DETECCIÓN in Vitro DE INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA EN PLANTAS DE LA FLORA COLOMBIANA POR EL MÉTODO DE ELLMAN

DETECCIÓN in vitro DE INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA EN
PLANTAS DE LA FLORA COLOMBIANA POR EL MÉTODO DE ELLMAN
Presentado por:
DUVAN ALBERTO VALENCIA PRECIADO
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍAS
ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA
PEREIRA
2015
Presentado por:
Código: 1087123615
TRABAJO DE GRADO
Requisito parcial para optar al título de Químico Industrial
DIRECTOR DEL PROYECTO

Dr. OSCAR MARINO MOSQUERA MARTÍNEZ
GRUPO BIOTECNOLOGÍA - PRODUCTOS NATURALES
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍAS
ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA
PEREIRA
2015
NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO

Presentado por:
El suscrito director y jurados del presente trabajo de grado, una vez revisada
la versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar la nota
de: _______________.
Con la connotación: _______________.
Para la constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy 2 de Marzo de

2015.
Director: ___________________________
Oscar Marino Mosquera Martínez
Jurado: ___________________________
Francisco Javier Jiménez
DEDICATORIA
Dedicado a mis padres y hermanos por toda la paciencia, cariño y comprensión

brindados.
Duvan Alberto Valencia Preciado

AGRADECIMIENTOS
• A mi madre, Ruby Consuelo Preciado Landazuri por ser mi gran amiga

y su apoyo incondicional, incluso en los momentos más difíciles.
• A mi padre, William Alberto Valencia Cajiao por haberme dado un gran

ejemplo de un buen ciudadano.
• A todos los miembros de mi familia, por la paciencia, los consejos y el

apoyo brindado.
• A mis profesores, Oscar Marino Mosquera y Jaime Niño Osorio, por

haberme confiado la responsabilidad de pertenecer al Grupo de
Biotetecnología – Productos naturales, la paciencia, las experiencias
compartidas, los conocimientos y consejos brindados.
• A mis compañeros del Grupo de Biotetecnología – Productos naturales,

por toda la asistencia brindada.
• A la Universidad Tecnológica de Pereira por brindarme todas las

herramientas e insumos necesarios para culminar esta etapa de mi vida.
TABLA DE CONTENIDO
TABLA DE CONTENIDO ......................................................................................... 3

