Tesis UNP

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
CARACTERIZACIÓN PROTEÓMICA Y LIPIDÓMICA DE LOS

EFLUENTES DE LA INDUSTRIA PROCESADORA DE HARINA
Y ACEITE DE PESCADO DE LA CORPORACIÓN PESQUERA
INCA S.A.C.
Presentada por:
Br. Melitza de Lourdes Cornejo La Torre.
TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE
Bióloga
Piura – Perú
2013
Tesis presentada como requisito para optar el título de
BIÓLOGA
_______________________________________
Br. MELITZA DE LOURDES CORNEJO LA TORRE
AUTOR
________________________________________
Blg. CÉSAR TORRES DÍAZ MSc.
ASESOR
________________________________________
Blg. RONALD MARCIAL RAMOS MSc.
PRESIDENTE
________________________________________
Blg. WILDER RODRÍGUEZ ARTEAGA MSc.
SECRETARIO
________________________________________
Mcblg. JAIME FERNÁNDEZ PONCE
VOCAL
ii
DEDICATORIA
A mi familia en general, y en especial a mis padres por hacer

de todo en esta vida para que pudiera lograr mis sueños; este triunfo
es suyo.
A mis hermanos, porque sin sus sacrificios no sería quien

soy, ustedes son mi ejemplo.
A Mario, mi compañero incondicional, por su paciencia y

comprensión, por el gran apoyo y los jalones de orejas cuando fueron
necesarios.
A los amigos, compañeros casi hermanos que siempre

estuvieron presentes en los momentos de incertidumbre y de los
cuales aprendí que el camino se aliviana cuando se puede contar con
ustedes.
A todos aquellos que nunca dudaron que lograría este

triunfo.
iii
AGRADECIMIENTOS
Me complace de sobre manera a través de esta investigación exteriorizar mi sincero
agradecimiento a la Universidad Nacional de Piura en la Facultad de Ciencias,
Escuela Profesional de Ciencias Biológicas y en ella a los distinguidos docentes
quienes con su profesionalismo y ética puesto de manifiesto en las aulas enrumban a
cada uno de los que acudimos con sus conocimientos que nos servirán para ser útiles
a la sociedad.
Al centro de Investigación BIOTEC C.M.C y todo su personal por la confianza
depositada en mí y por la oportunidad de desarrollo profesional, por el
financiamiento de esta investigación y la orientación continua hasta la culminación
de la misma.
A Eric Miahle por su ejemplo, amistad, exigencia y confianza durante el tiempo que
estuvo vinculado directamente con el desarrollo de la presente investigación.
A todos aquellos que de alguna u otra manera me brindaron su apoyo y ayuda para la
culminación de mi tesis.
De todo corazón, ¡muchas gracias!
iv
ÍNDICE GENERAL
DEDICATORIA ........................................................................................................ iii
AGRADECIMIENTOS.............................................................................................. iv
ÍNDICE GENERAL ................................................................................................... v
INDICE DE CUADROS ........................................................................................... vii
INDICE DE FIGURAS ............................................................................................ viii
INDICE DE ANEXOS ............................................................................................... xi
RESUMEN ............................................................................................................. xiii
ABSTRACT ........................................................................................................... xiv
I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
II. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................ 11
2.1. ÁREA DE ESTUDIO ........................................................................................................ 11
2.2. TOMA DE MUESTRA Y TRANSPORTE ........................................................................... 11
2.3. ANÁLISIS Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS ....................................................... 12
2.3.1. ANALISIS PROTEÓMICO ................................................................................. 13

2.3.2. ANALISIS LIPIDÓMICO.................................................................................... 20
III. RESULTADOS............................................................................................. 23
3.1. ANALISIS FÍSICO-QUÍMICO DE LOS EFLUENTES ........................................................... 23
3.2. ANÁLISIS PROTEÓMICO DE LOS EFLUENTES PESQUEROS ........................................... 24
3.2.1. RECUPERACIÓN DE PROTEÍNAS ..................................................................... 24

3.2.2. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA SDS-PAGE............................ 26
3.2.3. ANÁLISIS ESPECTROMÉTRICO DE LAS PROTEÍNAS RECUPERADAS ................ 27
3.2.4. IDENTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EXTRAÍDAS .......................................... 32
3.3. ANÁLISIS LIPIDÓMICO DE LOS EFLUENTES PESQUEROS.............................................. 33
v
3.3.1. RECUPERACIÓN DE LÍPIDOS DE LOS EFLUENTES PESQUEROS....................... 33
3.3.2. ANÁLISIS ESPECTROMÉTRICO DE LOS LÍPIDOS RECUPERADOS ..................... 35
IV. DISCUSIÓN ................................................................................................. 50
V. CONCLUSIONES ............................................................................................ 59
VI. RECOMENDACIONES ................................................................................ 60
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 61
ANEXOS................................................................................................................. 69
vi
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1 soluciones empleadas para el fraccionamiento de péptidos y proteínas complejas

mediante Zip Tip® columnas cromatográficas ..................................................................... 17
Cuadro 2 parámetros físico-químicos evaluados en los efluentes de la industria procesadora

de harina y aceite de pescado. ............................................................................................... 23
Cuadro 3 Masas obtenidas del análisis MS/MS del pico 597.47 ......................................... 29
Cuadro 6 Ácidos grasos identificados en aceite de pescado de la planta de la corporación

pesquera INCA S.A.C mediante cromatografía de gases ...................................................... 43
Cuadro 7 Atribuciones de las principales masas mostradas durante el análisis MALDI

TOF/TOF MS de los efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de pescado. .. 44
Cuadro 8 valores de cuantificación de proteínas precipitadas de los efluentes de la industria

procesadora de harina y aceite de Anchoveta realizadas con Qubit® ................................... 82

procesadora de harina y aceite de pescado realizadas con fluorómetro Qubit® ................... 82
Cuadro 10 valores de cuantificación de lípidos recuperados de los efluentes de la industria

procesadora de harina y aceite de pescado. ........................................................................... 90
vii
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Precipitación de proteínas de diferentes muestras de efluentes de la industria

Figura 2 Concentración de proteínas recuperadas de los efluentes de la industria

procesadora de harina y aceite de pescado de la corporación pesquera INCA S.A.C ........... 25
Figura 3 Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE al 12,5% ............................... 26
Figura 4 Espectro de masas de las proteínas recuperadas de los efluentes pesqueros. El

análisis fue realizado en el rango de masas de 10 – 1000 m/z............................................... 27
Figura 5 Espectro de masas de las proteínas recuperadas de los efluentes pesqueros. El

análisis fue realizado en el rango de masas de 1000 – 5000 m/z........................................... 28
Figura 6 Espectro de masas de las proteínas recuperadas de los efluentes pesquero. El

análisis fue realizado en el rango de masas de 5000 – 30000 m/z......................................... 28
Figura 7. Espectro de masas de una muestra digerida del concentrado de proteínas obtenido
de los efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de pescado ........................... 28
Figura 8 Espectro de masas MS/MS del pico 597.47 Resolución: 2156 Señal ruido: 1202 29
Figura 9 Espectro de masas MS/MS del pico: 615.50 Resolución: 5501 Señal ruido: 1587
............................................................................................................................................... 30
Figura 10 Espectro de masas MS/MS del pico: 1229.91 Resolución: 9877 Señal ruido:
3287 ....................................................................................................................................... 31
Figura 11 Recuperación de Lípidos de diferentes muestras de efluentes de la industria

viii
Figura 12 Concentración de lípidos recuperados de los efluentes de la industria
procesadora de harina y aceite de pescado de la corporación pesquera INCA S.A.C ........... 34
Figura 13 Cristalización vista al estereoscopio de las diferentes matrices analizadas.

A=Chapainaing (2009), B= Jakab (2002), C= Lay (2006), D=Picarello (2009), E= Estándar
del laboratorio y F= Estándar con modificaciones ................................................................ 36
Figura 14 Perfiles de masas generados de la co-cristalización matriz-analito. (A) Muestra

Aceite de Anchoveta de Consumo Humano Indirecto (CHI) y (B) Muestra Lípidos totales
extraídos de los efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de pescado. .......... 37
Figura 15 espectros de masas MALDI TOF/MS en modo positivo de Glyceryl trioleate con
matriz DHB tomada con diferentes intensidades de láser (todos los valores son dados en
unidades internas del espectrómetro de masas (A=4900, B=5200, C= 5500). ...................... 38
Figura 16 espectros de masas de los lípidos de los efluentes pesqueros previo a la limpieza
de masas A espectros de todas las repeticiones, B espectro consenso de lípidos totales
después de la limpieza de masas............................................................................................ 39
Figura 17 espectros MS de las muestras de lípidos recuperados de los efluentes de la

industria procesadora de harina y aceite de pescado en el rango de 500 – 700m/z ............... 40
Figura 18 espectros parcial MS de las muestras de lípidos recuperados de los efluentes de la

industria procesadora de harina y aceite de pescado en el rango de 800 – 900m/z ............... 41

industria procesadora de harina y aceite de pescado en el rango de 900 – 1000m/z ............. 41

industria procesadora de harina y aceite de pescado en el rango de 1000 – 1200m/z ........... 42
Figura 21 Composición porcentual de los constituyentes lípidos de los efluentes de la

industria procesadora de harina y aceite de pescado de la corporación pesquera INCA S.A.C
............................................................................................................................................... 49
ix
Figura 22 Porcentaje de constituyentes lipídicos con Ácido Eicosapentanoico (A5, EPA) y
Ácido Docosahexaenoico (D6, DHA) en su estructura. ........................................................ 49
Figura 23 Flujograma del proceso de harina y aceite de Anchoveta de la Corporación

Pesquera INCA S.A.C ........................................................................................................... 70
Figura 24 Esquema protocolar de cuantificación Qubit® .................................................... 72
Figura 25 vista panorámica de las zonas costeras aledañas a la planta procesadora de harina
y aceite de pescado de la corporación pesquera INCA S.A.C ............................................... 91
Figura 26 Sistema de traslado de la materia prima de las tolvas de las embarcaciones hacia
la planta procesadora. ............................................................................................................ 91
Figura 27 Maquinaria de centrifugado para la extracción de licores y acetite de pescado... 92
Figura 28 Colecta de muestras y análisis de parámetros físico-químicos. ........................... 92
Figura 29 Material empleado para la extracción de proteínas de los efluentes pesqueros. .. 93
Figura 30 Muestras de efluentes para la recuperación de proteínas. .................................... 93
Figura 31 Proteínas en precipitación con TCA – Acetona. .................................................. 94
Figura 32 Electroforesis de las proteínas recuperadas de los efluentes pesqueros. .............. 94
Figura 33 muestras de efluentes pesqueros para la recuperación de lípidos totales. ............ 95
Figura 34 Spot de las muestras de lípidos para el análisis espectrométrico. ........................ 95
Figura 35 Espectrómetro de masas 4800 MALDI TOF-MS empleado para el análisis de

proteínas y lípidos de los efluentes pesqueros. ...................................................................... 96
x
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de harina y aceite de Anchoveta de la Corporación

Pesquera INCA S.A.C ........................................................................................................... 70
Anexo 2 Protocolo de Precipitación de Proteínas con TCA – Acetona ............................... 71
Anexo 3 Protocolo de cuantificación fluorométrica Qubit® 2.0 Fluorómetro Invitrogen ... 72
Anexo 4 Protocolo de preparación del Gel de poliacrilamida al 12.5%............................... 73
Anexo 5 Protocolo de digestión de Proteínas en gel de Poliacrilamida para Análisis por

Espectrometría de masas MALDI-TOF TOF ........................................................................ 74
Anexo 6 Condiciones del método de adquisición para el análisis MS en el rango masas de

10 – 1000Da. ......................................................................................................................... 76
Anexo 7 Condiciones del método de adquisición para el análisis MS en el rango de masas

de 1000 a 5000 Da. ................................................................................................................ 77
Anexo 8 Condiciones del método de adquisición para el análisis MS en el rango de masas

de 5000 a 20000 Da. .............................................................................................................. 78
Anexo 9 Condiciones del método de procesamiento para el análisis MS de las proteínas

recuperadas. ........................................................................................................................... 79
Anexo 10 Condiciones del método de adquisición para el análisis MS/MS de las proteínas
recuperadas de los efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de pescado. ...... 80
recuperadas de los efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de pescado. ...... 81
Anexo 12 Cuadro 8 valores de cuantificación de proteínas precipitadas de los efluentes de

la industria procesadora de harina y aceite de Anchoveta realizadas con Qubit® ................ 82
Anexo 13 Protocolo de recuperación de lípidos ................................................................... 83
Anexo 14 Matrices empleadas para el análisis de los lípidos recuperados de los efluentes
pesqueros. .............................................................................................................................. 85
Anexo 15 Condiciones del método de adquisición para el análisis MS de los lípidos

recuperados de los efluentes pesqueros ................................................................................. 86
xi
Anexo 16 Condiciones del método de procesamiento para el análisis MS de los lípidos
Anexo 17 Condiciones del método de adquisición para el análisis MS/MS de los lípidos
Anexo 18 Condiciones del método de procesamiento para el análisis MS/MS de los lípidos
Anexo 19 valores de cuantificación de lípidos recuperados de los efluentes de la industria

