Sensibilidad a la temperatura de la enzima extracelular Vmax y Km en

ambientes térmicos
Cabeza corriente: sensibilidades de temperatura de Vmax y Km
Steven D. Allison 1,2 *
Adriana L. Romero-Olivares 1
Ying Lu 1
John W. Taylor 3
Kathleen K. Treseder 1
1 Departamento de Ecología y Biología Evolutiva, Universidad de California, Irvine, CA 92697, EE.
UU.
2 Departamento de Ciencias de Sistemas Terrestres, Universidad de California, Irvine, CA 92697, EE.
UU.
3 Departamento de Biología Vegetal y Microbiana, Universidad de California, Berkeley, CA 94720-
3102, EE. UU.
* Correspondencia:
Steven D. Allison
321 Steinhaus
Irvine, CA 92697, EE. UU.
Teléfono: 949-924-2341
Fax: 949-824-2181
allisons@uci.edu

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Palabras clave: sensibilidad a la temperatura, enzima extracelular del suelo,
Vmax, Km, cambio climático, hongos,
teoría del estado de transición, adaptación térmica
Abstracto
La magnitud y la dirección de las retroalimentaciones del ciclo del carbono bajo
el calentamiento climático siguen siendo inciertas
debido al conocimiento insuficiente sobre las sensibilidades de temperatura de
los procesos microbianos del suelo.
Las tasas enzimáticas podrían aumentar a temperaturas más altas, pero esta
respuesta podría cambiar con el tiempo si
los microbios del suelo se adaptan al calentamiento. Usamos la relación de
Arrhenius, estado de transición bioquímica
teoría y teoría de fisiología térmica para predecir las respuestas de la enzima
extracelular Vmax y
Km a la temperatura. Sobre la base de estos conceptos, planteamos la hipótesis
de que Vmax y Km correlacionarían
positivamente entre sí y mostrar sensibilidades de temperatura positivas. Para
enzimas de más caliente
ambientes, esperábamos encontrar una menor sensibilidad a la temperatura de
Vmax, Km y Km, pero mayor
Sensibilidad a la temperatura Vmax. Probamos estas hipótesis con aislamientos
del hongo filamentoso
Neurospora discreta recolectada de todo el mundo y con hojarasca en
descomposición de un
experimento de calentamiento en el bosque boreal de Alaska. Para las enzimas
extracelulares de Neurospora , Vmax Q 10
varió de 1.48 a 2.25, y el Km Q 10 varió de 0.71 a 2.80. De acuerdo con la teoría,
Vmax y
Km se correlacionó positivamente para algunas enzimas, y Vmax disminuyó bajo
calentamiento experimental en
Arena de Alaska. Sin embargo, las sensibilidades de temperatura de Vmax y Km
no variaron como se esperaba con
calentamiento Tampoco encontramos ninguna relación entre la sensibilidad a la
temperatura de Vmax o Km y la media
temperatura anual del sitio de aislamiento para las cepas
de Neurospora . Disminución de Vmax en Alaska
el tratamiento de calentamiento implica una retroalimentación negativa a corto
plazo para el cambio climático, pero la Neurospora
los resultados sugieren que los cambios impulsados por el clima en los insumos
de la planta y las propiedades del suelo son controles importantes
sobre la cinética enzimática a largo plazo. Nuestros datos empíricos sobre la
enzima Vmax, Km y la temperatura
Las sensibilidades deberían ser útiles para parametrizar los modelos
biogeoquímicos existentes, pero revelan una
necesidad de desarrollar una nueva teoría sobre los mecanismos de adaptación
térmica.

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Introducción
Para el año 2100, se espera que las emisiones de gases de efecto invernadero
causadas por el hombre calienten el planeta en 3-5  C
con mayores incrementos sobre la superficie de la tierra (IPCC, 2013). Este
calentamiento influirá en lo biológico
procesos y ecosistemas, lo que podría conducir a reacciones que mitiguen o
agraven el efecto invernadero
los niveles de gas y la magnitud máxima del calentamiento planetario. Dado que
los suelos contienen alrededor de tres
veces tanto carbono como la atmósfera (Jobbágy & Jackson, 2000),
retroalimentaciones que involucran carbono del suelo
son particularmente importantes para las proyecciones climáticas futuras. Sin
embargo, estas retroalimentaciones están mal resueltas
y siguen siendo difíciles de predecir (Todd-Brown et al. , 2014).
Las pérdidas de carbono en el suelo bajo el calentamiento son una fuente
importante de incertidumbre en las retroalimentaciones climáticas
(Carey et al. , 2016; Crowther et al. , 2016). Aunque muchos procesos
contribuyen a estas pérdidas,
Se espera que la descomposición microbiana de la materia orgánica del suelo
aumente con el calentamiento debido a
la sensibilidad positiva a la temperatura de la mayoría de las reacciones
bioquímicas (Davidson & Janssens, 2006). En
en particular, la degradación de moléculas orgánicas complejas depende de
microbiana extracelular
enzimas con propiedades cinéticas sensibles a la temperatura (Wallenstein et al. ,
2011; Steinweg et al. ,
2012). Por ejemplo, glucósido hidrolasas tales
como α- glucosidasa, β- glucosidasa, celobiohidrolasa,
y β- xilosidasa degrada el almidón, la celulosa y la hemicelulosa (Burns et al. ,
2013). Otras enzimas
tales como N -acetil-glucosaminidasa, leucina-aminopeptidasa y fosfatasa se
dirigen a formas orgánicas de
nitrógeno y fósforo, mientras que las enzimas oxidativas degradan los polímeros
aromáticos (Sinsabaugh, 1994,
2010).
Aunque la cinética enzimática ha sido estudiada durante mucho tiempo por los
bioquímicos en el laboratorio (Somero,
1978), la sensibilidad a la temperatura de las enzimas del suelo sigue sin estar
clara. Los cambios en la temperatura pueden
afectar las propiedades cinéticas de las enzimas individuales, la expresión de
isozimas con diferentes cinéticas
propiedades por organismos específicos, y las abundancias relativas de microbios
que expresan diferentes
enzimas (Davidson & Janssens, 2006; Bradford, 2013). Cualquier combinación
de estos factores puede