LISTA DE TABLAS .................................................................................................. 5
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ 6
LISTA DE ANEXOS ................................................................................................. 8
RESUMEN ............................................................................................................... 9
ABSTRACT ............................................................................................................ 10
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 11
2. MARCO TEÓRICO ............................................................................................ 13
2.1. LA ACETILCOLINESTERASA (AChE) ........................................................ 13
2.2. INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA ...................................... 14
2.3. CLASIFICACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA
........................................................................................................................... 15
2.3.1. DERIVADOS ANÁLOGOS DE LA TETRAHIDROACRIDINA ............... 15
2.3.2. DERIVADOS DE LA N-BENCILPIPERIDINA ....................................... 16
2.3.3. DERIVADOS DE LA BENZOFENONA ................................................. 16
2.3.4. ANÁLOGOS DEL DIBENZOFURANO .................................................. 17
2.3.5. GALANTAMINA .................................................................................... 18
2.3.6. FISOSTIGMINA .................................................................................... 19
2.3.7. DERIVADOS DE LA HUPERZINA ........................................................ 19
2.4. MÉTODOS PARA DETECTAR INHIBIDORES DE LA AChE ..................... 20
2.4.1. MÉTODO DE ELLMAN ......................................................................... 20
2.4.2. MÉTODO FLUOROMÉTRICO .............................................................. 22
2.4.3. BIOAUTOGRAFÍA ................................................................................ 22
2.4.4. HPLC-UV-VIS-MS Y DETECCIÓN BIOQUÍMICA ................................. 24
2.5. PARQUE REGIONAL NATURAL UCUMARÍ (PRNU) ................................. 25
2.5.1. FAMILIAS DE PLANTAS A ESTUDIAR ................................................ 27
3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 34
4. OBJETIVOS ....................................................................................................... 35
4.1. OBJETIVO GENERAL................................................................................. 35
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................... 35
3
5. SECCIÓN EXPERIMENTAL .............................................................................. 36
5.1. REACTIVOS Y EQUIPOS ........................................................................... 36
5.1.1. REACTIVOS ......................................................................................... 36
5.1.2. EQUIPOS ............................................................................................. 36
5.1.3. MATERIAL VEGETAL .......................................................................... 36
5.2. METODOLOGÍA .......................................................................................... 38
5.2.1. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES ............................. 38
5.2.2. CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA ................................................... 38
5.2.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA SOBRE LA
ACETILCOLINESTERASA POR EL MÉTODO DE ELLMAN EN
MICROPLACAS.............................................................................................. 39
5.2.4. REGISTRO Y EVALUACIÓN DE DATOS ............................................ 41
5.2.5. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA VERDADERA
SOBRE LA ACETILCOLINESTERASA POR BIOAUTOGRAFÍA ................... 42
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 43
6.1. CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA .......................................................... 43
6.2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA SOBRE LA
ACETILCOLINESTERASA POR EL MÉTODO DE ELLMAN EN MICROPLACAS
........................................................................................................................... 47
6.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA VERDADERA SOBRE
LA ACETILCOLINESTERASA POR BIOAUTOGRAFÍA .................................... 50
7. CONCLUSIONES .............................................................................................. 58
8. RECOMENDACIONES ...................................................................................... 59
9. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 60
ANEXOS ................................................................................................................ 71
4
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Actividades biológicas encontradas en las familias en estudio. ............... 33

Tabla 2. Lista de plantas a evaluar su actividad inhibitoria de la enzima
acetilcolinesterasa. ................................................................................................ 37
Tabla 3. Reveladores y controles usados para evaluación fitoquímica de los
extractos crudos..................................................................................................... 38
Tabla 4. Preparación de las soluciones para la evaluación de la actividad inhibitoria
de la AChE (Nair et al., 2011). ............................................................................... 39
Tabla 5. Caracterización fitoquímica de los extractos de metanol y diclorometano.
............................................................................................................................... 44
Tabla 6. Actividad inhibitoria sobre la AChE de extractos metanólicos.................. 47
Tabla 7. Extractos metanólicos con verdadera actividad inhibitoria de la AChE. ... 55
Tabla 8. Detección in vitro de inhibidores de la acetilcolinesterasa por el método de
Ellman en plantas de la flora colombiana. ............................................................. 57
5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de la galantamina, (McNulty et al., 2009). ............................. 12

