata se emplea en forma de lactato
que actúa como dador de iones; así, la formación de plata metálica se produce
lentamente, lo que mejora la tolerancia a la luz. Además, a lo largo del procedi -
miento se utiliza un agente reductor, como la hidroquinóna, que acelera la
transformación a plata metálica, y goma arábiga como agente protector.
En general, este procedimiento es más sensible que la técnica pura del oro
coloidal y requiere concentraciones más bajas de oro. En él no deben usarse
tinciones de contraste que puedan alterar los depósitos de plata metálica. La
fijación en sublimado seguida de un tratamiento con solución de lugol da
excelentes resultados, ya que la débil capacidad oxidante del mercurio intensifi -
ca la reacción del oro una vez f ijado a los lugares antigénicos.
1.7. Fundamentos técnicos y principales aplicaciones de las lectinas

en histopatología
Las lectinas son proteínas o glucoproteínas de origen no inmune, general-

mente obtenidas de plantas y que tienen la propiedad de unirse específicamente
a determinados hidratos de carbono o a sus formas nitrogenadas presentes en el
glicocálix celular. Esta unión ocurre de forma habitual con el azúcar terminal de
las gl icoproteínas, si bien es posible que se establezca también con glúcidos
situados en cadena laterales ramificadas de la molécula .
Por la capacidad de hemaglutinar los eritrocitos sanguíneos, estas moléculas
fueron denominadas en un principio ffHemaglutininas vegeta/esJJ. En la actuali -
dad reciben el nombre genérico de «lectinas» (del latín: captar, seleccionar) ,
propuesto por Boyd y Shapleigh .
Hasta el momento se han purificado más de 100 tipos de lectinas, sintetiza -

das en su mayor parte por plantas inferiores y en menor cuantía por microorga -
nismos (bacterias y hongos) y por algunos animales vertebrados inferiores (an -
guilas) e invertebrados (caracoles) .
Las funciones que ejercen estas proteínas son variadas, pero en general se
encuentran relacionadas con los fenómenos de reconocimiento y adhesión celu -
lar, especialmente con los implicados en la organización de la matriz extracelular
y en procesos de secreción . En las plantas, las lectinas intervienen en los meca -
nismos de defensa contra agentes fitopatógenos.
Debido a la heterogeneidad de su origen y estructura, la clasificación más
adecuada de las lectinas se basa en su afinidad hacia el líidrato de carbono, al
que se unen específicamente. De este modo, puede considerarse:
1. Lectinas que se unen a 0-manosa/D-glucosa.

Ejemplo -Con A o concanavalina A (canavalina ensiformis).
2. Lectinas que se unen en N-acetil D-galactosamina.
Ejemplo·s - DBA Dolichos biflurbs: ·
- PNA Arachis hipogaea.
3. Lectinas que se unen a N-acetil ,glucosamina .
Ejemplo - UEA Ulex europaeus.
4. Lectinas que se unen a O-galactosa.
Ejemplo - RCA Ricinus communis.
5. Lectinas que se unen a L-fucosa .
Ejemplos - UEA Ulex europaeus.
- LTA Lotus tetragonolobus.
6. Lectinas que se unen a ácido siálico
7. Lectinas que se unen a hidratos de carbono complejos.
Ejemplo - PHA Phaseolus vulgaris.
METODOS PARA LA DEMOSTRACION DE LECTINAS

Las lectinas son moléculas fáciles de conjugar con distintos fluorocromos
(isotiocianato de fluoresceína , ficoeritrina, etc .), con oro coloidal o con enzimas
(peroxidasa de rábano), por lo que es posiblé demostrar su presencia sobre
tejidos mediante métodos inmunohistoquímicos directos. No obstante, son más
empleados los anticuerpos antilectinas con PAP o lectinas biotiniladas, que son
detectadas mediante el método de la avidina - biotina, principalmente por el
procedimiento ABC, para conseguir la máxima amplificación de la señal.
En cuanto al mecanismo último de unión molecular entre las lectinas y el
hidrato de carbono que reconocen, debe tenerse en cuenta que la un ión no t iene
carácter inmune, por lo que es lábil, no covalente, de carácter reversible y
requiere para su estabilidad la presencia de iones ca ++, Mn ++ y Mg ++.
• Observaciones:
1. Los métodos de lectinas pueden emplearse para el estudio de secciones
en congelación o embebidas en parafina .
2. Antes del empleo de algunas lectinas puede ser útil la digestión enzimá -
tica. El tratamiento enzimático más usado es la tripsinización.
3. La manipulación de las lectinas no está exenta de riesgos: algunas son
potentes venenos, y por ello es necesario manipularlas en adecuadas
condiciones de seguridad (utilización de campanas de extracción de
gases, guantes y mascarillas) .
4. En cada laboratorio es necesario establecer la dilución precisa de trabajo
para cada lectina.
5. Es conveniente, por último, establecer un control negativo. Este control
consiste en reservar una de las secciones histológicas problema con el f in
de bloquear la lectina a estudio mediante la preincubación con el azúca r
específico.
PRINCIPALES USOS Y APLICACIONES DE LAS LECTINAS

Las primeras aplicaciones de las lectinas aprovechaban su capacidad mitogé -
nica (concavalina A) y para identificar los grupos sanguíneos ABO . Debido a la
especificidad con que se unen a distintos hidratos de carbono, las lectinas han
contribu ido a desvelar la distribución de éstos en los diferentes tejidos y sus
variaciones de expresión durante los procesos de maduración y diferenciación
celular. Actualmente se reconocen distintos cambios en la ordenación de los
receptores de las lectinas una vez establecida la transformación neoplásica e
incluso en casos de displasia celular.
2. ASPECTOS PRACTICOS DEL DESARROLLO

DE LAS TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS
Durante las inmunotinciones es conveniente aplicar alguna forma de fijación

para preservar el tejido, aun cuando se manejen secciones en congelación . Las
condiciones en que se realiza la fijación repercuten grandemente en el resultado
de las técnicas inmunohistoquímicas. Por ello debe tenerse en cuenta que:
1. Los fijadores que actúan por precipitación de proteínas, como los fijado -
res ácidos (Bouin o Carnoy), el alcohol etílico y los compuestos a base
de metales pesados ( 85 o Zenker), suelen producir mejores resultados
que los fijadores por reticulación (formalina) o los que contienen oxi -
dantes, como la solución de Helly.
2. El tiempo de fijación debe ser el . necesario para preservar la imagen
histológica: un exceso de fijación reduce la inmunorreactividad del teji -
do.
3. El efecto de cada fijador sobre un antígeno puede ser distinto según la
localización histológica y anatómica de dicho antígeno.
4. En muestras de gran volumen , la fijación por inmersión en la solución
fijadora proporciona resultados variables en cuanto a la positividad imu-

nohistoquímica, ya que las zonas mejor fijadas se teñirán más que las
más profundas.
5. Existen determinados antígenos de superficie o receptores nucleares cu-
ya determinación en tejidos fijados no proporciona buenos resultados:
por ello deben detectarse en tejido congelado sin fijar o usando una
fijación breve en acetona, en cloroformo o en una mezcla de ambos.
6. La fijación debe ser inmediata para evitar la autolisis. Si no fuera posible,
puede frenarse el proceso de autolisis de los tejidos manteniéndolos a
4 oc o en soluciones conservantes (para más detalles, véase fijación del
tejido linfoide en el capítulo 34) .
En la mayor parte de los estudios inmunohistoquímicos el formol tamponado

al 1 O por 1 00 y la solución de Zenker dan buenos resultados. No obstante, en
casos especiales pueden emplearse otras soluciones como el paraformaldehído
al 4 por 100 en buffer fosfato 0.05 M a pH 7 .2, o los líquidos de Bouin o
Karnowsky.
En inmunohistoquímica la formalina debe emplearse tamponada cuando se
utilice como fijador. No obstante, la formalina disminuye la inmunorreactividad
de los antígenos tisulares porque produce reacciones cruzadas entre grupos
amino terminales de las proteínas que se encuentran fundamentalmente en los
residuos lisina. En ocasiones lo que ocurre es un fenómeno de enmascaramiento
antigénico dependiente de la fijación del formaldehído sobre grupos vecinos que
contienen residuos de lisina.
En cuanto a la pérdida de inmunorreactividad vinculada a la fijación en
formol, los antígenos más afectados son los linfocitarios de membrana que
resisten la inclusión en parafina (véase capítulo 34), citoqueratinas, vimentina,
fibronectina e inmunoglobulinas tanto de superficie como intracitoplasmáticas,
si bien estas últimas podrán recuperarse con digestión proteolítica (véase más
adelante) .
En general, tras la fijación en formol tamponado los antígenos ricos en
carbohidratos se alteran menos que los proteicos.
El uso de fijadores alcohólicos se recomienda para la determinación de
filamentos intermedios tales como vimentina, desmina, citoqueratinas, proteína
acídica glial fibrilar y neurofilamentos. Aparentemente, la disolución de los lípi-
dos de membrana por este tipo de fijadores aumenta la penetración de los
anticuerpos y mejora la inmunotinción . Sin embargo, los fijadores alcohólicos
previenen menos la autolisis de los tejidos, hecho que debe tenerse en cuenta si
se realizan incubaciones prolongadas.
Los fijadores ácidos que actúan por precipitación de proteínas y contienen
ácido pícrico y acético preservan mejor que la formalina y los alcoholes la anti -
genicidad de las inmunoglobulinas y polipéptidos. Para las hormonas polipeptí-
dicas y aminas biógenas la solución de Bouin es el fijador de elección, puesto
que produce la interrupción de la membrana de los gránulos que las contienen .
La acetona determina muy mala preservación morfológica pero conserva
muy bien los antígenos de superficie celular.
Los fijadores que contienen paraformaldehído proporcionan en gene-
ral buenos resultados inmunohistoquímicos. Para tejidos incluidos en plástico
puede ser eficaz la fijación en paraformaldehído vehiculado en buffer cacodilato
0.1 M (pH 7.2) con cloruro cálcico 50 Mm. Para la identificación de enzimas y
proteínas de gran tamaño se recomienda el paraformaldehído al 4 por 1 00, ya
sea solo o con glutaraldehído al 50 por 100 (del 0.1 al 0.5 por 100) en buffer
fosfato 0.1 M (pH 7.2 a 7.4) .
Como se desprende de todo lo anterior, las pautas de fijación en inmunohis-
toquímica serán distintas según el antígeno que se desee estudiar. Cuando se
utiliza un anticuerpo por primera vez, es aconsejable usar secciones de tejido
congelado como control a fin de determinar la fijación más adecuada así como
las diluciones óptimas del anticuerpo primario. Además, siempre deben utilizarse
preparaciones de control positivo y negativo que serán fijadas de la misma forma
que el tejido objeto de estudio.
Para acortar el t iempo de fijación puede recurrirse a la fijación por mi -
croondas, que disminuye además la tinción de fondo . Este método, que reduce
la duración del proceso a segundos, es especialmente útil para antígenos que
requieren digestión proteolítica, como el relacionado con el factor VIII y las
citoqueratinas, ya que hace innecesario el pretratamiento enzimático.
El procedimiento técnico para realizar este tipo de fijación incluye:
1. Toma de un volumen aproximado de hasta 1 cm 3 de tejido fresco .
2. Fijación de las muestras en una mezcla diluida de un aldehído (formalde -
hído al 2 por 1 00 o glutaraldehído al 0 .05 por 1 00 en tampón cacodilato
0.1 M y cloruro cálcico al 0.025 por 100 para un pH final de 7 .35) .
3. Irradiación en horno de microondas entre 5 a 8 segundos para una
temperatura final de la solución de 45 oc ± 5 °C).
2.2. Procesamiento histológico
DECALCIFICACION
La inmunorreactividad de las inmunoglobulinas, polipéptidos, hormonas, f i-
lamentos intermedios, antígenos tumorales y proteína S- 1 00 se conserva bien
tras la apl icación de algunos procedimientos rutinarios de decalcificación (EDTA
0.5 M , ácido acético acuoso al 1 O por 100 o ácido fórmico al 5 por 1 00) . Sin
embargo, la resistenc ia 2 la decalcificación será distinta en el caso de otros
antígenos, en especial si se utilizan soluciones fuertes · que contengan ácido
nítrico (en este último caso, la inmunorreactividad desaparece al cabo de pocas
horas de tratamiento) . En este sentido, las inmunoglobulinas son particular-
mente sensibles a la decalcificación en ácidos fuertes.
PROCEDIMIENTO DE INCLUSION
Aunque los procedimientos habituales de deshidratación y aclaramiento no
deterioran excesivamente los antígenos tisu lares y en particular los intracitoplás -
micos, la inclusión habitual, tanto en parafina como en alguna de las resinas
sintéticas, puede afectar a los resultados inmunohistaquímicos. Así, el uso de
acetona en lugar de etanol y el de cloroformo o benzoato de .metilo en lugar del
xileno mejoran notablemente la inmunotinción, ya que aumentan la tinc ión
específica y disminuyen la de fondo, sobre todo en el caso de ciertos antígenos
como las inmunoglobulinas presentes en las células plasmáticas.
En cuanto al medio de inclusión, la tinción inespecífica de fondo es mayor en

el material embebido en parafina que en las secciones criostáticas. Precisamente
se ha señalado que la inclusión en parafina caliente produce pérdida de la
antigenicidad, por lo que el tiempo de infiltración debería reducirse al mínimo y
se ha llegado a recomendar el empleo de panifinas de bajo punto de fusión. Por
otra parte, para asegurar· una tinción uniforme es de gran importancia realizar
\ una desparafinación completa de las preparaciones histológicas antes de la
inmunotinción.
OBTENCION DE CORTES Y FROTIS CELULARES.

UTILIZACION DE ADHESIVOS TISULARES
Si el procedimiento de inmunotinción se realiza sobre tejido congelado, se
obtendrán en el criostato cortes de 4-6 micras de espesor que se secan al aire
(ventilador) a temperatura ambiente durante dos horas; a continuación se fijan
en acetona absoluta a 4 °C durante cinco minutos y se vuelven a secar al aire
otros 30 minutos. Si la técnica se va a efectuar más tarde, las secciones pueden
guardarse envueltas en papel de aluminio y con un desecante, a -20 oc o a
temperaturas inferiores. En el momento de realizar la inmunotinción se llevan los
cortes a temperatura ambiente (no se desecha el envoltorio de papel de aluminio
hasta que los cortes hayan alcanzado dicha temperatura) y se vuelven a secar al
aire del ventilador, a temperatura ambiente, durante aproximadamente 60 minu-
tos. Luego se re?liza una refijación en cloroformo de 20 a 30 minutos y se pasan
al baño de TBS.
Los cortes en parafina se obtienen con un grosor de 3-5 micras y se dejan
secar toda la noche en estufa a 37 oc. A continuación se desparafinan cuidado-
samente en xileno, se llevan hasta el alcohol absoluto y se hidratan.
Cuando se aplican los métodos inmunoenzimáticos es bastante fácil que se
desprendan los cortes debido a los numerosos lavados que es preciso efectuar,
sobre todo si se ha realizado digestión con proteasas (véase más adelante) . Por
ello se recomienda emplear un adhesivo que fije las secciones a los portaobjetos.
Existen varios tipos de adhesivos: albúmina de huevo, gelatina, poli - L- lisina,
cromo gel , etc. (véase capítulo 3) .
Por lo que se refiere a los resultados de las técnicas, hay que tener presente
que un exceso de adhesivo puede ser causa del aumento de la tinción inespecífi -
ca de fondo . Por idéntico motivo, en la técnica de avidina-biotina se evitará el
uso de la albúmina de huevo como adhesivo.
Los frotis e improntas citológicas se realizan sobre portaobjetos limpios y
desengrasados en etanol -clorhídrico. Las células procedentes de cultivos celula-
res se extienden de igual forma o se cultivan directamente sobre cubreobjetos o
portaobjetos estériles.
Una vez confeccionadas las preparaciones histológicas, se debe trazar un
círculo con lápiz de diamante en torno a la sección para evitar que se difundan
los antisueros. En la actualidad existen en el mercado portaobjetos que presen -
tan una o varias superficies ligeramente deprimidas a donde pueden adherirse
los tejidos para realizar la incubación sin que ocurran fenómenos de difusión de
los reactivos.
2.3. Restablecimiento de la inmunorreactividad tisular:

digestión enzimática y deslipidización
La pérdida de antigenicidad ocasionada por los fijadores que contienen

aldehídos, como el formol tamponado, puede compensarse de dos formas: a)
utilizando un procedimiento inmunoenzimático de máxima sensibilidad, y b)
mediante digestión proteolítica con enzimas o por deslipidización.
DIGESTION ENZIMATICA: CONSIDERACIONES GENERALES
1. La digestión con proteasas no aumenta la reactividad de los antígenos

ricos en carbohidratos, tales como el antígeno carcinoembrionario, los
antígenos específicos de lectinas y el antígeno LeuM1 o CD15.
2. La digestión enzimática es útil principalmente para los métodos realiza-
dos sobre tejidos fijados en formalina, en especial si éstos han permane -
cido mucho tiempo en la solución fijadora . Sin embargo, no mejora
demasiado la inmunotinción de tejidos fijados en B-5, formol-acético o
líquido de Zenker o Bouin.
3. Con el tratamiento enzimático de duración óptima se reduce en gran
medida la tinción no específica, probablemente porque se suprimen al-
gunas de las moléculas proteicas responsables de la misma.
4. El aumento en antigenicidad que proporciona la digestión con proteasas
facilita el uso más diluido de los antisueros, lo que contribuye a reducir la
tinción no específica.
5. La digestión enzimática tiene inconvenientes tales como:
a) Si es excesiva, puede llegar a producir la destrucción del tejido, con

desprendimiento de porciones de éste.
b} Por digestión del antígeno puede debilitarse la tinción o crear falso -
negativos.
e) La digestión proteolítica excesiva de antígenos tisulares puede de-
senmascarar fragmentos proteicos comunes a diversos antígenos y,
por tanto, incrementar la tinción no específica .
Conviene recordar, no obstante, que la tinción no específica puede

ser también debida al uso de antisueros en diluciones inapropiadas,
siendo una causa frecuente el empleo de concentraciones de anticuerpos
diseñadas para secciones sin digestión previa, concentraciones que re-
sultan muy elevadas cuando se ha practicado tratamiento enzimático .
6. Cuando por las características del antígeno o del tejido no sea aconseja-
ble la digt::stión enzimática se puede recuperar parcialmente la anti-
genicidad de las muestras fijadas en formaldehído por otros medios:
como por ejemplo, empleando una solución de suerosa al 1 O por 1 00, de
forma que las secciones desparafinadas se almacenan en suerosa al 1 O
por 1 00 en PBS durante 16 horas antes de la inmunotinción .
7. Cualquier actividad enzimática proteolítica residual debe eliminarse una
vez completado el tratamiento de los cortes. Los métodos para ello son :
-Inmersión en tampón frío, por ejemplo, PBS o TBS a 4 oc, de 1 O a 30
minutos; después se enjuaga en agua corriente fría de 5 a 1 O minutos.
- Uso de inhibidores de las proteasas.

-Lavado en PBS glicinado al 0.2 por 1 OO.
DIGESTION ENZIMATICA: AGENTES PROTEOUTICOS

No existe una proteasa universal que sea adecuada para todos los tipos de
antígenos. No obstante, pueden obtenerse muy buenos resultados con tripsina
porcina de tipo 11 , o pronasa (véase más adelante) . Para un ajuste correcto del
procedimiento es aconsejable llevar a cabo el pretratamiento enzimático para
varios tiempos diferentes de incubación . En todo caso, la utilización de las
diversas proteasas está condicionada en gran medida por el tipo de antígeno
sobre el que se quiere incrementar la inmunorreactividad. A continuación se
exponen algunos de los ejemplos más característicos de desviación de la norma:
- Proteína S- 1 00 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bromelaína
- Vimentina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pepsina
- Queratina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ficina
- Factor VIII - RAg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ficina
Para controlar la digestión del tejido fijado como de costumbre e incluido en

parafina pueden utilizarse los siguientes procedimientos:
1. Proteasa 0.1 (tipo VIl) en PBS (pH 7 .4) durante 60 minutos a 37 °C.
2. Pronasa (0.0025 por 100 en Tris-CIH de 4 a 6 minutos.
3. Pronasa (0.5 a 1 mg/mL) en PBS de 1 a 5 minutos a temperatu ra
ambiente.
4. Solución de pepsina (4 mg/mL) en CIH 0 .01 N (pH 2 .25) durante 30
minutos a 37 °C.
5. Tri psi na (porcina tipo 11) en concentración de 25 mg/dL de 30 a 45
minutos, o de 50 mg / dL durante 20 minutos a 37 oc.
6. Tripsina al 0.06 por 100 o subtilisina 0.003 por 100 en TBS 0.15 M (pH
7.4) , de 15 a 60 minutos a temperatura ambiente.
7. Para las inmunoglobulinas extracelulares, incubar en tripsina 0 .1 mg (tipo
111) en buffer fosfato 0.1 M a pH 7.4 durante 3·0 minutos, enjuagar en
PBS seguido de solución salina de citrato tamponado (pH 2.6) y nuevo
pase en PBS.
8. Para eliminar los glicosaminogl icanos que enmascaran la fibronect ina en
el tejido cartilaginoso maduro humano, se puede realizar un pretrata -
miento con hialuronidasa (275 U / mg en buffer fosfato 0.1 M) de 15 a 30
minutos a temperatura ambiente.
RESTABLECIMIENTO DE LA INMUNORREACTIVIDAD
POR DESUPIDIZACION
La inmunorreactividad de ciertos antígenos de membrana se restablece mejor
por med io de la exposición a solventes de lípidos como el cloroformo que
med iante tratamiento con enzimas proteolíticas. Al parecer, las glucoproteínas
como el Leu - 7 + (CD57) están parcialmente enterradas en la doble capa de
lípidos de la membrana celular, por lo que se requ iere una exposición prolonga-
da (24 horas) al cloroformo de las secciones de parafina una vez hidratadas.

Resultados similares proporciona este reactivo en el caso de la proteína acídica
glial fibrilar (PAGF) .
2.4. Bloqueo de . la actividad enzimática endógena
Si en las técnicas inmunoenzimáticas se utiliza como marcador una enzima

normalmente presente en el tejido que se examina, debe inhibirse su actividad
endógena antes de la inmunotinción; de lo contrario, la enzima endógena reac -
cionará con el sustrato empleado para localizar la enzima marcadora, dando
lugar a falso-positivos.
La peroxidasa y otras sustancias que origil')an reacciones similares a ella
(como la hemoglobina) se encuentran en tejidos normales y en tumores; en
especial están presentes en leucocitos y hematíes, por lo que se han diseñado
varios procedimientos para inhibir su actividad .
El método más empleado es la incubación de las secciones, antes del proce -
dimiento inmunológico, con metano! absoluto al que se añade peróxido de
hidrógeno (metano! absoluto que contenga agua oxigenada al 0 .3 por 100
durante 1 0-30 minutos a temperatura ambiente) .
La actividad de la fosfatasa alcalina, a excepción de la de tipo intestinal,
puede bloquearse con levamisol en concentraciones de 1 mM . La fosfatasa
alcalina de tipo intestinal es sensible al tratamiento con ácido acético al 20 por
100, peróxido de hidrógeno al 0.3 por 1 00 y ácido periódico al 2.5 por 1 OO.
La glucosa oxidasa y otras enzimas como la alfa-2 -galactosidasa no presen -
tan problemas, ya que no existe actividad en los tejidos humanos.
Si durante el revelado se emplea diaminobencidina como cromógeno, debe
prepararse bajo campana de extracción de gases, utilizando guantes y mascarilla,
si bien en lugar de diaminobencidina pueden usarse otros cromógenos (véase
posteriormente) .
2.5. Bloqueo de la tinción de fondo
La tinción de fondo o «background» de una preparación inmunohistoquí -

mica puede ser específica o inespecífica . La tinción de fondo específica es
debida a varias causas:
1. A la presencia del antígeno objeto de estudio en lugares distintos a aquel
en que se quiere detectar. Por ejemplo: si se están determinando inmu -
noglobulinas en células plasmáticas, se teñirán los elementos celulares
que las contengan, así como las moléculas de inmunoglobulinas presen -
tes en el suero.
2. A la existencia en el antisuero primario de anticuerpos frente a antígenos
distintos al que quiere determinarse. Este problema apenas se manifiesta
cuando se utilizan anticuerpos policlonales de buena calidad o anti-
cuerpos monoclonales. En todo caso, la dificultad se resuelve en gran
medida usando altas diluciones del antisuero primario.
3. Al atrapamiento pasivo del antígeno o a su difusión hacia lugares donde
habitualmente no se encuentra. Esto ocurre por lo general si la fijación se
retrasa o es inadecuada, o cuando existen áreas extensas de necrosis e

infiltrado inflamatorio.
La causa más frecuente de tinción de fondo inespecífica es la unión no
inmunológica del antisuero a ciertos componentes de los tejidos, sobre todo
colágena y reticulina, debido a fuerzas hidrofóbicas y electrostáticas. General-
mente produce un color uniforme de fondo y es menos intensa con las técnicas
que usan anticuerpos no marcados. Por lo común es el antisuero primario el que
proporciona los niveles más altos de tinción de fondo inespecífica.
En estos casos la coloración del fondo puede reducirse bloqueando los
l~s con afinidad no inmune por las inmunoglobulinas. En Ta práct1ca, el
procedimiento implica incubar los cortes con una inñlünoglobulina que no
interfiera con el antisuero primario. Para ello, en las técnicas multisecuenciales
se usa suero normal de la especie animal de la que se ha obtenido el anticuerpo
secundario. En otras ocasiones se aconseja añadir este suero bloqueante al
antisuero primario y al complejo PAP.
La tinción de fondo inespecífica también puede reducirse usando el antisuero
primario en diluciones muy altas, añadiendo grandes concentraciones de sal
(2.5 por 1 00 de NaCI) al tampón, empleando preferentemente Tris buffer o
agregando al tampón detergentes tales como el Tritón X-1 OO.
La digestión enzimática, como ya se ha indicado, reduce igualmente la tin-
ción de fondo inespecífica.
2.6. Penetración de los reactivos. Detergentes
Para obtener buenos resultados en las técnicas inmunohistoquímicas es

esencial que los antisueros penetren de forma adecuada y alcancen los antí-
genos que se desea detectar. Para contrarrestar la escasa penetración de algunos
conjugados se puede recurrir al uso de detergentes como el Tritón X-1 00 y la
saponina, que actúan permeabilizando las membranas. Estas sustancias son muy
útiles cuando se trabaja con células intactas de improntas, frotis y monocapas de
cultivos celulares o con cortes gruesos en congelación o en parafina. Los deter-
gentes que alteran mucho la estructura fina de las membranas no son recomen-
dables para microscopia electrónica.
2.7. Controles
Se dice que una tinción inmunohistoquímica es específica si se demuestra

que:
1. No ocurre tinción si se omite el antisuero primario.
2. Se inhibe la tinción si se adsorbe el antisuero primario con el antígeno
frente al cual se ha obtenido, pero no con otros antígenos.
Para un buen desarrollo de la técnica es conven iente realizar siempre los
siguientes controles:
Control negativo: se omite el antisuero primario o se sustituye por suero
no inmune o buffer, utilizando el mismo tejido que para el control positivo; si el
resultado técnico es positivo será debido a una positividad inespecífica.
Control positivo: se utiliza una sección de tejido del que se tenga certeza
absoluta de que contiene el antígeno por determinar. De este modo, si con un
control positivo la técnica es negativa en la preparación problema, este hecho
será debido a un defecto de fijación o a cualquier fallo en el procedimiento
técnico.
Control de absorción: el control negativo ideal consiste en demostrar que
desaparece la inmunorreactividad si el antisuero primario es preabsorbido por el
antígeno, pero no si es preabsorbido por moléculas similares. Este tipo de
control se usa en la valoración de nuevos anticuerpos y no de forma rutinaria .
Control de bloqueo: no resulta imprescindible, pero puede ser de utilidad.
Consiste en bloquear la unión entre el antisuero primario y el antisuero conjuga -
do en la técnica indirecta o la unión entre el anticuerpo ffpuenteJJ y el complejo
PAP en la técnica de peroxidasa-antiperoxidasa. Se realiza intercalando en las
incubaciones de los anticuerpos mencionados una incubación con inmunoglo-
bulinas del mismo tipo que las marcadas.
Todos los controles que se utilizan en inmunohistoquímica tienen como
finalidad determinar los falso-positivos y negativos, confirmando que la técnica
se ha desarrollado bien .
Causas de falso -negativos

1. Enmascaramiento de los antígenos .
2. Desnaturalización de los antígenos por el calor, lo que impide que
los anticuerpos los reconozcan .
Causas de falso-positivos
1. Presencia de peroxidasa endógena por una mala inhibición .

2. Reacciones cruzadas inespecíficas entre antígenos y anticuerpos:
algunos anticuerpos pueden reaccionar con antígenos parecidos a los
antígenos problema y, sobre todo, existe la posibilidad de que se produz -
ca una fijación química no inmune entre los anticuerpos y la colágena
del tejido conectivo.
2.8. Tipos de anticuerpos. Diluciones
Al hablar del fundamento teórico de las técnicas inmunohistoquímicas he -

mos hecho abstracción del carácter policlonal o monoclonal de los anticuerpos
primarios. Aunque algunos anticuerpos monoclonales dan buenos resultados en
parafina, en general la consecución de resultados óptimos para la mayoría de
ellos requiere cortes en congelación .
Por lo que se refiere a las incubaciones, todos los métodos inmunohistoquí -
micos consisten en tratamientos sucesivos con antisueros, separados por lava -
dos en tampones. Para obtener una tinción óptima es importante que cada
antisuero se use en la dilución más adecuada, que no se evapore durante la
incubación y que el anticuerpo no unido al antígeno se elimine por completo
antes de la incubación siguiente. Las diluciones inadecuadas pueden dar lugar a
falso-negativos y a incremento de la tinción de fondo . Por ello, siempre debe
ensayarse una amplia gama de diluciones cuando se usa un anticuerpo por
primera vez o cuando un antisuero conocido se emplea por primera vez sobre
un tejido problema. En la práctica, la variación en las diluciones afecta exclu-
sivamente al anticuerpo primario: las de los restantes antisueros son siempre
iguales.
2.9. Incubaciones
Para prevenir la evaporación de los antisueros, las incubaciones se llevan a

cabo en una atmósfera húmeda, preferentemente en cámaras de incubación . De
esta forma se ahorra considerable cantidad de anticuerpos. Puesto que la tempe-
ratura influye en la velocidad de reacción antígeno-anticuerpo, si se realizan
incubaciones cortas el procedimiento se hará a temperatura ambiente; si por el
contrario se aplican incubaciones largas durante toda la noche, por ejemplo, la
cámara de incubación se mantendrá a 4 oc.
2.10. Lavados
En cualquier procedimiento inmunohistoquímico es preciso eliminar todo el

antisuero no unido al antígeno durante una incubación antes de pasar a la
siguiente, lo cual se realiza lavando en el tampón elegido, habitualmente TBS.
Para ello se extrae primero el exceso de antisuero lavando las preparaciones
sobre varillas de vidrio con frasco lavador, procurando no incidir directamente
sobre los cortes para evitar su daño. A continuación o se cubren de nuevo las
preparaciones con tampón en esta posición o se introducen en una jarra de
Coplin o se colocan en un cristalizador introducidas en una cestilla de portaob-
jetos, donde reciben tres baños de 2 -5 minutos cada uno. Para que la solución
de lavado se agite continuamente sobre la superficie del corte se deposita el
recipiente con los portaobjetos sobre un agitador magnético o en un baño de
agitación vacío.
/
2.11. Revelado de las técnicas inmunoenzimáticas:

cromógenos y sustratos
En las técnicas inmunoenzimáticas se denomina revelado el proceso median -