Anexo 20 Galería fotográfica. .............................................................................................. 91
xii
RESUMEN
Los efluentes pesqueros son considerados en los últimos años como los
principales contaminantes de las zonas costeras donde son vertidos. Esta
investigación caracterizó los efluentes de la industria procesadora de harina y aceite
de pescado mediante la utilización de la técnica MALDI TOF/MS a fin de conocer
que proteínas y lípidos se encuentran en estos.
Las proteínas se extrajeron con ácido tricloroacético y acetona, se separaron
en geles de poliacrilamida al 12,5% y se analizaron en un espectrómetro de masas
MALDI TOF/TOF. Los patrones de migración electroforética indican que las
proteínas del músculo de pescado no serían las encontradas en los efluentes
estudiados. Los lípidos fueron recuperados mediante la combinación de solventes
orgánicos y analizados en un espectrómetro de masas MALDI TOF/TOF,
determinándose que el 70% de las moléculas recuperadas corresponden a
Glicerolipidos [GL], comprobándose además que el 32% de las moléculas
identificadas poseen Ácido Eicosapentanoico (EPA) y el 7% Ácido
Docosahexaenoico (DHA) en su estructura. Dichos resultados sustentan el desarrollo
de nuevas investigaciones a fin de implementar estrategias para el aprovechamiento
de estas moléculas de importancia alimenticia, farmacéutica y biotecnológica.
xiii
ABSTRACT
Fishing effluents are considered in recent years as major pollutants in coastal
areas where they are dumped. This research characterized the effluent
processing industry fish meal and oil by using MALDI TOF/MS in order to
know which proteins and lipids are found in these.
Proteins were extracted with trichloroacetic acid and acetone, were separated on
polyacrylamide gels and 12,5 % were analyzed in a MALDI TOF/TOF mass
spectrometer. Electrophoretic migration patterns indicate that proteins of fish
muscle would not be found in the effluents studied. The lipids were recovered
by the combination of organic solvent and analyzed in a MALDI TOF / TOF
mass spectrometer, demonstrating that 70% of the molecules recovered
correspond to glycerolipids [GL], verifying that the 32% of the molecules
identified possess eicosapentaenoic acid (EPA) and 7% docosahexaenoic acid
(DHA) in its structure. These results support the development of new research
in order to implement strategies for the use of these molecules important food,
pharmaceutical and biotechnology.
xiv
I. INTRODUCCIÓN
La pesca de captura y la acuicultura suministró aproximadamente 154 millones de
toneladas de pescado al mundo, de ello 20,2 millones de toneladas fueron destinados
a fines no alimentarios, principalmente la elaboración de harina y aceite de pescado
(Pulvenis, 2012). Esta actividad productiva es desarrollada en muchos países del
mundo, tal como Reino Unido, Dinamarca, Noruega, Islandia, Ecuador, Chile, Perú,
etc. (Guerrero, Omil, Méndez & Lema, 1998; Mathiesen, 2011; IFFO, 2012;
Pulvenis, 2012).
En el Perú, la industria de harina de pescado es la más grande después de la
minería, siendo el principal productor del mundo; 47.5% del total (Pulvenis, 2012;
Rojas & Llaja, 2010); existiendo 190 empresas procesadoras de harina y aceite
aproximadamente a lo largo de la línea costera peruana (PRODUCE, 2013) las cuales
procesan aproximadamente 3,6 millones de toneladas de pescado al año, llegando a
exportarlo casi en su totalidad (Pulvenis, 2012).
El proceso de fabricación de harina y aceite de pescado generalmente sigue los
mismos principios (IFFO, 2012 & Bimbo, 2002); sin embargo, la utilización de la
materia prima y, de manera más importante, los métodos de elaboración varían en
función del continente, la región, el país e incluso dentro de cada país, variando los
requisitos del proceso de un área a otra y de una planta a otra (Bimbo, 2002;
Centurión, Ganoza & Torres, 2007 & Pulvenis, 2012); sin embargo, el requerimiento
de grandes volúmenes de agua, principalmente destinadas al lavado y limpieza de la
materia prima, se ha mantenido invariable a través del tiempo, debido a que el agua
1
es un lubricante importante y un medio de transporte en las diferentes etapas de
manipulación y procesamiento del pescado; generando, por ende, grandes volúmenes
de aguas residuales o efluente (García, 2007 & SFIA, 1999) los cuales pueden llegar
a tener un alto nivel de contaminación orgánica (SEAFISH, 1999; Watson, 2003 &
García, 2007; Jaczynski, Yi-Chen, Joaquín & Torres, 2005). Debido a esto las
empresas productoras de harina y aceite de pescado son consideradas como las
principales generadoras de residuos orgánicos en las zonas costeras, en especial las
zonas costeras peruanas (Gonzales, 2008; Centurión et al., 2007; Bimbo, 2002 &
Cabrera, 2001).
Existen tres principales efluentes líquidos generados durante el proceso de
producción de harina y aceite de pescado; agua de bombeo, sanguaza y agua de cola
(Cabrera, 2002; Afonso & Bórquez, 2002; Centurión et al., 2007). El agua de
bombeo, es el agua residual generada por el transporte hidráulico de la materia prima
desde las bodegas de las embarcaciones hacia las fábricas y cuyas características en
las pesquerías sudamericanas son únicas a diferencia la sanguaza y el agua de cola
que son generadas en las plantas procesadoras de todo el mundo (Bimbo, 2002), por
tal motivo los estudios basados en las técnicas de recuperación de materiales de
interés en éstos últimos están mejor desarrolladas (Cabrera, 2001).
Durante el desembarque de la materia prima, de las embarcaciones pesqueras
hacia la planta de procesamiento, se utiliza agua de mar como medio de transporte de
la materia prima (IFFO, 2012; Afonso et al., 2002), generando un efluente rico en
grasas y sólidos suspendidos provenientes del almacenamiento del pescado en las
bodegas de las embarcaciones desde la captura hasta el momento del desembarque
2
(García, 2007), el líquido residual generado durante este procedimiento es evacuado
al mar después de los tratamientos necesarios en planta (Centurión et al., 2007) y es
el fluido residual al que mayores consideraciones se debería prestar debido a los
grandes volúmenes de agua empleados.
La sanguaza es producida a bordo de las embarcaciones cuando la materia prima
es almacenada durante el viaje de retorno a la fábrica y también cuando es
descargada y almacenada en pozas dentro de las fábricas antes de ser procesada, es el
resultado de la acción bacteriana y la autolisis de las enzimas propias del intestino de
los peces, además de la presión a la cual están sometidos durante el almacenamiento,
originando que tanto proteína como aceite se liberen en la sanguaza, que de no ser
procesada se perderían (García, 2007 & Bimbo, 2002).
El agua de cola es una emulsión de aceite en agua, que es generada como
subproducto del prensado de la materia prima que previamente ha sido sometida a
cocción, en el cual el aceite es acompañado por proteínas y otros materiales
orgánicos (IFFO, 2012; García, 2007) puede representar el 60% del peso de la
materia prima de pescado fresco y contiene aproximadamente 8% de sólidos, de no
recuperarse muchos productos de valor y con posibles aplicaciones industriales se
perderían (Bimbo, 2002).
Cualquier materia prima que no es procesada y transformada en harina de pescado
o aceite será finalmente descargada junto con las aguas residuales. La identificación
de los componentes y caracterización de los efluentes generados durante este proceso
es el primer paso para comprender en donde están las ineficiencias en el proceso de
3
producción. Esta información se puede usar junto con las relaciones de producción
para calcular las pérdidas de materia prima y las oportunidades para aumentar la
productividad y las ganancias dentro de esta industria (Mueller-Volimer, Bimbo,
Basurco & Egocheaga, 1998).
Tradicionalmente, existía poco interés en muestrear y tratar los efluentes de las
plantas harineras en el Perú (Mueller-Volimer et al., 1998). El infrecuente muestreo
que se llevaba a cabo se confinaba a parámetros ambientales como Demanda
Bioquímica de Oxígeno (DBO), Demanda Química de Oxígeno (DQO) y sólido
suspendidos (SS) (Mueller-Volimer, et al., 1998). Sin embargo, debido a la creciente
demanda de tratar de mantener el equilibrio y la buena salud de los ecosistemas,
adicionales a estos, se han evaluado la existencia de otros parámetros/contaminantes
dentro de los efluentes tales como: coliformes fecales (FREMP, 1993), nitrógeno
total (NT), Fósforo total (FT), y nitrógeno amoniacal (N-NH4) (Priambodo,
Sarwoko, Wahyono & Soedjono, 2011), sulfuros, aceite y grasa (González, 1996.,
Priembodo et al, 20011 & Miroslav, Morse, Hicks, Lechter & Miller, 2007) . Si bien
es cierto que estos parámetros pueden ser útiles para evaluar impactos ambientales,
también es cierto que no ayudan a determinar las pérdidas de materia prima.
Puesto que esta clase de harina se produce de pescado, quitando un poco de agua
y aceite, su composición refleja la composición de la materia prima (Guerrero, 1998),
de manera similar, la composición de los efluentes está basada en la composición de
la materia prima que se está procesando (Miroslav et al, 2007) y del método de
procesamiento empleado por las distintas empresas. Por tal motivo, los efluentes
generados durante este proceso están constituidos principalmente por proteínas
4
(Miroslav et al., 2007 & Afonso et al., 2002) y lípidos, especialmente ácidos grasos
poliinsaturados sustancias de considerable valor dentro de la industria de alimentos
(Guerrero et al., 1998). El alto contenido de éstos productos añade un especial interés
en la implementación de técnicas de recuperación de éstos (Civit, Parín & Lupín,
1982., González, 1996., Stine, Pedersen, Smiley & Bechtel, 2010., García, Pacheco,
Ramírez & Carvallo, 2011; Swapan, Bijinu, Kuma & Narayan, 2011), con el fin de
optimizar el proceso de producción (Afonso et al., 2002 & Guerrero et al., 1998;);
además de reducir la posibilidad de contaminación de las bahías (Cabrera, 2001.,
Cabrera, 2002 & Gonzales, 2008).
Actualmente se han implementado diversos métodos para la recuperación de
sólidos, como las proteínas, simultáneamente al tratamiento que reciben los efluentes
pesqueros (García, 2007), dentro de estos se encuentra la evaporación, especialmente
del agua de cola, con el objetivo de concentrar los sólidos totales y lograr la máxima
recuperación de productos valiosos (García, 2007; Centurión et al., 2007).
Algunos métodos fisicoquímicos para la precipitación de proteínas también han
sido empleados, estos métodos involucran la adición de sustancias químicas para
alterar el estado físico de los sólidos disueltos y suspendidos y así facilitar su
remoción por sedimentación, uno de los compuestos más empleado para este
propósito es el quitosano (Jaczynki et al., 2005 & Pacheco, Leyva, Carvallo y García,
2009 ), sin embargo la precipitación de las proteínas también se puede lograr por la
combinación de variaciones de pH y temperatura (Civit et al., 1982; Bourtoon,
Chinann, Jantawat & Sanguandeekul, 2009; Pacheco et al., 2009., Stine et al., 2010
& García et al., 2011).
5
El desarrollo de nuevas tecnologías ha permitido actualmente el uso de sistemas a
base de membranas, las cuales han permitido una exitosa recuperación de proteínas,
mediante procesos de Ultrafiltración (UF) y Nanofiltración (NF); aunque su uso en la
industria pesquera, especialmente en la harinera, no es muy común (Afonso et al.,
2002., Stine, et al, 2010 & Muro, Riera & Díaz, 2011).
Un sistema que ha permitido no solo la remoción de proteínas, sino también la
recuperación de aceites de los efluentes pesqueros es el sistema de flotación por aire
disuelto (DAF por sus siglas en inglés) y que es usado frecuentemente en el
tratamiento de aguas residuales de los efluentes pesqueros con gran éxito (Centurión,
et al., 2007).
La gran mayoría de estas investigaciones están enfocadas a recuperación de
compuestos de valor siendo escazas las investigaciones destinadas a detallar la
composición y calidad éstos. Debido a esto, la creciente demanda de mejora de la
calidad de los productos y la racionalización de la producción en la industria de los
alimentos, hoy en día, ha llevado a la sustitución gradual de las técnicas de análisis
de calidad que consumen mucho tiempo por herramientas analíticas más específicas
para el análisis de compuestos de los productos y el monitoreo de procesos, en
especial los relacionados a la obtención de productos de calidad (Vilhelmsson,
Martín, Poli & Houlihan, 2005).
Con objeto de poder cumplir con todos estos requerimientos es necesario el
empleo de metodologías analíticas apropiadas que permitan la correcta identificación
6
y cuantificación de estos compuestos. Dicho de manera general, dichas metodologías
deben ser capaces de proporcionar una alta sensibilidad, debido a las bajas
concentraciones que en algunos de los casos pueden encontrarse. Dentro de las
técnicas existentes hoy en día destaca la espectrometría de masas.
La espectrometría de masas, MS, por sus siglas en inglés, es una técnica
consolidada, que durante la pasada década ha tenido un gran avance en el ámbito
biológico y se está imponiendo en los laboratorios analíticos de investigación o de
diagnóstico (Yates, Ruse & Nakorchevsky, 2009). Ello se debe fundamentalmente al
desarrollo de diferentes metodologías, especialmente la combinación de técnicas
analíticas de separación, como los métodos cromatográficos o la electroforesis, con
la espectrometría de masas en sus diferentes modalidades. Debido a su sensibilidad,
rapidez, alta especificidad analítica, el amplio intervalo de aplicabilidad con amplia
versatilidad al trabajar con moléculas grandes o pequeñas, posibilidad de obtener
información cualitativa y cuantitativa en una única prueba así como su flexibilidad
que permite diseñar procedimientos analíticos en relativamente poco tiempo, se ha
consolidado como el mejor método de detección para la identificación de proteínas y
lípidos a gran escala. Si bien presenta limitaciones, es una técnica imprescindible en
ámbitos como la Proteómica y/o lipidómica y será en un futuro próximo, técnica de
rutina para cualquier laboratorio de análisis (Martín & Ballesteros, 2010).
La espectrometría de masas es una técnica analítica en la que los átomos o
moléculas de una muestra son ionizados, con mayor frecuencia positivamente,
separados por su relación masa/carga (m/z) y posteriormente detectados y registrados
(Blanksby & Mitchell, 2010; Martín et al., 2010; El-Aneed, Cohen & Banoub, 2009;
7
Yates et al., 2009 & Schiller et al., 2007). La importancia y proyección de la MS es
debida a su potencial analítico. Las ventajas de esta técnica se pueden resumir en los
siguientes aspectos: proporciona una insuperable especificidad en la determinación
del peso molecular debido a la posibilidad de medir exactamente su masa molecular
así como obtener información a partir de los fragmentos iónicos de un analito en
particular. Su sensibilidad es muy elevada y en teoría, la MS permite detectar una
única molécula (Martín et al., 2010). Es muy versátil, ya que permite determinar la
estructura de tipos de compuestos muy diversos. Es aplicable a los elementos y a
todo tipo de muestras, volátiles y no volátiles, polares y apolares, sólidos, líquidos y
gases. En combinación con técnicas de separación de alta resolución, es la más
calificada para analizar muestras complejas reales (Martín et al., 2010; El-Aneed et
al., 2009).
Los avances tecnológicos en espectrometría de masas en los últimos años y el
desarrollo de diversas técnicas analíticas han permitido enfocar las investigaciones
hacia la identificación de componentes de mezclas complejas logrando una rápida
expansión del campo de investigación de la proteómica (Yates et al., 2009) y
lipidómica (Blanksby et al., 2010). Herramientas como las antes mencionadas y su
desarrollo a gran escala para la biología de sistemas permiten identificar y cuantificar
las miles de especies de proteínas y los lípidos y las interacciones de estos con otros
metabolitos (El-Aneed et al, 2009). El objetivo general de estas mediciones es
obtener resultados inmediatos de las proteínas y lípidos presentes en un compuesto
(Vilhelmsson et al., 2005., Yates et al., 2009 & Blanksby et al., 2010).
8
La caracterización proteómica y lipidómica por estudios de espectrometría de
masas ha comenzado a adquirir desde hace unos años una mayor importancia, pues
requiere mucho menor tiempo y se pueden obtener resultados de mejor calidad.
Asimismo, la realización de estos estudios presentan ventajas en relación a las
técnicas tradicionales como son la sencillez al momento de preparar las muestras; de
igual manera, la rapidez con que se obtienen los resultados suele ser de gran ayuda
pues se requieren sólo minutos para conseguir el perfil de masas correspondiente a
las muestras analizadas (Fernández et al., 2010).
La Espectrometría de Masas por Ionización Desorción asistida con Láser por
Matriz - Tiempo de Vuelo (MALDI TOF MS), es una técnica de ionización basada
en la utilización de una matriz de absorción ultravioleta (Schiller et al., 2007) y
ampliamente empleada en el análisis por espectrometría de masas (Yates et al.,
2009). Aunque el análisis de biomoléculas de gran tamaño es la aplicación principal
de MALDI-TOF MS, también hay un creciente interés en el análisis de lípidos
(Blanksby et al., 2010 & Schiller et al., 2007).
Esta técnica también ha sido descrita como una metodología de amplio valor en la
ciencia de los alimentos, proporcionando información valiosa sobre la composición
de la materia prima, la involución de los productos antes, durante y después de su
procesamiento o consumo (Vilhelmsson et al., 2005), en vista de las múltiples
aplicaciones de esta técnica, permitirá el análisis de los principales constituyentes de
los efluentes generados durante la producción de harina y aceite de pescado.
Actualmente no existe un diagrama de flujo único para el análisis proteómico o
lipidómico de una muestra, ya que las variables como complejidad, método de
9
separación, concentración y estabilidad de las proteínas y/o lípidos además de la
plataforma tecnológica disponible para su análisis, y muy especialmente el tipo de
pregunta biológica que se pretende abordar, son los parámetros básicos que
determinan la elección de una estrategia de estudio (Pando & Ferreiras, 2007).
Con lo descrito anteriormente se planteó como objetivo el establecimiento de
metodologías de recuperación de proteínas y lípidos de los efluentes resultantes del
procesamiento de harina y aceite de pescado, así como, la utilización de la técnica de
espectrometría de masas MALDI TOF/TOF en la identificación de los compuestos
recuperados en los efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de pescado
10
II. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. ÁREA DE ESTUDIO
La presente investigación se desarrolló en los laboratorios del Centro
de Investigación Científica BIOTEC C.M.C, localizado en la ciudad de
Tumbes – Perú.
2.2. TOMA DE MUESTRA Y TRANSPORTE
Las muestras de efluentes fueron colectadas en las instalaciones de la
planta productora de harina y aceite de pescado de la Corporación Pesquera
INCA S.A.C. ubicada en el puerto de Chimbote – Provincia del Santa –
Ancash. Las muestras fueron colectadas por el equipo del Centro de
Investigación de Biotec C.M.C en colaboración con el personal de
Aseguramiento de Calidad de planta. Según el flujo de proceso de la empresa
pesquera, los efluentes corresponden a la mezcla del agua de bombeo
empleada para trasladar la materia prima, desde la embarcación hacia planta y
la sanguaza, líquido generado durante el almacenamiento de la materia prima
previo a su procesamiento ANEXO 1. Antes de su mezcla dichos líquidos
sufren un tratamiento previo orientado a la máxima recuperación de los
sólidos suspendidos, estos tratamientos son: coagulación de proteínas,
liberación de grasa y disminución de la actividad enzimática y microbiana,
estos tratamientos están orientados a la optimización de la utilización de la
materia prima empleada para el proceso.
11
Las muestras fueron colectadas al inicio de la salida de los efluentes
hacia el emisor submarino, el cual los traslada varios metros mar adentro para
su eliminación. Se colectaron 3 muestras por cada tipo de efluente en frascos
de vidrio color ámbar, de 1 litro de capacidad, estériles, con tapa rosca y
fueron conservados en hielo seco hasta su traslado a los laboratorios del
Centro de Investigación BIOTEC C.M.C en la ciudad de Tumbes para la
realización de los análisis correspondientes.
2.3. ANÁLISIS Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Las muestras fueron analizadas en base a algunos parámetros de calidad,
tales como: Temperatura, pH, determinación de sólidos y contenido orgánico,
Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO), el cual fue desarrollado siguiendo
el protocolo para el monitoreo de efluentes y cuerpos marinos receptores y
realizado en las instalaciones del laboratorio ambiental del Organismo de
Inspecciones CERPER S.A de la ciudad de Chimbote.
El procesamiento para la caracterización proteómica y lipidómica se
realizó en los laboratorios del Centro de Investigación BIOTEC C.M.C en la
ciudad de Tumbes y se desarrolló tal como se detalla a continuación.
12
2.3.1. ANALISIS PROTEÓMICO
2.3.1.1. RECUPERACIÓN DE PROTEÍNAS
Se empleó el método de precipitación de proteínas con Ácido
Tricloroacético – Acetona (TCA-A) de Sánchez (2001) ANEXO 2 con
algunas ligeras modificaciones. Para el desarrollo de este protocolo, las
muestras de efluentes pesqueros fueron centrifugadas a 14000rpm,
posteriormente 4 volúmenes de la solución obtenida fue mezclada con 1
volumen de ácido Tricloroacético al 100% (1,43mg/ml), la mezcla se
dejó incubar por 10 minutos a 4°C y luego se centrifugó a 14000rpm
durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante, dejando intacta la
proteína en el pellets. El pellet formado se lavó con acetona helada y se
centrifugó en las condiciones antes mencionadas, este paso fue repetido
tres veces, finalmente, los pellets fueron secados al colocar los tubos en
baño seco a 95°C durante 5 - 10 minutos o el tiempo suficiente para
eliminar la acetona por completo manteniendo la calidad del pellet.
2.3.1.2. CUANTIFICACIÓN FLUOROMÉTRICA DE LAS PROTEÍNAS
PRECIPITADAS
Los pellets de las proteínas precipitadas fueron suspendidos en agua
ultra pura con 0,1% ácido Trifluroacético (TFA). La cuantificación fue
desarrollada siguiendo el protocolo de fábrica del Fluorómetro Qubit® 2.0
de Invitrogen (ANEXO 3), para lo cual, 200µL de Solución de trabajo fue
preparada al mezclar 1 µL de Qubit™ Protein Reagent con 199µL de
13
Qubit™ Protein Buffer; se mezcló 10µL de la muestra de proteínas con
190µL de la solución de trabajo preparada anteriormente, se dejó incubar
durante 15 minutos evitando la iluminación directa de la muestra, pasado
este tiempo se colocó el tubo en la cámara de lectura del Fluorómetro
Qubit® 2.0 Invitrogen y se realizaron las lecturas correspondientes, las
lecturas se realizaron por triplicado a fin de mantener la homogeneidad de
las mismas.
2.3.1.3.PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS PRECIPITADAS
Se ensayaron dos métodos para la purificación de las proteínas
recuperadas de los efluentes pesqueros, electroforesis en gel de
poliacrilamida (1D-SDS-PAGE) y columnas cromatográficas ZipTip® de
fase reversa, para lo cual se siguieron los siguientes procedimientos:
2.3.1.3.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE
2.3.1.3.1.1. Preparación del gel de Poliacrilamida
La electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE fue
desarrollada de acuerdo al método de Laemmli (1970), para lo cual
se preparó 30 ml del gel de migración al 12,5% y 6 ml de la
solución del gel concentrador al 4% ANEXO 4.
2.3.1.3.1.2. Cargado y corrida de las muestras
25µL de muestra de proteínas fue mezclada con un volumen
similar de buffer de muestra (Tris HCl 0,09M pH 6,8; SDS 2%;
Glicerol 20%; DTT 0,1M y azul de bromofenol 0,025%) en tubos
14
Eppendorf de 0,2ml; la mezcla fue calentada por 5 minutos a 95°C
con ayuda de un baño seco, pasado este tiempo las muestras fueron
cargadas en los hoyos del gel preparado anteriormente, incluyendo
en uno de los carriles un marcador de peso molecular (Precision
Plus Protein™ Standards) como referencia. Las muestras se
corrieron a 90V hasta que el azul de Bromofenol llegue al borde
inferior del gel, el cual duró aproximadamente 12 horas.
2.3.1.3.1.3. Fijación de las proteínas en el gel de poliacrilamida
Terminado el tiempo de corrida el gel fue sacado de la cámara de
migración y se colocó en un recipiente conteniendo una solución
fijadora (Metanol/Ácido Acético) durante 15 minutos en un
recipiente tapado, con agitación suave.
2.3.1.3.1.4. Tinción y decoloración del gel de poliacrilamida
Luego del proceso de fijación el gel fue teñido con 50 - 75ml de
azul de Coomassie R-250 por 45 minutos. Transcurrido este tiempo
se eliminó el exceso de colorante con varios cambios del
decolorador (etanol 45%, ácido acético 10% y agua destilada). Los
resultados fueron Registrados por fotografía.
2.3.1.3.1.5. Digestión de las proteínas para su análisis
Las manchas proteínicas de cada banda fueron cortadas del gel
manualmente con una hoja de bisturí estéril y digeridas con
15
Tripsina. El protocolo empleado para la digestión fue el de
Shevchenko, Tomas, Havlis, Olsen & Mann (2006) ANEXO 5.
Las bandas de interés cortadas fueron colocadas en tubos
Eppendorf de 1,5ml adicionándoseles 100µL de la mezcla
bicarbonato de amonio 100mM/Acetonitrilo (1:1v/v) y se incubo
con agitación ocasional, por 30 minutos aproximadamente,
posteriormente se adicionó 500µL de Acetonitrilo puro, hasta que
las piezas del gel se tornen blancas y encogidas, posterior a esto se
adicionó 50µL de tripsina (0,1µg/µL) y se incubó en la nevera por
30 minutos, pasado este tiempo se observó si la tripsina fue
absorbida y se agregó más, se dejó incubar por 90 minutos y se
adicionó 20µL de bicarbonato de amonio 50mM hasta cubrir las
piezas del gel, los tubos con las piezas de gel se colocaron en un en
un baño seco a 37°C y se incubaron durante toda la noche,
terminada la incubación, los tubos fueron enfriados a temperatura
ambiente, para la extracción de los péptidos de la muestra digerida
fue necesario adicionar 100µL del buffer de extracción (1:2 v/v) de
acetonitrilo/ácido fórmico al 5% y los tubos fueron incubados a
37°C por 15 minutos con agitación ocasional, posteriormente se
extrajo el sobrenadante y la extracción peptídica fue se almacenada
a -20°C hasta el momento de los análisis.
16
2.3.1.3.2. Columnas cromatográficas ZipTip® de fase reversas
Este procedimiento fue desarrollado siguiendo el protocolo de fábrica
de las columnas Millipore® C4 y C18 en busca de purificar y
fraccionar las proteínas de alto y bajo peso molecular respectivamente,
se prepararon 50 µL de cada una de las soluciones necesarias tal como
se indica en el cuadro siguiente.
Cuadro 1 soluciones empleadas para el fraccionamiento de péptidos y proteínas complejas