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influencia las propiedades cinéticas observadas y sus sensibilidades de
temperatura dentro de un ambiente dado
y en respuesta al cambio de temperatura.
Existe una abundante literatura teórica sobre la cinética y la termodinámica de las
enzimas.
reacciones catalizadas. Se supone que muchas enzimas siguen la cinética de
Michaelis-Menten que describe
la velocidad de reacción (V):
V = Vmax [S] / (Km + [S]) [eq. 1]
donde Vmax es la velocidad de reacción máxima, [S] es la concentración de
sustrato y Km es la mitad
constante de saturación (es decir, concentración de sustrato en la que V es la
mitad de Vmax). Tenga en cuenta que aparece Km
en el denominador de la ecuación de Michaelis-Menten, por lo que aumenta en
Km la menor reacción
velocidades Para las enzimas purificadas, Vmax es proporcional a k cat * [E]
donde k cat es la renovación catalítica
velocidad (cantidad de moléculas de sustrato convertidas en producto por enzima
por unidad de tiempo), y [E] es la
concentración de enzima. En mezclas de enzimas, como suelos o fluidos de
cultivo, mide Vmax y Km
Depende de las proporciones de enzimas individuales con diferentes propiedades
cinéticas (Wallenstein et al.
Alabama. , 2011).
La teoría del estado de transición proporciona un marco para predecir cómo
Vmax y Km responden a
calentamiento (Fig. 1). Según esta teoría, la catálisis enzimática requiere la unión
enzima-sustrato,
formación de un complejo activado enzima-sustrato, y formación y disociación
del producto. Cada
el paso implica un cambio en la energía libre de Gibbs:
Δ G ES = Δ H ES - T Δ S ES para unión al sustrato [eq. 2]
y
Δ G ‡ = Δ H ‡ - T Δ S ‡ para la formación del complejo [eq activado. 3]

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donde  H es el cambio en la entalpía (calor de reacción),  S es el cambio en la
entropía (una métrica de
trastorno), y T es la temperatura. En una reacción enzimática típica (Fig.
1),  G ES es negativo y  G ‡ es
positivo.
Vmax yk cat se rigen por la formación del complejo activado y dependen de
temperatura a través de la relación Arrhenius (Davidson & Janssens, 2006):
k cat = A * exp (-Ea / RT) [eq. 4]
donde A es un factor preexponencial, Ea es energía de activación y R es la
constante de gas ideal. Arrhenius
y la teoría del estado de transición están relacionadas porque Ea =  H ‡ + RT,
y  S ‡ influye en la
factor exponencial (ver Lonhienne et al. (2000) para más detalles). Las tasas de
reacción aumentan a medida que Ea declina o
a medida que la temperatura aumenta debido a una fracción creciente de
reactivos con suficiente energía para formar un
complejo activado.
Con el calentamiento a largo plazo, como se espera bajo el cambio climático,
Vmax y su temperatura
la sensibilidad podría cambiar debido a los mecanismos de adaptación térmica
(Bradford, 2013). Adaptado al frío
se cree que las enzimas se optimizan a través de reducciones en  H ‡ que
reducen Ea (Lonhienne et al. ,
2000; Georlette et al. , 2004; Siddiqui y Cavicchioli, 2006). Sin embargo, a
temperaturas más altas,
selección para minimizar la disminución de Ea porque las enzimas y los sustratos
tienen mayor energía cinética. Si Ea
aumenta bajo el calentamiento a largo plazo, por lo que debe Vmax sensibilidad a
la temperatura de acuerdo con el
Relación Arrhenius. Aún así, este mecanismo no es ampliamente reconocido, ya
que algunos estudios recientes
hipotetizó el patrón opuesto: menor sensibilidad a la temperatura de Vmax en
ambientes más cálidos
(Wallenstein et al. , 2009; Brzostek & Finzi, 2012; Nottingham et al. , 2016).
Para Km, la teoría del estado de transición dicta que la respuesta de temperatura
depende de la
Energética de la unión enzima-sustrato. La afinidad de unión (1 / Km) depende
de la energía libre
cambio al unirse,  G ES (Tsuruta y Aizono, 2003):

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1 / Km = exp (-  G ES / RT) [eq. 5]
donde  G ES =  H ES - T  S ES (ecuación 2). Por lo tanto, la afinidad aumenta
con una mayor liberación de entalpía (más
negativo  H ES ) y una mayor entropía tras la unión al sustrato
(más  S ES positiva). Reordenando el
rendimiento de ecuaciones
Km = exp (  H ES / RT -  S ES / R) [eq. 6]
Un negativo  H ES en eq. 6 dicta que el Km aumenta con el aumento de T. Por el
contrario, Km debería disminuir
con calentamiento si  H ES es positivo porque el término  H ES / RT disminuirá
a medida que T aumenta (Siddiqui &
Cavicchioli, 2006). Tenga en cuenta que la unión del sustrato sigue siendo
termodinámicamente favorable con un positivo
Δ H ES si los incrementos en entropía contrarrestan el término de entalpía
(Snider et al. , 2000; Tsuruta & Aizono,
2003; Siddiqui y Cavicchioli, 2006).
Recientemente, la teoría de la tasa macromolecular (MMRT) se ha propuesto
para dar cuenta de la empírica
evidencia de que las tasas catalíticas enzimáticas no siguen la relación de
Arrhenius con el aumento
temperatura (Hobbs et al. , 2013; Schipper et al. , 2014; Alster et al. ,
2016). MMRT postula que Ea es
no constante como se supone en la teoría de Arrhenius, pero varía con el aumento
de la temperatura debido a
cambios en la capacidad de calor de la enzima. Aunque MMRT ofrece promesa
como una explicación más mecanicista
de la sensibilidad a la temperatura de la enzima, la teoría aún no se ha aplicado a
las preguntas sobre Km o
adaptación térmica de Vmax y Km.
El objetivo de este estudio fue determinar las sensibilidades de temperatura de
Vmax y Km y
si estas sensibilidades cambian con el calentamiento a largo plazo. La
sensibilidad a la temperatura se define aquí como
la pendiente de la relación entre el valor log (Vmax) o log (Km) y la incubación
de laboratorio
temperatura. Nuestra hipótesis fue que 1) la sensibilidad a la temperatura sería
positiva para la enzima Vmax
basado en la teoría de Arrhenius y positivo para Km debido a una distribución
más amplia de sustrato enzimático
estados conformacionales a temperaturas más altas (Hochachka y Somero, 2002;
Georlette et al. , 2004).
También predijimos que Vmax se correlacionaría positivamente con Km si el
sustrato enzimático fuera más fuerte