te el cual se pone de manifiesto el lugar de la reacción antígeno -anticuerpo por
la adición del sustrato de la enzima y un cromógeno.
El cromógeno más empleado en las técnicas inmunohistoquímicas que utili -
zan peroxidasa es la diaminobencidina (DAB) y, en segundo lugar, el 3-amino-
9-etilcarbazol. Por lo común la DAB produce resultados mejores que el 3-
amino-9-etilcarbazol y otros cromógenos tales como el 4 - CI - naftol, el reactivo
de Hanker- Yates o la tetrametilbencidina . Además, en el caso de la DAB la
tinción puede aumentar añadiendo al final del proceso metales pesados, como
ocurre en la intensificación con plata .
Cuando la enzima peroxidasa se incuba con un sustrato adecuado, general-
mente peróxido de hidrógeno, libera oxígeno naciente que por oxidación de la
DAB origina un producto de reacción insoluble y de color pardo (fig . 20.7,
véase páginas en color). Un incremento o disminución en la proporción entre

cromógeno y sustrato así como la exposición a luz intensa, que puede actuar
como oxidante, puede afectar al grado de tinción específica y de fondo de la
reacción final.
Por todo ello, se recomienda que el revelado se realice en condiciones de
iluminación no muy intensa y que el agua oxigenada no exceda la concentración
del 3 por 1 00 y la DAB la de 0,5 por 1 OO. Por otra parte, la reacción de la DAB
puede intensificarse manteniendo el pH por debajo de 7 .6. No obstante, en estas
condiciones existe el riesgo de aumentar la tinción de fondo no específica
causada por la oxidación espontánea que originan los metales que puedan estar
presentes en el tejido.
La penetración de la DAB en el tejido puede incrementarse sin riesgo de
sobreteñir, incubando los tejidos durante 30 minutos en DAB con una cantidad
despreciable de agua oxigenada. De los tres a los cinco últimos minutos se
añade la cantidad apropiada de peróxido de hidrógeno en una concentración
final del 0.05 por 1 OO.
La reacción de revelado con la DAB se detiene lavando cinco veces las
preparaciones en soluciones frías de agua destilada, Tris buffer 0.05 M a pH 7.6
o TBS, o por la adición de azida sódica .
Para preparar la solución de revelado se puede emplear el siguiente procedi-
miento:
1. Añadir 5 mg de DAB a 1 O ml de TBS 0.05 M a pH 7 .6 y agitar hasta
que se disuelva. Para mayor comodidad, la DAB puede almacenarse en
alícuotas a - 20 °C.
2. Añadir 0 .1 ml de agua oxigenada al 3 por 100 recién preparada por cada
3 ml de la solución de DAB.
3. Las secciones se incuban a temperatura ambiente hasta que se obtenga un
producto de color pardo, generalmente durante 5 a 1O minutos. Si es po-
sible, el revelado se realizará bajo control microscópico procediendo a de-
tener el proceso en el momento en que la tinción sea óptima con la mínima
tinción de fondo.
• Observaciones:
Debido al potente efecto carcinogénico de la DAB, se ha difundido el uso de
otros cromógenos tales como pirocatecol y tetrametilbencidina, pese a que sus
resultados son menos satisfactorios que los de la DAB. Para manipular la DAB es
preciso adoptar ciertas precauciones: debe ser manejada bajo campana de gases y
usando guantes de goma y mascarilla.
Además, cualquier objeto que se ponga en contacto con ella debe introducirse
después en lejía. Al final del revelado, el exceso de DAB debe decantarse sobre
un recipiente que contenga lejía .
El 3-amino-9-etilcarbazol. que se incluye generalmente en los preparados

comerciales, da lugar a un producto de color pardo rojizo y soluble en etanol,
por lo que requiere montaje en medio acuoso. La intensidad de la tinción se
borra con el tiempo. Si se emplea este cromógeno, se puede preparar la solución
reveladora de la siguiente forma:
1. Disolver 1 O mg de 3-amino- 9-etilcarbazol en 6 ml de dimetilsulfóxido y

añadir luego 50 ml de tampón acetato 0.02 M a un pH entre 5.0 y 5.2.
2. Agregar 0.4 ml de peróxido de hidrógeno al 3 por 100 y utilizar inmedia-
tamente.
3. Enjuagar las secciones en tampón acetato 0.02 M a pH 5, filtrar la solución
e incubar de 5 a 1 O minutos a temperatura ambiente. Las secciones se
montan en un medio acuoso.
Para las técnicas que emplean la fosfatasa alcalina como enzima trazadora, se
utiliza como sustrato el naftol AS fosfato y como cromógeno en fast red TR o la
neofucsina hexazotizada, que producen color r:ojo o el fast blue BB, que origina
color azul.
Coloración con fast red TR:
- Naftoi-AS-MX fosfato libre de ácido ................. . 2.0 mg
-N, N-dimetil formamida ..... ... .................. . . 0.2 ml
-Tris buffer 0 .1 M pH 8.2 .. .... . .. . . . .. . ........... . 9.8 ¡.tl
- Levamisol ..... . ... . ... .. . . ... . .... . ..... ... .... . 2.4 mg
-Sal fast red TR ....... . .. . .. .. ........... ... ..... . 10.0 mg
Modo de operar:
Se disuelve el naftoi-AS-MX fosfato en la N,N-dimetil formamida y se añade
el Tris buffer. Añadir y disolver el levamisol y la sal fast red TR y filtrar inmediata-
mente sobre las secciones. Incubar los cortes de 1O a 20 minutos; como el pro-
ducto de reacción, de color rojo brillante, es soluble en alcohol, se monta en medio
acuoso.
Se puede obtener un producto de reacción azul usando 2.1 mg de la sal fast
b/ue BB en lugar de la fast red TR .
Procedimiento de la neofucsina hexazotizada:
- Naftoi-AS - 81 fosfato . . . . . . . . . . ......... ........... 5 mg
- N,N-dimetil formamida . . . . . . . . ......... ........... 60 ¡tl
-Tris buffer 0.05 M pH 8,7 . . . . . . ......... ........... 10 ml
- Levamisol 1 M . . . . . . . . . . . . . . . ......... ........... 1O ¡.¡L
-Nitrito sódico al 4 por 100 (recién preparado) .......... 50 ¡.¡L
- Neofucsina al 5 por 100 en CIH 2 M ...... ........... 20 ¡.¡L
Modo de operar:
El sustrato debe prepararse bajo campana extractora. Añadir la neofucsina al
nitrito sódico, mezclar de 30 a 60 segundos e incorporar entonces el Tris buffer y
el levamisol. Inmediatamente antes de teñir, agregar el naftol AS-bifosfato di-
suelto en la N,N-dimetil formamida y filtrar directamente sobre las secciones. In-
cubar las secciones de 1 O a 20 minutos. El producto de reacción es rojo brillante;

las secciones deben ser deshidratadas rápidamente, aclaradas en xileno y montadas
con un medio sintético permanente.
3. PROCEDIMIENTOS TECNICOS
TECNICA DE PEROXIDASA-ANTIPEROXIDASA (PAP)

PARA ANTICUERPOS POLICLONALES
Modo de operar:
1. Realizar dos círculos concéntricos con lápiz de diamante alrededor del
corte. Desparafinar e hidratar.
2. Inhibir la peroxidasa endógena con cualquiera de los procedimientos para
ello (véase página 358).
3. Incubar con suero de cerdo (o del animal del que se haya obtenido el anti-
cuerpo puente) normal o diluido en TBS al 1/20 durante 20-30 minutos.
4. Drenar el exceso de suero y secar alrededor del círculo.
5. Incubar con el antisuero primario de conejo a la dilución óptima, usando
como diluyente suero normal de cerdo al 1:20 o TBS. Incubar 30 minutos
en cámara húmeda a temperatura ambiente o toda la noche en cámara
húmeda a 4 oc.
6. Eliminar el exceso de antisuero con TBS y aplicar tres lavados en TBS de
3 minutos cada uno.
7. Incubación con el anticuerpo secundario (habitualmente, suero de cerdo
anti-lgG de conejo). usando para diluirlo el mismo solvente que para el
anticuerpo primario. La incubación se realiza en cámara húmeda durante
30 minutos.
8. Proceder como en el paso 6.
9. Incubar en cámara húmeda, de 30 a 60 minutos con el complejo peroxida -
sa-antiperoxidasa en la dilución óptima : para diluir, emplear el mismo
reactivo que en los pasos 3 y 5 .
¡-::.
10. Proceder como en el paso 6 .
11 . Revelar con DAB aproximadamente 1 O minutos bajo control microscó -
pico.
13. Si se desea mejorar la inmunotinción, incubar en sulfato de cobre al 0 .5
por 100 en cloruro sódico al 0.9 por 100, durante 1 O minutos.
15. Contrastar con hematoxilina - preferentemente de Mayer-, deshidratar,
aclarar y montar.

- Lugares con inmunotinción ( +) . . . . . . . . . Color pardo negruzco
TECNICA DE (PAP) PARA ANTICUERPOS MONOCLONALES
Si se utiliza como anticuerpo primario un anticuerpo monoclonal de ratón, el

procedimiento es idéntico al descrito, con la salvedad de que se utilizarán:
a) Como suero bloqueante no inmune, el suero normal de conejo en lugar de
suero de cerdo;
b) Como antisuero secundario, una lgG de conejo frente a ratón, y
e) Un complejo peroxidasa antiperoxidasa procedente de ratón .
Aunque no se disponga de un complejo PAP de ratón, puede realizarse la téc-
nica, a condición de que tras la incubación con el anticuerpo primario y el corres-
pondiente lavado, se proceda a incubar con suero de conejo frente a ratón, en la
dilución óptima, durante 30 minutos. A continuación, y después de lavar, se siguen
los pasos 4 y sucesivos con la técnica para anticuerpos policlonales.
Si el método se lleva a cabo sobre cortes en congelación, una vez obtenidas
las secciones se fijan en acetona como se indica en «Obtención de cortes». En este
caso no suele inhibirse la peroxidasa endógena .
3.2 . Técnica de inmunofosfatasa alcalina
TECNICA DE FOSFATASA ALCALINA ANTI-FOSFATASA

ALCALINA (APAAP)
Se procede igual que para la técnica de PAP, aunque usando un complejo de
fosfatasa alcalina anti -fosfatasa alcalina.
La reacción puede mejorarse repitiendo una o dos veces todos los pasos a partir
de la incubación con el anticuerpo secundario o puente.

- Lugares con inmunotinción ( +) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rojo intenso
3 .3 . Técnicas de avidina-biotina
Usan como trazador tanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina.

METODO DE LA AVIDINA MARCADA
Modo de operar:
1. Incubar con suero normal de cerdo (SNC), diluido 1:20 en TBS durante 20
minutos.
2. Drenar el exceso de SNC.
3. Incubar con el anticuerpo primario en la dilución óptima, usando como
disolvente SNC en dilución 1:20, durante 30-45 minutos a temperatura
ambiente o toda la noche a 4 °C.
4. Eliminar el exceso de antisuero con TBS y lavar en TBS, tres cambios
de 5 minutos cada uno.
5. Incubar con el anticuerpo secundario biotinado, en la dilución óptima,
usando como disolvente SNC a 1:20, de 30 a 45 minutos.
6. Proceder como en el paso 4 .
7. Incubar con la avidina marcada con la enzima, en la dilución óptima,
usando como disolvente SNC a 1 :20 de 30 a 60 minutos.
8. Proceder como en los pasos 4 y 6.
9. Incubar con la solución correspondiente de revelado según que el marcaje
se haya realizado con peroxidasa o con fosfatasa alcalina.
1O. Lavar en agua corriente.
11 . Contrastar con hematoxilina, preferentemente de Mayer, y montar.
TECNICA DEL COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA (ABC)
Los pasos 1 al 6 son iguales que en la técnica anterior. Después se procede a
incubar con el complejo avidina-biotina durante 30 minutos. Los pasos 8 al 11
son asimismo iguales.
• Observaciones:
Algunos tejidos tienen la capacidad de atrapar la avidina (ya sea por afinidad
molecular o por su alto contenido en biotina endógena), lo cual puede determinar
la aparición de falso-positivos. Es posible bloquear este fenómeno incubando las
secciones antes de la tinción con avidina al 0.1 por 1 00 y tratando después con
biotina al 0.01 por 1 OO.
TECNICAS INMUNOHISTOOUIMICAS ( 11 ) 367
3.4. Métodos del oro coloidal para microscopia óptica
TECNICA DIRECTA
Modo de operar:
1. Tratar las secciones con solución yodo-yodurada de lugol durante 5 minu-
tos, aclarar con tiosulfato sódico al 2.5 por 100 y lavar bien en agua
corriente.
2. Incubar con suero de cabra normal al 1/20 en albúmina sérica bovina
(AS B) al 0.1 por 1 00 y pH 8.2 en TBS, durante 1 O minutos.
3. Drenar (no lavar) el exceso de solución anterior.
4. Incubar con el anticuerpo primario en la d ilución óptima en ASB -TBS
durante una hora.
5. Eliminar el exceso de antisuero primario y lavar en ASB- TBS : tres baños
de 5 minutos de duración cada uno.
6. Lavar en PBS: tres baños de 2 minutos cada uno.
7. Refijar con glutaraldehído al 2 por 100 en PBS durante 10-15 minutos.
Este paso no es necesario si se ha realizado tratamiento previo con yodo y
tiosulfato.
8. Lavar bien en agua destilada. Si es necesario se puede intensificar la tinción
con plata (veáse a continuación)
9. Contrastar con hematoxilina, deshidratar, aclarar y montar.
TECNICA INDIRECTA
Modo de operar:
1 a 3. Como en la técnica directa.
4. Incubar con el anticuerpo primario en la dilución óptima en ASB- TBS
durante 60 minutos.
5. Lavar con ASB- TBS hasta eliminar el exceso de antisuero. A continua -
ción, realizar tres baños con ASB- TBS de 5 minutos cada uno.
6. Incubar con el anticuerpo secundario conjugado con el oro a la dilución
óptima en ASB -TBS durante una hora.
7. Eliminar el antisuero secundario lavando con ASB- TBS . A continuación,
realizar tres lavados de 2 minutos cada uno en ASB- TBS.
8. Lavar con PBS 0.1 M a pH 7.6: tres baños de 2 minutos cada uno.
9. Refijar con glutaraldehído al 2 por 100 en PBS de 1O a 15 minutos (este
paso no es necesario si se ha llevado a cabo el paso 1 ) .
1 O. Lavar bien en agua destilada y, si se desea, intensificar la coloración con
plata (véase a continuación) .
11 . Contrastar, deshidratar, aclarar y montar.
INTENSIFICACION CON PLATA DE LA COLORACION

DEL ORO COLOIDAL
Soluciones:
a) Tampón citrato 2M:
-Citrato sódico .................................. . 23.5 g
- Acido cítrico ................................... . 25.5 g
-Agua destilada ............................... . .. . 100.0 mL
b) Solución de plata:
- Lactato de plata . ...... .... .. ... ................ . . 110.0 mg
-Agua destilada ..................... . . . . .... ..... . 15.0 mL
e) Solución de hidroquinona:
- Hidroquinona ....... .. ............. ... .......... . 950.0 mg
-Agua destilada .......... ........ ... .. ........... . 15.0 mL
d) Solución de goma arábiga al 50 por 100 7.0 mL
e) Solución de trabajo :
-Solución de lactato de plata ...... . ........ . ....... . 15.0 mL
-Solución de hidroquinona ... .. . . .................. . 15.0 mL
-Tampón citrato 2 M ......................... .... . . 10.0 mL
-Agua destilada .............. ........ . . .... . ..... . 60.0 mL
- Solución de goma arábiga . . . ........ ............ .. . 7 .0 mL
Modo de operar:
1. Lavar los cortes en tampón citrato 2 M durante 2 minutos.
2. Incubarlos en la solución de plata a temperatura ambiente y protegidos de
la luz (cuarto oscuro con luz de seguridad) durante 3 minutos.
3. Lavarlos en agua destilada, contrastar con hematoxilina si se desea, des-
hidratar, aclarar y montar.
CAPITULO 21
Microscopía electrónica
de barrido
GUION DE CONTENIDOS
1. INTRODUCCION
2. PRINCIPIOS BASICOS DE LA MICROSCOPIA ELECTRONICA
DE BARRIDO
3. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
4. VARIANTES METODOLOGICAS EN MICROSCOPIA
ELECTRONICA DE BARRIDO
5. APLICACIONES DE LA MICROSCOPIA ELECTRONICA
DE BARRIDO
1. INTRODUCCION
La microscopía electrónica de barrido nació en 1938, cuando Manfred van

