Universidad Veracruzana

Microbiología ambiental

Giseth Damaris Higinio Santander

IA-2-V

Fijación y métodos de tinción

En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona importante
información para la identificación temprana y definitiva de los microorganismos. En la valoración de
las muestras, es trascendente el poder de resolución del microscopio, el cual se define como la
capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos del objeto para
que se puedan visualizar como dos puntos separados. El poder de resolución de un objetivo es el
responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de la imagen, y depende de la longitud
de onda (λ) del haz de luz utilizado y de la apertura numérica del objetivo empleado. Para
aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han desarrollado técnicas tintoriales que destacan
las características morfológicas de los microorganismos. Existe una gran variedad de tinciones que
pueden ser aplicadas dentro del campo de la microbiología
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera. De
acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extraídos de
plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y
manipulados en el laboratorio. Químicamente, el colorante está constituido de un componente
cromóforo y un auxócromo. El cromóforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene
una absorción característica en la región ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la capacidad
que tiene la molécula para que sus electrones absorban energía o luz visible, se exciten y emitan
diversos colores de acuerdo con la longitud de emitida como resultado del cambio en el nivel
energético.
Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al microscopio
óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos para que por medio del uso de colorantes, sea
mucho más fácil su identificación; además, la presencia de ciertas estructuras, así como su reacción
a determinadas técnicas, nos permite clasificar a las bacterias.
Así pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:
1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.
2. Revelan su forma y tamaño.
3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
4. Producen reacciones químicas específicas.
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se
utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción diferencial, cuando se visualiza más
de un color porque se utiliza más de un colorante Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica, cuando
se utilizan anticuerpos marcados con una molécula fluorescente para identificar una estructura
celular en particular (inmunocitoquímico).
Algunas técnicas tintoriales como Gram o ZiehlNeelsen requieren antes de su proceso la fijación de
las muestras. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para las bacterias la fijación por el calos es lo más corriente, aunque
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también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehído, ácidos y alcoholes. Después de
la fijación se realiza habitualmente en células que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando
después éste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación
produce generalmente el encogimiento de las células, la tinción, por el contrario, hace que las
células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las células
que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.
A continuación se mencionarán las principales técnicas de tinción utilizadas en microbiología.
Tinciones simples
Se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico. Se utilizan solamente para incrementar el
contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Se fija el
espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el
exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada.
Tinciones diferenciales
Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de
dos etapas: una tinción simple seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se
utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante.
Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología.
Tinciones específicas
Se utilizan para incrementar el contraste en las células microbianas y revelan estructuras
particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y las cápsulas.
Tinción adecuada
En su forma más simple, el verdadero proceso de tinción puede implicar la inmersión de la muestra
en la solución colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el exceso de colorante
y la observación. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente. Cuando la solución
de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tinción mordentada permanece.
Tinción indirecta
Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente habitual es
el ácido tánico.
Tinción directa
Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro
tratamiento previo.
Tinción naranja de acridina
El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede
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variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como

colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto.
Tinción de Gram
Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la
pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con cierto detalle la tinción de Gram. Las
células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de cristal violeta
(otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de
colorante. En este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las grampositivas, están
teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) – yoduro potásico
(KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico simplemente hace soluble el yodo en
agua. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De
nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación.
Se lleva a cabo después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las
que es soluble el complejo yodo – cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se
decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos
de células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración. Después de la decoloración las
células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de
manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un
colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste
las células gramnegativas son rojas mientras que las grampositivas permanecen azules.

Tinción ácido – alcohol resistencia

Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que tienen un alto
contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser calificadas por la tinción de Gram.
Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina – fenol, en la que la fucsina
hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido – alcohol
sensibles como las resistentes. Después se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias
ácido – alcohol sensibles se decoloren mientras que las ácido – alcohol resistentes se quedan rosa.
Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de
metileno que tiñe las células ácido – alcohol sensibles de color azul quedando las células ácido –
alcohol resistentes de color rosa.
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Tinción de esporas
Se utiliza para teñir las estructuras de
resistencia llamadas endosporas bacterianas.
Sobre el portaobjetos con la preparación se
echa verde malaquita que tiñe las células de
verde. Luego se lava con agua destilada con lo
que las células se quedan incoloras y las
endosporas permanecen verde. Finalmente se
usa la safranina para obtener bacterias de
color rosa mientras que las endosporas continúan con su color verde del verde malaquita.

Tinción negativa
Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se
dejan sin teñir pero se colorea un cambio el medio que las rodea.
Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia
utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea
las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de
partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro
insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de
aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su
máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor
de las células bacterianas.

Tinción de azul algodón de lactofenol

El examen microscópico es de gran importancia en micología para la observación de las diferentes
especies de hongos de interés clínico. Se deben utilizar tinciones que logren preservar la integridad
de las estructuras fúngicas. La tinción de azul algodón de lactofenol no es considerada una tinción
diferencial, sin embargo, posee características tintoriales que permiten observar cada uno de los
componentes fúngicos y apreciar fácilmente las estructuras para una adecuada identificación. El
fenol inactiva las enzimas líticas de la célula e impide que ésta se rompa; de igual forma, destruye la
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flora acompañante e inactiva a la célula, quitándole el grado de patogenicidad; además, actúa como
mordiente cuando se usa en combinación con colorantes. El ácido láctico preserva las estructuras
fúngicas al provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al interior fúngico, lo que genera
una película protectora. El azul de algodón es un colorante ácido, que tiñe el citoplasma y la quitina
presente en las células fúngicas, mientras que el glicerol mantiene húmeda la preparación.2 Una vez
preparado el colorante, se debe colocar la muestra microbiológica en un portaobjetos por medio de
una impronta (proceso en el cual se coloca una impresión de la muestra sobre una estructura
utilizando una cinta adhesiva transparente).

Preparación de la impronta
1. Colocar el material necesario en la campana de
seguridad tipo.
2. Seleccionar las colonias para realizar las improntas.
3. Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente
aproximadamente de 1 cm2.
4. Pegar los segmentos de cinta en un asa micológica.
5. Poner una gota de azul de algodón en el portaobjetos.
6. Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior
de hongo.
7. Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodón y poner
otra gota de azul de algodón.
8. Poner un cubreobjetos sobre la preparación.
9. Observar en 40x.

Bibliografía
En línea:
Técnicas de tinción. Recuperado el 5 de octubre de 2016 a las 17:26 horas.
http://acuanatura.galeon.com/cursosonline/tecnicasdetincion/tecnicasdetincion.pdf
Métodos y técnicas de tinción. Recuperado el 5 de octubre de 2016 a las 17:42 horas.
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/10/metodos-y-tecnicas-de-tincion.html
Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Recuperado el 5 de octubre a las 18:04
horas.
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http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf