UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL MAULE

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y FORESTALES

ESCUELA DE INGENIERÍA FORESTAL

Establecimiento al cultivo in vitro de Porlieria chilensis (Johnst.)

a partir de embriones maduros

Profesor Guía:
Karla Quiroz Bravo

Informe presentado como parte

de los requisitos para optar al
Título de Ingeniero forestal

FABIÁN ALEXANDER ROJAS NEIRA

TALCA – CHILE
AÑO 2016
 A Dios
A mis padres Alicia y Juan
ÍNDICE GENERAL

AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................... i
ÍNDICE GENERAL .............................................................................................................. ii
ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................................... v
ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................................... vii
RESUMEN GENERAL ..................................................................................................... viii
SUMMARY ........................................................................................................................ ix
1. INTRODUCCIÓN............................................................................................................. 1

2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ............................................................................................. 3

2.1. Objetivo general .............................................................................................................. 3

2.2. Objetivos específicos ...................................................................................................... 3

3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 4

3.1. Antecedentes generales de Porlieria chilensis (Jhonst) ............................................... 4
3.1.1. Identificación de la especie ......................................................................................... 4
3.1.2. Descripción de la especie ............................................................................................ 4
3.1.3. Distribución geográfica............................................................................................... 5
3.1.4. Tipo forestal y asociaciones vegetales ......................................................................... 5
3.1.5. Antecedentes del desarrollo de la especie .................................................................... 6
3.2. Escarificación ............................................................................................................. 7
3.2.1. Escarificación química ................................................................................................ 7
3.3. Semilla ...................................................................................................................... 8
3.4. Germinación ............................................................................................................... 8
3.5. Cultivo in vitro ........................................................................................................... 9
3.6. Cultivo o rescate de embriones ................................................................................. 11
3.7. Propagación vegetativa ............................................................................................. 12
3.8. Desinfección y manipulación .................................................................................... 12
3.9. Desinfección del material vegetal ............................................................................. 13
3.10. Medios de cultivos .................................................................................................... 14
3.11. Reguladores de crecimiento ...................................................................................... 14

i
3.11.1. Auxinas................................................................................................................ 15
3.11.2. Citoquininas ......................................................................................................... 15
3.11.3. Giberalinas ........................................................................................................... 16
3.12. Etapas en el cultivo in vitro .................................................................................. 16
3.12.1. Etapa 0, preparación del material ......................................................................... 16
3.12.2. Etapa I, introducción y establecimiento ................................................................ 17
3.12.3. Etapa II, propagación ........................................................................................... 18
3.12.4. Etapa III, enraizamiento y preparación del explante para las condiciones ex vitro . 18
3.12.5. Etapa IV, adaptación o aclimatación de plantas .................................................... 18

4. MATERIAL Y MÉTODO ............................................................................................... 19

4.1. Lugar de trabajo .......................................................................................................... 19
4.2. Materiales ................................................................................................................... 19
4.2.1. Materiales y equipos de laboratorio .......................................................................... 19
4.2.2. Material vegetal ........................................................................................................ 19
4.2.3. Desinfección del material vegetal ............................................................................. 20
4.2.4. Condiciones generales de los ensayos ....................................................................... 20
4.3. Efecto de diferentes tiempos de inmersión en acido sulfúrico 1M sobre el
establecimiento in vitro de Porlieria chilensis........................................................... 20
4.3.1. Establecimiento del material vegetal ......................................................................... 21
4.3.2. Diseño experimental y análisis estadístico ................................................................ 22
4.4. Efectos de diferentes concentraciones de Zeatina sobre el establecimiento in vitro de
Porlieria chilensis .................................................................................................... 22
4.4.1. Establecimiento del material vegetal ......................................................................... 23

4.4.2. Diseño experimental y análisis estadístico ................................................................ 23

4.5. Efectos de diferentes reguladores de crecimiento sobre la multiplicación in vitro de

Porlieria Chilensis.................................................................................................... 24
4.5.1. Manejo del material vegetal ...................................................................................... 24
4.5.2. Diseño experimental y análisis estadístico ................................................................ 25

5. RESULTADOS Y DISCUSIONES .......................................................................... 26

5.1. Evaluación de los efectos de diferentes tiempos de inmersión en acido sulfúrico
1M sobre el establecimiento in vitro de Guayacán .................................................... 26
5.1.1. Efecto del acido sulfúrico 1M sobre la germinación en el establecimiento in vitro .... 26

ii
5.1.2. Contaminación en el establecimiento in vitro de Porlieria chilensis .......................... 28

5.2. Evaluación de los efectos de diferentes concentraciones de Zeatina sobre el

establecimiento in vitro de Porlieria chilensis, familia Tipay 21, .............................. 29
5.2.1. Efectos de las distintas concentraciones de Zeatina sobre la germinación en el
establecimiento in vitro de Tipay 21 ......................................................................... 29
5.2.2. Contaminación en el establecimiento in vitro de Porlieria chilensis, familia Tipay
21... .......................................................................................................................... 31

5.3. Evaluación del efecto de diferentes citoquininas (Zeatina y BAP) sobre la fase de
multiplicación in vitro de Porlieria Chilensis ........................................................... 32

6. CONCLUSIÓN ............................................................................................................. 37
7. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 38

iii
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Efecto de la escarificación con acido sulfúrico 1M sobre el porcentaje de

germinación en el establecimiento in vitro de cuatro familias de Porlieria chilensis, en medio
de cultivo WPM suplementado con 1,0 mgL-1 de BAP. Análisis con Kruskal Wallis. Medias
con una letra común no son significativamente diferentes (p < 0,05)...................................26
.
Figura 2. Germinación de semillas y desarrollo de plántulas in vitro de Porlieria chilensis.
Establecidas en medio de cultivo WPM suplementado con 1,0 mgL-1 de BAP. Evaluadas
después de 14 días de establecidas. (A) Emisión de radícula; (B) Desarrollo radicular; (C)
Emisión de Cotiledones; (D) y (E) Desarrollo de radícula y cotiledones de la plántula y (F)
Plántula expandida........................................................................ .................................................27

Figura 3. Presencia de contaminación en el establecimiento in vitro de cuatro familias de

Porlieria chilensis, en medio de cultivo WPM suplementado con 1,0 mgL-1 de BAP. Análisis
con Kruskal Wallis. Medias con una letra común no son significativamente diferentes
(p > 0,05).............................................................................................................................................28

Figura 4. Presencia de contaminación en establecimiento in vitro de Porlieria chilensis.

Evaluados a 14 días después de establecidas en medio de cultivo WPM suplementado con 1,0
mgL-1 de BAP (A), (B) y (C) Contaminación con hongo; (D) Contaminación con
bacteria................................................................................................................................................29

Figura 5. Efecto de diferentes concentraciones de Zeatina sobre el porcentaje de germinación

en Porlieria chilensis, familia Tipay 21, con medio de cultivo WPM en establecimiento in
vitro. Análisis con Kruskal Wallis. Medias con una letra común no son significativamente
diferentes (p < 0,05)........................................................................................................................... 30

Figura 6. Germinación de semillas y desarrollo de plántulas in vitro de Guayacán, familia

Tipay 21. Establecidas bajo medio de cultivo WPM suplementado en diferentes
concentraciones de Zeatina. Evaluadas después de 14 días de establecidas. (A)
emisión de radícula; (B) desarrollo radicular; (C) emisión de cotiledones;
(D) y (E) desarrollo de radícula y cotiledones de la plántula;(F) plántula
expandida............................................................................................................................................30

Figura 7. Presencia de contaminación en el establecimiento in vitro de la familia Tipay 21, en

medio de cultivo WPM suplementado con diferentes concentraciones de Zeatina. Análisis con
Kruskal Wallis. Medias con una letra común no son significativamente diferentes
(p > 0,05).............................................................................................................................................31

iv
Figura 8. Presencia de contaminación en establecimiento in vitro de la familia Tipay 21.
Evaluados a 14 días después de establecidas en medio de cultivo WPM suplementado con
distintas concentraciones de Zeatina. (A) y (B) Contaminación con bacteria; (C)
Contaminación con hongo................................................................................................................. 32

Figura 9. Efecto de diferentes concentraciones de Zeatina y BAP en medio de cultivo WPM

sobre el porcentaje de supervivencia (A), y la presencia de contaminación (B), en la
multiplicación in vitro de Porlieria chilensis. Análisis con Kruskal Wallis. Medias con una
letra común no son significativamente diferente (p > 0,05)......................................................... 33

Figura 10. Presencia de callo en los diferentes tratamientos de multiplicación in vitro de

Porlieria chilensis, en medio de cultivo WPM suplementados con Zeatina y BAP en
diferentes concentraciones. Análisis con Kruskal Wallis. Medias con una letra común no son
significativamente diferentes (p < 0,05).......................................................................................... 34

Figura 11. Efecto de diferentes concentraciones de Zeatina y BAP en medio de cultivo

WPM, sobre el porcentaje de elongación de las yema (A), altura de las plantas (B), en la
multiplicación in vitro de Porlieria chilensis. Análisis con Kruskal Wallis. Medias con una
letra común no son significativamente diferentes (p < 0,05)........................................................35

Figura 12. Multiplicación de los segmentos nodales de Porlieria chilensis establecidas en

medio de cultivo WPM suplementados con diferentes concentraciones de citoquininas,
evaluadas después de seis semanas de establecido el ensayo. (A) SRC; (B) 0,75 mgL-1 Zea;
(C) 1,25 mgL-1 Zea; (D) 1,75 mgL-1 Zea; (E) 1,5 mgL-1 BAP; (F) 2,0 mgL-1 BAP................37

v
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Escarificación con acido sulfúrico 1M a diferentes tiempos de inmersión.................21

Tabla 2. Diferentes concentraciones de Zeatina adicionada al medio de cultivo WPM

utilizadas para el establecimiento in vitro de la familia Tipay 21................................................22

Tabla 3. Diferentes concentraciones de citoquininas (Zeatina y BAP) adicionadas al medio de

cultivo WPM para el ensayo de multiplicación en Porlieria chilensis.......................................24

vi
 RESUMEN GENERAL

Porlieria chilensis (Johnst). Es un arbusto o árbol pequeño endémico de Chile

perteneciente a la familia Zygophyllaceae, se distribuye entre la IV y VI región del país, está
muy adaptado a sitios secos y áridos, creciendo en los faldeos cordilleranos y en las
pendientes rocosas de los cerros. Está clasificada en la categoría de especie Vulnerable. El
objetivo de este trabajo fue establecer un protocolo eficiente para su introducción,
establecimiento y propagación al cultivo in vitro, a partir de embriones maduros provenientes
de dos localidades (Tipay y Monte Aranda), para lo cual se establecieron tres ensayos. En el
ensayo de introducción se evaluaron cuatro tratamientos de escarificación, bajo cultivo WPM
suplementado con 1,0 mgL-1 de BAP, logrando establecer que el tratamiento de inmersión en
acido sulfúrico 1 Molar durante 6 minutos fue el que presento la mejor respuesta con un 95%
de germinación y porcentajes de contaminación relativamente bajos. Para el ensayo de
establecimiento se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de Zeatina, sobre el
establecimiento in vitro de la familia Tipay 21, los resultados mostraron que el tratamiento
bajo cultivo WPM suplementado con 0,3 mgL-1 Zeatina fue el que logro la mejor respuesta
con un 88% de germinación y un porcentaje de contaminación muy bajo. Finalmente el
ensayo de multiplicación se evalúo el efecto de dos citoquininas (Zeatina y BAP) en distintas
concentraciones, se obtuvo como resultado que las variables Contaminación y supervivencia
no presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, sin embargo, las variables
Elongación de yema, Presencia de callo y altura de brotes, los tratamientos en que el cultivo
fue suplementado con Zeatina lograron las mejores respuestas especialmente con el
tratamiento bajo cultivo WPM suplementado con 1,25 mgL-1 Zeatina.

vii
 SUMMARY

Porlieria chilensis (Johnst). It is an endemic shrub or small tree of Chile belonging to

the Zygophyllaceae family, it is distributed between IV and VI region of country, is much
adapted to dry and arid places, growing in rocky mountain slope. It is classified under the
category of Vulnerable species. The aim of this paper was to establish an efficient protocol for
its introduction, establishment and spread to the in vitro culture from mature embryos
originated from two localities (Tipay and Monte Aranda), for which three tests were
established. In the introduction test, four scarification treatments were evaluated, under WPM
culture supplemented with 1.0 mgL-1 of BAP, managing to establish that the treatment of
immersion in sulfuric acid 1Molar during 6 minutes presents the best answer with 95 % of
germination and relatively low percentages of contamination. In the establishment test there
was evaluated the effect of different concentrations of Zeatina, on the establishment in vitro of
the Tipay family 21, the results showed that the treatment under WPM culture supplemented

with 0.3 mgL-1 zeatina was the one that achieved the best results with 88 % of
germination and a very low percentage of contamination. Finally the multiplication test
evaluate the effect of two citoquininas (Zeatina and BAP) in different concentrations, it was
obtained like result that the variables Contamination and survival did not present significant
differences between the treatments, nevertheless, the variables bud Elongation, callus
Presence and shoot height, the treatments in which the cultivation was supplemented with
zeatina achieved the best answers especially with the treatment under WPM culture
supplemented with 1.25 mgL-1 Zeatina.

viii
 1. INTRODUCCIÓN

Porlieria chilensis (Johnst). Es una especie perteneciente a la familia Zygophyllaceae,

que tiene 26 géneros y alrededor de 250 especies entre árboles y arbustos distribuidos en las
regiones calurosas y secas de ambos hemisferios. Esta especie es endémica de Chile, crece
desde la Provincia del Limarí (IV Región), hasta la Provincia de Colchagua (VI Región),
principalmente en faldeos cordilleranos y en pendientes rocosas de los cerros (Donoso, 1978;
Rodríguez et al., 1983). Se asocia con especies como litre (Lithraea caustica), y Quillay
(Quillaja saponaria), situándose dentro de la Región del Matorral y Bosque Esclerófilo
(Gajardo, 1992).