Arden, basándose en los estudios experimentales realizados por Mac Koll en
1935, construyó un prototipo de microscopio de esta índole. Sin embargo, no
alcanzó un completo desarrollo hasta los años sesenta, en que la ffCambridge
lnstrument CompanyJJ comercializó el instrumento utilizando para ello los estu-
dios de Oatley. Las dificultades planteadas en el procesamiento de los especí-
menes biológicos hicieron que las investigaciones realizadas sobre este material
no avanzaran tanto como los estudios sobre materiales inorgánicos.
Hoy día, subsanados casi todos los problemas relacionados con el procesa -
miento de las muestras, la microscopía electrónica de barrido constituye un
método sumamente útil para el estudio de la morfoestructura superficial
de las muestras biológicas, y, en consecuencia, un medio complementario
de análisis que suministra importante información sobre la estructura de las
células y tejidos.
En comparación con la microscopía electrónica convencional. la microscopía
electrónica de barrido ofrece dos ventajas principales: a) permite la observación
de áreas mucho mayores sobre la superficie de los objetos, y b) puede propor-
cionar más información sobre la estructura y composición del objeto analizado
debido a la gran cantidad de interacciones que realizan los electrones del haz de
observación entre sí y con el propio objeto de estudio.
2. PRINCIPIOS BASICOS DE LA MICROSCOPIA ELECTRONICA

DE BARRIDO
En el microscopio electrónico de barrido, que permite el estudio tridimensiÓ-

nal de la superficie de las muestras, un haz de electrones emitidos por un
filamento de tungsteno que actúa como cátodo es dirigido hacia la muestra a
través de una columna incluida en el microscopio. Este haz se desplaza sobre la
muestra realizando un barrido de su superficie que es proyectado sincrónica y
simultáneamente sobre la pantalla de observación . Dependiendo de la señal
detectada, la información que proporciona el instrumento puede hacer referen-
cia: a) al poder de emisión de electrones secundarios (arrancados de la muestra
por el haz primario). retrodispersados del haz primario o absorbidos por el
objeto; b) a la capacidad de inducir cambios eléctricos sobre un objeto que
actúa como semiconductor (efecto inducido}; e) a la emisión de luminiscencia
debida a la liberación de fotones por parte de objeto sometido a la irradiación
electrónica, y d} al igual que en la microscopía electrónica de transmisión, a la
detección de los electrones residuales que atraviesan la superficie. Por lo que se
refiere a la utilización de la microscopía electrónica de barrido en Biología,
cuando se realiza especial énfasis en el estudio del poder de emisión de electro-
nes dispersados y residuales, la aplicación se relaciona principalmente con el
microanálisis, mientras que cuando la información hace referencia sobre todo a
electrones absorbidos y el efecto de fotoluminiscencia, se obtiene una imagen
tridimensional del objeto de estudio. .
Los componentes básicos del microscopio de barrido son, además del cañón
de electrones (fig . 21.1 ), un sistema de lentes deflectoras que varía las caracte-
MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO 371
Figura 21.1. Microscopio electrónico de barrido .
rísticas del haz y diversos amplificadores y detectores de la señal. Para que los
electrones puedan circular libremente, en el interior de la columna debe existir un
o-
vacío de 1 3 Pa.
En cuanto al mecanismo de recepción , la radiación producida tras interac-
cionar el haz electrónico con el objeto es acelerada por un colector con carga
positiva que la dirige hacia el escintilador, donde la energía cinética de la
radiación no fotónica es convertida en luz visible. Posteriormente, un fotomulti-
plicador la transforma en señal eléctrica, que es ampliada y expresada en térmi-
nos de variación luminosa en un tubo de Braum. De esta manera se forma la
imagen que se refleja en una pantalla y puede ser recogida simultáneamente por
fotografía indirecta.
3. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Debido a la gran variedad de los materiales susceptibles de ser observados

con microscopía electrónica de barrido, los criterios metodológicos para su
preparación son asimismo muy numerosos. No obstante, es posible esbozar una
pauta general aplicable a muestras biológicas (tabla 21 .1 ) .
3.1 . Fijación del material
En esta fase del proceso, que persigue dar una adecuada estabilidad a la
muestra, se utilizan fijadores químicos del tipo de los aldehídos; de ellos, el más
empleado es el glutaraldehído al 2.5 por 1 OO.
TABLA 21.1: PAUTA GENERAL PARA EL PROCESAMIENTO

DE MUESTRAS CON M.E.B.
1. Lavar la superficie de la muestra con suero fisiológico.
2. Fijar durante 6 horas con una solución de glutaraldehído al 2.5 por 1 00 en
tampón fosfato a pH 7.4, 0.1 M .
3. Lavar con tampón fosfato durante 30 minutos (tres cambios de 1O minu-
tos) .
4. Postfijación con tetróxido de osmio al 2 por 100 en tampón fosfato, du-
rante una hora.
5. Deshidratar en soluciones crecientes de acetona:
-Acetona 30 por 100: 10 minutos
-Acetona 100 por 1 00: 2 cambios de 1 O minutos cada uno
-Acetona anhidra: 2 cambios de 1 O minutos cada uno
-Acetato de amilo: 2 cambios de 1O minutos cada uno
6. Desecación:
-Introducir las muestras, impregnadas en acetato de amilo, en la cámara,
que quedará totalmente cerrada .
-Introducir en la cámara C0 2 líquido, que se intercambiará con el acetato
de amilo. Esta maniobra se realizará varias veces, hasta conseguir la
eliminación total del acetato de amilo .
-Se eleva la temperatura de la cámara a 31 oc.
-Expulsar lentamente el gas de la cámara.
7. Montar las muestras, utilizando como sustancia adherente la plata coloidal.
8. Recubrir con oro.
9. Observar las muestras en un microscopio electrónico de barrido.
Un paso previo que resulta necesario para la adecuada observación de las

muestras es el lavado minucioso con suero salino de la superficie objeto de
estudio.
Otras cuestiones de gran interés relativas a la fijación son el tipo de solución
amortiguadora que debe emplearse para diluir el glutaraldehído, la cantidad de
fijador que se debe utilizar y su tiempo de actuación .
En relación con la solución amortiguadora, debe tenerse en cuenta que las
variaciones de presión osmótica afectan mucho a los resultados de la microsco-
pia electrónica de barrido, por lo que deben observarse escrupulosamente las
precauciones necesarias para la isotonicidad del líquido fijador. No obstante, se
pueden considerar como soluciones amortiguadoras de uso generalizado el
tampón fosfato y el tampón cacodilato.
De la misma forma que el tipo de solución amortiguadora y la proporción a la
que debe ser preparada la solución fijadora varían mucho según la experiencia
de cada laboratorio, el tiempo que deben permanecer las muestras en el fijador
es también muy variable: puede oscilar entre 2 y 24 jloras según el tamaño,

considerándose como tiempo medio el de 6 horas. Una vez fijada las muestras,
se lavan en solución amortiguadora (generalmente, tres cambios de 1 O a 15
minutos cada uno).
3.2. Tratamiento posfijación
Esta fase es de gran importancia, ya que previene la deformación del secado

al aire cuando no se dispone del procedimiento del punto crítico (véase más
adelante) , aumenta la conductividad eléctrica de la muestra y evita casi por
completo la extracción de los lípidos de las membranas durante el ulterior
proceso de deshidratación . Como agente posfijador suele emplearse el tetróxido
de osmio al 1 ó 2 por 100 en igual solución amortiguadora que la utilizada para
el glutaraldehído, y durante un tiempo que oscila entre 30 minutos y 2 horas de
tratamiento, dependiendo del tamaño de la muestra.
3.3. Deshidratación
Tras lavar las muestras nuevamente, se procede a su deshidratación. A fin de

evitar posibles alteraciones artefactuales, la liberación del agua de los tejidos
debe realizarse de forma gradual en baños crecientes del agente deshidratante.
Los agentes más utilizados son el etanol, la acetona y el etilenglico/. Los dos
primeros se utilizan con gran eficacia en los laboratorios de microscopia electró -
nica; la pauta de deshidratación con acetona se recoge en la tabla 21 .1.
En esta fase del proceso, y antes de la desecación de las muestras, resulta
necesario el empleo de líquidos intermediarios, como el acetato de amilo.
3.4. Desecación
Es importante señalar que en el procesamiento de muestras biológicas para

su observación por microscopía electrónica de barrido no es suficiente la simple
deshidratación, sino que es necesario conseguir una completa deseca-
ción. Para ello se aplica casi siempre el método del punto crítico, que evita en
gran medida los efectos de la tensión superficial.
Mediante este método se consigue la extracción completa del líquido intra-
celular y extracelular con escasas alteraciones estructurales. El procedimiento se
realiza del siguiente modo: una vez colocada la muestra en una interfase de
líquido y gas, se lleva el conjunto a su punto crítico, o combinación de presión y
temperatura a la cual la densidad del gas es idéntica a la del líquido. En este
momento, si todo el sistema se lleva a una temperatura superior a la crítica sin
modificar la presión, todo el líquido pasará a gas sin atravesar las superficies
celulares y del tejido, incluyendo el contenido en la muestra, con lo cual se
evitan los efectos de arrastre y de tensión superficial que toda evaporación
supone.
Puesto que trabajando con muestras biológicas es inviable alcanzar el punto
crítico del agua (374 oc y 218 atm.), es necesario utilizar otros fluidos como el
dióxido de carbono, el óxido nitroso y distintos derivados del freón .
3.5. Descripción del procedimiento técnico de desecación
Las muestras, contenidas en una solución de acetato de amilo que actúa

como líquido intermediario para combinar con el co2 o el freón 13 utilizados en
el punto crítico, se introducen, en pequeños cestos, dentro de una cámara que
ha sido adaptada para resistir presiones y temperaturas elevadas (figs. 21 .2 y 3) .
Una vez allí. y con la cámara a temperatura inferior a 1O oc.
se introduce C0 2
líquido para, a continuac ión, expulsar muy lentamente el acetato de amilo, que
se va intercambiando con el C0 2 ; esta fase del proceso se mantiene el tiempo
necesario para conseguir la extracción total del acetato de amilo, lo que depende
del tamaño y número de muestras incluidas en la cámara . El proceso se da por
terminado cuando se observa la salida de co2 por la válvula de expulsión .
Figura 21.2. Cámara de punto crítico.
Figura 21.3. Cestos para muestras.

Después se eleva la temperatura de la cámara: cuando se alcanzan los 31 oc y

una presión de 74 barr (punto crítico del C0 2 ), se procede muy lentamente a la
eliminación del gas de la cámara.
Igual pauta se sigue cuando se utiliza freón 13, cuyo punto crítico se consi-
gue a una temperatura de 39 oc y presión de 40 barr.
Para desecar las muestras también se utiliza actualmente el fluorocarbón, que
presenta algunas ventajas sustanciales con respecto al método expuesto más
arriba, en especial la de que no requiere aplicar presiones y temperaturas eleva-
das ni utilizar aparatos específicos. No obstante, como el producto se ha intro-
ducido recientemente parece necesaria una valoración más amplia de sus efec-
tos.
3.6. Montaje de las muestras
Las muestras desecadas se colocan en soportes de aluminio especialmente

diseñados para el microscopio electrónico de barrido, utilizando como adherente
sustancias conductoras tales como la plata coloidal (fig. 21.4).
Es importante reiterar que en esta fase del proceso la manipulación de la
muestra debe ser extremadamente cuidadosa, evitando dañar o manchar con la
sustancia adherente la superficie que se desea observar.
Figura 21.4. Portaobjetos de aluminio para MEB .
Para un correcto montaje se deben seguir las siguientes pautas:

1. Comprobar que la consistencia de la plata coloidal es semilíquida .
2. Depositar cantidad suficiente de plata para adherir la muestra. Una canti -
dad excesiva puede ser motivo de que se oculte toda la superficie de
estudio.
3. Colocar la muestra sobre la plata depositada en el portaobjetos antes de
que ésta se seque totalmente.
4. Dejar secar la plata .
3.7. Recubrimiento
La última fase del proceso consiste en proveer a las muestras de una super -
ficie conductora de la electricidad y del calor que facilite su carga durante el
barrido, para lo cual es necesario utilizar carbón o metales pesados como oro,
platino, paladio, aluminio, etc.
De entre las numerosas pautas existentes para el recubrimiento destaca el
bombardeo iónico en cámara de vacío, que se consigue por la descarga del
cátodo donde se encuentra el metal sobre un ánodo donde está la muestra,
usando como vehículo un gas inerte como el argón (fig . 21 .5). El procedimiento
más común es la metalización con oro o la doble metalización con carbón y oro.
Esta última se consideró en principio la más adecuada, pero en realidad la
aplicación simple con oro, correctamente efectuada, resulta suficiente para con -
seguir una buena superficie conductora y, en consecuencia, una adecuada ima -
gen microscópica .
Figura 21.5. Sistema para metalización de muestras (Sputtering) ..
Otro método para obtener una superficie conductora es el recubrimiento por

evaporación tras calentamiento de un metal en cámara de vacío, lo que hace que
sobre la muestra se depos!te una capa del metal en cuestión .
Otros métodos más antiguos, como la inmersión simple en soluciones alco -
hólicas saturadas de cloruro de oro con posterior secado al aire, son muy poco
utilizadas en la actualidad.
En cuanto a la capa de metal depositada sobre la muestra, hay que señalar
que una capa muy delgada produce efectos de carga en la posterior observación,
los cuales se traducen en la pantalla como destellos luminosos (figs. 21.6 y 7),
en tanto que una capa muy gruesa oculta los límites reales de los elementos
superficiales que configuran la muestra. Para soslayar estas dificultades se dis-
pone de medidores de grosor de la capa metalizadora.
Figura 21.6. Imagen con efectos de carga (membrana otolítica) .
Figura 21 .7. Imagen sin efectos de carga (epitelio traqueal).
4. VARIANTES METODOLOGICAS EN MICROSCOPIA ELECTRONICA

DE BARRIDO
Sobre el proceso convencional de muestras para microscopía electrónica de

barrido pueden aplicarse numerosas variantes, tales como la utilización de técni-
cas conductoras, criofractura, criofijación, marcadores de superficie, moldes de
estructuras tubulares, etc. El análisis detallado de estas variantes excede los
objetivos básicos de este capítulo. Con todo, la extensa aplicación de la criofija-
ción , de la criofractura y de las técnicas conductoras aconseja incluir algunas
consideraciones sobre ellas.
4.1. Criofijación
La criofijación se utiliz!l como procedimiento sustitutivo de la fijación quími-

ca, fundamentalmente en especímenes susceptibles de ser microanalizados.
Consiste en la fijación de muestras por medio de líquidos criogénicos, entre los

que destaca el nitrógeno líquido; esta fijación evita la movilización iónica de las
muestras sin introducir sustancias ajenas a ellas.
Este proceso de criofijación consiste básicamente en la inmersión de los
especímenes -previamente depositados sobre los portamuestras de barrido, ya
sean de aluminio o de grafito- en nitrógeno líquido que presenta un punto de
ebullición de -196.3 °C. Para evitar la formación de microcristales por el impor-
tante cambio de temperatura , debe utilizarse un agente criogénico intermedio,
como el freón 22 líquido.
En la actualidad existen sistemas que, en cámaras de vacío y a muy bajas
temperaturas, permiten realizar tras la criofijación una deshidratación progresiva
que sustituye por completo al proceso convencional, incluida la metalización .
4 .2. Criofractura
La característica básica del microscopio electrónico de barrido, que permite

observar de modo exclusivo la superficie de las muestras, hace necesaria la
manipulación adecuada de éstas cuando se precisa observar su interior. Como es
lógico, dadas las características de observación con este tipo de microscopio es
imprescindible cortar las muestras para exponer la superficie al bombardeo de
electrones.
Los sistemas convencionales de microtomía no son suficientemente válidos
para obtener la superficie de corte, ya que proporcionan una superficie lisa por
completo que al ser bombardeada por los electrones se traduce en una imagen
artefactual.
Por este motivo, la aplicación de la criofractura ha constituido una herra -
mienta de trabajo muy útil, particularmente en la microscopía electrónica y
sobre todo en el estudio de las estructuras membranosas. Con el desarrollo
del procesamiento de los especímenes para microscopía electrónica de barri -
do, esta técnica también ha sido incorporada a ella con objeto de que propor-
cione una superficie que refleje fielmente las características del interior de las
muestras.
Las bases teóricas del proceso consisten en cortar o fracturar la muestra por
la presión mecánica de una cuchilla a baja temperatura tras producir el enfria -
miento utilizando nitrógeno líquido como sustancia criogénica. Durante el per -
feccionamiento de este proceso se han desarrollado diferentes modalidades
técnicas. A continuación se expone una de ellas, que tiene la particularidad de
insertarse con facilidad en el proceso convencional.
Fijación: glutaraldehído 2.5 por 100 en tampón fosfato 0.1 M a pH 7.4.
Modo de operar:
1. Lavar con tampón fosfato durante 30 minutos (tres cambios de 1 O mi-
nutos) .
2. Retallar la muestra.
3. Postfijación en tetróxido de osmio 2 por 1 00 en tampón fosfato .