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el enlace aumenta la barrera de energía de activación como lo implica la teoría
del estado de transición (figura 1). Residencia en
teoría bioquímica, planteamos la hipótesis de que 2a) la magnitud de Vmax a una
temperatura común
sería más bajo y la sensibilidad a la temperatura de Vmax sería mayor para las
enzimas de más cálido
ambientes. Para Km, hipotetizamos 2b) una menor magnitud y menor
sensibilidad a la temperatura de
Km para enzimas de ambientes más cálidos. Los ambientes cálidos deberían
seleccionar enzimas con
mayor rigidez para mejorar la unión del sustrato, lo que reduce Km a una
temperatura común y
limitando los cambios en la conformación de la enzima a medida que aumenta la
temperatura (Georlette et al. , 2004; Dong &
Somero, 2009).
Probamos estas hipótesis con cepas individuales del hongo
filamentoso Neurospora
discreta aislado en un gradiente de temperaturas medias anuales y con microbios
enteros
comunidades que crecen en hojarasca en una manipulación de calentamiento en
Alaska boreal. Estos dos sistemas
son complementarios porque las comunidades de camadas producen una mezcla
más compleja de enzimas
en comparación con las cepas de Neurospora individuales . Además, el
experimento de calentamiento captura el corto plazo
respuesta de las comunidades al calentamiento, mientras que las cepas
de Neurospora han evolucionado a la larga
término, efectos integrados de diferentes condiciones climáticas.
materiales y métodos
Cepas de Neurospora
Se obtuvieron cepas de Neurospora discreta de Côte d'Ivoire, Tailandia, Suiza y
España a partir de
el Fungal Genetic Stock Centre (Gladieux et al. , 2015). Otras cepas de los
Estados Unidos fueron
de una colección de cultivo mantenida en el laboratorio de J. Taylor (Tabla
1). Especies de Neurospora ocurren en
todos los continentes, muestran una estructura poblacional compleja e incluyen
poblaciones que habitan el suelo
y reproducir el siguiente incendio en bosques templados y boreales (Jacobson et
al. , 2004).

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Condiciones de crecimiento
Las cepas de Neurospora se inocularon de cultivos madre en el centro de una
placa de agar que contenía
Medio mínimo de Vogel (VMM). Las placas se sellaron con Parafilm y se
incubaron durante 5-7 días a
21ºC hasta que esté completamente cubierto por el micelio. El micelio se
transfirió luego a un matraz de 250 ml
que contiene 100 ml de VMM y se incuba a 28ºC con agitación a 150
rpm. Después de 3 días, el medio
se centrifugó para separar el micelio que luego se enjuagó y se resuspendió en
VMM,
se homogeneizó en una licuadora (pulsos de 4 x 10 segundos) y se transfirió a un
matraz con 120 ml de VMM fresco. Esta
procedimiento era necesario para reducir la agregación de micelio que inhibía el
crecimiento de algunos
son. Después de 4 días más de crecimiento a 28ºC y agitación a 150 rpm, el
micelio se separó
del medio por centrifugación, y el sobrenadante se usó en ensayos enzimáticos.
Experimento de calentamiento de la tierra
Analizamos los parámetros de las enzimas en bolsas de papel recogidas de un
experimento de calentamiento del suelo en Alaska
bosque boreal cerca de Delta Junction, AK, EE. UU. (63º55'N, 145º44'W). El
experimento de calentamiento comenzó en
Julio de 2005 con cinco parcelas de control sin calentamiento de 2.5 mx 2.5 m
combinadas con cinco 2.5 mx 2.5 m calentadas
parcelas en un área de 1 km 2 (Allison y Treseder, 2008). El calentamiento se
logró con tapa cerrada
invernaderos. El panel superior de cada invernadero se eliminó en septiembre y
se reemplazó en cada
mayo subsiguiente para permitir que la nieve llegue a las parcelas. La lluvia entró
a los invernaderos a través de un
sistema de canaletas y tubos. En promedio, el tratamiento de calentamiento
aumentó la temperatura del aire
1.6ºC, aumento de la temperatura del suelo en 0.5ºC (5 cm de profundidad) y
reducción de la humedad del suelo en un 22% (0-5 cm)
profundidad).
Los sacos de basura que contienen 2 g de agujas de abeto senescentes se
colocaron bajo control y se calentaron
parcelas el 22 de mayo de 2013 (Romero-Olivares et al. , 2017). Cada bolsa tenía
10 cm  10 cm y estaba construida
de una capa de malla de nylon elástica de 1 mm y una pantalla de ventana de
fibra de vidrio de 1 mm. Cada trama

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recibió 5 juegos de 2 bolsas colocadas en el piso del bosque. Un conjunto de
bolsas fue cosechado el 5 de julio de 2013,
28 de agosto de 2013, 29 de mayo de 2014, 7 de septiembre de 2014 y 4 de julio
de 2015, y el contenido de las 2 valijas
fueron combinados. Las submuestras se eliminaron para la determinación de la
actividad de la enzima (~ 0,6 g fresca
peso) y peso seco. Las submuestras de enzimas se almacenaron a -80ºC hasta el
análisis.
Ensayos enzimáticos
Las actividades potenciales de las enzimas extracelulares se midieron de acuerdo
con fluorimetría establecida
y protocolos colorimétricos para microplacas de 96 pocillos (German et al. ,
2011). Para ensayos de cultivo, 125 μl
El sobrenadante del cultivo de Neurospora se combinó con 125 μl de sustrato
(Tabla 2) disuelto en 50 mM.
tampón de maleato, pH 6.0. Para ensayos de hojarasca, el material se
homogeneizó en tampón de maleato 50 mM, pH
6.0, usando un Homogeneizador Bamix de mano (BioSpec Products, Bartlesville,
OK, EE. UU.) En una proporción de ~ 2.7
mg de litro ml -1 de tampón. Este homogeneizado (125  l) se combinó con 125 μl
de sustrato disuelto en
agua ultra pura. Las soluciones de sustrato se diluyeron en serie dos veces desde
el máximo
concentraciones mostradas en la Tabla 2 para crear un gradiente con ocho
concentraciones de sustrato. El buey
el ensayo también recibió 10 μl de H 2 O 2 al 0,3% en todos los pocillos con
sustrato. Todos los ensayos incluyeron homogeneizado (o
cultura) espacios en blanco y controles de sustrato. Los ensayos fluorimétricos
también incluyeron 7-amino-4-metilcoumarina
(AMC) y 4-methyumbelliferone (MUB) estándares para LAP y las otras enzimas
hidrolíticas,
respectivamente. La fluorescencia se midió a partir de 125  l de 25  M MUB o
AMC con 125 μ l de agua o
tampón como estándar o con 125 μl de homogeneizado o sobrenadante de cultivo
como control de extinción.
Las placas de ensayo se incubaron durante 1-5 h (enzimas hidrolíticas) o 24 h
(oxidasas) a 4, 10, 16,
22, 28 y 34ºC. La fluorescencia se leyó a 365 nm / 450 nm de excitación /
emisión para el hidrolítico
enzimas, y la absorbancia se leyó a 410 nm para OX y PPO en una microplaca
BioTek Synergy H4
lector (Winooski, VT, EE. UU.). Las actividades enzimáticas se expresaron como
nmol h -1 ml -1 sobrenadante de cultivo o

