CLASE 1: Técnicas de DNA recombinante

Margarita Carú

La mayoría de los procesos involucrados en las técnicas de DNA recombinantes son

inducidos, no están necesariamente ocurriendo de forma natural en los organismos.
En que se basan, de manera muy sencilla, en que uno pueda manipular in vitro distintas
combinaciones génicas y poder incorporar el fragmento de DNA in vivo a alguna célula.
Las técnicas de DNA recombinantes son herramientas y procedimientos que permiten
aislar, identificar, recombinar y amplificar genes, para luego obtener la expresión de
estos genes en huésped homólogos o heterológos.

Clonación molecular: etapas:

• Purificación y obtención de DNA  el DNA no puede estar muy fragmentado

 Tiene que estar libre de proteínas
• Obtención de moléculas de DNA recombinante  cortar específicamente una
secuencia, pegar dos fragmentos de DNA y copiar estos fragmentos (DNA hibrido)
• Introducción del DNA a la célula  la incorporación del hibrido de DNA solo se
podrá realizar en células que estén en estado de competencia
• Selección de clones de interés

Para obtener moléculas de DNA recombinantes se deben seguir los siguientes pasos:
1. Cortar: cortar secuencias específicas de DNA
2. Pegar: unir dos fragmentos de DNA en una molécula
3. Copiar: hacer copias idénticas de un fragmento

Por etapas:

1. CORTAR: el DNA se puede romper en cualquier sitio y para romperlo se puede

hacer por medio de las endonucleasas, que son:
 DNAasas que producen cortes inespecíficos, ya que producen cortes en
cualquier enlace fosfodiester y los fragmentos originados no son
reproducibles posteriormente
 Enzimas de restricción, que generan cortes específicos dentro de una
secuencia de DNA, ya que el corte se realiza cuando hay una secuencia
de reconocimiento para la enzima y produce fragmentos discretos
reproducibles. Por ejemplo: EcoRI tiene un sitio de reconocimiento en
una secuencia palindromica (que presentan un eje de simetría) y genera
cortes en la secuencia formando extremos cohesivos que permiten luego
pegar dos fragmentos de DNA cortados con la misma enzima. El corte
también se produce en el enlace diester.
Enzimas de restricción:
• Endonucleasas sitio-específicas de procariotas
• Función natural: Sistema Restricción-Modificación
El sistema de restricción- modificación se refiera al hecho que están enzimas por el
sistema de restricción pueden cortar el DNA foráneo que entra a la célula, por ejemplo
el de los fagos, pero también seria capaz de cortar su propio DNA por lo que hace uso
del sistema de modificación, en el cual modifica su DNA metilandolo y así no presentar
sitios de reconocimiento para la enzima
• Enzimas de modificación sitio-específicas (Ej., metilasas) ayuda a la protección del
propio DNA
• Enzimas tipoII son útiles en técnicas de DNA recombinante, ya que contienen el
sistema de restricción y modificación por separado y para las técnicas de DNA
recombinantes solo se usa la función de restricción.

Las enzimas de restricción constituyen un mecanismo de autodefensa para la célula, ya

que no pueden cortar su propio DNA, pero si el foráneo ya que la secuencia de DNA no
esta metilada y es blanco para las enzimas de restricción.

Características de los sitios de restricción:

• Generalmente reconocen entre 4-8 bp
• Simetría rotacional (palindromicos)
• Ruptura en ambas hebra produce:
• Terminales romos
(ej: HindII)
• Extremos
cohesivos o
complementarios
(ej: ClaI)

Las enzimas de restricción deben sus nombres a: por

ejemplo para EcoRI

Si deseo tener una mayor frecuencia de corte cual enzima usaría? Escojo HaeIII porque
reconoce solo 4 pb

Para el caso de FnuAI y HindII se puede ver nucleótidos N e Y respectivamente, son

nucleótidos variables, que hacen referencia a N = 2 o 3 nucleótidos mas en ambas
hebras y en el caso de Y= puede ser cualquier nucleótido respetando la simetría
 Proyección del corte:

Como se puede ver Sma I y Xma I reconocen la misma

secuencia pero realizan sus cortes de forma distinta, en el
caso de Sma I deja extremos romos y Xma I extremos
cohesivos. Esto es lo que se llama isoesquizomeros, o sea
que reconocen la misma secuencia pero hacen cortes
distintos.

En el caso de Xma I como se puede ver deja una proyección

de la hebra 5´ y en el caso de Pst I al realizar el corte la
proyección es 3´, ya que esta es la parte de la cadena que
queda “flotando” y sirve al momento de pegar dos hebras de
DNA.

Es muy importante tener en cuenta la proyección de un

corte al momento de pegar dos hebras de DNA, en el caso
de PstI y Nsi I puede verse que reconocen secuencias
distintas, pero que en el centro de esta son iguales. Al
momento de realizarse el corte estas enzimas pasaran a tener proyecciones iguales, los
que hará que tengas extremos compatibles.

proyección de Nsi I

5´-ATGCA- -T- 3´
3´-T- -ACGTC- 5´

2. PEGAR: la endonucleasas (enzimas de restricción) generan extremos que

facilitan el apareamiento molecular, ya que se corta con la misma enzima las dos
hebras a aparear.

En la imagen se puede ver la molécula A y B, que presentan un sitio de corte para

BamHI lo que permite que presenten extremos compatibles y puedan ser hibridadas
 uniéndose covalentemente con DNA ligasa ( enlace fosfodiester). Cuando se
hibridan ambas hebras se forman los puentes de H entre las hebras compatibles.

En el caso de DNA circular

(plásmido) se hace un corte con
EcoRI y luego a un DNA
foráneo que se quiere clonar,
se corta con la misma enzima
de restricción y se hibrida con
el DNA plasmidial, el cual se
vuelve a recircularizar.

Generalmente se escogen
enzimas de restricción que
generen extremos cohesivos, ya
que en el caso de los extremos
romos la ligación es menos
eficiente y solo algunas ligasas
pueden unir covalentemente las
dos hebras que se quieran
hibridar, como por ejemplo la
DNA ligasa del fago T4.

3. COPIAR: se realizan muchas copias idénticas del fragmento de DNA recién

obtenido a través del clonamiento molecular, que consta de las siguientes
etapas:
• DNA blanco (target) + vector (CORTAR)
• Método para unir DNA target y DNA vector in Vitro (PEGAR)
• Introducir el rDNA al huésped
• Selección

Para que se produzca el clonamiento molecular se deben seleccionar los vectores en el

cual vamos a insertar el DNA de interés es por esto que el vector debe cumplir con las
siguientes características:
• Replicón: DNA para “llevar” y amplificar DNA exógeno en una célula huésped
• Ej: plásmidos, fagos/virus, o combinaciones

Para realizar clonamiento molecular existe el protocolo genérico rDNA.

Para preparar el DNA foráneo se

corta con EcoRI y luego se hace
lo mismo con el vector a utilizar
que ha sido seleccionado desde
una biblioteca en la cual se tiene
toda la información para la
utilización del vector. Luego de
esto el DNA y el vector se ponen
en un tubo de ensayo para realizar
la reacción de ligamiento, para la
cual se debe mezclar el DNA exógeno y el vector en presencia de ligasa, debe haber una
relación optima entre vector: inserto, para que todos
los vectores puedan tener un DNA integrado, por lo
que debe haber mucho mas inserto y debe haber un
apareamiento de base intermolecular entre extremos
compatibles.
Para que se realice la ligación de forma esperada lo
que se hace es bajar la temperatura para permitir que
se realicen de mejor manera las interacciones de
puentes de H que son débiles y con mayor temperatura se debilitan. ( se pueden poner
en el refri =O )

Que se hace para que no se recircularice el vector? Al vector se le remueven el fosfato

del 5´ al tratarlo con una enzima llamada fosfatasa, que quita el fosfato del extremo
dejando el OH libre, para que ya no
pueda realizar un ataque nucleofilico
sobre el OH 3´. Luego al insertar el
DNA, que anteriormente fue cortado
con la misma enzima de restricción
que el vector, se hibrida con el vector
pero en el extremo 5´ no puede
realizarse un enlace covalente por lo
que se reconoce como DNA dañado y
se repara con el sistema nick.

Luego que el DNA esta cortado y ligado al vector se produce la incorporación del DNA
recombinante en el huésped. Esto se puede hacer
a través de un shock térmico o de un proceso
llamado electroporación, en donde a la bacteria se
le da un pulso eléctrico que permite generar poros
en la membrana y se capaz de incorporar el DNA
de interés.
Para realizar el proceso de incorporación del
vector y del DNA de interés hibridado con el se
tiene que realizar una transformación con células
competentes.
Para la transformación se debe incubar la mezcla
de ligamiento con ‘células competentes’ que son
células tratadas que aumentan la incorporación
del DNA y luego se debe hacer tratamientos de:
 40-41° por 1-2 minutos
 Pulso breve de alto voltaje
Uno de los métodos mas usados para transformar es la electroporacion, pero existen
otros métodos como el proyectil, en las cuales tengo microesferas recubiertas de DNA y
se disparan a la célula, o también puede realizarse a través de una inyección o virus.
(OJO: esto se ha descrito para eucariontes)

Cuando ya se tienen las células competentes que incorporaron los plásmidos se debe
realizar una selección de ellas, ya que no todas habrán incorporado de manera correcta
el vector con el DNA, otras incorporan solo el vector y hay también células que no
alcanzan a incorporar nada. Se hace una selección de transformantes. Se desea separar
aquellas células que tienen vector y las que no. Para esto el vector debe llevar un gen
que permita identificarlo, por ejemplo un gen de resistencia que le permite a la célula
vivir en presencia de un antibiótico por ejemplo.
Si tenemos este vector, en el cual podemos
apreciar resistencia a ampicilina y tetraciclina, y
lo incorporamos en una célula competente
(AmpRTetR), esta se volverá resistente a ambos
antibióticos , pero sin vector la célula es sensible
(AmpSTetS).
Pero como yo quiero insertarle a este vector un
fragmente de DNA lo que se hace es cortar el
vector en el sitio de restricción que se encuentra
en la resistencia de Tet (EcoRI) y corto el DNA
que se va a hibridar con la misma enzima EcoRI y
luego se hibridan, por lo cual el vector con el
inserto perderá su resistencia a Tet y al crecer la célula esta será AmpRTetS y así puedo
diferenciar:
1° la célula que lleva el vector de las que no lo llevan (por ambas resistencias)
2° las que llevan el vector de las que llevan el vector mas el inserto ( que son las que
nos interesan), a través de la resistencia a Amp y la sensibilidad a Tet.

Entonces se pueden seleccionar transformantes creciendo en:

MM + Amp : aquí van a crecer tanto las bacterias que presentaban el vector y las que
presentan el vector-inserto de DNA
Luego desde esta placa se extrae parte de cada colonia y se hacer crecer ordenadamente
en otras placas, manteniendo siempre una distribución igual en cada placa ya que nos
permitirá saber que colonia es a partir de la primera (se hace picando cada colonia y
marcándola en la otra placa que acabamos de preparar igual como lo hicimos en
genética)
MM + Amp + Tet : van a crecer solo las bacterias que tenían el vector
MM + Amp : van a crecer solo las bacterias con vector – inserto

Frecuencia de transformación
• electroporación: 109-1010 colonias/μgDNA
• Shock térmico: 105-109 colonias/μgDNA
La electroporacion es mucho más eficiente !!!!!!

Vectores de clonación

• Moléculas de DNA que se replican autónomamente (Ej. plásmido)

• Marcador de selección (ej. Resistencia)
• Pueden estar presente en varias copias por célula
• Sitio de inserción para el DNA exógeno.
– (hay vectores con varios sitios de inserción, esto es lo ideal)

Generalmente se escogen plásmidos chicos para clonar porque se tienen mayor numero
de copia en la célula, lo que nos permite tener mas copias del DNA de interés.
plásmidos
• Elemento genético extracromosómico
• Rango de tamaño1-200 kb
• Transferible por conjugación o transformación
• Resistencia a antibióticos
• Bajo N° copias v/s alto N° copias

El plásmido que se ve es muy parecido al que se dijo

recién pero este es malo para clonar porque el sitio de
corte no interfiere la resistencia y además es un plásmido
muy grande. Fue uno de los primeros que se descubrió.

Lo que más se hace es la inserción por in activación de un gen, esto se puede ver en el
siguiente caso:
El tamaño de este plásmido es mucho menor que
el mostrado anteriormente.
Tiene un solo gen de resistencia a antibiótico
Tiene un gen llamado lacZ, el cual como producto
génico tiene a la β- galactosidasa. En el inicio del
gen tiene un sitio de clonación múltiple, el cual
tiene sitio de restricción para muchas enzimas,
permitiendo la plasticidad en el corte, ya que si el
DNA de interés era más fácil cortarlo con SmaI se
puede encontrar en el MCS una secuencia de corte
para la misma enzima. Cuando se hibridan el
vector con el fragmento de DNA ya preparado el
gen lacZ se inactiva por lo cual no se produce β- galactosidasa.
Por lo tanto las bacterias que reciben el vector solo, son resistentes a Amp y sintetizan
β- galactosidasa, en cambio las bacterias que presenten el vector con el inserto también
serán resistentes a Amp pero no sintetizaran β- galactosidasa, por lo que aquí tenemos
un sistema de doble selección, por un lado con el antibiótico seleccionamos las bacterias
que incorporaron el vector o no y con la producción de β- galactosidasa se selecciona
aquellas que incorporaron el fragmento de DNA de las que no.
Para poder utilizar este sistema de selección se ocupan placas de MM + Amp + Xgal
(sustrato) + IPTG (precursor)

Características útiles de los plásmidos

• Replicación relajada
• Marcadores de selección
• Polilinker o MCS (sitio de clonación múltiple)
• Identificación de recombinantes
• La mayoría derivados de pUC o pBR322|