4. Lavar con tampón fosfato durante 30 minutos (tres cambios de 1O mi-
nutos).
5. Deshidratar en soluciones de etanol crecientes (cambios de 15 minutos) .
6. Criofractura.
-Se introduce la muestra impregnada en etanol dentro de un cilindro de
parafilm.
-Se liga uno de los extremos del cilindro y se añade etanol, ligando poste-
riormente el otro extremo.
- Se introduce el cilindro en nitrógeno líquido. Sobre una placa metálica
fría se coloca el cilindro y se fractura con una cuchilla de un sólo golpe
en dos mjtades.
-Estas mitades son colocadas en etanol absoluto, eliminando cuidadosa-
mente el cilindro de parafilm. Para el resto del proceso se aplica, a partir
de la desecación, la pauta convencional descrita en la tabla 21 .1.
4.3. Técnicas conductoras
Estos métodos han sido introducidos con el fin de aumentar la conductividad

de las muestras biológicas y, por tanto, la emisión .de un mayor número de
electrones secundarios en muestras en las que no se desea utilizar la meta-
lización .
Existen numerosas variantes metodológicas, entre las que destaca la pro-
puesta por Murakami, empleando la combinación del ácido tánico y el tetróxi -
do de osmio a lo largo del procesamiento de las muestras. Con la utilización de
dichos compuestos en las muestras no recubiertas, se consigue mejor resolución
y un mayor contraste durante la observación. A continuación se describe la
pauta que creemos más eficaz y de más fácil aplicación.
Fijación: ninguna. Secciones criostáticas.
Modo de operar:
1. Lavar en tampón fosfato.
2. Inmersión de las muestras en una solución acuosa de suerosa al 2 por 100,
arginina al 2 por 100, glicina al 2 por 100 y glutamato sódico al 2 por
100 a pH 6.2 durante 16 horas.
4. Inmersión en una solución acuosa de ácido tánico al 2 por 100 durante
8 horas.
6. Postfijación en tetróxido de osmio al 2 por 100 en tampón fosfato durante
8 horas.
7. Lavar en tampón fosfato durante 30 minutos.
8. Deshidratar en acetona .
9. Desecar.
1O. Montar las muestras.
5. APLICACIONES DE LA MICROSCOPIA ELECTRONICA

DE BARRIDO
Al igual que ocurrió con la microscopía electrónica de transmisión, la micros-

copía electrónica de barrido ha desencadenado una revisión sistemática de la
morfoestructura de los distintos sistemas biológicos, y se ha convertido en un
método de extendida aplicación en las diferentes ramas del saber. Es un método
sumamente útil en paleontología, cristalografía, microelectrónica, arte y ciencias
de materiales, botánica, microbiología, parasitología, histología, citología y, en
general, en todas aquellas ramas de la ciencia que tienen como objeto de
estudio la morfoestructura de muestras, siempre que éstas sean capaces de
resistir un alto vacío.
Este tipo de microscopía ha experimentado un gran avance en los dos últi -
mos decenios, fundamentalmente debido a que la observación de imágenes
tridimensionales de amplias superficies está permitiendo ampliar los conoci-
mientos estructurales que quedaban parcialmente ocultos con el empleo exclusi -
vo de la microscopía, óptica y electrónica de transmisión.
Teniendo en cuenta las múltiples aplicaciones de la microscopía de barrido,
invitamos al lector a que consulte la bibliografía especializada, en la que encon-
trará mención de las innovaciones añadidas a este instrumento, que determinan
que tanto las técnicas de preparación de muestras como las diferentes aplicacio-
nes del método estén sometidas a una revisión constante. A continuación se
exponen en síntesis diferentes aplicaciones de la M.E.B. en biología celular, sin
especificación detallada del procedimiento metodológico.
En el estudio de las poblaciones celulares del sistema inmunitario y sanguíneo,
la M .E.B . está permitiendo tipificar nuevos patrones morfológicos de superficie;
así ocurre en las recientes descripciones de los linfocitos «peludos» y «vellosos»
que definen morfológicamente a dos formas particulares de leucemia. Una tipifica-
ción morfológica similar se está revelando importante en los estudios de prolife-
ración y renovación de las poblaciones epiteliales, de la morfología cromosómi-
ca, de los espermatozoides, etc.
Singular interés tiene la aplicación de este tipo de microscopía a los procesos
de biomineralización y, por ende, a los tejidos duros, al no ser necesaria su
descalcificación. De este modo ha sido posible realizar descripciones de esmalte,
dentina, otoconias vestibulares, cálculos urinarios y huesos, entre otros, tan -
to en condicionales normales como en condiciones patológicas y de experi-
mentación.
Por otra parte, la aplicación del barrido tras la preparación de moldes vascu-
lares permite conocer mejor la configuración tridimensional microvascular de
diferentes órganos y sistemas.
Uno de los avances más significativos en este campo es la posibilidad de
incorporar sistemas de detección de energía dispersiva de rayos X y electrones
retrodispersos, que, combinados con técnicas complementarias hacen posible la
determinación cualitativa y cuantitativa de diferentes elementos químicos y la de
su distribución topográfica (microanálisis).
Además, la imagen obtenida por captación de los electrones retrodispersos
permite visualizar estructuras artificiales «teñidas» con elementos de elevado
número atómico, posibilitando de esta forma la localización de diversas activida-
des enzimáticas así como el análisis de la expresión de antígenos y receptores de
la superficie celular mediante la aplicación de técnicas inmunocitoquímicas y de

oro coloidal.
Combinando la observación tridimensional con el marcaje inmunocitoquími-
co de antígenos de superficie celular, es posible analizar las interrelaciones
celulares y con macromoléculas, así como definir, de forma más sensible que
mediante la inmunohistoquímica convencional, la proporción de determinados
receptores de membrana.
CAPITULO 22
La histoautorradiografía
GUION DE CONTENIDOS
1. DIFERENCIA ENTRE RADIOGRAFIA Y
AUTORRADIOGRAFIA
2. CONCEPTO DE HISTOAUTORRADIOGRAFIA
3. ISOTOPOS E ISOTOPOS RADIACTIVOS
4. FUNDAMENTOS DE LA TECNICA DE AUTORRADIOGRAFIA
5. CONDICIONES NECESARIAS PARA LA REALIZACION DE
AUTORRADIOGRAFIAS. ESQUEMA GENERAL DE
DESARROLLO DE LA TECNICA DE AUTORRADIOGRAFIA
6. PROCEDIMIENTO HISTOLOGICO PARA
AUTORRADIOGRAFIA
7. CONTROLES
8. POSITIVIDAD DE FONDO INESPECIFICA
9. METODOS PARA ELIMINAR LA INESPECIFICIDAD
10. TECNICA CON EMULSIONEN PLACA
11. TECNICA CON EMULSIONES LIQUIDAS
12. TECNICA DE AUTORRADIOGRAFIA DE CUERPO ENTERO
---- - - - - - - - - - - - - - -- ----
1. DIFERENCIA ENTRE RADIOGRAFIA Y AUTORRADIOGRAFIA
Una radiografía es la representación de los patrones con que se distribuye la

radiación en una muestra determinada. En general, la radiación consiste en rayos
X o gamma que se registran sobre una placa fotográfica. La muestra que se
desea radiografiar se coloca entre una fuente de radiación y una placa radiográfi-
ca, de forma que la absorción y la dispersión de la radiactividad por la muestra
determina la imagen que se registra sobre la película fotográfica (fig. 22.1 ). En la
técnica de autorradiografía, sin embargo, la misma muestra que se examina
constituye la fuente de radiación a través de material radiactivo que le ha sido
incorporado previamente.
FR
- ---------------
~
-- -------------~--------
___ ----------- -------- --------------~~

-
- ------------ ---------
K - --------------- :"'.:.
A B
Figura 22.1. Diferencia entre radiografía y autorradiografía . En el procedi-

miento de radiografía (A) el objeto que se va a examinar se coloca entre la
fuente de radiación (FR) y la placa fotográfica (PF). En la autorradiografía
(B) el objeto que se examina es la propia fuente de radiación.
2. CONCEPTO DE HISTOAUTORRADIOGRAFIA
La histoautorradiografía consiste en la localización de sustancias radiactivas

en extensiones de células o cortes de tejidos (fig. 22.2, véase páginas en color)
mediante el efecto que la radiactividad ejerce en una emulsión que se coloca
sobre el corte histológico o extensión celular. Los isótopos radiactivos tienen
una amplia utilidad en biología y medicina, ya que prácticamente cualquier
molécula de interés biológico puede «marcarse» con la incorporación de uno o
más átomos radiactivos. Hay básicamente tres tipos de pruebas que pueden
llevarse a cabo mediante autorradiografía:
1. Estudio de incorporación de precursores. En este tipo de pruebas un
precursor radiactivo de una determinada mólecula, de la que interesa
localizar el lugar en que se sintetiza, se añade a un cultivo celular o a
fragmentos de tejido mantenidos en medio de cultivo, o se inyecta a un
animal. La timidina, por ejemplo, es un precursor del ADN: si añadimos
timidina marcada con un isótopo radiactivo - 3 H timidina- a un cultivo
de células en cuyo medio no exista este precursor, las células incorpora-
rán la timidina. La localización del isótopo radiactivo nos indicará qué
células están sintetizando ADN.
2. Estudios sobre la distribución de drogas y hormonas.
3. Localización de iones y otras moléculas difusibles.
LA HISTOAUTORRADIOGRAFIA 385
Cualquiera que sea el tipo de experiencia, el isótopo radiactivo se puede

localizar por la acción que la radiactividad de este isótopo ejerce sobre la sal de
plata de una emulsión. Esta forma de registro constituye el fundamento de la
autorradiografía, una de las aplicaciones de la radiactividad a la biología celular,
de especial importancia para el rastreo de las vías metabólicas de elementos o
sustancias de interés biológico o farmacológico y para conocer la situación de
determinadas moléculas en una célula.
3. ISOTOPOS E ISOTOPOS RADIACTIVOS
Cada átomo consta de un núcleo -que contiene protones {de carga positi -
va) y neutrones (sin carga)- y un número de electrones, de carga negativa, que
se encuentran en órbita alrededor del núcleo.
Un elemento químico se define como un conjunto de átomos cuyo núcleo
tiene el mismo número de protones. Cuando estos átomos tienen diferente
número de neutrones se dicen que son isótopos del mismo elemento (fig . 22.3) .
Lo que caracteriza, por tanto, a un elemento determinado es el número de
protones del núcleo, el cual controla el número de electrones periféricos y su
distribución. Estos electrones gobernados por el núcleo determinan las propie-
dades químicas del elemento. Los distintos isótopos de un mismo elemento
tienen las mismas propiedades químicas, pero sus propiedades físicas -densi -
dad y volatilidad- varían por su distinta masa .
Un isótopo se llama radiactivo cuando tiene un núcleo más o menos
inestable -desproporción entre carga y masa por alteración en la proporción
entre protones y neutrones- que tiende a pasar a otro átomo estable emitiendo
radiaciones. El núcleo inestable se desintegra emitiendo partículas cargadas
hasta que alcanza una nueva proporción entre neutrones y protones que sea
estable. Aunque los radioisótopos naturales son poco frecuentes debido a su
carácter inestable, se pueden producir átomos radiactivos en reactores nucleares
bombardeando otros átomos con partículas de alta energía . De esta forma, en la
actualidad se dispone de muchos elementos biológicos marcados con isótopos
radiactivos.
(:;\ ~ ~
V ~ V
'~ O
Figura 22.3. Representación esquemática de los isótopos del oxígeno. El

oxígeno en estado elemental viene definido por el número de protones y
neutrones del núcleo, 8 . Sus isótopos presentan diferente número de neu -
trones.
Cada isótopo tiene unas características bien definidas. La forma en que tiene
lugar la desintegración, es decir, el tipo de radiación o partícula emitida y su
energía, es constante.
Las radiaciones pueden dividirse en dos grandes grupos. El primero es el
grupo de partículas cargadas, en el que se incluyen las partículas alfa y beta, que
forman las principales radiaciones de interés en autorradiografía.
- Partículas alfa. Cada partícula alfa es idéntica al núcleo del átomo de
helio, consistente en dos protones y dos neutrones, y, por tanto, tiene dos
cargas positivas.
- Partículas beta. Son electrones de origen nuclear. Tienen la misma masa
que los electrones y la misma carga negativa . La emisión de partículas beta
es la forma más común de que los núcleos radiactivos, inducidos artificial -
mente, consigan su estabilidad . La mayor parte de los radioisótopos de
interés en biología son emisores de partículas beta .
El segundo grupo incluye las partículas no cargadas, tales como los neutro-
nes, y las radiaciones electromagnéticas, tales como los rayos X y gamma .
Uno de los isótopos más ampliamente utilizados es un isótopo del hidrógeno
denominado tritio ( 3 H) . Las partículas beta que emite el tritio no se desplazan
más de 2 micras en los especímenes biológicos, o 1 micra en las emulsiones para
histoautorradiografía. Esta baja energía lo convierte en un isótopo muy útil para
muchos estudios autorradiográficos, ya que el resultado de la técnica queda
poco afectado por diferencias en el grosor de los cortes o en el espesor de la
emulsión.
4. FUNDAMENTOS DE LA TECNICA DE AUTORRADIOGRAFIA
Ya hemos indicado que las técnicas de autorradiografía tienen como finali -

dad la localización de sustancias radiactivas por el efecto que la radiactividad
produce en una emulsión fotográfica. Este efecto se traduce en la aparición de
granos de plata metálica en la emulsión, sobre el lugar en que se encuentran
dichas sustancias (fig. 22.4) .
Las emulsiones fotográficas y las que se utilizan en histoautorradiografía,
denominadas emulsiones nucleares, son suspensiones de cristales de bromuro
de plata en gelatina. En fotografía , cuando la luz incide sobre una emulsión
Granos
de
plata
.. Emulsión
Figura 22.4. Efecto de la radiactividad sobre la emulsión . La radiactivi -

dad presente en el tejido se traduce en la aparición de granos de plata me-
tálica en la emulsión .
fotográfica se produce un cambio en los cristales de bromuro. Este cambio no es

apreciable a simple vista, pero si la emulsión se trata con un agente revelador los
cristales afectados por la luz se convierten en granos de plata metálica, mientras
que los cristales no iluminados permanecen inalterados. En términos de fotogra -
fía, la película que se ha expuesto tiene una ffÍmagen /atenteJJ que puede conver -
tirse en verdadera mediante el proceso de revelado.
Se cree que la imagen latente se debe a la presencia de mínimas trazas de
plata metálica dentro de los cristales de bromuro de plata que han sido expues-
tos. En presencia de un revelador este núcleo de plata metálica cataliza la
conversión de todo el cristal en plata metálica . Los cristales de bromuro, que no
se han reducido a plata, se disuelven con el fijador fotográfico, quedando así un
patrón de granos de plata que reproduce el patrón de luz que incidió sobre la
emulsión . En autorradiografía, el trazo de partículas cargadas se recoge sobre
una emulsión nuclear básicamente por el mismo procedimiento, excepto que en
este caso los electrones que se liberan en el cristal obtienen su energía del paso
de la partícula cargada a través del cristal, y no de fotones de luz visible.
En virtud de su carga, las partículas cargadas (alfa y beta) pueden ejercer un
efecto a distancia sobre los electrones en órbita alrededor de los núcleos atómi-
cos de la plata y el bromuro que constituyen los cristales de la emulsión .
Si están cargadas positivamente (partículas alfa) , pueden atraer a los electro -
nes fuera de la órbita. Si son partículas con carga negativa (partículas beta) , su
paso cerca de un electrón puede ser suficiente para repelerlo fuera de la órbita .
Cuando pasan a través de la materia, las partículas pierden energía, en una serie
de efectos de carga sobre los electrones que entran en su campo.
Además, pueden también perder energía en interacciones, - menos frecuen -
tes- , con núcleos atómicos cargados positivamente. Estas pérdidas de energía
dan lugar a muchas imágenes latentes, distribuidas en el cur&o de la partícula a
través de la emulsión.
Las partículas no cargadas sólo pierden energía por colisión directa con
electron E<s o núcleos. Ya que tales colisiones son relativamente improbables,
estas partículas pueden recorrer distancias considerables a través de la emulsión
sin dejar una imagen latente que indique su paso. Por eso las partículas cargadas
son las de más interés en autorradiografía.
5. CONDICIONES NECESARIAS PARA LA REALIZACION