mediante Zip Tip® columnas cromatográficas
Soluciones Composición Volumen
1 Hidratación Acetonitrilo 50% en Agua con TFA 0.1% 50µL
2 Lavado Agua con TFA 0.1% 50µL
3 Preparación TFA 2.5% 50µL

Acetonitrilo 5%, 10%,20%, 30%, 50% y
4 Gradiente 50µL
70% en Agua con TFA 0.1%
2.3.1.4. Preparación de matriz para el análisis por espectrometría de masas
Las matrices empleadas para el análisis espectrométrico fueron: ácido
sinapínico 10 mg/mL en Acetonitrilo con 0,1% ácido Trifluroacético
(TFA) y ácido α-Ciano-4-hidroxicinnamico (CHCA) 10mg/ml en
Acetonitrilo con 0,1% TFA. La matriz fue disuelta en un volumen de
solvente apropiado para lograr la necesaria concentración de la matriz. Se
llevó a agitación durante aproximadamente 1 minuto o hasta que disuelva
por completo y posteriormente se centrifugó durante 30 segundos, la
matriz preparada fue conservada a -20°C hasta el momento del análisis.
Las matrices fueron preparadas semanalmente.
17
2.3.1.5.Análisis de las proteínas
Después de la digestión se tomó 1,5µl de la muestra de proteínas y se
mezcló con 1,5µl de matriz homogeneizando minuciosamente, 1µl de la
mezcla fue colocada en el spot de la placa Opti-TOF®. La placa fue
colocada en el espectrómetro de masas y se realizó el análisis siguiendo
las condiciones establecidas ANEXO 6.
2.3.1.5.1. Análisis proteómico por espectrometría de masas:
El análisis por espectrometría de masas se desarrolló usando un
espectrómetro de masas MALDI TOF/TOF MS - Analyzer Applied
Biosystems, los espectros fueron captados en modo MS Linear High
Mass Positive y MS Reflector Positive con un láser Nd:YAG de
335nm de longitud de onda, a una frecuencia de 200Hz (ANEXO 6).
La placa Opti-Tof fue calibrada en un rango de 800 – 1800m/z
utilizando una mezcla de calibrantes [Bradykinin (2–9 clip),
Angiotensin I, human, Glu1-Fibrinopeptide B, ACTH (1–17 clip),
ACTH (18–39 clip), ACTH (18–39 clip)], los espectros se obtuvieron
con 500 disparos de láser (20 puntos de disparo con 25 disparos por
punto) con un potencial de 5000 unidades internas de intensidad de
láser en un rango de masas de 10-1000 m/z 1000-5000m/z y 5000-
20000m/z.
18
Para el análisis de fragmentos de iones en modo de tiempo de vuelo en
tándem (TOF/TOF), se aceleraron los precursores a 8kV y se los
seleccionaron en la puerta de entrada de iones. Además, los
fragmentos generados por colisión de los precursores con aire en la
cámara de disociación inducida por colisión (CID) se aceleraron a
15kV en la fuente 2 y se analizaron sus masas después de pasar por el
reflector de iones.
El análisis automático de los datos se realizó usando el programa
informático 4000 Series Explorer versión 3.5.3 (Applied Biosystem).
Para la calibración interna de los espectros de masas del MALDI-TOF
se usaron los iones de autolisis de la tripsina 842.510m/z y
2211.105m/z.
La reproducibilidad de los análisis fue medido por el cálculo de la
desviación estándar de los valores obtenidos de las intensidades
relativas de las señales de los espectros MALDI.
2.3.1.5.2. Identificación de proteínas:
Los datos MS y MS/MS fueron combinados mediante la búsqueda en
el software ProteinPilotTM Software 4.0 con ayuda del Paragon™
algoritmo (Matrix Science, Boston, MA) usando el GPS Explorer
software, Versión 3.6 que permite la búsqueda no redundante. Los
datos obtenidos fueron contrastados contra de la base de datos del
Centro Nacional para la Información Biotecnológica no redundante
(NCBInr). Las proteínas funcionales de Engraulis ringers
19
identificadas previamente con el software fueron comparadas
manualmente para la conformación antes de la aceptación de los
resultados. La homología de proteínas conocidas se determinó
mediante la búsqueda en las bases de datos de proteínas en la NCBI
con BLAST.
2.3.2. ANALISIS LIPIDÓMICO
2.3.2.1. EXTRACIÓN DE LÍPIDOS TOTALES
La extracción de lípidos se desarrolló por el método de Bligh & Dyer
(1959) con las mínimas modificaciones (ANEXO 13). Para lo cual se
tomó 1 volumen de muestra y se añadió un volumen establecido de la
mezcla (1:2vol/vol) Cloroformo:Metanol, la mezcla se homogenizó
durante 1 minuto, posteriormente se añadió 1 volumen de cloroformo y
se agitó con ayuda de un vórtex durante 30 segundos, seguidamente se
añadió 1 volumen de agua destilada y se agitó vigorosamente por 30
segundos, la mezcla resultante se centrifugó a 1000rpm durante 5
minutos a temperatura ambiente, se recuperó el precipitado de la fase
inferior o clorofórmica, esta fase se lavó con agua destilada 3 veces. Se
tomó la fase inferior y se rotuló como MLT (muestra de lípidos totales) y
se almacenaron a -20°C hasta el momento del análisis.
20
2.3.2.2. ANÁLISIS DE LÍPIDOS
Los lípidos en cloroformo fueron homogenizados por 1 minuto
aproximadamente con una solución de cloruro de sodio (NaCl) 1M,
recuperándose posteriormente la fase clorofórmica. Se tomó 2µl de la
muestra y se mezcló con 5µl de la matriz DHB 40mg/ml en
Meltanol:Acetona:Eter etílico (3:5:1 v/v/v), homogeneizándose por 1
minuto aproximadamente, de esta mezcla se tomó 1µl y se colocó en los
spot correspondientes de la placa OPTI TOF®, los análisis se realizaron
por triplicado. El secado y proceso de cristalización se desarrolló a
temperatura ambiente. La placa fue colocada en el espectrómetro de
masas MALDI TOF/MS y se desarrolló la corrida con las condiciones
establecidas ANEXO 15.
2.3.2.2.1. Análisis lipidómico por espectrometría de masas:
El análisis por espectrometría de masas se desarrolló en 4800 Matrix
Assisted Laser Desorption Ionization Tandem Time-Of-Flight Mass
Spectrometer (4800 MALDI TOF/TOF MS Analyzer Applied
Biosystems), los espectros fueron adquiridos en modo MS Reflector
Positivo, la ionización se realizó con un láser Nd:YAG de 335nm de
longitud de onda, a una frecuencia de 200Hz, Opti-Tof fue calibrada
en un rango de 800 – 1800m/z utilizando una mezcla de calibrantes
[Bradykinin (2–9 clip), Angiotensin I, human, Glu1-Fibrinopeptide B,
ACTH (1–17 clip), ACTH (18–39 clip), ACTH (18–39 clip)], los
espectros se obtuvieron con 250 disparos del láser (25 puntos de
disparos con 10 disparos por punto) con un potencial de 5600
21
unidades internas de intensidad de láser en un rango de masas de 500-
1500 m/z correspondiente a rango de masas de los Lípidos.
Para el análisis de fragmentos de iones en modo de tiempo de vuelo en
tándem (TOF/TOF), se aceleraron los precursores a 8kV y se
seleccionaron en la puerta de entrada de iones. Además, los
fragmentos generados por colisión de los precursores con aire en la
cámara de disociación inducida por colisión (CID) se aceleraron a
15kV en la fuente 2 y se analizaron sus masas después de pasar por el
reflector de iones.
El análisis automático de los datos se realizó usando el programa
informático 4000 Series Explorer versión 3.5.3 (Applied Biosystem).
Para la calibración interna de los espectros de masas del MALDI-TOF
se usó el ion de 1, 2, 3-tri-(9Z-octadecenoyl)-glycerol (Triolein