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μmol h -1 g -1 camada seca según German et al. (2011, 2012) usando un
coeficiente de extinción de 3.9
μ M -1 para pirogalol.
Análisis estadístico
Los datos de actividad de la enzima se verificaron en busca de valores atípicos, y
los valores por debajo de los límites de detección se convirtieron en
0.0001, eliminando actividades negativas del conjunto de datos. Las actividades
de control de calidad eran aptas para
la ecuación de Michaelis-Menten usando la función de mínimos cuadrados no
lineales (nls) en la base R (R
Development Core Team, 2011). Los parámetros Vmax y Km se extrajeron del
ajuste del modelo, y
parámetros de ajustes pobres fueron descartados.
Los parámetros extraídos se transformaron logarítmicamente y se analizaron con
regresión lineal usando
temperatura de incubación como la variable independiente. Las pendientes de
regresión se extrajeron como una métrica
de la sensibilidad a la temperatura Vmax o Km (TS) en términos de cambio en el
registro (Vmax) o log (Km) por  C.
las pendientes se convirtieron en valores Q 10 usando la relación Q 10 = exp
(10  pendiente). Para Neurospora
culturas, también utilizamos este enfoque para analizar la relación Vmax / Km
para cada cepa y enzima.
Los parámetros de regresión se usaron para calcular la enzima Vmax o Km a
16ºC, de aquí en adelante referido como
Vmax o Km por simplicidad. Elegimos 16ºC como la temperatura común a la
cual comparar
parámetros porque se encuentra dentro del rango de nuestros ensayos de
laboratorio y se aproxima al crecimiento
temperaturas de temporada para muchas de nuestras cepas.
Se realizaron análisis adicionales sobre los parámetros de la enzima. Para
las culturas Neurospora ,
probamos correlaciones significativas de Spearman entre Vmax y Km usando la
función corr.test
del paquete de psicología en R. Usamos regresión lineal simple para probar
relaciones significativas
entre la temperatura media anual del sitio de aislamiento de deformación (MAT)
y los parámetros cinéticos de la enzima o
sensibilidades a la temperatura. Para dar cuenta de la no independencia entre las
cepas aisladas de la misma
sitio, también probamos estas relaciones después de incluir el sitio como un
efecto aleatorio en la regresión

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modelo. Para los análisis de la hojarasca, probamos los efectos del tratamiento de
calentamiento y la fecha de recolección en
log los parámetros cinéticos de la enzima y la sensibilidad a la temperatura
usando el análisis de varianza de modelos mixtos
(ANOVA) con bloqueo como el factor aleatorio.
Resultados
Neurospora aislado Vmax y Km
En condiciones de cultivo, los parámetros cinéticos de la enzima variaron
sustancialmente entre enzimas y cepas
(Tablas 3-5, Tabla S1). En promedio, Vmax a 16ºC fue mayor para N -acetil-
glucosaminidasa (NAG) en
140.8 nmol h -1 ml -1 y menor para las oxidasas (<0.16 nmol h -1 ml -1 ). El otro
Vmax significa rango
entre 0,37 y 3,25 nmol h -1 ml -1 (Tabla 3, Fig. 2a). Los valores promedio de Km a
16ºC fueron menores a 100
μ M para NAG, α- glucosidasa (AG) y las oxidasas, pero variaron hasta 850 μM
para las otras enzimas
(Tabla 4, Fig. 2b). Estos patrones para Vmax y Km resultaron en una Vmax / Km
de 1,17 muy alta para
NAG, un valor intermedio de 0.032 para AG y valores inferiores a 0.004 para las
otras enzimas (Tabla 5,
Fig. 2c). Vmax y Km tuvieron una correlación significativamente positiva entre
las cepas de β- xilosidasa (BX; r =
0.76), oxidasa total (OX; r = 0.92) y polifenol oxidasa (PPO; r = 0.94).
Neurospora aisla la sensibilidad a la temperatura de Vmax y Km
Al igual que con los parámetros cinéticos en sí, Vmax TS y Km TS variaron
entre cepas y enzimas
(Cuadros 3-4, S2). En promedio, todos los valores de Vmax TS fueron positivos,
con Q 10 en el rango de 1.48 (PPO) a
2.25 (NAG). Los valores de TS fueron generalmente positivos, a excepción de
algunas cepas que mostraron valores negativos
para celobiohidrolasa (CBH), leucina aminopeptidasa (LAP) y OX (figura 3a).
Los resultados para Km TS fueron mucho más variables. Km TS fue
consistentemente positivo para NAG
con un promedio de tensión cruzada de Q 10 de 2,80 (Tabla 4, Fig. 3b). La
mayoría, pero no todas, las cepas mostraron resultados positivos
Km TS para AG, fosfatasa ácida (AP) y las oxidasas con Q 10 promedio que varía
de 1.17 a 1.48

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(Tabla 4). Km TS para las enzimas degradantes de carbohidratos β- glucosidasa
(BG), BX y CBH variaron
sustancialmente a través de cepas que incluyen valores positivos y negativos
(figura 3b). Solo LAP mostró una
sistemáticamente negativo Km TS para la mayoría de las cepas con un promedio
Q 10 de 0.71 (Tabla 4). El TS de
Vmax / Km fue generalmente positivo para todas las enzimas excepto NAG, que
fue consistentemente negativo, y
las oxidasas que mostraron Vmax / Km TS baja o variable (Tabla 5, Fig. 3c).
Respuesta cinética enzimática a MAT para aislamientos de Neurospora
Hubo algunas relaciones positivas significativas entre los parámetros cinéticos de
la enzima y MAT de
el sitio de aislamiento de la tensión Vmax mostró una relación positiva con MAT
para AP, CBH y LAP con R 2
valores que varían de 0.13 a 0.33 (Fig. 4). Se observaron patrones similares para
Km, con significativos
relaciones positivas para LAP (R 2 = 0.24) y NAG (R 2 = 0.26). Cuando el sitio de
aislamiento se incluyó como
efecto aleatorio en el modelo de regresión, solo la relación CBH Vmax con MAT
permaneció
significativo ( P = 0.016). No encontramos una relación significativa entre MAT
y Vmax TS o Km TS
para cualquier enzima.
Camada Vmax y Km bajo tratamiento de calentamiento de Alaska
Los efectos del calentamiento en los parámetros cinéticos de la enzima de
hojarasca dependieron de la fecha y la enzima (tablas 6, S3).
El efecto de calentamiento en Vmax fue negativo y significativo para todas las
enzimas excepto CBH, y hubo
también una interacción con la fecha para AP, BG, NAG, OX y PPO (figura
5a). Para Km, el efecto de calentamiento fue
positivo, al menos en algunas fechas, para AP, BG, CBH, LAP y NAG (figura
5b). Por el contrario, hubo un
efecto de calentamiento negativo significativo en Km para las oxidasas.