DE HISTOAUTORRADIOGRAFIAS
1. Han de hacerse en un laboratorio dotado de cuarto oscuro de

fotografía.
2. Es necesario un permiso especial para el manejo de materiales
radiactivos que otorga el Consejo de Seguridad Nuclear. Para obtener-
lo se ha de justificar que se dispone de un sistema de almacenamiento y
recogida de los desechos radiactivos.
CONDICIONES DEL CUARTO OSCURO

Lo ideal es disponer de un cuarto oscuro exclusivamente para autorra-
diografía. La limpieza es muy importante, ya que las emulsiones nucleares
pueden acumular polvo, que sería fuente de inespecificidad. Es conveniente que

se controlen las condiciones de temperatura y humedad, ya que ambos factores
pueden afectar considerablemente al desarrollo de la técnica. Estas condiciones
variarán según el tipo de emulsión que se utilice.
El cuarto debe estar situado a distancia de cualquier fuente de radiacti-
vidad. Debe estar dotado de luz de seguridad, cuyos filtros se cambiarán de
acuerdo con las recomendaciones para cada emulsión . La bombilla de la luz de
seguridad deber ser de 15 watios o menos.
La luz de seguridad y la luz general del cuarto deben tener tomas indepen -
dientes, de forma que sea posible mantener condiciones de oscuridad completa.
Es preciso disponer de superficies de trabajo adecuadas para el desarrollo de
la técnica y de un refrigerador para guardar la emulsión y para exponer las
autorradiografías. También se necesita una toma de agua y un fregadero, preferi-
blemente cerca del lugar donde se realice el revelado y fijación .
ESQUEMA GENERAL DEL DESARROLLO DE LA TECNICA

DE AUTORRADIOGRAFIA
El procedimiento técnico puede sintetizarse en los siguientes pasos :

1. La sustancia radiactiva que se quiere estudiar debe administrarse a ani-
males de experimentación (fig. 22.5) , o bien añadirse a células o a pe-
queños fragmentos de tejido (fig . 22.6) que hay que mantener en medio
de cultivo, ya que para que las células incorporen dicha sustancia han de
estar vivas. La dosis y tiempo de administración deben determinarse para
cada experiencia .
2. Realización de preparaciones histológicas o extensiones celulares .
3. Aplicación de la emulsión fotográfica.
4. Exposición de las autorradiografías.
5. Revelado.
6. Fijación.
Figura 22.5. Incorporación de sustancias radiactivas. Una sustancia ra -

diactiva, por ejemplo 125 1 se introduce en un animal de experimentación;
se sacrifica el animal y se extrae el tiroides que, por tener una capacidad
especial de captar yodo , tendrá incorporada la mayor parte de este ele-
mento radiactivo .
~
Figura 22.6.
liJ- ~
Incorporación de una sustancia radiactiva por células en
cultivo. A : Células en suspensión. 8 : Adición del isótopo. C: Células que han
incorporado el isótopo radioactiva .
6. PROCEDIMIENTO HISTOLOGICO PARA AUTORRADIOGRAFIA
6.1. Condiciones generales de trabajo
Todo el material debe estar escrupulosamente limpio. Lo ideal es disponer de

un juego completo de material de vidrio exclusivamente para esta técnica.
Los portaobjetos que vayan a emplearse se pueden limpiar dejándolos toda la
noche sumergidos en una solución que se prepara disolviendo 10 g de bicro-
mato potásico en 850 mL de agua y añadiendo 100 mL de ácido sulfúrico
concentrado. El ácido debe añadirse muy lentamente y removiendo de forma
constante. Después de este baño, se lavan los portaobjetos durante varias horas
en agua corriente fría y después se les aplican dos baños de agua destilada de 30
minutos. Luego se sumergen una sola vez en la siguiente solución a temperatura
ambiente:
- Gelatina . ............. . ........ .. .... .... .. . .. . 5.0 g
-Cromo alumbre .. .. . .. . ... . . .. .. . .. .. .. . .. . . . .. . 0.5 g
-Agua hasta completar .. . . . ... ........ .. ......... . 1000 mL
Esta solución de gelatina permite una buena adherencia de la emulsión a los
portaobjetos; debe filtrarse inmediatamente antes de usar y no debe
mantenerse, aun en nevera, más de 48 horas. Una vez aplicada, los por-
taobjetos se dejan escurrir y secar en una atmósfera libre de polvo.
6.2. Fijación
Tanto el formaldehído como el glutaraldehído son adecuados para fijar los

tejidos para autorradiografía, aunque ambos disminuyen la formación de la
imagen latente. Se deben evitar los fijadores que contengan sales de
mercurio, como el Zenker, ya que producen quemografía positiva (véase
más adelante). Los fijadores, como el líquido de Bouin, que contienen ácido
pícrico se pueden emplear siempre que los tejidos así fijados se traten con
alcohol amoniacal o carbonato de litio para eliminar el color amarillo. Después
de la fijación debe lavarse el tejido para quitar cualquier vestigio del fijador. El
metanol y el líquido de Carnoy no tienen efectos notables sobre la emulsión,
pero preservan peor la estructura hística. Para fragmentos de tejido de

tamaño no superior a 1 cm 3 algunos autores recomiendan el uso de
ácido acético: etanol (1 :3) durante 1 hora y formol salino durante 24
horas.
6.3. Inclusión
El medio de inclusión dependerá de la sustancia que se vaya a investigar: si

es soluble en benceno se inclu irá en polietilenglicol y si lo es en agua se
utilizará la parafina.
6.4. Cortes histológicos
Se debe procurar que el espesor de los cortes sea lo más homogéneo posible
en cada experiencia, ya que las diferencias de grosor pueden alterar gravemente
los resultados. Los cortes deben tener un grosor medio de 4 micras.
6.5. Desparafinación
Debe ser lo más cuidadosa posible, porque los restos de parafina alterarían
los resultados de la técnica. Los productos que se empleen deben ser de gran
pureza y estar exentos de trazas de metales (p. ej., de los contenedores) que
puedan ser causa de quemografía (véase más adelante).
6.6. Aplicación de la emulsión
a) CARACTERISTICAS DE LA EMULSION. Ya se ha señalado que las

emulsiones -fotográficas y nucleares- son suspensiones de cristales de bro-
muro de plata en gelatina. Los cristales de bromuro de plata tienen una estructu -
ra cúbica; los iones de plata y bromuro están espaciados regularmente de tal
forma que cada ion de plata está rodeado por 6 de bromuro, y viceversa. En
fotografía, la luz no produce una imagen latente en cristales perfectos, y por
tanto los defectos en la estructura regular de los cristales son esenciales para la
fotosensibilidad de una emulsión fotográfica. Estos defectos se introducen du-
rante la manufactura de las emulsiones insertando, por ejemplo, átomos de otros
elementos, como el sulfuro. Las dislocaciones resultantes en el enrejado regular
se conocen en fotografía como granos o manchas de sensibilidad.
La estructura cristalina del bromuro de plata tiene la propiedad de que los
electrones compartidos entre iones adyacentes, cuando reciben una dosis muy
baja de energía, pueden salir de su órbita para entrar en una banda de conducti -
vidad que les permite recorrer grandes distancias a través del enrejado de crista -
les, de un ion próximo. Esta propiedad es básica para la formación de la imagen
latente.
La principal diferencia entre las emulsiones fabricadas para la fotografía de
luz y las emulsiones nucleares para autorradiografía radica en que estas últimas
tienen una proporción muy superior de granos de plata con respecto a la canti-
dad de gelatina . Esto hace que la emulsión sea más densa y, por tanto, que la
capacidad de detener partículas cargadas sea mayor, de forma que el trayecto
recorrido por las partículas es más corto. Para una relación determinada bromu-
ro/gelatina, el bromuro de plata puede formar pocos cristales de tamaño grande
o estar dividido en gran número de cristales pequeños. Con esta última alternati-
va se obtiene más información por unidad de volumen de emulsión, la posibili-
dad de que los cristales se activen o no es mayor y cualquier cambio que se
produzca dentro de la emulsión se reproducirá con mayor seguridad o resolu-
ción . Por esta razón las emulsiones nucleares designadas para recoger trazos de
partículas subatómicas suelen tener cristales más pequeños que las fabricadas
para fotografía.
La gelatina forma un medio de soporte para los cristales y los individualiza de
manera que un cristal no cataliza el revelado de los adyacentes. Debe permitir el
acceso de los reactivos a los cristales, dando lugar a la aparición de imágenes
latentes por acción mecánica . Por otra parte, sufre cambios considerables en el
volumen por hidratación o secado, por lo que los procedimientos de secado
deben ser suaves y lentos. Algunas casas comerciales añaden a sus emulsiones
un agente plastificante para evitar que encoja durante el secado, pero este
agente puede desaparecer de la emulsión al sumergirla en un baño acuoso o al
diluirla. Por ello se aconseja añadir 1 por 1 00 de glicerol a cualquier baño
acuoso en que se sumerja la emulsión.
b) CONSIDERACIONES PRACTICAS SOBRE LA UTILIZACION DE

LAS EMULSIONES:
1. La utilización de emulsiones requiere que se excluya cualquier cau-
sa capaz de producir imagen latente, diferente de la fuente de
radiactividad .
2. La emulsión no debe calentarse más de 50 oc.
3. Todas las sustancias químicas que se pongan en contacto con
ella deben ser de alta calidad. Solo debe usarse agua destilada, al
menos hasta haber completado la fijación . El material que se ponga en
contacto con la emulsión (contenedores, pinzas, varillas de agitación,
etc.) debe ser preferentemente de vidrio o plástico y tiene que
estar perfectamente limpio.
4. Debe evitarse la presión sobre la emulsión seca.
5. El proceso de secado debe ser lento y cuidadoso para evitar que
encoja la gelatina.
6. La iluminación debe ser la mínima posible. Es preciso seguir las
recomendaciones de las casas comerciales en cuanto a los filtros que
deben usarse con la luz de seguridad para cada tipo de emulsión.
7. La luz de seguridad debe apagarse cuando no sea absoluta-
mente necesaria. No debe exponerse la emulsión a la luz com-
pleta hasta que hayan transcurrido varios minutos tras el lavado
que se realiza después de la fijación.
8. La exposición de la emulsión debe hacerse en las mejores condiciones.
Deben secarse completamente las preparaciones con la emul-
sión aplicada antes de la exposición. Durante la exposición, las
preparaciones deben preservarse de agentes químicos extraños que pue-

dan ser causa tanto de imagen latente como de la pérdida de ésta .
9. Debe controlarse la temperatura de exposición.
e) TECNICAS DE APLICACION DE LA EMULSION. Existen dos técni-
cas fundamentales (fig. 22.7) :
1. Técnica de la emulsión en placa (stripping film) (fig. 22.7a). Se
expende comercialmente en placas de vidrio que llevan adherida la emul-
sión por una de sus caras. Según el tamaño de la muestra hística que se
quiere autorradiografiar, se corta y despega un trozo de la emulsión, que
se pone a flotar en un baño de agua de donde se pesca con la propia
preparación hística hasta montarla sobre ella . Este método asegura un
grosor homogéneo de la emulsión, pero resulta caro.
2. Técnicas de la emulsión líquida (dipping o coating film) (fig.
22.7b). Se emplean emulsiones líquidas en forma de gel, sumergiendo
en ellas las preparaciones para que se impregnen. La ventaja de esta
técnica estriba en que es posible aplicar un grosor variable de la emulsión
diluyéndola en agua. El principal inconveniente es que el espesor de la
emulsión suele ser irregular.
6. 7. Exposición
Durante la exposición, la radiactividad procedente del tejido actúa sobre la

emulsión produciendo la imagen latente. Se llevará a cabo cuando los portaob-
jetos se hallen completamente secos. Deben estar totalmente protegidos de la
luz y a una temperatura de 4 oc.
(?;:_:~-C::::::Z -..· . :. --.·-::v

B
Figura 22.7. A) Técnica de emulsión en placa : 1. Cortar un trozo de

emulsión . 2. Despegar con unas pinzas y hacerlo flotar sobre el agua. 3.
Recoger con un portaobjetos que tenga la muestra después de haber dejado
flotar la emulsión durante 2-3 minutos para que se expanda. 8) Técnica de
emulsión líquida: 1. Derretir la emulsión sumergiendo el recipiente que la
contiene en un baño de agua . 2. Sumergir la preparación en la emulsión.
6.8. Revelado de la imagen latente
En el revelado químico (el habitual para casi todas las técnicas de autorradio-
grafía) la emulsión se coloca en una solución que reduce el bromuro de plata a
plata metálica y bromuro de hidrógeno. La mayor parte de los agentes revelado-
res tiene su potencial apropiado de reducción a un pH alcalino.
La plata metálica que se ha depositado en los cristales de la emulsión durante
la exposición de las autorradiografías, cataliza la reducción del bromuro de plata.
Así, a medida que aumenta el tiempo de revelado se añade cada vez más plata a
las manchas de sensibilidad de la emulsión . El proceso de revelado termina
cuando toda la plata en los cristales de la emulsión se transforma en plata
metálica . Al final de este proceso los granos de plata tienen forma de filamento
enrollado y ocupan un volumen tres veces superior al de los cristales originales.
Algunos reveladores actúan sólo en la superficie de los cristales, mientras
que otros pueden actuar en profundidad . Hay que destacar que como el borra -
miento de la imagen latente (véase más adelante) afecta fundamentalmente a los
depósitos de plata situados en la superficie de los cristales, será más probable
que esto ocurra con los reveladores que sólo actúan en superficie.
En fotografía , el revelado se define como la conversión completa de los
cristales de bromuro de plata en granos de plata metálica. En autorradiografía,
sin embargo, el revelado culmina con la producción de una masa visible de
plata metálica, lo que puede ocurrir mucho antes de que el revelado sea
completo. Como es lógico, esto varía con las condiciones de observación: un
grano será visible en microscopia electrónica mucho antes de que sea suficiente-
mente grande para visualizarse con el microscopio óptico.
El revelado es, pues, un proceso de amplificación por el que se aumenta el
tamaño de los depósitos de plata metálica, presentes en la emulsión, hasta que
alcanzan un límite a partir del cual pueden reconocerse. Este límite está entera -
mente determinado por las condiciones de observación.
CONDICIONES QUE AFECTAN AL REVELADO QUIMICO