Figura 2. Reacción entre la acetilcolinesterasa y la acetilcolina (Milkani et al., 2011).
............................................................................................................................... 13
Figura 3. Pasos involucrados en la hidrólisis de la acetilcolina en el sitio activo de la
AChE (Milkani et al., 2011). ................................................................................... 14
Figura 4. Estructura de la tacrina, inhibidor de la AChE (Singh et al., 2013). ........ 15
Figura 5. Estructura química del donepezilo. ......................................................... 16
Figura 6. Inhibidores de la AChE derivados de la benzofenona (Belluti et al., 2009).
............................................................................................................................... 17
Figura 7. Rivastigmina (A) y su derivado 5-tio-1-azaciclopentano [α] naftaleno. ... 18
Figura 8. Fisostigmina, el primer inhibidor de la AChE usado como medicamento
(Singh et al., 2013)................................................................................................. 19
Figura 9. Huperzinas, huperzina A y huperzina B. ................................................. 20
Figura 10. Reacciones implicadas en la determinación de actividad de la
acetilcolinesterasa in vitro por el método de Ellman (Ellman et al., 1961). ............ 21
Figura 11. Hidrólisis del Ioduro de 7-acetato-1-metilquinolina (IAMQ) a Ioduro de 7-
hidroxi-1-metilquinolina (HMQI) por la AChE (Rhee et al., 2003b)......................... 22
Figura 12. Reacción de la AChE con el acetato de α-naftilo para formar el α-naftol y
la posterior formación de un colorante diazoico (púrpura) con la sal de diazonio (sal
de Fast Blue) (Marston, 2011). .............................................................................. 23
Figura 13. Esquema de HPLC acoplado en línea con UV-VIS-MS – Detección
Bioquímica (Ingkaninan et al., 2000)...................................................................... 25
Figura 14. Mapa del Parque Regional Natural Ucumarí (CARDER). ..................... 26
Figura 15. Flores de especies de la familia Apocynaceae (A) Cynanchum ellipticum
y (B) Cynanchum formosum (Jürgens et al., 2009)................................................ 27
Figura 16. Oxypetalum cordifolium (Asclepiadaceae) (Tomado de:
http://plantasdecolombia.org). ................................................................................ 28
Figura 17. Aster amellus L. (Asteraceae) (Münzbergová et al., 2011). .................. 29
Figura 18. Ricinus communis (Euphorbiaceae) (Tomado de:
Figura 19. Faramea occidentalis (Rubiaceae) (Tomado de:
Figura 20. Piper sarmentosum (Piperaceae) (Zakaria et al., 2010). ...................... 31
Figura 21. Withania somnifera (Solanaceae) (Vanden Berghe et al., 2012). ......... 32
Figura 22.Urera lianoides (Urticaceae) (Tomado de: http://plantasdecolombia.org).
............................................................................................................................... 32
Figura 23. Preparación de las diferentes concentraciones de los extractos
metanólicos. ........................................................................................................... 40
Figura 24. Esquema para la determinación de la actividad inhibitoria de la AChE por
el método espectrofotométrico de Ellman en microplacas (Nair et al., 2011). ....... 40
6
Figura 25. Porcentajes de abundancia relativa de metabolitos secundarios en los
extractos vegetales demetanol y diclorometano. ................................................... 46
Figura 26. Número de plantas con actividad contra acetilcolinesterasa. ............... 48
Figura 27. (A) Detección IAChE de los extractos metanólicos por bioautografía y (B)
Falsos positivos de los extractos metanólicos. Los extractos evaluados fueron:
Cynanchum sp (123), Oxypetalum cordofolium (139), Baccharis sp (131), Clibadium
pentaneuron (125), Critoniela acuminata (127), Lepidaploa lehamannii (135),
Mikania banisteriae (124), Mikania lloensis (136), Pentacalya urbanii (122), Tilesia
baccata (133), Acalypha diversifolia (126), Alchornea coelophylla (128), Alchornea
sp (140), Hyeronima sp (130), Faramea sp (138), Galantamina (GAL), Fisostigmina
(ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI). ...................................................... 51
Falsos positivos de los extractos metanólicos.Los extractos evaluados fueron:
Rubiacea sp (132), Piper crassinervium (167), Piper pesaresanum (148), Piper
umbellatum (163), Cestrum sp (137), Depprea aff sachapapa (170), Dunalia
solanacea (145), Lycianthes radiata (146), Solandra coriacea (164), Solanum
acerifolium (120), Solanum cf umbellatum (121), Solanum lepidotum (134), Solanum
sp (129), Boehmeria bullata (142), Phenax uliginosus (143), Galantamina (GAL),
Fisostigmina (ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI). ................................. 52
Figura 29. (A) Detección IAChE de los extractos de diclorometano por bioautografía
y (B) Falsos positivos de los extractos de diclorometano. Los extractos evaluados
fueron: Urera ballotaewfolia (150) (extracto metanólico), Cynanchum sp (123),
Oxypetalum cordofolium (139), Baccharis sp (131), Clibadium pentaneuron (125),
Critoniela acuminata (127), Lepidaploa lehamannii (135), Mikania banisteriae (124),
Mikania lloensis (136), Pentacalya urbanii (122), Tilesia baccata (133), Acalypha
diversifolia (126), Alchornea coelophylla (128), Alchornea sp (140), Hyeronima sp
(130), Galantamina (GAL), Fisostigmina (ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído
(ANI). ..................................................................................................................... 53
fueron: Faramea sp (138), Rubiacea sp (132), Piper crassinervium (167), Piper
pesaresanum (148), Piper umbellatum (163), Cestrum sp (137), Depprea aff
sachapapa (170), Dunalia solanacea (145), Lycianthes radiata (146), Solandra
coriacea (164), Solanum acerifolium (120), Solanum cf umbellatum (121), Solanum
lepidotum (134), Solanum sp (129), Galantamina (GAL), Fisostigmina (ESE),
Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI). ................................................................. 54
Figura 31. Extractos con actividad inhibitoria verdadera contra acetilcolinesterasa.
............................................................................................................................... 56
7
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Cálculos de porcentaje de actividad inhibitoria sobre la enzima