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Sensibilidad a la temperatura de la cama Vmax y Km
En promedio, Vmax TS fue positivo para todas las enzimas de hojarasca (Fig. 6a,
Tabla S4). Tratamiento de calentamiento
aumentó significativamente Vmax TS de AP, BG, BX y NAG, y hubo una fecha
significativa por
interacción de tratamiento para AG, lo que indica aumento de TS bajo
calentamiento en las fechas de recolección anteriores
(Tabla 6). Por el contrario, el tratamiento de calentamiento redujo
significativamente Vmax TS de LAP.
Km TS varió por la enzima y, en algunos casos, el tratamiento de calentamiento
(Fig. 6b, Tabla 6). Para AG, Km
TS fue bajo en las parcelas de control, pero aumentó significativamente con el
calentamiento. Por el contrario, Km TS de AP fue
generalmente positivo en las parcelas de control, pero disminuyó
significativamente con el calentamiento en algunas fechas. En
el promedio de Km TS para BG fue cercano a cero, pero hubo una interacción
significativa de tratamiento por fecha.
Los valores BX y CBH fueron cercanos a cero y no mostraron efectos de
calentamiento. Km TS para LAP era
consistentemente negativo y significativamente reducido por el tratamiento de
calentamiento, pero para NAG fue
consistentemente positivo con el efecto de calentamiento dependiente de la fecha
de recolección. Km TS para las oxidasas
fue en general positivo pero disminuyó significativamente con el calentamiento
para OX.
Discusión
Encontramos que los valores de Vmax de las enzimas extracelulares involucradas
en la descomposición aumentaron
exponencialmente con el aumento de la temperatura, consistente con la teoría de
Arrhenius y una retroalimentación positiva
al calentamiento climático (Davidson & Janssens, 2006). Aún así, la fuerza de
esta retroalimentación podría reducirse
si las enzimas exhiben una adaptación térmica tal que Ea se eleva por
calentamiento, reduciendo así el valor absoluto
Vmax mientras aumenta Vmax TS. Nuestros resultados de enzimas de camada
brindan soporte para esta
mecanismo de adaptación, ya que la mayoría de las enzimas mostraron valores
más bajos de Vmax y algunas mostraron una mayor Vmax
TS bajo tratamiento de calentamiento (Fig. 7). Por el contrario, no encontramos
soporte para la adaptación térmica
cuando se comparan enzimas de cepas de Neurospora nativas de diferentes
ambientes térmicos. Estas
resultados contrastantes sugieren que los procesos a nivel comunitario pueden
influir en la adaptación térmica de

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Enzimas de hojarasca de Alaska, mientras que los taxones de Neurospora fueron
limitados en su respuesta térmica debido a
limitaciones filogenéticas o factores ecológicos, como la disponibilidad de
sustrato cambiante a través de la MAT
gradiente.
Relación Vmax-Km
En el estudio de Neurospora , las correlaciones positivas significativas entre
Vmax y Km para BX, OX y PPO
predicciones apoyadas de la teoría del estado de transición (Fig. 1). Un pozo de
energía libre más profundo para la enzima-
la unión del sustrato conduce a Km más bajo, pero también a una mayor barrera
de energía libre para superar durante
activación del estado de transición (Lonhienne et al. , 2000; Georlette et al. ,
2004; Siddiqui &
Cavicchioli, 2006). Esta mayor barrera de Ea da como resultado una velocidad de
reacción más lenta (Vmax inferior), consistente
con las relaciones que vimos.
Sensibilidad a la temperatura de la cinética enzimática
La sensibilidad a la temperatura de Vmax, representada como valores de Q 10 ,
varió de 1,48 a 2,25 para
Enzimas de Neurospora , similares a otros estudios (Koch et al. , 2007; Hui et
al. , 2013; Nottingham et al. ,
2016). Mientras que nuestros valores Q 10 se basaron en la teoría de Arrhenius,
MMRT se ha propuesto como una
marco más apropiado para analizar la sensibilidad a la temperatura de la enzima
porque no lo hace
suponen Q 10 constante a medida que cambia la temperatura (Schipper et al. ,
2014). Sin embargo, nuestro estudio no fue
ideal para probar MMRT porque usamos un rango de temperatura por debajo del
óptimo térmico del
enzimas. Además, las predicciones de adaptación térmica aún no se han
desarrollado para MMRT.
No obstante, ajustamos con éxito la ecuación MMRT para obtener parámetros
termodinámicos y calor
capacidades para muchas de nuestras enzimas Neurospora y hojarasca
(Información de apoyo). Este análisis
mostró que la mayoría de las capacidades de calor de la enzima en nuestro
estudio fueron cercanas a cero donde la teoría de Arrhenius

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y MMRT producen valores Q 10 similares . Aún así, si MMRT se desarrolla aún
más para hacer predicciones sobre
adaptación térmica, nuestros datos podrían ser utilizados para probarlos.
Km TS fue positivo para algunas enzimas pero casi cero o negativo para otras en
ambos
sistemas experimentales. Km TS se mide con menor frecuencia que Vmax TS en
contextos ambientales,
pero nuestros resultados son parcialmente consistentes con estudios previos
(German et al. , 2012b; Stone et al. ,
2012). Como en estos estudios, Km TS fue generalmente menor que Vmax
TS; sin embargo, la magnitud de Km
TS para Neurospora y enzimas de hojarasca de Alaska fue menor que en la
mayoría de los suelos medidos
anteriormente, incluidos los de nuestro sitio de campo de Alaska. NAG fue una
excepción a este patrón con
mayor Km TS entre las cepas de Neurospora y la hojarasca de Alaska en
comparación con los suelos de Alaska y varios
otros sitios (German et al. , 2012b; Stone et al. , 2012).
Km TS puede ser menor que Vmax TS, o incluso negativo, debido a la
termodinámica
procesos que controlan la unión enzima-sustrato (Fig. 1). Nuestros datos indican
que las enzimas como NAG
y PPO, con Km TS positivo fuerte, tienen valores negativos de  H ES . Estas
enzimas también tienen relativamente
valores de Km bajos, consistentes con un rol dominante para el término de
entalpia en eq. 6. Basado en estos
resultados, las sensibilidades de temperatura de Vmax y Km pueden tener
consecuencias para el ciclo de nitrógeno
bajo calentamiento Para NAG, que está involucrado en la degradación de quitina,
Km TS fue más positivo que
Vmax TS, tal que NAG fue la única enzima con un Vmax / Km TS
sistemáticamente negativo. A diferencia de,
Vmax / Km TS para LAP fue muy alto debido a un Km TS negativo. Porque
LAP está involucrado en la proteína
degradación, estos resultados implican que el aumento de las temperaturas podría
favorecer un mayor ciclo de nitrógeno
de fuentes de proteínas en relación con los peptidoglucanos, particularmente si
las concentraciones de sustrato para estos
las enzimas están cerca de Km.