Desde un punto de vista ecológico, Porlieria chilensis es un elemento clave de

ecosistemas áridos y semiáridos ya que realiza levantamiento hidráulico (Muñoz et al., 2008).
Este proceso se refiere al movimiento pasivo del agua a través de las raíces, desde capas
profundas de suelo húmedo hacia capas superficiales de suelo seco (Horton y Hart, 1998).
Adicionalmente, el microclima debajo del dosel del Guayacán es más húmedo y menos
caluroso que en áreas abiertas (Tracól et al., 2011). En conjunto, estas observaciones sugieren
que P. chilensis puede amortiguar la variabilidad climática, formar islas de fertilidad que
promueven el reclutamiento de otras especies, y por tanto actuar como un ingeniero
ecosistémico en ambientes xerofíticos.

En el pasado se la utilizó para una gran variedad de aplicaciones como herramientas de

labranza, botones y piezas de máquinas por su gran resistencia y dureza, en trabajos de
tornería por su veteado decorativo; también se ha utilizado como planta medicinal, tintórea y
para la producción de leña y carbón. (Navas, 1976; Donoso, 1978). En la actualidad su
principal uso es la artesanía, especialmente en la IV Región de Coquimbo. También se sugiere
usarla como especie ornamental y apícola (Ríos, 2004).

Porlieria chilensis se encuentra actualmente con problemas de conservación, debido a

su tala indiscriminada y también afectada por un sobre pastoreo del ganado caprino (Arancio
et al., 2001) provocando una disminución del número de individuos en sus poblaciones, por
esto ha sido clasificada en la categoría de especie Vulnerable (Squeo et al., 2001).

1
 Las características de la madera del guayacán y los riesgos de vulnerabilidad que esta
especie presenta han despertado un gran interés en su conservación y uso sustentable, por lo
tanto es necesario conocer más de sus características. Para ello este trabajo de investigación
pretende establecer un procedimiento in vitro para germinar y multiplicar semillas de
Guayacán mediante técnicas de rescate de embriones maduros, con la intención de contribuir
al aumento del número de individuos de la especie. Se pretende optimizar las estrategias de
desinfección, las condiciones ambientales y nutricionales de los embriones para establecer el
cultivo en el ambiente in vitro y obtener respuestas morfológicas eficientes destinadas a la
rehabilitación de los bosques degradados.

Desde el punto de vista académico esta investigación permitirá generar información

útil para la comunidad científica, ingenieros, técnicos forestales y estudiantes vinculados con
el área de la conservación de especies endémicas vulnerables. En general es insuficiente el
trabajo que se realiza con especies leñosas endémicas, por lo que el trabajo será un estudio
interesante que pudiera ser aplicado como modelo a otras especies similares.

2
 CONCLUSIÓN

En el ensayo de introducción de las cuatro familias de Porlieria chilensis el mejor

tratamiento pregerminativo fue el de inmersión de las semillas durante 6 minutos en acido
sulfúrico 1 Molar alcanzando un porcentaje del 95% en la familia Tipay 21 la cual a su vez
tuvo una muy buena respuesta de germinación en todos los tratamientos evaluados. Por otra
parte en la utilización del protocolo de desinfección utilizando NaCl al 3% durante 30 minuto
unido con la escarificación con acido sulfúrico 1 Molar durante 6 minutos se observo un
efecto sinérgico entre estos, ya que se obtuvo una baja tasa de contaminación en todos los
tratamientos.

En cuanto al establecimiento de Porlieria chilensis, familia Tipay 21 evaluada

mediante el tratamiento pregerminativo de 6 minutos en acido sulfúrico 1 Molar, con medio
de cultivo WPM suplementado con diferentes concentraciones de Zeatina, el mejor
tratamiento fue el suplementado con 0,3 mgL-1 Zeatina alcanzando un 88% de germinación
en comparación del tratamiento sin regulador de crecimiento que logro un 41%. Al igual que
el ensayo anterior al combinar el protocolo de desinfección mas la escarificación con acido
sulfúrico 1 Molar durante 6 minutos se alcanzaron niveles muy bajos de contaminación en
todos los tratamientos.

Finalmente en el ensayo de multiplicación las variables supervivencia y

contaminación no presentaron diferencias significativas entre los tratamientos suplementados
tanto con Zeatina como BAP superando el 75% de explantes vivos y porcentajes de
contaminación muy bajos, en cuanto a la presencia de callos los tratamientos suplementados
con BAP fueron los que mayor aparición tuvieron superando el 60%. El mejor tratamiento
para la elongación de las yemas y el crecimiento de los explantes fue el medio de cultivo
WPM suplementado con 1,25 mgL-1 Zeatina que obtuvo un 96% de elongación y un
promedio de altura de 14 cm.

3
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