acetilcolinesterasa. ................................................................................................ 72
Anexo 2. Pruebas fitoquímicas por CCD. .............................................................. 73
Anexo 3. Prueba de Dragendorff para alcaloides. ................................................. 73
Anexo 4. Prueba de ninhidrina para aminas. ......................................................... 73
Anexo 5. Prueba de 2,4 - dinitrofenilhidracina para aldehídos. .............................. 74
8
RESUMEN
En el presente trabajo se exhiben los resultados de un estudio dirigido a evaluar la

actividad inhibitoria verdadera contra la acetilcolinesterasa (EC 3.1.1.7.) de
extractos de metanol y diclorometano de 31 plantas pertenecientes a las familias
Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae,
Piperaceae, Solanaceae y Urticaceae, recolectadas en el Parque Regional Natural
Ucumarí (PRNU).
En la búsqueda de plantas como fuente potencial de fitocompuestos inhibidores de
la enzima acetilcolinesterasa (AChE) se validó el método espectrofotométrico de
Ellman en microplacas, para determinar el porcentaje de actividad inhibitoria de la
AChE de los extractos metanólicos a concentraciones de 0,1, 1, 10 y 100 ppm.
La aplicación de Cromatografía de Capa Delgada (CCD) permitió detectar aldehídos
y aminas como falsos-positivos en el ensayo de inhibición de la AChE, los cuales
no pueden ser discriminados por el método espectrofotométrico de Ellman en
microplacas.
La verdadera actividad inhibitoria sobre la acetilcolinesterasa fue observada en los
extractos metanólicos de Critoniela acuminata (Asteraceae), Acalypha diversifolia,
Alchornea coelophylla (Euphorbiaceae), Piper crassinervium (Piperaceae),
Solanum cf umbellatum y Solanum lepidotum (Solanaceae) los cuales presentaron
actividad inhibitoria sobre la AChE mediante el método espectrofotométrico de
Ellman en microplacas y mostraron halos de inhibición de la AChE por
Cromatografía de Capa Delgada; los mismos extractos fueron también positivos con
el revelador de Dragendorff a excepción de Alchornea coelophylla y Piper
crassinervium.
El extracto metanólico de Alchornea coelophylla mostró el mayor porcentaje de
actividad inhibitoria verdadera 18,92% a 100 ppm. Se determinó la concentración
inhibitoria media de Solanum cf umbellatum (IC 50 = 1,22 mg/L).
9
ABSTRACT
In the present work, we report the results of a study aimed to evaluate the true
inhibitory activity against acethylcholinesterase (EC 3.1.1.7.) of methanol and
dichloromethane extracts of thirty one plants belonging to the family Apocynaceae,
Asclepiadaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae, Piperaceae, Solanaceae
and Urticaceae, which were harvest in the Parque Regional Natural Ucumarí
(PRNU).
In quest of plants as potential source of phytocompounds inhibitors of the
acethylcholinesterase enzyme (AChE) was validated spectrophotometric method of
Ellman microplate, to determine the percentage of inhibitory activity AChE of
methanol extract at concentrations of 0,1, 1, 10 and 100 ppm.
The application of Thin Layer Chromatography (TLC) allowed detection of aldehydes
and amines as false-positive test inhibition of AChE, which can’t be discriminated by
the spectrophotometric method of Ellman in microplates.
True inhibitory activity on acetylcholinesterase was observed in methanol extracts of
Critoniela acuminata (Asteraceae), Acalypha diversifolia, Alchornea coelophylla
(Euphorbiaceae), Piper crassinervium (Piperaceae), Solanum cf umbellatum y
Solanum lepidotum (Solanaceae) which showed inhibitory activity AChE with Ellman
spectrophotometric method in microplates and showed halos of inhibition of AChE
by Thin Layer Chromatography; the same extracts were also positive with the
developer of Dragendorff except Alchornea coelophylla and Piper crassinervium.
Alchornea coelophylla methanolic extract showed the highest percent of true
inhibitory activity 18.92% to 100 ppm. The mean inhibitory concentration of Solanum
cf umbellatum (IC 50 = 1,22 mg/L) was determined.
10
1. INTRODUCCIÓN
"Demencia" es un término general que describe una variedad de enfermedades y