+
[OOO]) m/z= 884.7833 y en su forma ionizada [M + Na] m/z =
907.7725. La reproducibilidad de los análisis fue medido por el
cálculo de la desviación estándar de los valores medidos de las
intensidades relativas de las señales de los espectros MALDI.
2.3.2.2.2. Identificación de Lípidos
Las masas obtenidas en los espectros fueron filtradas con ayuda del
software mMass 4.0 para eliminación de masas contaminantes e
interferentes al momento de la interpretación, posteriormente, las
masas resultantes de dicho proceso fueron analizadas con ayuda del
SimLipid Software (PREMIER Biosoft International, USA).
22
III. RESULTADOS
3.1. ANALISIS FÍSICO-QUÍMICO DE LOS EFLUENTES
Los análisis físico-químicos de los efluentes de la industria
procesadora de harina y aceite de pescado fueron realizados siguiendo el
protocolo para el monitoreo de efluentes y cuerpo marino receptor. Ministerio
de pesquería. R.M. N°003-2002-PE. Pág. 215568, 215575, 215576 y 25577;
los resultados se muestran en el cuadro siguiente:
Cuadro 2 parámetros físico-químicos evaluados en los efluentes de la industria procesadora

de harina y aceite de pescado.
Muestra pH T° DBO(mg/L) SST (mg/L) AyG (mg/L)

Agua de bombeo 6,21 22,7 16,700 4949,7 3268,7
Efluente Planta 6,8 54,5 1,175 5,68 4,0
Efluente PAMA 6,9 21,1 27,5 28,3 1,73

Fuente: Corporación pesquera Inca S.A.C. - Certificaciones del Perú S.A. - CERPER
DBO = Demanda Bioquímica de Oxígeno.

SST = Sólidos Suspendidos Totales
AyG = Aceites y grasas.
El cuadro 2 muestra los parámetros de calidad de los diferentes
efluentes generados durante el procesamiento de harina y aceite de pescado.
Los efluentes PAMA (analizados durante esta investigación) son los efluentes
vertidos al mar y como se puede observar los valores obtenidos se encuentran
por debajo de los establecidos como máximos por la política nacional.
23
3.2. ANÁLISIS PROTEÓMICO DE LOS EFLUENTES PESQUEROS
3.2.1. RECUPERACIÓN DE PROTEÍNAS
Con el objetivo de maximizar el número de proteínas recuperadas, los
efluentes pesqueros fueron sometidos a diversos análisis (Sánchez, 2001.,
García, 2007 & Benndorf, Vogt, Jehmlich, Schmidt, & Thomas, 2009). De
los cuales el protocolo de precipitación de proteínas con TCA–A, detallado en
la sección material y métodos fue el que presentó los mejores resultados.
7
concentración (mg/mL)
6
5 Sánchez
4 García
3 Laboratorio
2 Benndorf
1
0
AB EF PAMA EF Planta
Figura 1 Precipitación de proteínas de diferentes muestras de efluentes de la industria

procesadora de harina y aceite de pescado.
Como se puede observar en la figura 1 el protocolo estandarizado fue
empleado con diferentes muestras líquidas procedentes de la industria
productora de harina y aceite de pescado de la Corporación Pesquera INCA
S.A.C. Las diferencias en la concentración de proteínas de cada uno de los
efluentes analizados son notorias. El agua de Bombeo (AB) presenta mayor
concentración de proteínas en comparación a los efluentes resultantes de la
producción de harina y aceite de Anchoveta (EF PAMA) y los efluentes
resultantes de la limpieza de planta pesquera (EF Planta). De las tres

24
muestras analizadas los efluentes PAMA son los empleados en este estudio,
ya que son el resultado final del proceso reductor de especies marinas y el
cual es eliminado hacia el mar a través de un emisor submarino
Tras optimizar el protocolo de recuperación de proteínas de los
efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de pescado se
determinó la concentración de proteínas utilizando un cuantificador comercial
Fluorómetro Qubit® - Invitrogen, obteniéndose extractos proteínicos de
aproximadamente 500µL con una concentración de proteínas en promedio de
0.011 mg (Anexo 12).
La figura 2 muestra la concentración de proteínas en µg/ml de cada
una de las muestras analizadas durante la presente investigación. La figura
muestra concentraciones mínimas de 0,008mg/ml y máximas de 0.013 mg/ml.
Proteínas de efluentes pesqueros
14
12
Concentración µg/ml
10
8
6
4
2
0
M13
M15
M11
M17
M19
M21
M23
M25
M27
M29
M31
M33
M35
M37
M39
M1
M3
M5
M7
M9
Código de muestra
Figura 2 Concentración de proteínas recuperadas de los efluentes de la industria

procesadora de harina y aceite de pescado de la corporación pesquera INCA S.A.C
25
3.2.2. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA SDS-PAGE
Tras la recuperación de proteínas, se realizaron geles de poliacrilamida a
diferentes concentraciones con el objetivo de identificar la concentración de
poliacrilamida adecuada para la mejor visualización de bandas de las proteínas
recuperadas.
Figura 3 Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE al 12,5%
26
La figura 3 muestra un gel de poliacrilamida al 12.5%, esta concentración resultó
ser la más conveniente para la separación de las proteínas recuperadas de los
efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de pescado. Las bandas
visualizadas a lo largo de los carriles E1, E2 y E3 correspondientes a las muestras
de efluentes pesqueros y los carriles M1, M2, M3 y M4 corresponden a proteínas
extraídas de músculo de Anchoveta, los cuales se emplearon con fines
comparativos.
3.2.3. ANÁLISIS ESPECTROMÉTRICO DE LAS PROTEÍNAS
RECUPERADAS
Se realizaron varios análisis previos para determinar la presencia de masas
proteínicas en los efluentes pesqueros, los cuales fueron analizados en los
diferentes rangos de masas correspondientes a los niveles bajo, medio y alto
peso molecular tal como se muestra en las figuras 4 – 6; en estas figuras se
puede apreciar la amplia presencia de masas correspondiente a una gran
concentración de especies proteínicas en los efluentes en análisis.
Final - Shots 500 - INDUSTRIA CMC B

171.64(R2016,S73)
379.07(R3026,S280)
100
90 1.7E+4
80
70 163.76(R795,S123) 587.07(R6433,S161)
60 294.08(R3026,S176)
457.09(R6066,S137)
50 372.22(R5844,S123)
550.06(R6368,S121)
40 440.06(R3558,S95)
146.80(R842,S70)
284.32(R5656,S105)
30
518.10(R5931,S73)
706.10(R5911,S72)
620.10(R6504,S61)
363.07(R6088,S48)
111.85(R998,S48) 485.08(R9328,S30)
20 211.56(R4741,S32)558.10(R6703,S27)
292.09(R7158,S29) 705.09(R7144,S30)
810.12(R8743,S22
626.09(R6997,S25)
897.14(R7843
10 368.41(R6949,S17)
144.80(R2713,S15)
38.94(R1874,S12)
0
9.0 207.8 406.6 605.4 804.2 1003.0
Mass (m/z)
Figura 4 Espectro de masas de las proteínas recuperadas de los efluentes pesqueros. El análisis fue
realizado en el rango de masas de 10 – 1000 m/z
27
Final - Shots 500 - INDUSTRIA CMC B
100 1035.99(R15543,S22)
90 1067.90(R11115,S16) 576.5
80
70 1023.70(R16993,S13)
60
50 1434.05(R17745,S14)
1995.28(R18574,S22)
1109.04(R9886,S11)
40 2338.44(R23304,S19)
2018.25(R20928,S13)
1481.86(R19361,S10) 3472.27(R28107,S56)
3067.12(R25902,S37)
4259.72(R27347,S
30 2718.32(R26764,S22) 4602.94(R288
3838.66(R28381,S65)
20 2357.21(R25341,S11)
1900.40(R14361,S13)
3225.90(R29962,S26)
3515.04(R31231,S28)
4254.96(R26730,S
2825.88(R28300,S15) 4544.12(R309
3969.19(R29559,S16
10
0
1000.0 1803.2 2606.4 3409.6 4212.8 5016.0
Mass (m/z)
Figura 5 Espectro de masas de las proteínas recuperadas de los efluentes pesqueros. El análisis
fue realizado en el rango de masas de 1000 – 5000 m/z
Final - Shots 500 - ALTO PESO II US

100 5000.14(R1359,S13)
90 3766.3
80 5019.60(R706,S14)
70 5267.02(R658,S7)
60
50 5995.23(R672,S10)
40 7090.12(R932,S7)
30 8566.27(R468,S17)
20 10446.98(R474,S13)
12589.57(R576,S15)
10 14308.33(R242,S9)
15892.47(R681,S8)
17641.88(R297,S7)
25264.81(R242,S
21270.84(R335,S14)
27246.84(R3
19216.26(R455,S9)
22995.52(R339,S15)
0
4999.0 10017.2 15035.4 20053.6 25071.8 30090.0
Mass (m/z)
Figura 6 Espectro de masas de las proteínas recuperadas de los efluentes pesquero. El análisis
fue realizado en el rango de masas de 5000 – 30000 m/z
Las proteínas extraídas de las bandas, siguiendo el protocolo de Shewshenco
et al. (2006) fueron digeridas y co-cristalizadas con matriz CHCA y analizadas
con el espectrómetro de masas MALDI TOF/TOF, obteniendo diversos espectros
de masas, tal como se muestra en las figuras siguientes:
Final - Shots 400 - BAJO PESO SEXTO USO;

615.50(R5501,S1587)
100
6.6E+4
90
80 597.47(R2159,S1202)
70
60 579.17(R1019,S369)
1229.91(R9877,S3287)
50
40 560.77(R1968,S71)
30
20 653.47(R9119,S261)
10 568.23(R8032,S45)
1233.91(R11083,S91)
865.62(R10397,S53)
1844.25(R12934,S30)
2239.85(R20616,S18)
2757.42(R26955,S20)
3504.01(R25721
3088.17(R28879,S20)
0
499.0 1201.6 1904.2 2606.8 3309.4 0
4012.0
Mass (m/z)
Figura 7. Espectro de masas de una muestra digerida del concentrado de proteínas obtenido de los
efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de pescado
28
Espectros MS/MS del spot set P18
Final - Shots 750 - BAJO PESO SEXTO US

100 579.43(R2804,S
430.38(R2489,S1164)
2.7E+4
90
80
70 412.40(R1460,S867)
60
50
40 561.38(R3033,S3
30
20 58.09(R1673,S428) 394.35(R1668,S203)
10 112.11(R1806,S160)
168.11(R2344,S104)
44.06(R1963,S33) 581.02(R8545,S
479.34(R5493,S13)
416.28(R4042,S8)
225.15(R1796,S24) 532.71(R5913,S9)
328.20(R5190,S8)
0
9.0 133.6 258.2 382.8 507.4 632.0
Mass (m/z)
Figura 8 Espectro de masas MS/MS del pico 597.47 Resolución: 2156 Señal ruido: 1202
El cuadro 3 muestra algunas de las masas generadas durante el análisis
MS/MS del pico 597.47. La fragmentación de este pico genero 377 masas, de las
cuales las masas mostradas corresponden a aquellas con las más altas tasas de
Señal/Ruido (S/N) y área cluster.
Cuadro 3 Masas obtenidas del análisis MS/MS del pico 597.47
Index Centroid Lower Upper Height S/N Resolution Area Clust.

Mass Bound Bound Area
7 58.09 58.02 58.21 4095 428 1674 28881.39 30914.92
17 84.11 84 84.21 999 104 1720 8398.17 8900.04
23 99.10 99.03 99.17 1196 124 2446 7581.81 8020.03
26 112.11 111.93 112.28 1533 160 1806 12903.29 13774.02
41 168.11 167.94 168.29 992 104 2344 10638.57 11388.52
50 394.35 394.12 394.72 3926 203 1668 69523.48 92747.28
63 412.40 412.09 412.89 17324 867 1460 349952.34 461851.69
83 430.38 430.16 430.89 23973 1164 2489 312600.31 411352.88
143 561.38 560.91 561.67 6859 332 3034 101518.8 138534.83
144 562.60 562.41 563 4073 199 2432 84313.87 116652.21
177 579.43 578.96 580.06 24489 1197 2805 401968.84 558626.31
29
Final - Shots 750 - BAJO PESO SEXTO
597.48(R23
100
90 5.4E+4
80 448.39(R2926,S1151)
70
60
50 580.64(R335
40 430.42(R1958,S550)
30 58.09(R1691,S990)
20 412.37(R2276,S204)
10 112.11(R1725,S244)
190.09(R2629,S157)
55.08(R1725,S116) 562.62(R2259
497.34(R3839,S99
266.20(R2165,S8)
0
9.0 137.2 265.4 393.6 521.8 650.0
Mass (m/z)
Centroid Lower Upper

Index Height S/N Resolution Area Clust. Area
Mass Bound Bound
18 41.06 41 41.17 1593 109 1513 10739.43 10739.43
29 55.08 55 55.21 1637 116 1726 12783.76 13752.91
31 58.09 57.98 58.19 14466 990 1691 96998.41 97710.73
53 84.10 84.02 84.19 2347 165 1260 21014.56 22267.9
62 99.10 99.02 99.27 2051 145 1947 16265.14 17371.5
70 112.11 111.92 112.28 3454 244 1725 33272.02 35696.69
117 166.10 165.98 166.27 1568 115 2044 14611.53 16908.76
118 168.12 167.97 168.36 1631 119 2136 17149.47 19607.91
132 190.09 189.93 190.31 2178 157 2630 17274.58 19296.04
179 412.37 412.13 412.77 6272 204 2276 92186.72 122721.27
189 430.42 430.06 431.01 17584 550 1959 294238.53 383619.66
203 446.42 445.97 447.01 5129 159 1815 88314.21 118069.4
204 448.39 448.01 448.94 37533 1151 2927 472879.31 626077.38
238 562.62 562.23 562.95 3336 101 2259 54953.33 78582.48
256 579.43 579.05 579.88 21968 648 3900 262331.03 354260.25
257 580.64 580.49 581.19 17473 532 3352 273245.47 393419.56
282 597.48 596.93 598.14 51065 1588 2370 917541.5 1375242.63
30
Final - Shots 750 - BAJO PESO SEXTO
615.43(R2360,S3020)
100
90 3.2E+4
80
70
60
50
40 597.42(R2256,S805)
30
20 58.08(R1828,S1036)
448.37(R2446,S386)
579.38(R3486,S318)
10 168.09(R3639,S183)
41.06(R1716,S123)
432.24(R5720,S14)
279.19(R3797,S19) 923.33(R8072,S10)
742.48(R7894,S9)
1041.31(R9771,S
1181.47(R8
0
9 267 525 783 1041 1299
Mass (m/z)
Centroid Lower Upper Clust.