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Respuesta al ambiente térmico
La teoría fisiológica predice que los organismos de ambientes fríos deben
minimizar la enzima Ea a
maximizar las tasas catalíticas; por el contrario, las enzimas adaptadas al calor
deberían tener un Ea mayor (Georlette et al. ,
2004; Somero, 2004; Siddiqui y Cavicchioli, 2006). Basado en la relación de
Arrhenius (ecuación 4),
las enzimas adaptadas al calor deberían, por lo tanto, tener sensibilidades a
temperaturas más altas. Múltiples estudios
sugieren que las propiedades de las enzimas del suelo responden al ambiente
térmico (Fenner et al. , 2005; Stone et al.
Alabama. , 2012), pero a diferencia de la teoría fisiológica, algunos estudios han
encontrado una mayor Vmax TS en
enzimas de ambientes más fríos . Por ejemplo, en algunos suelos de tundra y
bosques, Vmax TS aumentó
durante las estaciones frías (Wallenstein et al. , 2009; Brzostek & Finzi, 2011),
aunque este patrón se revirtió
para la actividad proteolítica en un bosque de arce azucarero (Brzostek y Finzi,
2012). A través de un gradiente de elevación
en los Andes, Vmax TS fue mayor a elevaciones más altas y más frías para
algunas enzimas extracelulares
(Nottingham et al. , 2016).
Nuestro estudio presta apoyo para la teoría fisiológica en condiciones
controladas, con enzimas
desde el experimento de calentamiento, pero no a través del gradiente de MAT
donde observamos una mayor Vmax para
algunas enzimas Neurospora de sitios más cálidos (Fig. 4A). Sospechamos que
factores aparte de los térmicos
el medio ambiente puede modular los parámetros enzimáticos de
las cepas de Neurospora . Los ecosistemas hosting
estas cepas difieren no solo en MAT, sino también en precipitación, tipo de
vegetación, comunidad biótica
composición y características edáficas del suelo. Todos estos factores pueden
seleccionarse en el complemento de
genes de enzimas extracelulares presentes en los genomas de hongos, así como
las propiedades cinéticas de la
enzimas expresadas (Riley et al. , 2014). Como en estudios previos (German et
al. , 2012b), tales
las diferencias pueden haber oscurecido la influencia de la temperatura en las
propiedades bioquímicas de
enzimas individuales o clases de enzimas.
En el experimento de calentamiento con la arena de Alaska, muchas de estas
características fueron mejores
controlado porque usamos un diseño de muestreo emparejado. Este diseño puede
haber otorgado el poder de
detectar cambios en la enzima Vmax consistente con la teoría fisiológica e
impulsado por el nivel de la comunidad

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procesos. Un estudio previo mostró que nuestro tratamiento de calentamiento
altera la comunidad de hongos
composición y la capacidad genética para degradar los compuestos de tipo
lignina, lo que es consistente con
cambios en el funcionamiento de las enzimas del suelo (McGuire et al. ,
2010). También es posible que una mayor temporada tardía
el secado en el tratamiento de calentamiento afectó los resultados de la enzima
Vmax (Allison y Treseder, 2008), pero
otros estudios sugieren que el secado puede aumentar la Vmax medida en
contraste con el patrón que
observado (Alster et al. , 2013).
Las tendencias en Vmax TS difirieron en nuestros dos sistemas de
estudio. Nuevamente, bajo el mejor control
condiciones del experimento de calentamiento, encontramos algún apoyo para la
predicción fisiológica que
los ambientes más cálidos permiten un Ea relativamente más alto y, por lo tanto,
una mayor sensibilidad a la temperatura.
Sin embargo, en nuestro estudio Neurospora , no hubo relaciones entre Vmax TS
y cepa origen MAT.
Estos resultados se alinean con las observaciones de Elias et al. (2014), que no
encontraron diferencias en Q 10 entre
enzimas de psicófilos versus termófilos. Del mismo modo, no hay relación entre
MAT y Vmax
TS se encontró en un estudio latitudinal cruzado previo con cinco enzimas
(German et al. , 2012b). Como un
en conjunto, estos hallazgos desafían la teoría fisiológica clásica y sugieren una
necesidad de desarrollar aún más
MMRT (Schipper et al. , 2014) o teoría sobre la rigidez enzimática (Elias et al. ,
2014) para abordar la enzima
adaptación térmica a escala global.
Con base en la teoría bioquímica y fisiológica, predijimos que Km y Km TS
deberían ser
más bajo en ambientes más cálidos. Encontramos poco apoyo para esta teoría,
tanto Km como Km TS variaban
inconsistentemente con el ambiente térmico en los estudios de Neurospora y
Alaska (Fig. 4B, 5B,
6B). Aunque el Km TS de la  glucosidasa del suelo se encontró previamente
que disminuía al aumentar el MAT, no
se observó relación con otras cuatro enzimas (German et al. , 2012b). Tomados
en conjunto, estos
los resultados sugieren que puede haber límites bioquímicos para la adaptación
térmica de Km, o que
la adaptación es difícil de observar en mezclas de enzimas influenciadas por
factores ecológicos de confusión
factores.

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Las predicciones de las retroalimentaciones carbono-clima requieren datos sobre
los cambios de la tasa enzimática bajo un
clima más cálido (Wieder et al. , 2013). En general, los resultados de nuestro
estudio de calentamiento de Alaska sugieren una
retroalimentación negativa, ya que las comunidades de hojarasca mostraron una
menor enzima Vmax bajo tratamiento de calentamiento
(Fig. 7). Este resultado es consistente con la teoría fisiológica y con la reducción
de la respiración del suelo y
aumento de las reservas de carbono del suelo superficial observadas en el
tratamiento de calentamiento (Allison y Treseder, 2008;
Crowther et al. , 2016). Nuestros resultados también sugieren que las respuestas
de adaptación térmica pueden ser más débiles o
más difícil de observar en amplios gradientes climáticos. A pesar de que
las cepas de Neurospora
evolucionado bajo MAT muy diferente, hubo poca evidencia de adaptación
térmica de Neurospora
enzimas. La temperatura puede ser una fuerza selectiva débil sobre las
propiedades de las enzimas en comparación con otras
factores edáficos y ecológicos que varían a través de amplios gradientes
climáticos.
Con respecto a la sensibilidad a la temperatura, nuestro estudio identifica la
necesidad de un nuevo desarrollo teórico.
La teoría fisiológica existente no puede explicar la variación observada en la
temperatura de Vmax o Km
sensibilidades en ambientes térmicos, especialmente en
nuestro estudio Neurospora . En general, el
la respuesta fue más débil de lo esperado, lo que sugiere que la mayoría de las
enzimas mantendrán su temperatura
sensibilidades bajo un clima más cálido. Incluso si los mecanismos y la teoría
subyacente no están claros en
En este punto, este resultado empírico es importante para la parametrización de
modelos basados en rasgos que requieren
Vmax, Km, y datos de sensibilidad a la temperatura en enzimas microbianas
(Allison, 2012; Kaiser et al. , 2014).
Por ejemplo, nuestros hallazgos sugieren que el ciclo relativo de diferentes
formas de nutrientes, particularmente
proteínas frente a peptidoglicanos, pueden cambiar debido a las respuestas
cinéticas diferenciales a la temperatura
a través de las clases de enzimas En conjunto, nuestro estudio proporciona datos
de enzimas y conocimientos teóricos que
debería ayudar a mejorar las predicciones de las retroalimentaciones
biogeoquímicas del suelo bajo el cambio climático (Wang et al.
Alabama., 2013; Wieder et al. , 2013, 2014).