condiciones médicas que se desarrollan cuando las células nerviosas del cerebro
mueren o dejan de funcionar normalmente. La muerte o el mal funcionamiento de
las neuronas, causa cambios en la memoria, comportamiento e incapacidad para
pensar con claridad (Thies y Bleiler, 2012). El tipo más conocido de demencia es la
enfermedad de Alzheimer (EA) (Nie et al., 2009). La EA es un trastorno neurológico
irreversible, que se caracteriza por la pérdida de memoria, disfunción cognitiva,
trastornos de la conducta y déficits en las actividades cotidianas (Konrath et al.,
2012).
La principal estrategia terapéutica para el tratamiento de la EA es el aumento del
nivel de acetilcolina (ACh) en el cerebro, mediante la intervención catalítica de la
enzima acetilcolinesterasa (AChE). Actualmente, cuatro de los cinco fármacos
utilizados en el tratamiento de la EA son inhibidores de la AChE, tales como tacrina,
rivastigmina, donepezilo y galantamina. Cada fármaco tiene un efecto diferencial en
los individuos con EA, ya sea retrasar la neurodegeneración o la estabilización de
la función cognitiva. Sin embargo, el éxito de estos fármacos se ve limitado por su
toxicidad hepática dependiente de la dosis y los efectos secundarios periféricos
relacionados (Lakshmi et al., 2013).
Los efectos secundarios más comunes de estos medicamentos incluyen náuseas y
vómitos, los cuales están relacionados con la presencia de neuronas colinérgicas
en exceso en el cerebro. Efectos adversos menos frecuentes, incluyen bradicardia,
calambres musculares, disminución del apetito y pérdida de peso, así como el
aumento de la producción de ácidos gástricos. Por lo tanto, se necesitan nuevas
moléculas que sean potencialmente más eficaces inhibiendo la AChE para reducir
al mínimo estos efectos secundarios (Chen et al., 2012). Hasta la fecha, no hay una
cura disponible para la EA, excepto para el tratamiento sintomático. En
consecuencia, actualmente hay una gran demanda por el descubrimiento de nuevas
alternativas médicas para el tratamiento de la EA (Orhan y Aslan, 2009).
Los productos naturales desempeñan un papel esencial en muchas áreas de la
sociedad, por ejemplo, como agentes nutricionales y terapéuticos para prevenir o
curar enfermedades. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que
aproximadamente el 65% de la población mundial se basa principalmente en las
plantas usadas en las medicinas tradicionales para su atención primaria de salud.
En 1990, el 80% de las sustancias usadas como medicamentos para el tratamiento
de enfermedades eran productos naturales o sus análogos (Kvalheim et al., 2011).
Su potencial terapéutico también se ha demostrado con éxito en el campo de la EA.
Por lo tanto, la naturaleza puede ser considerada como una importante fuente de
nuevas entidades químicas potencialmente interesante para el tratamiento de varias
enfermedades, incluyendo la EA (Di Giovanni et al., 2008).
11
Los metabolitos secundarios de las plantas se han utilizado como inhibidores de
varias clases de enzimas. Varios miles de extractos de plantas de diferentes lugares
del mundo han sido probados contra la enzima acetilcolinesterasa, varias especies
vegetales han demostrado actividad inhibitoria sobre la AChE. Estas plantas, por lo
tanto, tienen importancia terapéutica potencial (Ashraf et al., 2011).
Tradicionalmente, las plantas han sido una rica fuente de inhibidores de la AChE.
Los habitantes de Cáucaso usan bulbos de campanillas (Galanthus sp,
Amaryllidaceae) para tratar la falta de memoria. El compuesto activo de esta planta
se ha aislado y llamado galantamina (Figura 1). Hoy en día este compuesto se
produce comercialmente a partir de especies del género Narcissus y se utiliza para
tratar la enfermedad de Alzheimer, se comercializa bajo el nombre Reminyl. Otros
inhibidores de la AChE derivados de plantas utilizadas para el tratamiento de la EA
incluyen la huperzina A aislada de Huperzia serrata y rivastigmina (Excelon); el
último es un derivado de fisostigmina, la cual fue aislada de la haba de Calabar
(Physostigma venenosum) (de Jong et al., 2006).
CH3
H
O O H
OH
N
CH3
Figura 1. Estructura de la galantamina, (McNulty et al., 2009).
Colombia es un país con una gran riqueza de especies de plantas pertenecientes a