Index Height S/N Resolution Area
Mass Bound Bound Area
3 23.00606 22.96 23.11 10701 995 1424 56176.08 56176.08
11 38.98231 38.88 39.09 23503 2185 1679 139219.03 139219.03
12 40.97997 40.94 41.02 1446 134 1765 7441.53 7441.53
27 58.08346 58.02 58.23 5950 569 1812 38603.95 40897.24
49 84.09716 84.01 84.25 2831 267 2177 19350.58 19941.36
112 161.00874 160.84 161.14 1156 109 2268 9883.43 10253.21
133 190.0515 189.94 190.3 32057 3103 2242 278678.06 302253.47
134 192.05835 191.94 192.31 1329 112 2086 13181.32 10756.96
153 206.0661 205.84 206.3 31172 3030 2406 272597.41 298123.03
154 208.0546 207.93 208.46 3169 285 2433 27643.93 25810.15
194 515.43158 515.16 515.95 22878 694 1981 361940.66 514177.88
201 531.367 530.87 531.96 29838 896 3984 336511.66 468952.09
267 635.36481 635.02 635.67 7605 199 3878 141664.83 150544.17
268 637.5733 637.04 638.15 51948 1579 1226 1378139.5 1967999.75
269 639.46588 639.11 640.02 16418 420 2693 261225.63 263995.53
31
3.2.4. IDENTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EXTRAÍDAS
Las masas de obtenidas durante el análisis MS/MS fue contrastada con
ayuda del software ProteinPilot con las masas de secuencias de proteínas
homologas de otras especies de peces descargadas de la base de datos de
UNIPROT y comparadas con ayuda del algoritmo PARAGONTM.
Las masas de los picos seleccionados como precursores no generaron
similitud con la bases de datos de proteínas Engraulis ringens “anchoveta
peruana” ni de otras especies marinas afines.
32
3.3. ANÁLISIS LIPIDÓMICO DE LOS EFLUENTES PESQUEROS
Este estudio requirió la aplicación de diversas técnicas, las cuales
permitieron la obtención de los mejores resultados, dentro de estos
procedimientos destacan los siguientes:
3.3.1. RECUPERACIÓN DE LÍPIDOS DE LOS EFLUENTES PESQUEROS
En la figura 11 se puede observar los valores promedio de las cantidades de
lípidos recuperados de diversas muestras líquidas de la industria procesadora de
harina y aceite de pescado. En esta misma figura se puede observar que el agua
de bombeo (AB) es el efluente pesquero del cual se puede obtener mayor
concentración de moléculas lipídicas, seguida por los efluentes empleados en
esta investigación. Como se observa en la figura anterior, se logró una
recuperación 23,5mg de lípidos de una muestra de Efluentes pesqueros
empleando con el método de Bligh & Dyer frente a los 16,4mg logrados con el
método de Folch y los 5,3mg obtenidos con el uso de hexano.
60
concentración (mg/mL)
50 AB
40
Efluente PAMA
30
20 Efluente Planta
10
0
Bligh & Dyer Folch Hexano
Figura 11 Recuperación de Lípidos de diferentes muestras de efluentes de la industria

33
Tras optimizar el protocolo de recuperación de lípidos de los efluentes
de la industria procesadora de harina y aceite de pescado se determinó la
concentración aproximada de dichas moléculas. Utilizando el método de
Bligh & Dyer lográndose recuperar en promedio 1,6µg de moléculas lipídicas
por cada ml de muestra de efluentes empleada (Anexo 19), las muestras
obtenidas fueron almacenadas a -20°C para los análisis posteriores.
En la figura 12 se muestra la concentración de moléculas lipídicas
µg/ml de cada una de las muestras analizadas en la presente investigación. La
figura muestra concentraciones mínimas y máximas de 1.1µg/ml y 1.9µg/ml
de lípidos respectivamente.
Lípidos de efluentes pesqueros
2
Concentración µg/ml
1.5
0.5
0
M1 M3 M5 M7 M9 M11 M13 M15 M17 M19 M21 M23 M25 M27 M29
Código de muestra
Figura 12 Concentración de lípidos recuperados de los efluentes de la industria procesadora de

harina y aceite de pescado de la corporación pesquera INCA S.A.C
34
3.3.2. ANÁLISIS ESPECTROMÉTRICO DE LOS LÍPIDOS RECUPERADOS
3.3.2.1.Selección de la matriz de análisis
Existen principalmente dos características que tienen un impacto
importante en la calidad de los espectros MS, la homogeneidad de la mezcla
matriz muestra y la potencia del láser aplicado. Con el objetivo de establecer
una técnica de análisis coherente se realizaron varios ensayos (Jakab, Nagy,
Héberger, Vékey & Forgács, 2002., Lay, Liyanage, Durham & Brooks,
2006., Picariello, Paduano, Sacchi & Addeo, 2009 & Chapagain & Wiesman,
2009) enfocados a la selección de la combinación adecuada de matriz-
muestra que sea capaz de generar cristales homogéneos que produzcan la
ionización total de la muestra en estudio y que además garantice la
reproductibilidad del método de análisis.
En la figura 13 se puede apreciar las diferentes spot realizados con
diferentes técnicas de preparación de matriz, se puede apreciar que en las
imágenes A, B, C y D si bien ocurre la cristalización, ésta no es homogénea,
lo cual podría representar un interferente importante en la reproducibilidad de
los espectros de los lípidos analizados, en la imagen E se puede apreciar la
cristalización de la matriz estándar empleada en el laboratorio, si bien dicha
matriz presenta cristalización homogénea, también presenta ciertas
deficiencias, tal como, re-humedecimiento, lo cual interfiere no sólo en el
análisis sino también en la calidad de los datos obtenidos. Finalmente, se
realizaron ciertas modificaciones a la matriz estándar, logrando obtener el
spot deseado imagen 9-F, el cual superó los problemas anteriormente
35
presentados, permitiendo la obtención de espectros reproducibles y datos de
calidad para el análisis de lípidos recuperados de los efluentes pesqueros.
Figura 13 Cristalización vista al estereoscopio de las diferentes matrices analizadas.

A=Chapainaing (2009), B= Jakab (2002), C= Lay (2006), D=Picarello (2009), E=
Estándar del laboratorio y F= Estándar con modificaciones
En la figura 14 se muestran los perfiles de masas correspondiente a
muestras de Aceite de Anchoveta de Consumo Humano Indirecto (CHI) y de
lípidos totales extraídos de los efluentes de la industria procesadora de harina
y aceite de pescado; la reproducibilidad de la técnica obtenida por la co-
cristalización homogénea entre la matriz seleccionada y el analito en
evaluación es evidente en ambas imágenes.
36
Figura 14 Perfiles de masas generados de la co-cristalización matriz-analito. (A) Muestra
Aceite de Anchoveta de Consumo Humano Indirecto (CHI) y (B) Muestra Lípidos totales
extraídos de los efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de pescado.
3.3.2.2. Selección de la intensidad de láser
La intensidad del láser es otro de los parámetros a tener en cuenta para la
obtención de espectros reproducibles, para evaluar este parámetro se realizó
una serie de ensayos, utilizando Glicerol trioleate como estándar del estudio,
con el fin de identificar la intensidad de láser en la cual la fragmentación de
las moléculas sea mínima.
37
Como se puede observar en la figura 15 se probaron diferentes
intensidades de láser para identificar la idónea para desarrollar el análisis.
Con intensidad de 5200 unidades internas la tasa de señal ruido mejoró
lográndose observar la aparición de un segundo pico (923.7 Da)
correspondiente a la formación de un aducto del estándar empleado en el
análisis (figura 15-B).
Se seleccionó 5200 unidades internas como potencial de láser para los
futuros análisis de los lípidos recuperados de los efluentes de la industria
procesadora de harina y aceite de pescado de la Corporación Pesquera INCA
S.A.C.
Figura 15 espectros de masas MALDI TOF/MS en modo positivo de Glyceryl

trioleate con matriz DHB tomada con diferentes intensidades de láser (todos los
valores son dados en unidades internas del espectrómetro de masas (A=4900, B=5200,
C= 5500).
38
3.3.2.3. Análisis MALDI TOF/MS de los lípidos extraídos:
Utilizando DHB 40 mg/ml como matriz de análisis y empleando el
método de gota seca se realizó el spot de las diferentes muestras de lípidos
recuperados de los efluentes pesqueros, obteniéndose los perfiles de masas
correspondientes a las moléculas lipídicas de los efluentes de la industria
procesadora de harina y aceite de pescado (figuras 17 - 20). La limpieza de
masas contaminantes se desarrolló con el uso del software de acceso libre
mMass 4.0 (figura 16).
Figura 16 espectros de masas de los lípidos de los efluentes pesqueros previo a la

limpieza de masas A espectros de todas las repeticiones, B espectro consenso de lípidos
totales después de la limpieza de masas.
39
La figura 17 muestra el espectro de masas MS de los lípidos
recuperados en el rango 550 – 1200m/z y un espectro parcial en el rango de
550 – 700 m/z en el cual se puede observar que las moléculas predominantes
en este rango fueron los Diacylglicéridos (DG), los cuales presentaron tasas
de señal ruido en promedio de 24, muy cercana a nuestro umbral y como tal
sólo 9 asignaciones de DG se muestran en este rango, por lo tanto se cree que
esta región estuvo dominada por restos de ácidos grasos C20.

industria procesadora de harina y aceite de pescado en el rango de 500 – 700m/z
En la figura 18 se puede observar el espectro parcial de masas en el
rango de 800 – 900 m/z en el cual se observa la predominancia de los
Triacylglicéridos (TAG) con 20 asignaciones (cuadro 7).
40
Figura 18 espectros parcial MS de las muestras de lípidos recuperados de los efluentes de la
La figura 18 muestra el espectro parcial de los lípidos recuperados de los
efluentes pesquero en el rango de 900 – 1000 m/z, 16 moléculas de TAG fueron
asignadas en este rango, dichas asignaciones incluyen TAG que contienen ácido
eicosapentanoico (A5, EPA) y ácido docosahexaenoico (D6, DHA) en su estructura.

41
En la figura 20 se puede observar el espectro parcial de los lípidos
recuperados de los efluentes pesqueros en el rango de 1000 – 1200m/z, en
este rango 5 asignaciones corresponden a los Triacilglicéridos [TAG]; 3 a los
Esfingolípidos [SP] y 1 asignación corresponde a los Prenoles [PR].
En el rango de masas de 1200 a 1500 se realizaron 8 asignaciones, de
las cuales 6 corresponden a los [SP] y 1 asignación a los Prenoles [PR] y
Glicerofosfolípidos [GP] respectivamente (cuadro 7).
En las figuras anteriores se puede apreciar los espectros de masas de
las principales moléculas lipídicas identificadas mediante el análisis MALDI
TOF-MS las cuales en la mayoría corresponden a moléculas en
concentraciones mínimas, esto debido a la poca relación señal ruido mostrada
durante el análisis.
42
3.3.2.4. Análisis MS/MS de las masas lipídicas:
En el cuadro 6 se puede observar la lista de ácidos grasos que componen el
aceite de pescado tanto de Consumo Humano Directo e Indirecto (CHD y
CHI respectivamente), los cuales fueron identificados mediante análisis de
calidad con la técnica de cromatografía de gases, la obtención de los
valores teóricos de m/z mediante el análisis espectrométrico MALDI TOF
permitió la atribución de las masas a las moléculas lipídicas que fueron
recuperadas de los efluentes pesqueros en análisis, dichas atribuciones de
pueden observar en la cuadro 7.
Cuadro 6 Ácidos grasos identificados en aceite de pescado de la planta de la corporación

pesquera INCA S.A.C mediante cromatografía de gases
Ácido graso Peso molecular Nombre Identidad* % CHD** % CHI**

C14:0 228.2089 Myristic acid (M) 9.0 9.1
1
C14:1 226.1933 Myristoleic acid (M ) 0.4 0.5
C16:0 256.2402 Palmitic acid (P) 16.4 16.5
C16:1 254.2246 Palmitoleic acid (P1) 8.4 9.1
C18:0 284.2715 Stearic acid (S) 2.3 2.3
C18:1 282.2559 Oleic acid (O) 2.7 2.9
C18:2 280.2402 Linoleic acid (L) 7.5 6.5
C18:3 278.2246 Linolenic acid (Ln) 2.6 2.7
C20:0 312.3028 Arachidic acid (A) 0.8 0.9
C20:1 310.2872 C20:1 (A1) 1.6 2.1
C20:2 308.2715 C20:2 (A2) 0.4 0.4
C20:3 306.2559 C20:3 (A3) 1.7 0.0
4
C20:4 304.2402 C20:4 (A ) 0.6 0.7
5
C20:5 302.2246 EPA (A ) 25.4 24.0
C22:0 340.3341 Docosanoic acid (D) 0.4 0.4
C22:1 338.3185 C22:1 (D1) 0.9 0.9
C22:6 328.2402 DHA (D6) 5.9 6.7
C23:0 354.3498 Tricosanoic acid (T) 0.0 0.0
C24:0 368.3654 Lignoceric acid (Li) 2.9 2.6
C24:1 366.3498 Nervonic acid (N) 0.0 0.1
* Adoptado de las referencias Ayorinde et al. 1999.
** % de abundancia en muestras de Aceite de Consumo Humano Directo e Indirecto.
43
Cuadro 7 Atribuciones de las principales masas mostradas durante el análisis MALDI TOF/TOF MS de los efluentes de la industria procesadora de harina
y aceite de pescado.
Comp. m/z m/z Δ

Atribución Lipid ID Nombre sistemático
Química Experimental Teórica masas
[M1A5] Fragmento --- --- 567.7193 --- ---
[MA5] Fragmento --- --- 569.6845 --- ---
[P1A5]+ Fragmento --- --- 595.5041* --- ---
[PA5]+ Fragmento --- --- 597.8914* --- ---
[LnA5]+ Fragmento --- --- 619.5642 --- ---
[OA5]+ Fragmento --- -- 623.1692 --- ---
[LnA1]+ Fragmento --- --- 627.2667* --- ---
[A5A6]+ Fragmento --- --- 641.991* --- ---

1-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2-(5Z,8Z,11Z,14Z-
[LnA4 + Na]+ LMGL02010142 C41H66O5 661.3254 661.4802 0.1548
eicosatetraenoyl)-sn-glycerol
1-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2-(8Z,11Z,14Z-eicosatrienoyl)-
[LnA3 + Na]+ LMGL02010130 C41H68O5 663.4472 663.4959 0.0487
sn-glycerol
[PA3 +Na]+ LMGL02010116 1-hexadecanoyl-2-(10Z,13Z,16Z-docosatrienoyl)-sn-glycerol C41H74O5 669.3956* 669.5428 0.1472
[LA + Na]+ LMGL02010089 1-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-2-eicosanoyl-sn-glycerol C41H76O5 671.347 671.5585 0.2115
[AS + Na]+ LMGL02010008 1-eicosanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycerol C41H80O5 675.5635 675.5898 0.0263
[MMS + Na]+ LMGL03012761 1,2-ditetradecanoyl-3-octadecanoyl-sn-glycerol C49H94O6 801.7652* 801.6943 0.0709

1-(9Z-tetradecenoyl)-2-(9Z-hexadecenoyl)-3-(9Z,12Z-
[M1P1L + Na]+ LMGL03014658 C51H90O6 821.618* 821.6630 0.045
octadecadienoyl)-sn-glycerol
1-tetradecanoyl-2-(9Z-hexadecenoyl)-3-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-
[MP1L + Na]+ LMGL03014252 C51H92O6 823.6781* 823.6786 0.0005
sn-glycerol
1-tetradecanoyl-2-(9Z-hexadecenoyl)-3-(9Z-octadecenoyl)-sn-
[MP1O + Na]+ LMGL03014251 C51H94O6 825.7432 825.6943 0.0489
glycerol
[PP1P + Na]+ LMGL03010017 1,2-dihexadecanoyl-3-(9Z-hexadecenoyl)-sn-glycerol C51H96O6 827.6564 827.7099 0.0535
44
1,2-di-(9Z-hexadecenoyl)-3-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-sn-
[P1P1Ln + Na]+ LMGL03010078 C53H92O6 847.3107* 847.6786 0.3679
glycerol
[P1P1L +Na]+ LMGL03010064 1,2-di-(9Z-hexadecenoyl)-3-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycerol C53H94O6 849.6602 849.6942 0.034
[PPLn + Na]+ LMGL03010054 1,2-dihexadecanoyl-3-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-sn-glycerol C53H96O6 851.451 851.7099 0.2589
[PPO + Na]+ LMGL03010005 1,2-dihexadecanoyl-3-(11E-octadecenoyl)-sn-glycerol C53H100O6 855.6964 855.7412 0.0448
[PSS + H]+ LMGL03010069 1-hexadecanoyl-2,3-dioctadecanoyl-sn-glycerol C55H106O6 862.6392 862.7989 0.1597

1-tetradecanoyl-2-(6Z,9Z,12Z-octadecatrienoyl)-3-
[MLnA5 + Na]+ LMGL03014410 C55H90O6 869.9217* 869.6630 0.2587
(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-eicosapentaenoyl)-sn-glycerol
1-(9Z-hexadecenoyl)-2,3-di-(6Z,9Z,12Z-octadecatrienoyl)-sn-
[P1LnLn + Na]+ LMGL03012993 C55H92O6 871.6502* 871.6786 0.0284
glycerol
[PLnLn + Na]+ LMGL03010192 1-hexadecanoyl-2,3-di-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-sn-glycerol C55H94O6 873.0115* 873.6942 0.6827
[PLL + Na]+ LMGL03010141 1-hexadecanoyl-2,3-di-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycerol C55H98O6 877.2823* 877.7255 0.4432
[POO + Na]+ LMGL03010100 1-hexadecanoyl-2,3-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero C55H102O6 881.7477* 881.7568 0.0091
[SOO + H ]+ LMGL03010217 1-octadecanoyl-2,3-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycerol C57H106O6 887.6477 887.8062 0.1587

1-(9Z-tetradecenoyl)-2,3-di-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-
[M1A5A5 + Na]+ LMGL03012862 C57H88O6 891.6574 891.6473 0.0101
eicosapentaenoyl)-sn-glycerol
1-(9Z-hexadecenoyl)-2-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-
[P1LnA5 + Na]+ LMGL03010559 C57H92O6 895.5785* 895.6786 0.1001
1-(9Z-hexadecenoyl)-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-3-
[P1A5L + Na]+ LMGL03010503 C57H94O6 897.7323 897.6943 0.0380
1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-3-
[PA5L + Na]+ LMGL03010451 (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z- C57H96O6 899. 7123 899.7099 0.0024
[OLL + Na]+ LMGL03010327 1-(9Z-octadecenoyl)-2,3-di-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycerol C57H100O6 903.6369* 903.7412 0.1043
1-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-2,3-di-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-
[LA5A5 + H]+ LMGL03011473 C61H94O6 922.7029 922.7050 0.0021
1-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-2-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-
[LLnA + Na]+ LMGL03010591 C59H104O6 931.6755 931.7725 0.097
eicosanoyl-sn-glycerol
1-octadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-3-eicosanoyl-sn-
[SLA + Na]+ LMGL03010427 C59H110O6 937.9019* 937.8194 0.0285
glycerol
[P1AA + Na]+ LMGL03010378 1-(9Z-hexadecenoyl)-2,3-dieicosanoyl-sn-glycero C59H112O6 939.5538 939.8351 0.2813
45
1-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2,3-di-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-
[LnA5A5 + Na]+ LMGL03011549 C61H92O6 943.8801 943.6786 0.2015
1-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-2,3-di-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-
[LA5A5 + Na]+ LMGL03011473 C61H94O6 945.756 945.6943 0.0617
1-(9Z-octadecenoyl)-2,3-di-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-
[OA5A5 + Na]+ LMGL03011397 C61H96O6 947.659* 947.7099 0.0509
1-octadecanoyl-2,3-di-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-eicosapentaenoyl)-sn-
[SA5A5 + Na]+ LMGL03011320 C61H98O6 949.5847* 949.7255 0.1408
glycerol
1-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2-(11Z-eicosenoyl)-3-
[LnA1A5 + Na] LMGL03011248 C61H100O6 951.683 951.7412 0.0582
1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-3-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-
[OOD6 + Na]+ LMGL03011389 C61H102O6 953.6676* 953.7568 0.0892
docosahexaenoyl)-sn-glycerol
1-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-2-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-
[LA5D6 + Na]+ LMGL03012093 eicosapentaenoyl)-3-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-docosahexaenoyl)- C63H96O6 971.0075* 971.7099 0.7024
sn-glycerol
1-(9Z-octadecenoyl)-2-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-eicosapentaenoyl)-3-
[OA5D6 + Na]+ LMGL03012033 C63H98O6 973.9243* 973.7255 0.1988
(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-docosahexaenoyl)-sn-glycerol
1-(9Z-octadecenoyl)-2-(11Z-eicosenoyl)-3-
[OA1D6 + Na]+ LMGL03011766 (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z- C63H106O6 981.6574* 981.7881 0.1307
docosahexaenoyl)-sn-glycerol
1-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-2-(11Z-eicosenoyl)-3-(13Z-
[LA1D1 + Na]+ LMGL03011424 C63H114O6 989.8766* 989.8507 0.0259
docosenoyl)-sn-glycerol
1-(9Z-octadecenoyl)-2-(11Z-eicosenoyl)-3-11Z-docosenoyl-sn-
[OA1D1 + Na]+ LMGL03016275 C63H116O6 991.6661* 991.8664 0.2003
glycerol
1-(11Z,14Z-eicosadienoyl)-2-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-
[A2A5D + Na]+ LMGL03011981 C65H112O6 1012.1791 1011.8351 0.3440
eicosapentaenoyl)-3-docosanoyl-sn-glycerol
1-(11Z-eicosenoyl)-2-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-eicosapentaenoyl)-3-
[A1A5D + Na]+ LMGL03011916 C65H114O6 1014.8576 1013.8507 1.026
docosanoyl-sn-glycerol
[AAA3 + Na]+ LMGL03011657 1,2-dieicosanoyl-3-(10Z,13Z,16Z-docosatrienoyl)-sn-glycerol C65H120O6 1019.9353 1019.8977 0.0376
[D6D6D6 + Na]+ LMGL03012611 1,2,3-tri-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-docosahexaenoyl)-glycerol C69H98O6 1045.8767 1045.7255 0.1612
[DDD1 + Na]+ LMGL03012376 1,2-didocosanoyl-3-(13Z-docosenoyl)-sn-glycerol C69H132O6 1080.8839 1079.9916 0.8923
Sphingolipids [SP] LMSP0502AA03 Galα1-4Galβ1-4Glcβ-Cer(d18:1/20:0) C56H105NO18 1118.5286 1118.6963 0.1677

C61H114N2O1
Sphingolipids [SP] LMSP0601AA06 NeuAcα2-3Galβ-Cer(d18:1/26:0) 1168.9025 1169.7800 0.8775
6
Sphingolipids [SP] LMSP0506AA01 Fucα1-2Galα1-3Galβ1-4Glcβ-Cer(d18:1/16:0) C58H107NO21 1176.9034 1176.7228 0.1801
46
Prenol Lipids [PR] LMPR03070002 α-dihydroheptadecaprenol C85H140O 1179.783 1178.0977 1.6853
C61H112N2O2
Sphingolipids [SP] LMSP0601AJ03 NeuAcα2-3Galβ1-4Glcβ-Cer(d18:1/20:0) 1208.7891 1209.7830 0.9932
1
N-(2-hydroxy-hexacosanoyl)-4R-hydroxysphinganine-1-O- C62H121NO26
Sphingolipids [SP] LMSP03030003 1358.8369 1358.7725 0.0644
[inositol-1-phosphoryl-6-mannosyl-α1-2-inositol-1-phosphate] P2
Prenol Lipids [PR] LMPR03070004 α-dihydroeicosaprenol C100H164O 1403.8251 1404.2674 0.4429
Glycerophospholipids [GP] LMGP18000001 sn-caldarchaeo-1-phosphoethanolamine C88H178NO9P 1447.5441 1447.3131 0.2304

C73H134N2O2
Sphingolipids [SP] LMSP0601DC06 Galβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ-Cer(d18:1/26:0) 1455.7529 1455.3298 0.1769
6
C74H135N2O2
Sphingolipids [SP] LMSP0503AI07 Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ-Cer(d18:1/24:1(15Z)) 1484.3385 1483.9247 0.4138
7
C75H136N3O2
Sphingolipids [SP] LMSP0601AM08 GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ-Cer(d18:1/26:1(17Z)) 1495.4073 1494.9407 0.4666
6
C69H124N2O3
Sphingolipids [SP] LMSP0601DD01 KDNα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ-Cer(d18:1/16:0) 1499.7172 1499.8080 0.0914
1
* Reportados anteriormente en ensayos afines (Calvano et al, 2005., Ayorinde et al., 1999)
47
Como se puede observar en el cuadro 7, la mayoría de los picos estuvo
presente en más de uno de los ensayos realizados con efluentes pesqueros
como muestra, sin embargo, algunas diferencias fueron observadas entre las
muestras. En particular entre la región de m/z alta, es decir, en la región
1000–1500 m/z las muestras antiguas presentan algunos picos no observables
en los espectros de las muestras de extracción reciente, que podrían atribuirse
a moléculas lipídicas de mayor peso molecular (probablemente también
presentes en las muestras antiguas, pero a concentraciones no detectables).
De acuerdo con esta evidencia experimental, también los iones de
fragmentos de Diglicéridos (DG) están presentes en las todas las muestras
analizadas, los cuales corresponderían a la perdida de una molécula R-COO-
Na+ con la consiguiente formación de diglicéridos más cortos de carga
positiva, los cuales se detectaron fácilmente en la región de baja masa, 500 –
800 m/z estos mismos resultados han sido reportados con anterioridad
(Ayorinde, Keith & Wan, 1999 & Calvano, Palmisano & Zambonin, 2005).
En la figura 21 se puede observar la composición porcentual de las
moléculas lipídicas recuperados de los efluentes pesqueros, en esta figura
muestra a los Glicerolípidos como moléculas predominantes con el 70% de la
composición total, seguido por los Esfingolípidos con el 14% y los
fragmentos moleculares de Triglicéridos con el 12% y finalmente los Lípidos
Prenoles y Glicerofosfolípidos con el 3% y 1% respectivamente.
48
Fragmentos Glicerolípidos [GL] Esfingolípidos [SP]
Lípidos Prenoles [PR] Glicerofosfolípidos [GP]
3% 1%
14% 12%
70%
Figura 21 Composición porcentual de los constituyentes lípidos de los efluentes de la

industria procesadora de harina y aceite de pescado de la corporación pesquera INCA
S.A.C
En la figura 22 se puede observar el porcentaje de las moléculas
lipídicas que poseen Ácido Eicosapentanoico (A5, EPA) y Ácido
Docosahexaenoico (D6, DHA) como constituyentes de su estructura interna.
En esta figura se puede observar que el 32% de las asignaciones realizadas
poseen al menos una molécula de EPA en su estructura, mientras que el 7%
de estas mismas asignaciones posee DHA en su composición molecular.
EPA DHA Otros AG
32%
61%
7%
Figura 22 Porcentaje de constituyentes lipídicos con Ácido Eicosapentanoico