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Expresiones de gratitud
Agradecemos a Melissa Curran, Dorothy Tan, Richard Nguyen, Andrew Kavli,
Melinda Lee y Delaney
Islip para asistencia con ensayos enzimáticos. Cinco revisores anónimos
proporcionaron comentarios útiles que
mejorado el manuscrito Esta investigación fue financiada por el Programa de
Estudios de Ecosistemas NSF de EE. UU. (DEB-
1256896 y DEB-1457160).
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Tabla 1. Sitios de aislamiento de la cepa Neurospora y características del
sitio. Temperatura media anual (MAT)
y la precipitación media anual (MAP) durante el período 1981-2010 se
obtuvieron de PRISM
(http://www.prism.oregonstate.edu/) para sitios dentro de los Estados Unidos
continentales. MAT y MAP
para otros sitios se obtuvieron con Climate Reanalyzer (http://cci-reanalyzer.org),
Cambio Climático
Institute, Universidad de Maine, EE. UU., Utilizando la temperatura del aire de la
Universidad de Delaware y
Conjunto de datos de precipitación
CARNÉ DE IDENTIDAD
Genotipo
Sitio
Latitud Longitud MAT MAP
FGSC
8565
Neurospora discreta de
EE.UU
Wells, Nevada
41.11
-114.96 7.1 259
FGSC
8567
Neurospora discreta de
EE.UU
Cobalt, Idaho
45.00
-114.30 4.1 470
FGSC
8572
Neurospora discreta de
EE.UU
Perma-2, Montana
47.35
-114.59 7.1 495
FGSC
8991
Neurospora discreta de
Estados Unidos W963
Weaverville,
California
40.73
-122.94 12.4 950
FGSC
8994
Neurospora discreta de
Estados Unidos W1070
Chelan Lake, WA
47.86
-120.12 9.9 276
FGSC
9957
Neurospora discreta de
Tailandia P3004
Pakchong-2,
Tailandia
14.70
101,42 25,1 1171
FGSC
9967
Neurospora discreta de
Costa de Marfil P3650
Fougbesso, Ivory
Costa
7.59
-5.56 26.4 1061
FGSC
9979
Neurospora discreta de
EE.UU. W854
Tok, Alaska
63.33
-142,99 -4,4 256
FGSC
9983
Neurospora discreta de
EE.UU. W745
Pecos, Nuevo México
35.57
-105.66 9.4 439
FGSC
9992
Neurospora discreta de
Suiza W-1303
Leuk, Suiza
46.32
7,63 0,4 798
MM10
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Fairbanks, AK
64.83
-147.72 -1.9 276
MM2
Neurospora discreta de
Fairbanks, AK
64.83
-147.72 -1.9 276

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Estados Unidos
MM20
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Fairbanks, AK
64.83
-147.72 -1.9 276
MM23
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Fairbanks, AK
64.83
-147.72 -1.9 276
MM26
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Fairbanks, AK
64.83
-147.72 -1.9 276
MM30
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Fairbanks, AK
64.83
-147.72 -1.9 276
MM31
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Fairbanks, AK
64.83
-147.72 -1.9 276
MM6
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Fairbanks, AK
64.83
-147.72 -1.9 276
W1099
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Morgan Hill, CA
37.11
-121.65 15.7 560
W1101
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Morgan Hill, CA
37.11
-121.65 15.7 560
W1103
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Morgan Hill, CA
37.11
-121.65 15.7 560
W1111
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Morgan Hill, CA
37.11
-121.65 15.7 560
W1289
Neurospora discreta de
España
Macanet de la
Selva, España
41.78
2,73 13,7 701
W792
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Bernalillo, NM
35.3
-106.55 13.0 268
W793
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Bernalillo, NM
35.3
-106.55 13.0 268
W794
Neurospora discreta de
Bernalillo, NM
35.3
-106.55 13.0 268

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Estados Unidos
W795
Neurospora discreta de
Estados Unidos
Bernalillo, NM
35.3
-106.55 13.0 268
Tabla 2. Enzimas y sustratos analizados en el estudio actual.
Enzima y abreviatura
Objetivo de sustrato
Sustrato sintético y máximo
concentración (  M)
α- glucosidasa
Degradación del almidón AG
productos
4-MUB- α -D-glucopiranósido
1000
Fosfatasa ácida
AP fósforo orgánico
Fosfato 4-MUB
4000
β- glucosidasa
Degradación de la celulosa BG
productos
4-MUB- β -D-glucopiranósido
2000
β- xilosidasa
BX Hemicelulosa
productos de degradación
4-MUB- β -D-xylopyranoside
2000
Celobiohidrolasa
Degradación de celulosa CBH
productos
4-MUB- β -D-celobiosido
1000
Leucina
aminopeptidasa
Polipéptidos LAP
L-leucine-7-amido-4-
clorhidrato de metilcoumarina
1000
N- acetil- β- D-
glucosaminidasa
Degradación NAG quitina
productos
4-MUB- N -acetil- β -D-
glucosaminida
2000
Total oxidasa
OX Lignina y compuestos fenólicos
Pyrogallol + H 2 O 2
1000
Polifenol oxidasa
PPO Lignina y compuestos fenólicos
Pyrogallol
1000

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Tabla 3. Parámetros Vmax promedio de tensión cruzada
de Neurospora (calculados a 16ºC) y temperatura
sensibilidades (TS). SEM = error estándar de la media.
Log (Vmax) SEM Vmax (nmol h -1 ml -1 ) Vmax TS (  C -1 ) SEM
Q 10
AG
0.90 0.26
2.47
0.0576 0.0029 1.78
AP
1.18 0.19
3.25
0.0759 0.0044 2.14
BG
-0.47 0.25
0.62
0.0468 0.0045 1.60
BX
-0.74 0.30
0.48
0.0771 0.0090 2.16
CBH
-0.56 0.27
0.57
0.0621 0.0078 1.86
REGAZO
-1.00 0.21
0.37
0.0521 0.0122 1.68
ROCÍN
4.95 0.17
140.75
0.0813 0.0044 2.25
BUEY
-1.81 0.50
0.16
0.0502 0.0138 1.65
PPO
-2.18 0.46
0.11
0.0391 0.0078 1.48