muchas familias taxonómicas, lo que lo convierte en una fuente excelente en la
búsqueda de productos naturales con actividad benéfica para el hombre, tanto
desde la perspectiva biológica como económica (Correa y Gaviria, 2010).
12
2. MARCO TEÓRICO
2.1. LA ACETILCOLINESTERASA (AChE)
La enzima acetilcolinesterasa (AChE; código enzimático 3.1.1.7) juega un papel vital

en los sistemas nerviosos central y periférico (Asadabadi et al., 2009). Finaliza las
transmisiones de impulsos en las sinapsis colinérgicas en el sistema nervioso al
hidrolizar el neurotransmisor acetilcolina a colina y acetato, como se detalla en la
figura 2 (Milkani et al., 2011; Pohanka et al., 2011).
La AChE es una serina esterasa que pertenece a la categoría de las enzimas
hidrolasas. Es una proteína globular con una forma elipsoide que tiene unas
dimensiones aproximadas de 45 x 60 x 65 Å (Sussman et al., 1991).
CH3 O CH3
H3C O
+ +
N AChE H3C N +
O CH3 -
H3C CH3 OH H3C O
Acetilcolina Colina Acetato
Figura 2. Reacción entre la acetilcolinesterasa y la acetilcolina (Milkani et al., 2011).
El sitio activo de la AChE contiene dos regiones: (i) la región catalítica donde se
hidroliza el enlace éster y (ii) la región aniónica que acomoda la parte con carga
positiva de la acetilcolina. La primera región contiene la tríada catalítica de Ser203,
His447 y Glu334. Esta tríada catalítica es similar a otras serina esterasas. El
mecanismo de este tipo de enzima se basa en el ataque nucleofílico del grupo
hidroxilo del residuo de serina en el carbono carbonilo del enlace éster de la AChE.
El residuo de serina es acetilado temporalmente, mientras que la colina se forma y
difunde fuera del sitio activo. El residuo de serina acetilado a través del grupo
hidroxilo del aminoácido es hidrolizado hasta acetato, regenerando así nuevamente,
el sitio activo (figura 3) (Milkani et al., 2011).
La AChE juega un papel vital en los sistemas nerviosos central y periférico. Hay
evidencias que muestran tanto la relación de la función de la enzima y deficiencias
con las siguientes enfermedades: enfermedad de Parkinson (Asadabadi et al.,
2009), enfermedad de Huntington (Adam y Jankovic, 2008), miastenia gravis
(Mahadeva et al., 2008), esquizofrenia (Stip et al., 2007), el glaucoma (Millard y
Broomfield, 1995), esclerosis múltiple (Christodoulou et al., 2008) y la enfermedad
de Alzheimer (Seltzer et al., 2007; Bartus et al., 1982).
13
Figura 3. Pasos involucrados en la hidrólisis de la acetilcolina en el sitio activo de la
AChE (Milkani et al., 2011).
2.2. INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común de demencia en las