(A5, EPA) y Ácido Docosahexaenoico (D6, DHA) en su estructura.
49
IV. DISCUSIÓN
Gonzales, 2008 en su diagnóstico sobre la contaminación de la bahía de Ferrol
indica que la eficiencia de los procesos de tratamiento de los efluentes de las plantas
pesqueras en general, es todavía muy baja y éstos aun presentan niveles muy altos de
cargas orgánica; sin embargo, las mejoras y eficiencia implementadas desde el 2009
en las plantas de la Corporación Pesquera INCA S.A.C se ven reflejadas en la
disminución de las concentraciones de aceites, sólidos suspendidos y DBO llegando
a presentar niveles de DBO anuales de 13,02 mg/L en promedio, estos resultados son
menores a los reportados en la presente investigación 27,5mg/L ya que los resultados
que mostramos corresponden a la evaluación correspondiente al mes en el que se
realizó el muestreo respectivo, estos valores podrían disminuir considerablemente
dependiendo de los resultados de las evaluaciones en los meses posteriores, sin
embargo, estos valores no sobrepasan los límites máximos permisibles permitidos.
Los efluentes generados por las industrias pesqueras contienen gran cantidad de
materia orgánica. Dichos efluentes contienen una gran cantidad de proteínas, y
lípidos potencialmente valiosos, los cuales pueden ser empleados bajo diferentes
funcionalidades en diversas industrias, convirtiendo estos residuos en productos con
amplias utilidades. Nagaraja & Regupathi, 2013 caracterizaron los efluentes
industriales del procesamiento de pescado lograron obtener 450mg/L de proteínas
totales, tales resultados difieren significativamente de los obtenidos en la presente
investigación, esto debido a que los efluentes empleados por los autores antes
mencionados corresponden a efluentes sin tratamiento alguno de recuperación de
solidos suspendidos y/o compuestos de interés.
50
Empleando ácido tricloacético (TCA) y acetona a 4°C se obtuvo concentrados
proteínicos de 0,011 mg lo que representa el 35% de los sólidos suspendidos
presentes en los efluentes pesqueros en análisis; por su parte; García, 2007 utilizando
TCA al 10% logró determinar que entre el 69,7 y 76,7% de los sólidos recuperados
de los efluentes pesqueros corresponden a proteínas con alto potencial como una
fuente de ingrediente alimentario; estos datos difieren con los resultados obtenidos ya
que los efluentes empleados en la investigación antes mencionada corresponden al
agua de cola, efluente pesquero que en la actualidad en la corporación pesquera
INCA S. A. C es sometido a muchos procesos de recuperación de sólidos previos a
su vertimiento como efluente final, lo cual explicaría la gran diferencia en ambos
resultados.
La separación de proteínas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida se
ha utilizado anteriormente (García, 2000) y sigue siendo empleada con éxito en la
caracterización de proteínas de diversos efluentes (Stine et al, 2010., Westgate, 2009
& García, 2007). La calidad de las bandas obtenidas en los geles realizados durante
la presente investigación difieren de la calidad de las obtenidas en los trabajos antes
mencionados; ello debido a la variación de las concentraciones de las proteínas
presentes en las muestras empleadas. Sus resultados mostraron bandas definidas a lo
largo de los carriles del gel, previa concentración de las proteínas en niveles hasta
niveles de 10 - 30µg/ml, para lo cual se emplearon volúmenes muy altos de
efluentes. En la presente investigación, buscando obtener mejor resolución de
proteínas en dichos geles, los precipitados obtenidos fueron mezclados a fin de lograr
llegar al mínimo de concentración para lograr la visualización óptima.
51
La figura 3 muestra un gel de poliacrilamida al 12,5% en el cual se puede
apreciar que las proteínas migradas son tenuemente visibles tras la migración, pese a
esto, se puede observar la presencia bandas de proteínas entre los 250 y 25KDa,
observándose una mayor concentración de estas entre los 100 y 50KDa. También se
observaron pequeñas bandas en torno a los 150KDa. Estos resultados concuerdan
con los obtenidos por Westgate, (2009) quien utilizando sulfato de amonio al 50%
caracterizó los efluentes domésticos de tratamientos primarios y secundarios
logrando obtener perfiles de proteínas mediante SDS-PAGE alrededor de los 25 –
150KDa y los cuales fueron identificados como productos microbianos solubles.
Los estudios de la materia orgánica que contiene nitrógeno en los efluentes de
aguas residuales han medido la cantidad de diversos componentes, incluyendo
proteínas y precursores de subproductos de la desinfección (Pehlivanoglu - Mantas y
Sedlak, 2008), pero hasta este proyecto, pocas investigaciones se han preocupado por
examinar en más detalle las proteínas de los efluentes pesqueros. Las proteínas
presentes en otros efluentes, como los domésticos, son susceptibles de ser
modificadas e incluyen proteínas influyentes que son recalcitrantes, así como
productos microbianos solubles (SMPS) que son producidos por organismos durante
el tratamiento secundario (Westgate, 2009). Esto explica posiblemente que la
presencia de bandas en zonas distintas a las de musculo de pescado pueda pertenecer
a productos microbianos generados durante el almacenamiento de los efluentes
durante los diversos tratamientos a los cuales son sometidos.
52
La electroforesis en geles de poliacrilamida y la espectrometría de masas son
dos de las técnicas más ampliamente utilizadas para el análisis de proteínas. Su
combinación ofrece la más poderosa herramienta en estudios proteómicos. Esta
técnica ha sido empleada para la identificación de un sin número de proteínas con
enfoque a identificación del estado fisiológico de diversas especies de peces
(Vilhelmsson et al., 2005., Piñeiro, Barros-Velázquez, Vázquez, Figueras &
Gallardo, 2003., Parrington & Coward, 2002). El estudio proteómico de la presente
investigación responde al análisis MS/MS de los fragmentos de proteínas digeridas,
los cuales, no pudieron ser identificados como correspondientes a proteínas de
Engraulis ringens según comparaciones realizadas con la base de datos de
UniProtKB. El presente estudio estuvo basado en el supuesto de que las proteínas
presentes en los efluentes pesqueros corresponderían en su mayoría a proteínas del
músculo de Engraulis ringens “anchoveta peruana”, la cual es empleada como
materia prima fundamental para la elaboración de harina y aceite de pescado, sin
embargo, no logró identificar ninguna proteína para la especie antes mencionada. Los
diversos procesos, dentro de los cuales incluyen grandes variaciones de temperaturas,
procesos químicos de coagulación de proteínas y diversas etapas de filtración, a los
cuales son sometidos los efluentes pesqueros buscando maximizar la recuperación de
sólidos para ser reincorporados al proceso de producción de harina de pescado puede
ser la explicación a la baja calidad de las proteínas recuperadas de los efluentes
estudiados, lo cual no hizo posible su identificación de las mismas mediante la
utilización de las técnicas de SDS- PAGE/Espectrometría de masas.
53
Las aguas residuales o efluentes generados en las plantas durante el
procesamiento de pescado contienen usualmente grandes cantidades de componentes
proteínicos y aceite. La recuperación de lípidos de diversas fuentes ha sido descrito
con anterioridad (Civit, 1982., Suh, Cho, Son, Kim &. Lee, 1994., Guerrero et al.,
1998., Swapna et al, 2010 & Huang, Zhang, Gao & Sun, 2011). Sin embargo, la
utilización de efluentes pesqueros como fuente de material lipídico no ha sido
estudiado a profundidad, por lo cual en la presente investigación se ensayó varios
procedimientos a fin de lograr recuperar la mayor cantidad de moléculas lipídicas
viables para estudios posteriores de identificación. El método seleccionado y
empleado para la recuperación de moléculas lipídicas permitió obtener extractos
lipídicos de aproximadamente 0,0016 mg de lípidos totales por cada ml de efluente
empleado, lo que representa el 93% de los aceites y grasas presentes en los efluentes
pesqueros.
La reciente expansión de la investigación en el campo de la lipidómica ha
sido impulsada por el desarrollo de nuevas herramientas y protocolos de
espectrometría de masas para la identificación y cuantificación de los lípidos
moleculares de matrices complejas. Aunque hay similitudes entre el campo de la
lipidómica y el campo aliado de la espectrometría de masas, la proteómica, los
lípidos presentan algunas ventajas únicas y desafíos para el análisis por
espectrometría de masas (Blanksby et al, 2010). Conseguir intensidades espectrales
idóneas para el análisis de estas moléculas es uno de los desafíos a los que nos
enfrentamos durante este proceso. Schiller et al., 2007, por ello, se realizaron varios
ensayos a fin de optimizar el desarrollo de esta técnica. Sus resultados muestran que
si bien el ácido 2,5- dihidroxibenzoico (DHB) es una matriz establecida para el
54
análisis espectrométricos de lípidos existen otros isómeros que pueden ser empleados
con éxito como matrices MALDI, pero el isómero 2,5-DHB es el compuesto más
versátil para este tipo de análisis, esto debido a su comportamiento de cristalización
al momento de la unión matriz-analito. Si bien técnicas protocolares como la
microscopia de fuerza iónica es la indicada para analizar el tipo de cristalización de
la combinación matriz-analito, los resultados obtenidos muestran que el isómero 2,5-
DHB en combinación con diversos diluyentes genera diferentes tipos de cristales con
variaciones tanto en el tamaño y la forma, lo cual podría ser interferente al momento
del análisis espectrométrico; sin embargo, se obtuvo la combinación perfecta de
matriz-analito, que generó cristales más pequeños y uniformemente distribuidos en la
placa de análisis, los que permitió un óptimo desarrollo del análisis MALDI.
Hay principalmente dos características que tienen un impacto importante en
la calidad de los espectros MS, la homogeneidad de la mezcla matriz:muestra y la
energía láser aplicada (Benard, Arnhold, Lehnert, Schiller & Arnold, 1998). El
primer parámetro aún no está completamente definido y tiene que ser optimizada
para la mayoría de aplicaciones en lugar empíricamente mientras que el mejor valor
de este último podría ser determinado fácilmente. Benard et al., (1998). Utilizando
un espectrómetro de masas Voyager Biospectrometry Workstation (PerSeptive
Biosystems, Wiesbaden, Germany) demostró que con 2900 unidades internas de
intensidad de láser el estudio de digliceroles poliinsaturados se desarrolla de una
manera adecuada. Sin embargo, en la presente investigación para encontrar un ajuste
óptimo de la intensidad del láser, ésta se fue aumentando paso a paso, la intensidad
integral del pico aductor de sodio (907.7 Da) de Glyceryl trioleate muestra una fuerte
55
dependencia de la potencia del láser (figura 15), esta figura muestra tres espectros de
Glyceryl trioleate evaluado con diferentes intensidades de láser, en todos los casos se
puede apreciar la presencia de la masa 907, 7 Da el cual se puede asignar al aducto
de sodio [M + Na]1+ del ion molecular de Glyceryl trioleate. Con una intensidad de
láser de 5200 unidades internas (figura15-B) la tasa de señal ruido es mejorada y un
segundo pico de 923.7 Da aparece y el cual correspondería al aducto de potasio [M +
K]+ de Glyceryl trioleate o un producto de la oxidación de Glyceryl trioleate [OOO
+ 16O]1+, un pequeño pico de 853.713 Da correspondería a la pérdida de 3[H2O]1+
de la molécula de Glyceryl trioleate [M - 3H2O]. Todos los otros picos marcados con
asterisco corresponderían a picos generados de matriz empleada (DHB 40mg/ml).
Finalmente una intensidad de láser de 5500 unidades internas permite una
disminución de las tasas de señal ruido entre los picos de sodio y potasio y este
aumento en el poder del láser permite un aumento de la fragmentación de los picos
de matriz, interfiriendo estos en la calidad y el análisis de los datos obtenidos.
Nuestros resultados difieren con los obtenidos en ensayos anteriores
considerablemente, es debido a que si bien los equipos empleados son
espectrómetros de masas MALDI TOF-MS, difieren en el tipo de láser empleado
para la obtención de los iones analizados.
La técnica MALDI – TOF MS ha ganado gran importancia en el campo de
análisis, ya que la preparación de la muestra es fácil y rápida, requiriendo sólo
solventes orgánicos en que los lípidos de las muestras y las matrices sean solubles.
Por evaporación del solvente, se obtienen cristales homogéneos de la mezcla de la
muestra y la matriz. Los TAG de vegetales y de peces han sido determinados por
56
análisis MALDI TOF/MS en un solo paso, generando diferentes espectros de masas
en modos positivos (Calvano et al, 2005). En análisis desarrollados anteriormente se
demostró que muestras altamente poliinsaturadas, como los aceites de pescado,
tienden a proporcionar señales con intensidades de muy bajas. Por lo tanto, se prestó
gran atención a la etapa de optimización preparación de la muestra. Diferentes
técnicas han sido probadas haciendo uso de DHB como matriz La mezcla de
metanol, acetona y éter etílico (3:5:1 v/v) proporcionó la mejor cristalización de la
matriz en la placa de análisis y, en consecuencia, los espectros más reproducibles y
con mayores intensidades se produjeron.
De acuerdo con informes anteriores Asbury, Al-saad & Siems (1999) el análisis
MALDI-TOF-MS de TAGs, mostró gran cantidad de moléculas protonadas en los
espectros; los iones aductos de sodio [M + 23]1+ eran las principales especies
observadas. Estos resultados concuerdan con los resultados obtenidos en la presente
investigación, en la cual el 57.5% de las asignaciones realizadas para las moléculas
identificadas mediante el análisis MS/MS corresponden a triglicéridos unidos a
aductos de sodio, esto debido a la utilización de Na+ como aductor de la ionización.
El aceite de pescado es una importante fuente de ácidos grasos esenciales, sin
embargo no deja de ser una mezcla compleja que contiene una amplia gama de
compuestos, principalmente triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos (Calvano et
al, 2005). Si bien se empleó un método de “ionización suave”, se observó entre la
región de 500 – 800 muchos fragmentos de posibles diglicéridos que podrían
corresponder a la pérdida de moléculas COOH-Na+ de los triglicéridos constituyentes
de los efluentes pesquero. Las muestras analizadas presentan un amplio patrón de
repetitibilidad, con algunas ligeras variaciones en las intensidades totales, las
57
asignaciones realizadas a las moléculas de triacilglicéridos se realizó en base a la
disponibilidad de información relacionada con el perfil de ácidos grasos del aceite
de consumo humano indirecto.
Ayorinde et al.,1999 analizó mediante MALDI TOF/MS el aceite de hígado de
bacalao a fin de identificar los principales constituyentes del mismo, basándose en la
composición de los ácidos grasos, logrando realizar 66 asignaciones para
triglicéridos. Los resultados obtenidos en la presente investigación muestran cierto
grado de similitud en algunas de las asignaciones realizadas. Esta diferencia podría
explicarse ya que los análisis realizados por el autor mencionado corresponden a
muestras puras de aceite, mientras que las muestras empleadas para la investigación
son el remanente del proceso productivo aceite de pescado.
Si bien los ácidos grasos poliinsaturados PUFAs como EPA y DHA son las
moléculas de mayor importancia biotecnológica y comercial en los aceites ya sea de
origen vegetal como animal, los TAG son también constituyentes de amplia
importancia por ser la principal reserva energética del organismo. En los resultados
obtenidos el 70% de las asignaciones realizadas corresponden a este tipo de
moléculas. Sin embargo, es de recalcar que de 66 asignaciones realizadas, el 39% de
las asignaciones tiene en su estructura moléculas de EPA y DHA (32% y 7%
respectivamente). Lo cual muestras la importancia de estas moléculas no sólo como
constituyentes individuales, si no también estructurales.
58
V. CONCLUSIONES
Se estandarizaron protocolos para la recuperación de proteínas y
lípidos de los efluentes de la industria productora de harina y aceite de
pescado de la Corporación Pesquera INCA S.A.C
No se lograron identificar proteínas pertenecientes a Engraulis ringens
“anchoveta peruana” a través de la técnica de espectrometría de masas
Se estandarizó un protocolo para el análisis de los lípidos recuperados
de los efluentes pesqueros a través de la técnica MALDI TOF/TOF.
Se determinó que el 70% de dichas moléculas lipídicas identificadas
corresponden a los glicerolípidos (diacilglicéridos y triacilglicéridos) mientras
que el 14% los esfingolípidos, de la misma manera el 12% corresponde a
diversos fragmentos producto del rompimiento de las diversas moléculas
presentes. En menores concentraciones se encuentran los prenoles y
glicerofosfolípidos con el 3% y el 1% respectivamente.
Se determinó que el 32% de las moléculas lipídicas identificadas
poseen en su estructura ácido eicosapentanoico (A5, EPA) y el 7% de las
mismas poseen el ácido docosahexaenoico (D6, DHA).
59
VI. RECOMENDACIONES
Se recomienda continuar con la investigación presente abarcando
mejores tecnologías que permitan llenar el vacío respecto a las proteínas y
lípidos presentes en los efluentes pesqueros y por consiguiente la aplicación
de mecanismos tecnológicos para su aprovechamiento.
60
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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68
ANEXOS
69
Anexo 1 Flujograma del proceso de harina y aceite de
Anchoveta de la Corporación Pesquera INCA S.A.C
MATERIA
PRIMA DESCARGA DE
AGUA
MATERIA
PRIMA
1
DE MAR
PCQ 1
TDC < 24 hrs AGUA DE
RECEPCIÓN Y TVBN < 60mg/100g TRATAMIENTO
PESAJE DE
MATERIA
BOMBEO
PRIMARIO 12
RECUPERACIÓN
PRIMA
2 11 SANGUAZA
DE SOLIDOS
FILTRADA
ALMACENAMIENTO
DE MATERIA
PRIMA SANGUAZA
FILTRACION
3 SOLIDOS
RECUPERADOS
AGUA DE
PCQ 2 BOMBEO
TDC < 36rs
TBVN < 60mg/100g
VAPOR COCCIÓN CONDEN.
4
LICOR DE ESPUMA
PRES-TRAINER TRATAMIENTO
RECUPERADA
PRE SECUNDARIO
DESAGUADO
5 FLOTACIÓN DE
ESPUMAS
13
FASE I
AGUA DE
BOMBEO
LICOR DE
PRENSADO
6
PRENSA
SÓLIDOS SEPARADOS
TRATAMIENTO
14
7 TORTAINTEGRAL
AIRE SECUNDARIO EFLUENTE
HACIA EL CMR
FLOTACIÓN DE
B ESPUMAS
A FASE II
PRESECADO
SEPARACIÓN
ETAPA I
ESPUMA
VAPOR RECUPERADA
LICOR DE
VAPOR SEPARADORA
9 8 MEZCLA
SOLIDOS SEP. 15
SEPARACIÓN
PAMA
ACEITE
PRESECADO
LODOS PULIDO CENTRIFUGACIÓN LODOS
ETAPA II
A
LICOR DE
SEPARADORA
AGUA DE
B
ENZIMA
COLA
MEZCLA
AGUA DE COLA
LODOS CENTRIFUGACIÓN
PCC
VAHOS
EVAPORACIÓN SECADO
FINAL
LC: T ≥ 85ºC 16
PRODUCTO B ACEITE
CONCENTRADO NO CONFORME RECUPERADO
PARA REPROCESO
CONDEN.
SUCIO
SALMONICIDA LODOS PULIDO 17
ENFRIAMIENTO AIRE
AIRE
PRODUCTO
NO CONFORME B
SALMONICIDA PARA REPROCESO
PRODUCTO NO
CONFORME PARA
ACEITE
EVALUACION
PURIFICADO
PULIDO
ACEITE
PULIDO
MOLIENDA
ACEITE CRUDO PRODUCIDO SECA ACEITE CRUDO PRODUCIDO
TBVN ≥ 60 mg/100g materia prima TBVN ≥ 60 mg/100g materia prima
C C
PRODUCTO NO
CONFORME PARA
AOX
EVALUACION
ENSAQUE
ACEITE CRUDO PRODUCIDO
TBVN < 60 mg/100g materia prima SACOS
HILOS
18
10 PRODUCTO NO
ALMACENAMIENTO MANTAS ALMACENAMIENTO CONFORME PARA ALMACENAMIENTO
PRODUCTO PRODUCTO
DE ACEITE DE HARINA EVALUACION DE ACEITE
NO CONFORME CONSUMO NO CONFORME
CONSUMO
HUMANO PARA DESECHO INSECTICIDA HUMANO PARA DESECHO
DIRECTO INDIRECTO
DESINFECTANTE
PRODUCTO NO
CONFORME PARA
EVALUACION
DISTRIBUCIÓN DE
ACEITE CONSUMO
19 DISTRIBUCIÓN DE
HARINA COSTADO
DISTRIBUCIÓN DE
ACEITE CONSUMO
HUMANO DIRECTO DEL BUQUE HUMANO INDIRECTO
Figura 23 Flujograma del proceso de harina y aceite de Anchoveta de la Corporación