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Tabla 4. Parámetros Km medios de tensión cruzada de Neurospora (calculados a
16ºC) y temperatura
sensibilidades (TS). SEM = error estándar de la media.
Log (Km) SEM Km (  M) Km TS (  C -1 ) SEM
Q 10
AG
4.35 0.090
77.4
0.0185 0.0023 1.20
AP
6,74 0,140
847.8
0.0156 0.0038 1.17
BG
5,21 0,266
184.0
-0.0076 0.0081 0.93
BX
6,61 0,282
746.0
0.0272 0.0127 1.31
CBH
5,57 0,189
261.4
-0.0061 0.0117 0.94
REGAZO
5.58 0.188
264.5
-0.0338 0.0068 0.71
ROCÍN
4,79 0,209
119.8
0.1031 0.0050 2.80
BUEY
4.54 0.408
93.5
0.0274 0.0206 1.31
PPO
4.01 0.354
55.1
0.0393 0.0123 1.48

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Tabla 5. Parámetros Vmax / Km promedio de cepa cruzada
de Neurospora (calculados a 16ºC) y
sensibilidad a la temperatura (TS). SEM = error estándar de la media.
Log (Vmax / Km) SEM Vmax / Km Vmax / Km TS (  C -1 ) SEM
Q 10
AG
-3.44 0.30 0.03205
0.0385 0.0029 1.47
AP
-5.54 0.21 0.00392
0.0582 0.0024 1.79
BG
-5.67 0.34 0.00343
0.0531 0.0072 1.70
BX
-7.18 0.18 0.00076
0.0447 0.0061 1.56
CBH
-5.91 0.31 0.00271
0.0743 0.0082 2.10
REGAZO
-6.58 0.27 0.00139
0.0856 0.0091 2.35
ROCÍN
0.16 0.24 1.17491
-0.0219 0.0017 0.80
BUEY
-6.32 0.21 0.00179
0.0247 0.0118 1.28
PPO
-5.92 0.14 0.00268
0.0012 0.0062 1.01

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Tabla 6. Valores p de análisis de varianza del modelo mixto en log (Vmax), log
(Km) y Vmax y Km
sensibilidad a la temperatura (TS). Los valores significativos se muestran en
negrita.
Vmax
Km Vmax TS Km TS
Calentamiento AG
<0.001 0.713
0.047 0.045
Fecha
0.362 0.093
0.042
0.146
Cálido  Fecha 0.590 0.663
0.002
0.117
Calentamiento AP
<0.001
0.019
0.012 <0.001
Fecha
0.001 0.088
0.063 0.230
Cálido  Fecha <0.001 0.066
0.399 0.034
BG calentamiento
<0.001 <0.001
0.013
0.141
Fecha
<0.001 <0.001
0.002
0.113
Cálido  Fecha <0.001 <0.001
0.226 0.003
BX calentamiento
<0.001 0.646
<0.001
0.687
Fecha
0.007 0.900
0.354 0.362
Cálido  Fecha 0.509 0.083
0.123 0.103
CBH calentamiento
0.061 <0.001
0.177 0.290
Fecha
0.003 <0.001
0.349 0.318
Cálido  Fecha 0.976 0.071
0.443 0.651
Calentamiento LAP
<0.001 0.004
0.006 <0.001
Fecha
0.015 <0.001
0.070 0.029
Cálido  Fecha 0.332 0.385
0.068 0.548

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Calentamiento NAG
<0.001 <0.001
<0.001
0.609
Fecha
0,406 <0,001 <0,001 0,026
Cálido  Fecha 0.002 <0.001
0.126 0.006
OX calentamiento
<0.001 <0.001
0.379 0.006
Fecha
0.067 0.005
0.004 <0.001
Cálido  Fecha <0.001 0.079
0.076 0.549
Calentamiento PPO
<0.001 <0.001
0.276 0.566
Fecha
0.003 0.331
0,841 0,313
Cálido  Fecha 0.011 0.112
0.975 0.734
Pie de figura
Fig. 1. Diagrama conceptual de los cambios termodinámicos durante una
reacción catalizada por enzimas. Enzima
( E ) se une al sustrato ( S ) para formar un complejo ( ES ) con energía de
enlace  G ES . Formación de un activado
El complejo ( ES ‡ ) requiere un cambio en la energía libre  G ‡ antes de
la formación del producto ( P ). Más negativo
valores de  G ES resultado en sustrato de unión más fuerte (bajar Km) pero
también pueden aumentar  G ‡ , de ese modo
reduciendo Vmax. Más  G ES negativo puede ocurrir a través de una mayor
liberación de entalpía (más negativo  H ES )
o mayor aumento de entropía (  S ES más positivo ) tras la unión del sustrato.
Fig. 2. Mapas de calor de (a) registro (Vmax), (b) log (Km) y (c) log (Vmax /
Km) para cepas individuales de
Neurospora calculada a 16ºC. Cajas grises faltan datos.

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Fig. 3. Mapas de calor de sensibilidades de temperatura para (a) Vmax (b) Km, y
(c) Vmax / Km para individuo
cepas de Neurospora . Los valores rojos son positivos, los valores azules son
negativos y los valores grises faltan.
Fig. 4. (a) log (Vmax) y (b) log (Km) frente a la temperatura media anual de la
deformación (MAT) para cada
enzima extracelular. Se muestran regresiones lineales simples significativas.
Fig. 5. (a) log (Vmax) y (b) log (Km) a lo largo del tiempo para enzimas
extracelulares de hojarasca en el boreal de Alaska
experimento de calentamiento del suelo. Los puntos representan los
medios  error estándar de la media.
Fig. 6. Sensibilidad a la temperatura de (a) Vmax y (b) Km a lo largo del tiempo
para enzimas extracelulares de hojarasca en
el experimento del calentamiento del suelo boreal de Alaska. Las líneas
discontinuas representan la sensibilidad a la temperatura cero.
Los puntos representan los medios  error estándar de la media.
Fig. 7. Cambios hipotéticos en el registro enzimático (Km), log (Vmax) y energía
de activación (Ea) bajo
adaptación térmica a ambientes fríos versus cálidos. Los rangos de temperatura
indican laboratorio
condiciones de ensayo. El acuerdo empírico con las hipótesis está indicado
para Neurospora versus
estudios de hojarasca en las dos últimas columna