El proceso de revelado puede resultar modificado por varias causas. En
primer lugar, por el tipo de revelador, ya que algunos agentes reveladores son
más potentes que otros. Por otra parte, la velocidad de revelado puede variar
considerablemente con alteraciones de pH y temperatura; también puede
variar si se diluye o agita la solución reveladora.
En ausencia de agitación, la capa de solución próxima a la emulsión se
depleciona rápidamente de revelador y la llegada de moléculas frescas se consi-
gue por difusión. La agitación, sin embargo, mantiene la concentración en las
capas próximas a la emulsión . La dilución del revelador retarda el proceso,
mientras que el aumento de temperatura lo acelera.
6.9. Paro del revelado, fijación y lavado
El revelado puede continuar después de quitar la emulsión de la solución

reveladora, ya que pueden quedar trazas de ella en la preparación.
El revelado se detiene disminuyendo el pH : para ello se usa un baño de
«paro» con ácido acético al1 por 100. Con emulsiones muy delgadas puede
ser suficiente diluir el revelador enjuagando en agua destilada. Una de las

ventajas del ácido acético es que endurece ligeramente la gelatina, disminuyen-
do así la tendencia de ésta a hincharse después del fijado y de los lavados.
Después del revelado químico y del baño de «paro», el proceso de fijación
disuelve los cristales de bromuro de plata que permanecen en la emulsión sin
revelar. La fijación se realiza generalmente con una solución de tiosulfato sódi -
co. El ion de tiosulfato forma una serie de complejos con la plata iónica sin
afectar a los depósitos de plata revelados. La tasa de fijación se puede incremen-
tar agitando la solución y aumentando la temperatura. El tiempo de fijación
es, en términos generales, el doble del período requerido para que la
emulsión se haga transparente . La solución de tiosulfato se usa habitual-
mente en una concentración del 30 por 1 OO. La velocidad del proceso de
fijación disminuye rápidamente a medida que se acumulan los productos que se
originan a lo largo del proceso en la solución fijadora. Por otra parte, al eliminar
los cristales de bromuro de plata sin revelar la fijación reduce el grosor de la
emulsión.
Después de la fijación se deben eliminar de la emulsión los productos que se
forman durante este proceso; esto se hace habitualmente lavando en agua
corriente. Con el baño en agua el volumen de la gelatina aumenta considerable-
mente, y debe tenerse mucho cuidado para no dañar o desplazar la emulsión .
Puede servir de ayuda mantener los portaobjetos en posición horizontal mientras
se lava y dar varios baños de agua estacionaria. Es conveniente mantener una
temperatura similar para todas las soluciones que se utilizan para autorradiogra -
fía, preferentemente por debajo de 20 oc.
El incremento de volumen que ocurre con el lavado puede reducirse endure-
ciendo la emulsión durante el proceso de fijación; puede ser útil fijar la gelatina
con formalina antes o después del revelado.
Algunos de los complejos de plata-tiosulfato son sensibles a la luz. Por este
motivo es conveniente trabajar bajo luz de seguridad hasta completar el proceso
de lavado; de lo contrario puede producirse un precipitado oscuro sobre la
gelatina.
Es difícil, incluso con un lavado prolongado, quitar las últimas trazas de
tiosulfato de la capa de emulsión. Algunos iones de tiosulfato se pueden absor -
ber sobre la superficie de los granos de plata. En la mayor parte de los casos este
hecho no reviste importancia. Pero si la emulsión se transfiere después de la
fijación a un medio ácido, los granos de plata revelados pueden erosionarse al
formarse sulfito de plata. Esta es la causa de que desaparezcan los granos de
plata después de realizar ciertos procedimientos de tinción o tras usar algunos
medios de montaje. Para reducir la absorción de tiosulfato sobre los
granos de plata se puede tratar la emulsión con una solución de yodu-
ro potásico antes de la fijación.
6.10. Tinción histológica
Sólo es posible establecer una correlación adecuada entre la respuesta de la

emulsión al material radiactivo y la muestra hística si se pueden reconocer los
detalles estructurales. Ello requiere realizar alguna forma de tinción del corte
hístico. Si el observador está familiarizado con la estructura histológica, se
pueden observar las autorradiografías sin teñir con el microscopio de contraste

de fases. Casi siempre se prefiere, sin embargo, realizar técnicas de tinción que
permitan visualizar el tejido con mucho mayor detalle.
Hay dos posibilidades de realizar la tinción:
a) Teñir antes de aplicar la emulsión.
b) Teñir después de que el proceso fotográfico se haya completado.
La primera de las posibilidades, o pretinción, aunque ofrece algunas venta-
jas, tiene muchas limitaciones. Entre las primeras está la de proporcionar una
tinción más exacta y no teñir la emulsión. Por otra parte, algunos grupos reacti-
vos, especialmente enzimas, se pueden perder durante el proceso fotográfico y
no pueden demostrarse histoquímicamente tras realizar autorradiografía. Una de
las desventajas es que la pretinción puede originar pérdida de radiactividad y
quemografía. Otro problema adicional es que el procesamiento fotográfico pue-
de alterar o hacer desaparecer la tinción. Este efecto, que es bastante importante
con las hematoxilinas, puede aminorarse seleccionando aquellas condiciones de
procesamiento que no impliquen grandes variaciones en el pH. El amidol, por
ejemplo, es un agente revelador adecuado a un pH sólo ligeramente alcalino;
después se puede emplear un baño de paro de agua destilada seguido de
fijación en tiosulfato sódico.
La pretinción se puede combinar con el uso de membranas impermeables,
diseñadas para evitar que la tinción afecte a la emulsión y que se pierda en el
procedimiento fotográfico.
En resumen, la pretinción es aceptable siempre que los controles demuestren
que el contaje de granos en preparaciones teñidas y sin teñir es idéntico y que
no se produce quemografía. En estas circunstancias, si se puede impedir la
pérdida de la tinción , la claridad y precisión de los resultados será generalmente
mejor que si la tinción se lleva a cabo con posterioridad.
En el procedimiento post-tinción no hay peligro de que se pierda radiactivi -
dad o de que se produzca quemografía. Sin embargo, este procedimiento tiene
dos inconvenientes fundamentales: que pueden perderse granos de plata, o
incluso la emulsión , y que las modificaciones que el procedimiento fotográfico
produce en algunos grupos reactivos presentes en el tejido impiden demostrar
determinadas sustancias.
La pérdida de los granos de plata de la emulsión está a menudo relacionada
con el pH de las soluciones empleadas. La fijación con tiosulfato sódico deja
rodeado de una cubierta de iones tiosulfato cada grano de plata revelado; estos
iones pueden persistir aún después de baños prolongados con agua . Si las
preparaciones se transfieren a una solución ácida, los iones pueden erosionar y
hacer desaparecer por completo los granos de plata, como ya se ha señalado
anteriormente. Esto puede ocurrir en la tinción con distintos tipos de hematoxili-
nas, cuando se diferencia con alcohol-ácido y también con la hidrólisis ácida
antes de la tinción mediante PAS . El efecto puede aminorarse tratando la emul-
sión con yoduro antes de la fijación y, sobre todo, controlando el pH de todas
las soluciones de tinción. Asimismo la pérdida de la emulsión puede producirse
con métodos de tinción que requieran calor o soluciones alcalinas.
Por otra parte, la capa de emulsión actúa como barrera para la tinción que se
quiere aplicar. Los reactivos tienen que difundir a través de la gelatina para
alcanzar el espécimen, y la gelatina puede contener trazas de tiosulfato, que
afecta a los reactivos o modifica el pH . La tinción puede mejorar si antes de ella

se sumergen las autorradiografías en una solución tampón a un pH óptimo para
la tinción que se quiera realizar. La gelatina toma la tinción con frecuencia , ya
que se trata de una proteína . Las contratinciones muy inespecíficas -como la
eosina- son las que producen más tinción de la emulsión nuclear, mientras que
las más selectivas -como verde metilo pironina para ácidos nucleicos- pueden
dar mejores resultados .
No obstante lo anterior, la postinción se considera, en general, preferible a la
pretinción. Sin embargo, antes de utilizar cualquiera de estos métodos de tinción
sobre material experimental debe siempre demostrarse que las densidades de
granos en una muestra teñida y en otra sin teñir son idénticas.
En general, si las autorradiografías van a ser observadas con luz de transmi -
sión, se debe utilizar una tinción suave, como la rosa, amarilla o verde
claro, en vez de tinciones azul oscuro o púrpura, que pueden producir una
tinción densa, difícil de distinguir de los granos de plata . Si se usa luz reflejada ,
con un efecto de campo oscuro, deben evitarse todos los métodos que produz-
can un precipitado brillante sobre el tejido y también las tinciones que den un
brillo fluorescente co"n este tipo de iluminación, como la eosina.
7. CONTROLES
No debe interpretarse una autorradiografía sin realizar dos tipos de controles.

El primero consiste en exponer, en idénticas condiciones, un espéci-
men similar al que se va a estudiar pero que no contenga material
radiactivo. La existencia de granos de plata en mayor cantidad que el nivel de
fondo inespecífico (background) de la emulsión indica que algún compo -
nente del espécimen experimental puede estar produciendo granos de plata por
mecanismos distintos a los de la radiactividad.
El segundo control tiene como finalidad conocer si existe pérdida de la
imagen latente. Se usará una muestra similar a la del primer control,
expuesta con una emulsión que haya sido velada previamente con luz o
radiación. Las condiciones de exposición y revelado deben ser idénticas a las
de la experiencia problema. Si los granos de plata del control no tienen una
densidad homogénea, las muestras experimentales pueden tener también regio -
nes similares de pérdida de la imagen latente.
Para cada ensayo se deben determinar siempre las condiciones óptimas de
revelado, eligiendo el revelador, la dilución y la temperatura de trabajo, que debe
ser siempre inferior a 22 °C. Se prepara entonces una serie de autorradiografías
de muestras similares a las que se desea estudiar. Hay que revelar cada muestra a
intervalos de tiempo crecientes. Si los granos de plata son pequeños y pocos,
incluso en los tiempos mayores de revelado, la tasa de revelado es demasiado
lenta. En tal caso debe intentarse aumentar la concentración de revelador o su
temperatura .
8. POSITIVIDAD DE FONDO INESPECIFICA
En cualquier autorradiografía aparecen , al revelar la emulsión, granos de plata

que no se deben a la rad iactividad incorporada al tejido, sino a otras causas. Las
más importantes son :
1. Un tiempo de revelado demasiado largo.
2. Exposición a la luz. Siempre deben seguirse las recomendaciones so-
bre luz de seguridad que se indican para cada emulsión . El filtro que las
casas comerciales recomiendan para cada tipo de emulsión sólo garanti -
za que la longitud de onda de la luz que incide sobre la emulsión es
aquella a la que es menos sensible. La intensidad de la luz está determi-
nada por la potencia de la bombilla -generalmente se usa de 15 watios-
Y por la distancia entre la fuente de luz y la emulsión.
Las emulsiones son especialmente sensibles a la luz cuando están
secas. Por ello en las últimas fases de la técnica y durante el revelado se
debe trabajar lo más lejos posible de la luz. Debe apagarse la luz siempre
que no sea absolutamente necesaria.
3. Presión. Debe evitarse cualquier tipo de presión sobre la emulsión . De
igual forma, la pérdida de volumen de la emulsión, cuando ésta se seca
demasiado rápidamente, hace que se encoja y puede ser causa de ines-
pecificidad .
4. Ouemografía. Muchas sustancias químicas, sobre todo agentes reduc-
tores, pueden producir imagen latente por acción química directa, fenó-
meno que se denomina quemografía positiva . Este tipo de artefacto es
menos probable en cortes congelados que en secciones de material
fijado en parafina . Por otra parte, algunas sustancias químicas presentes
en un tejido pueden dar lugar a un borramiento de la imagen latente
-quemografía negativa- .
La quemografía es consecuencia de la difusión, en la emulsión y a
partir del tejido, de moléculas que son capaces de reaccionar con los
cristales de plata de la emulsión . Estos dos procesos dependen de la
temperatura, de modo que se puede disminuir la severidad de este arte-
facto realizando la exposición a baja temperatura.
5. Contaminación de la emulsión. Las emulsiones deben mantenerse
libres de contam inación: por ello deben usarse sólo materiales de vidrio,
plástico o acero inoxidable completamente limpios. En las soluciones
sólo se empleará agua destilada o desionizada.
Para lavar adecuadamente el material de vidrio que se ha puesto en
contacto con la emulsión puede usarse hidróxido sódico, que dig iere la
gelatina. Después de lavarlo se puede emplear ácido crómico, que elimi-
na los restos de sales de plata; luego se vuelve a lavar durante varias
horas en agua corriente y, por último, en agua destilada.
6 . Radiación ambiental. Puede proceder de rayos cósmicos, isótopos
radiactivos presentes en materiales de construcción, aparatos de rayos X,
etc.
7. lnespecificidad espontánea. Las emulsiones nucleares son extrema-
damente sensibles, por lo que puede desarrollarse imagen latente de
forma espontánea . Así pues, no deben usarse emulsiones con más sensi-
bilidad de la necesaria para una experiencia determinada .
8. Causas de inespecificidad propias de las técnicas que utilizan

emulsiones en placa . En esta técnica la emulsión ha de despegarse
(stripping) de un soporte antes de aplicarse al espécimen. Si esto se hace
en condiciones de baja humedad, puede originarse electricidad estática e
i nespecificidad.
9. METODOS PARA ELIMINAR LA INESPECIFICIDAD
Muchas de las causas de inespecificidad pueden escapar al control del

técnico . El transporte de la emulsión a temperatura inadecuada o el efecto de
radiaciones cósmicas durante el transporte aéreo pueden ser causa de inespecifi-
cidad.
Sin embargo, la formación de la imagen latente es un proceso reversible y el
borramiento de esta imagen resulta favorecido por agentes oxidantes o por una
humedad alta.
Uno de los métodos más simples para erradicar la inespecificidad consiste en
hacer que la exposición se produzca con una humedad relativa muy
alta. Otro método consiste en mantener la emulsión durante un período
de una hora a 100 por 100 de humedad relativa y a una temperatura de
37 oc. Este procedimiento es suficiente para acelerar el borramiento de cualqu ier
imagen latente preexistente y tiene la ventaja de que no altera la emulsión .
El desarrollo de cualquier técnica de autorradlografía requiere su planifica -
ción en cada laboratorio y para cada experiencia concreta. A continuación
comentaremos algunas de las técnicas más usadas en autorradiografía, teniendo
en cuenta que el tiempo de exposición, revelado, etc., deberá ser ajustado por el
técnico para cada experiencia.
10. TECNICA CON EMULSIÓN EN PLACA (STRIPPING FILM)
a) Condiciones de temperatura y humedad:

1. Humedad relativa ideal entre 60-65 por 1 OO.
2. Temperatura entre 18-21 C.
b) Material requerido:
1. Recipiente con agua destilada a 25 C. Si la exposición va a durar más de
2-3 semanas, el agua debe ser reemplazada por una solución de bromuro
potásico (1 O mg/L) con glucosa al 5 por 1 OO.
2. Bisturí.
3. Pinzas sin dientes.
Modo de operar (fig . 22.7a) :

1. Despegar la emulsión de su soporte de vidrio. La AR-1 O se expende en
placas de vidrio que llevan adherida la emulsión . Cortar con el bisturí
fragmentos de emulsión en relación con el tamaño del espécimen que se
quiera autorradiografíar y teniendo en cuenta que la emulsión debe cubrir
la muestra con un margen de 1 cm por todas partes. Empezar a cortar a