Pesquera INCA S.A.C
70
Anexo 2 Protocolo de Precipitación de Proteínas con TCA – Acetona
71
Anexo 3 Protocolo de cuantificación fluorométrica Qubit® 2.0 Fluorómetro
Invitrogen
1. Preparar la solución de trabajo QubitTM diluyendo 1:200 Qubit™ Protein
Reagent con de Qubit™ Protein Buffer.
2. Mezclar 10µL de proteínas con 190 µL de la solución de trabajo preparada
anteriormente.
3. Evite la iluminación de las muestras.
4. Dejar incubar la muestra por 15 minutos.
5. Colocar el tubo de ensayo en la bóveda de lectura del Qubit® 2.0 Fluorómetro
Invitrogen.
6. Realizar las lecturas correspondientes.
Figura 24 Esquema protocolar de cuantificación Qubit®
72
Anexo 4 Protocolo de preparación del Gel de poliacrilamida al 12,5%
73
Anexo 5 Protocolo de digestión de Proteínas en gel de Poliacrilamida para Análisis
por Espectrometría de masas MALDI-TOF TOF
74
8. Para extraer los productos de la digestión, agregar 100uL de buffer se
extracción 5%ácido fórmico/acetonitrilo (1:2) a cada tubo e incubar a 37°C
por 15 min con agitación ocasional. Aproximadamente en 1: 2 entre el
volumen de la digestión y el buffer de extracción. (si se extraen alícuotas de
sobrenadante, éstas se pueden almacenar a -20°C por algunos meses)
9. Redisolver los péptidos tripsinados para futuros análisis agregando 10-20uL
de 0,1% ácido trifluroacético, agitar e incubar 2-5min en sonicación y luego
centrifugar 15 min a 10000rpm.
10. Almacenar la solución restante a -20°C.
75
Anexo 6 Condiciones del método de adquisición para el análisis MS en el rango masas
de 10 – 1000Da.
76
Anexo 7 Condiciones del método de adquisición para el análisis MS en el rango de masas de
1000 a 5000 Da.
77
Anexo 8 Condiciones del método de adquisición para el análisis MS en el rango de masas de
5000 a 20000 Da.
78
Anexo 9 Condiciones del método de procesamiento para el análisis MS de las proteínas
recuperadas.
79
recuperadas de los efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de pescado.
80
recuperadas de los efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de pescado.
81
Anexo 12 Cuadro 8 valores de cuantificación de proteínas precipitadas de los efluentes de la industria procesadora de harina y aceite de Anchoveta realizadas con Qubit®

procesadora de harina y aceite de pescado realizadas con fluorómetro Qubit®
CÓDIGO DE Promedio de lecturas Promedio de

MUESTRA (µg/mL) stock (µg/mL)
M1 0.67 13.333
M2 0.54 10.746
M3 0.43 8.56
M4 0.54 10.75
M5 0.46 9.15
M6 0.50 9.95
M7 0.53 10.55
M8 0.51 10.15
M9 0.45 8.96
M10 0.50 9.95
M11 0.45 8.955
M12 0.53 10.55
M13 0.49 9.75
M14 0.62 12.34
M15 0.47 9.35
M16 0.65 12.94
M17 0.42 8.36
M18 0.59 11.74
M19 0.54 10.746
M20 0.67 13.333
M21 0.46 9.15
M22 0.68 13.53
M23 0.48 9.55
M24 0.54 10.75
M25 0.58 11.54
M26 0.52 10.35
M27 0.49 9.75
M28 0.48 9.552
M29 0.42 8.358
M30 0.46 9.15
M31 0.56 11.14
M32 0.53 10.55
M33 0.62 12.34
M34 0.53 10.55
M35 0.52 10.35
M36 0.53 10.55
M37 0.64 12.736
M38 0.58 11.542
M39 0.63 12.54
M40 0.51 10.15
PROMEDIO 0.533 10.61
82
Anexo 13 Protocolo de recuperación de lípidos
83
7. Si usted necesita una solución muy limpia de moléculas lipídicas, debe
"lavar" la fase inferior que recuperó con una "fase superior auténtica" de la
siguiente manera:
a. Preparar "fase superior auténtica" de la siguiente manera: en un tubo de
vidrio de gran tamaño realizar el procedimiento antes detallado, pero
usando dH2O en lugar de la muestra. Recoger la fase superior y guárdela
en un tubo.
b. Agregue su fase inferior recuperado de paso # 5 a un tubo y luego añadir
la cantidad apropiada (muestra + volumen dH2O) de la "fase superior
auténtico." Por ejemplo, si se hizo una preparación de muestra de 1 ml, se
agregan 2,25 ml de la "fase superior auténtico."
c. agitar vigorosamente, centrifugar, y recoger fase inferior como se
describió anteriormente.
84
Anexo 14 Matrices empleadas para el análisis de los lípidos recuperados de los
efluentes pesqueros.
85
Anexo 15 Condiciones del método de adquisición para el análisis MS de los lípidos
recuperados de los efluentes pesqueros
86
Anexo 16 Condiciones del método de procesamiento para el análisis MS de los lípidos
recuperados de los efluentes pesqueros
87
Anexo 17 Condiciones del método de adquisición para el análisis MS/MS de los
lípidos recuperados de los efluentes pesqueros
88
Anexo 18 Condiciones del método de procesamiento para el análisis MS/MS de los
lípidos recuperados de los efluentes pesqueros
89
Anexo 19 valores de cuantificación de líp idos recuperados de los efluen tes de la indu stria procesadora de harina y aceite de pescado.
Cuadro 10 valores de cuantificación de lípidos recuperados de los efluentes de la industria

CÓDIGO DE CONCETRACIÓN STOCK

MUESTRA µg/ml mg/ml
M1 1.45 0.0015
M2 1.3 0.0013
M3 1.15 0.0012
M4 1.55 0.0016
M5 1.6 0.0016
M6 1.4 0.0014
M7 1.6 0.0016
M8 1.6 0.0016
M9 1.45 0.0015
M10 1.55 0.0016
M11 1.65 0.0017
M12 1.45 0.0015
M13 1.85 0.0019
M14 1.55 0.0016
M15 1.9 0.0019
M16 1.45 0.0015
M17 1.9 0.0019
M18 1.75 0.0018
M19 1.6 0.0016
M20 1.4 0.0014
M21 1.55 0.0016
M22 1.75 0.0018
M23 1.25 0.0013
M24 1.75 0.0018
M25 1.55 0.0016
M26 1.8 0.0018
M27 1.7 0.0017
M28 1.9 0.0019
M29 1.95 0.0020
M30 1.85 0.0019
PROMEDIO 1.61 0.0016
90
Anexo 20 Galería fotográfica.
Figura 25 vista panorámica de las zonas costeras aledañas a la planta

procesadora de harina y aceite de pescado de la corporación pesquera
INCA S.A.C
Figura 26 Sistema de traslado de la materia prima de las tolvas de las

embarcaciones hacia la planta procesadora.
91
Figura 27 Maquinaria de centrifugado para la extracción de licores y
acetite de pescado.
Figura 28 Colecta de muestras y análisis de parámetros físico-químicos.
92
Figura 29 Material empleado para la extracción de proteínas
de los efluentes pesqueros.
Figura 30 Muestras de efluentes para la recuperación de

proteínas.
93
Figura 31 Proteínas en precipitación con TCA – Acetona.
Figura 32 Electroforesis de las proteínas recuperadas de los

efluentes pesqueros.
94
Figura 33 muestras de efluentes pesqueros para la recuperación de
lípidos totales.
Figura 34 Spot de las muestras de lípidos para el análisis espectrométrico.
95
Figura 35 Espectrómetro de masas 4800 MALDI TOF-MS empleado
para el análisis de proteínas y lípidos de los efluentes pesqueros.
96

Tesis UNP

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

CARACTERIZACIÓN PROTEÓMICA Y LIPIDÓMICA DE LOS

Br. Melitza de Lourdes Cornejo La Torre.

TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE

A mi familia en general, y en especial a mis padres por hacer

A mis hermanos, porque sin sus sacrificios no sería quien

A Mario, mi compañero incondicional, por su paciencia y

A los amigos, compañeros casi hermanos que siempre

A todos aquellos que nunca dudaron que lograría este

Me complace de sobre manera a través de esta investigación exteriorizar mi sincero

agradecimiento a la Universidad Nacional de Piura en la Facultad de Ciencias,

Escuela Profesional de Ciencias Biológicas y en ella a los distinguidos docentes

quienes con su profesionalismo y ética puesto de manifiesto en las aulas enrumban a

Al centro de Investigación BIOTEC C.M.C y todo su personal por la confianza

depositada en mí y por la oportunidad de desarrollo profesional, por el

financiamiento de esta investigación y la orientación continua hasta la culminación

estuvo vinculado directamente con el desarrollo de la presente investigación.

De todo corazón, ¡muchas gracias!

DEDICATORIA ........................................................................................................ iii

ÍNDICE GENERAL ................................................................................................... v

INDICE DE CUADROS ........................................................................................... vii

INDICE DE FIGURAS ............................................................................................ viii

INDICE DE ANEXOS ............................................................................................... xi

RESUMEN ............................................................................................................. xiii

ABSTRACT ........................................................................................................... xiv

II. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................ 11

2.1. ÁREA DE ESTUDIO ........................................................................................................ 11

2.2. TOMA DE MUESTRA Y TRANSPORTE ........................................................................... 11

2.3. ANÁLISIS Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS ....................................................... 12

2.3.1. ANALISIS PROTEÓMICO ................................................................................. 13

3.1. ANALISIS FÍSICO-QUÍMICO DE LOS EFLUENTES ........................................................... 23

3.2. ANÁLISIS PROTEÓMICO DE LOS EFLUENTES PESQUEROS ........................................... 24

3.2.1. RECUPERACIÓN DE PROTEÍNAS ..................................................................... 24

VI. RECOMENDACIONES ................................................................................ 60

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 61

Cuadro 1 soluciones empleadas para el fraccionamiento de péptidos y proteínas complejas

Cuadro 2 parámetros físico-químicos evaluados en los efluentes de la industria procesadora

Cuadro 6 Ácidos grasos identificados en aceite de pescado de la planta de la corporación

Cuadro 7 Atribuciones de las principales masas mostradas durante el análisis MALDI

Cuadro 8 valores de cuantificación de proteínas precipitadas de los efluentes de la industria

Cuadro 9 valores de cuantificación de proteínas precipitadas de los efluentes de la industria

Cuadro 10 valores de cuantificación de lípidos recuperados de los efluentes de la industria

Figura 1 Precipitación de proteínas de diferentes muestras de efluentes de la industria

Figura 2 Concentración de proteínas recuperadas de los efluentes de la industria

Figura 3 Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE al 12,5% ............................... 26

Figura 4 Espectro de masas de las proteínas recuperadas de los efluentes pesqueros. El

Figura 5 Espectro de masas de las proteínas recuperadas de los efluentes pesqueros. El

Figura 6 Espectro de masas de las proteínas recuperadas de los efluentes pesquero. El

Figura 11 Recuperación de Lípidos de diferentes muestras de efluentes de la industria

Figura 13 Cristalización vista al estereoscopio de las diferentes matrices analizadas.

Figura 14 Perfiles de masas generados de la co-cristalización matriz-analito. (A) Muestra

Figura 17 espectros MS de las muestras de lípidos recuperados de los efluentes de la

Figura 18 espectros parcial MS de las muestras de lípidos recuperados de los efluentes de la

Figura 19 espectros MS de las muestras de lípidos recuperados de los efluentes de la

Figura 20 espectros MS de las muestras de lípidos recuperados de los efluentes de la

Figura 21 Composición porcentual de los constituyentes lípidos de los efluentes de la

Figura 23 Flujograma del proceso de harina y aceite de Anchoveta de la Corporación

Figura 24 Esquema protocolar de cuantificación Qubit® .................................................... 72

Figura 27 Maquinaria de centrifugado para la extracción de licores y acetite de pescado... 92

Figura 28 Colecta de muestras y análisis de parámetros físico-químicos. ........................... 92

Figura 29 Material empleado para la extracción de proteínas de los efluentes pesqueros. .. 93

Figura 30 Muestras de efluentes para la recuperación de proteínas. .................................... 93

Figura 31 Proteínas en precipitación con TCA – Acetona. .................................................. 94