1 cm del borde de la placa. Recordar que la emulsión se expande y aumenta
de tamaño al flotar en el agua.
Cortar con el bisturí un trozo de emulsión y despegar una esquina con
las pinzas, tirando suavemente. Si al despegar se observan chispas por
electricidad estática, echar vaho suavemente sobre la emulsión .
2. Hacer flotar la emulsión sobre el baño de agua. La zona superior de
la emulsión debe quedar boca abajo en el agua. Si se pliega el fragmento
de emulsión, se tira y se corta uno nuevo. Después de 2-3 minutos en el
agua la emulsión se expande e incrementa su volumen un 40 por 100
aproximadamente.
3. Tomar un portaobjetos por el lado opuesto a donde se encuentra
la muestra. sumergirlo en el agua y colocarlo por debajo del fragmento
de emulsión, formando un ángulo de aproximadamente 30 oc con la hori-
zontal. Levantar ahora el portaobjetos recogiendo la emulsión sobre ella. Si
se forman arrugas o si la película no cubre completamente el es-
pécimen, no se debe mover sobre el portaobjetos, sino hacerlo
flotar de nuevo y repetir el procedimiento. Por la presión del bisturí
y de las pinzas, la inespecificidad de fondo suele ser grande en los bordes
del fragmento de emulsión; por ello es conveniente dejar un margen razo-
nable alrededor de la muestra -aproximadamente 1 cm por cada lado-
de tal forma que ésta quede bajo un área de poca inespecificidad.
4. Secado y exposición. Colocar los portaobjetos recubiertos de emulsión
en posición vertical y dejar secar en una corriente suave de aire frío de 20
a 30 minutos. Si el procedimiento de secado se hace de forma muy lenta
o si no se deja secar completamente, se disminuye la positividad inespe-
cífica. Cierto grado de humedad en la emulsión favorece el borramiento de
la imagen latente, pero como al inicio de la exposición hay generalmente
algo de positividad inespecífica por el proceso de despegamiento de la
emulsión, este borramiento de la imagen latente conducirá a una dismi-
nución de la inespecificidad. Cuando se desee evitar completamente el bo-
rramiento de la imagen latente se dejará secar del todo la emulsión.
Mantener los portaobjetos hasta 24 horas en la oscuridad antes de
transferirlos a una caja negra, a prueba de luz, de preparaciones histoló-
gicas que contenga una bolsa de desecante (sílica gel) . Cerrar hermética-
mente y sellarla con papel negro o de aluminio. Guardar en refrigerador
a 4 oc durante el tiempo que vaya a durar la exposición, que se
habrá determinado previamente.
5. Revelado y fijación. Estas fases se deben llevar a cabo a 18 C: a esta
temperatura la emulsión no aumenta tanto de volumen como con tempera-
turas superiores.
Llevar las autorradiograflas al cuarto oscuro y dejar que adquieran la
temperatura ambiente.
Para la emulsión AR-10 de Kodak se recomienda usar el revelador
D-19. Se sumergen las autorradiografías en el revelador durante 5 mi-
nutos; se enjuagan después en un baño de «paro)) (ácido acético al 1
por 1 00) durante 1 minuto y seguidamente se fijan en una solución
de tiosulfito sódico al 30 por 100 p/v durante 5-1 O minutos (apro-
ximadamente el doble de lo que tarda la emulsión en quedar transparente).
Dejar que las autorradiografías se sequen y que se endurezca la emul-
sión .
6. Teñir según los procedimientos de tincíón que se detallan a continuación .
7 . Montar con DPX o Euparal.
Se recomiendan tres métodos de tinción para usar con la emulsión AR-1 O de

Kodak:
a) Tinción general (Hematoxilina-Eosina)

1. Hematoxilina de Ehrlich (recién filtrada) 30 minutos.
2. Diferenciar en 0.2 por 100 de CIH durante 2 minutos.
3. Enjuagar en agua corriente una hora.
4. Comprobar la intensidad de tinción, Si es muy débil, volver a teñir durante
1O minutos y repetir los pasos 2 y 3. Si es demasiado intensa, repetir la di-
ferenciación y el lavado.
5. Eosina, al 0.5 por 100, 3 minutos.
6. Diferenciar con agua destilada hervida y enfriada .
7. Secar el agua y montar.
b) Tinción nuclear (Hematoxilina de Harris)
1. Teñir con hematoxilina de Harris, 20-25 minutos.
2. Dar tres baños de agua destilada de 5 minutos cada uno.
3. Secar al aire y montar.
e) Verde metilo pironina
Con esta técnica es difícil obtener buenas fotografías. El contraste se puede
mejorar fotografiando con un filtro rojo .
Soluciones:
A) Pironina Y al 2 por 100 en tampón acetato 0.1 M a pH 4.2.
B) Verde metilo al 2 por 100 en tampón acetato 0.1 M a pH 4.2.
La solución B debe extraerse repetidamente con cloroformo para eliminar todas

las trazas de violeta de metilo. Generalmente se requieren cinco extracciones
con volúmenes iguales de cloroformo.
-Mezclar 7 partes de A con 3 partes de B; mantener en la oscuridad y
almacenar a 4 oc.
Teñir las autorradiografías de la forma siguiente:
1. Sumergir las autorradiografías en agua destilada durante 30 minutos.
2. Teñir con la solución de trabajo durante 30 minutos.
3. Lavar brevemente con dos cambios de agua destilada.
4. Secar al aire.
Todas las soluciones deben enfriarse entre 17.5-18 °C. En cualquiera de los
procedimientos anteriores las preparaciones se pueden deshidratar y aclarar en
xileno antes de montarse. Si este último procedimiento da lugar a áreas opacas
alrededor del tejido, se aconseja tratar con alcohol polivinilo durante la deshidrata-
ción de la siguiente forma :
Después de sumergir los portaobjetos en alcohol al 50 por 100, se pasan a una
solución al 2 por 1 00 de alcohol polivinilo en alcohol al 50 por 1 00 durante 1 -2
horas. Es aconsejable que las preparaciones permanezcan en posición horizontal
durante este tiempo. Después de secar al aire, se sumergen en alcohol absoluto y
luego en xileno; por último se montan.
11. TECNICAS CON EMULSIONES LIQUIDAS (D/PPING FILM)
En relación con la técnica de stripping film las ventajas de esta técnica son:
a) Se obtiene un mejor contacto entre la emulsión y el tejido.
b} Existen varios tipos de emulsiones disponibles en el mercado, con dife-
rente sensibilidad, entre las que se puede elegir la más adecuada para la
experiencia autorradiográfica que se quiera realizar.
e) Se pueden preparar capas de emulsión delgadas, que son más fáciles de
teñir y, por tanto, más fáciles de observar al microscopio.
d) Se pueden preparar rápidamente gran número de autorradiografías.
e) Algunas de estas emulsiones -las de cristales más finos- es posible
emplearlas para microscopia electrónica.
La principal limitación de estas técnicas deriva de que es prácticamente
imposible obtener un grosor homogéneo de la capa de emulsión .
Las casas comerciales expenden emulsiones con diverso grado de sensibili -
dad . Para los isótopos de baja energía, como el tritio, se recomiendan emulsio-
nes de poca sensibilidad . En cambio, cuando se trabaja con isótopos de alta
energía como el 1 •C, por ejemplo, deben emplearse emulsiones de mayor grado
de sensibilidad. Algunas emulsiones pueden derretirse y ser reutilizadas, pero
esto no siempre es aconsejable, por lo que hay que seguir las recomendaciones
para cada tipo de emulsión.
Las propiedades de estas emulsiones varían ligeramente y, por tanto, los
procedimientos técnicos para prepárar autorradiografías con cada una de ellas
son algo diferentes.
1. Condiciones del cuarto oscuro: usar bombilla de 15 watios y luz de segu-
ridad Wratten 2.
2. En el cuarto oscuro calentar un baño de agua a 40 °C.
3. La emulsión se expende en un vial de plástico, calentar el vial en el baño
durante 30 minutos para derretir la emulsión (fig. 22-78) .
4. Trasvasar la emulsión a un vaso de precipitado o recipiente de vidrio pre-
viamente calentado de 100 mL y mantenerlo a 40 oc en el baño de agua.
5. Los portaobjetos que se usen deben estar bien limpios y recubiertos de
adhesivo tisular (cromo gel} . Una vez desparafinadas las preparaciones
problema, se calientan a 40 oc. El corte histológico debe estar en los
dos tercios inferiores del portaobjetos. Antes de recubrir de emulsión
las preparaciones problema, sumergir un portaobjetos limpio sin corte his-
tológico y, bajo la luz de seguridad, comprobar que la emulsión es uniforme
y está libre de burbujas. Si existen muchas burbujas se espera 2 minutos y
se vuelve a repetir lo mismo con otro portaobjetos hasta que la emulsión
sea homogénea. Se sumergen entonces las preparaciones problema, una a
una, por la zona en que se encuentran los cortes y manteniéndolas en la
emulsión durante 1-2 segundos. Retirar despacio y drenar el exceso de
emulsión; dejar reposar con cuidado el borde inferior del portaobjetos sobre
papel de filtro humedecido. Con un pañuelo de papel, secar con cuidado
la parte posterior del portaobjetos. Dejar secar los portaobjetos en un
402 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOG ICA
soporte vertical - vaso Coplin, por ejemplo--, en posición vertical durante

30 minutos, a 25 oc de temperatura y 75 por 100 de humedad relativa.
6. Transferir los portaobjetos secos a una caja negra a prueba de luz, con un
paquete de gel de sílice, y sellar la caja con papel de celofán negro.
Almacenar en refrigerador a 4 oc durante el tiempo preestablecido de ex-
posición .
Técnicas para las emulsiones llford
El procedimiento es algo diferente para las emulsiones nucleares llford, que

generalmente requieren dilución. Se recomienda mezclar una parte de emulsión
con una parte de una solución de glicerol al 2 por 1 OO. El glicerol reduce el ruido
de fondo (background) que se produciría durante el secado .
1. Condiciones del cuarto oscuro. Usar una bombilla de 15 watios y el filtro
llford S o Wratten OC.
2. Trasvasar aproximadamente 40 mL de emulsión a un vaso de precipitación
de 50 mL y calentar en baño de agua durante 15-20 minutos a 43 C, para
derretirla.
3. Mezclar la emulsión derretida con un volumen igual de agua destilada que
contenga un 2 por 100 de glicerol. Verter la solución de glicerol, previa -
mente calentada, sobre la emulsión también c:\entada: hacerlo lentamente
para evitar que se formen burbujas. Mezclar b1en girando el recipiente o
removiendo la mezcla con una varilla de vidrio completamente limpia.
4. Colocar el recipiente con la emulsión diluida en el baño y permitir que las
burbujas que se hayan formado alcancen la superficie; para eliminarlas
puede emplearse una pipeta pequeña de tipo Pasteur.
5. Sumergir las preparaciones en la emulsión diluida tal como se ha descrito
para las emulsiones NTB de Eastman-Kodak. Secar y guardar por el mismo
procedimiento.
Revelado y procesamiento para las emulsiones líquidas

(Eastman-Kodak e llford)
El revelado y procesamiento que se especifican a continuación son adecuados

tanto para las emulsiones NTB (Eastman-Kodak) como para las suministradas por
llford. Los tiempos que se fijan en cada paso se dan sólo con carácter orientativo,
puesto que deben ser establecidos para cada experiencia en particular. Los tiempos
indicados corresponden a una temperatura de revelado de 18 oc con agitación
suave .
1. Utilizar el revelador que se recomiende para cada tipo de emulsión .
2. Fijación . Utilizar el fijador recomendado con las distintas emulsiones nu-
cleares o una solución de tiosulfato sódico (al 30 por 1 00) durante un
tiempo aproximado de 3 minutos.
3. Lavar con cuidado en agua corriente de 1O a 15 minutos.
4. Teñir según los procedimientos que se han descrito anteriormente.
5. Secar al aire, o bien deshidratar en alcoholes a concentraciones crecientes,
y montar con Euparal.
12. AUTORRADIOGRAFIA DE CUERPO ENTERO
Esta técnica se utiliza generalmente para conocer la distribución de determi-

nadas sustancias, como fármacos, hormonas, etc., en el organismo de un animal.
Pueden ser de mucha utilidad para estudiar la acumulación de ciertas sustancias
potencialmente perjudiciales - por ejemplo, agentes teratogénicos- en los teji -
dos maternos y fetales.
En síntesis esta técnica se lleva a cabo de la siguiente manera: en primer lugar
se inyecta al animal la sustancia marcada que se desea estudiar; luego se
anestesia al animal, se incluyen los órganos objeto de estudio en un gel semi-
líquido (carboximetil celulosa) y se congelan , bien en hexano a - 75 " C, enfriado
con hielo seco, o en isopentano enfriado con nitrógeno líquido. Se cortan
entonces secciones transversas o longitudinales en un criostato. Las secciones
con el radioisótopo se ponen después en contacto con una película de rayos X
que se impresiona. Las secciones de criostato también se pueden emplear para
técnicas de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica.

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Contenido

1 O. Coloraciones para fibras cofage11~s y elásticas del tejido

11. La impregnación argéntica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195

14. Histoquímica de proteínas, aminas biógenas y ácidos nuclei-

15. Métodos para la identificación y tinción de pigmentos e

17. Histoenzimología ............ . ......... . .............. 293

18. Fundamentos biológicos de la inmunohistoquímica . . . . . . . 321

19. lnmunohistoquímica (1): Técnicas de inmunofluorescencia . 331

20. Técnicas inmunohistoquímicas (11) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341

21. Microscopía electrónica de barrido 369

22. La histoautorradiografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383

23. Técnicas de análisis de imágenes en morfología microscópi-

24. ' Técnicas de manipulación de cultivos tisulares . . . . . . . . . . . 427

25. Técnicas de biología molecular en anat,o mía patológica . . . . 457

26. Riesgo tóxico y responsabilidad legal del técnico de labora-

27. Marcadores tumorales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505

9. FORMULARIO DE ESTUDIO MACROSCOPICO

1. CONCEPTO Y OBJETO DE LA HISTOTECNOLOGIA.

La Histotecnología es la ciencia que estudia los fundamentos técnicos y la

2. ESTUDIOS CITOHISTOLOGICOS VITALES. SUPRAVITALES

Se denominan vitales aquellos estudios citológicos o histológ icos que se

Se denominan estudios postvitales todos aquellos que se practican sobre

3. CONCEPTOS DE BIOPSIA Y PIEZA QUIRURGICA

Una biopsia es una porción de tejido obtenida de un individuo vivo

Figura 1 .1 . Fotografía tomada de una pieza macroscópica. (Pieza de his-

4. CONCEPTOS DE PREPARACION HISTOLOGICA,

Una preparación histológica es un fragmento de tejido que está dispuesto

5. GENERALIDADES SOBRE EL EXAMEN MACROSCOPICO

El estudio macroscópico de biopsias y piezas qu1rurgicas comprende un

nal facultativo del Servicio (habitualmente, los médicos residentes de

6. LA SALA DE ESTUDIO MACROSCOPICO

Las actividades de estudio macroscópico y tallado de las biopsias se llevan a

a) Area de disección y muestreo. Debe disponer de:

• Tomas de agua caliente y fría .

En la actualidad se fabrican unos módulos compactos dotados de todo ello,

Figura 1.2. Un modelo de banco de tallado dotado de los requerimientos

2. Estanterías para almacenar los recipientes que contienen el material.

b) Sistema de dispensación de formalina neutra o tamponada al

7. INSPECCION Y DESCRIPCION DEL MATERIAL

La primera fase del estudio macroscópico es la inspección general del mate-

8. MUESTREO Y SELECCION DEL MATERIAL

El muestreo debe realizarse sobre la totalidad del material recibido aunque

procedimiento consiste en obtener láminas de tejido del material, preservando al

9. FORMULARIO DE ESTUDIO MACROSCOPICO

El formulario de estudio macroscópico es una hoja de instrucciones para el

10. FOTOGRAFIADO Y RADIOGRAFIA DE LOS ESPECIMENES

La realización de fotografías de las piezas obedece a dos motivos:

El estudio radiográfico de las piezas quirúrgicas puede proporcionar informa-

11. AUTOPSIA CLINICA V MEDICO FORENSE

Autopsia significa etimológicamente «investigar por uno mismo». En medici-

11 .1. Autopsia medicolegal

Trata de investigar el origen de un fallecimiento cuando existen implicacio-

11.2. Autopsia clínica

12. SALA E INSTRUMENTAL DE AUTOPSIAS

Las necropsias se llevan a cabo en la sala de autopsias, que existe en todos

Figura 1.3. Sala de autopsias mostrando la mesa especialmente diseñada

El instrumental necesario, con las salvedades relativas a su tamaño en fun -

13. El PERSONAl DE AUTOPSIA

La autopsia es realizada por el médico anatomopatólogo (si es posible,

14. AUTOPSIAS PARCIALES

En ocasiones, la autorización otorgada para la realización de una autopsia

15. FUNCIONES DE lOS TECNICOS DE lABORATORIO

Dentro del territorio nacional, las funciones del técnico de laboratorio se

torio comienzan con la llegada del material al servicio de anatomía patológica a