personas de edad avanzada. Lamentablemente, hasta la fecha una cura efectiva o
incluso una terapia preventiva siguen siendo difíciles de alcanzar. Los tratamientos
disponibles tienen sólo un efecto paliativo, proporcionando una retención temporal
de las funciones cognitivas y de memoria, pero sin alterar la progresión de la
enfermedad (Puiatti et al., 2013).
En la actualidad, los inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChE) son los primeros y
el grupo más desarrollado de medicamentos aprobado para el tratamiento
sintomático de la EA (Yang et al., 2012). En el mercado se encuentran cinco
medicamentos, cuatro de ellos (tacrina, donepezilo, rivastigmina y galantamina) son
inhibidores de la AChE. No obstante, todos estos medicamentos presentan efectos
secundarios no deseados en los pacientes y su eficacia disminuye después un
tratamiento prolongado. Debido al rápido aumento de población de edad avanzada
a nivel mundial, hay una gran demanda de necesidades médicas no cubiertas en
este campo (Hu et al., 2013).
Un gran número de investigaciones se han dirigido a la extracción de nuevos
compuestos con actividad inhibidora obtenidos de diferentes especies de plantas,
la síntesis y ensayo de los nuevos inhibidores de la AChE y estudios de la relación
estructura-actividad de inhibidores de la AChE (Asadabadi et al., 2009).
Se ha encontrado un número significativo de compuestos de origen natural que
inhiben la AChE. El grupo más destacado de estos, son los alcaloides de las
Amaryllidaceae, tales como: galantamina y sanguinina, así como los alcaloides del
Lycopodium, huperzina A y B. El inhibidor de la AChE, el bromohidrato de
galantamina (Reminyl) fue el primero de los alcaloides de las Amaryllidaceae en ser
aprobado como medicamento para el tratamiento de la EA. Aunque el alcaloide
relacionado, sanguinina es un inhibidor más potente que la galantamina, su baja
abundancia natural ha impedido considerablemente su desarrollo como
14
medicamento, debido a esto la búsqueda de nuevos inhibidores de la AChE con
mejores perfiles biológicos continúa siendo de gran interés para los químicos
(McNulty et al., 2010).
2.3. CLASIFICACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA
Varios derivados naturales, semisintéticos y sintéticos han sido descubiertos o

diseñados para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y se pueden clasificar
en términos generales por sus estructuras químicas (Singh et al., 2013).
2.3.1. DERIVADOS ANÁLOGOS DE LA TETRAHIDROACRIDINA
La tacrina (9-amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina) (figura 4) fue el primer fármaco

aprobado para el tratamiento de la EA en 1993. Desafortunadamente, la
administración de tacrina para el tratamiento de la EA está asociada con una alta
incidencia de hepatotoxicidad (Khoobi et al., 2015). Es un potente inhibidor tanto de
la acetilcolinesterasa (IC 50 = 0,28 ± 0,02 µM) como de la butirilcolinesterasa
(IC 50 = 0,35 ± 0,2 µM) (BuChE). Su estructura ha sido modificada basándose en el
anillo de la 4-aminopiridina en el sistema tetrahidroacridina. Se ha encontrado que
el segmento 4-aminopiridina en la molécula tetrahidroacridina está relacionado con
la potente actividad de esta. Las modificaciones, clasificadas en la modificación del
anillo heterocíclico y la sustitución de 4-amino, pueden orientarse manteniendo el
grupo 4-aminopiridina intacto (Barreiro et al., 2003).
NH2
Figura 4. Estructura de la tacrina, inhibidor de la AChE (Singh et al., 2013).
15
2.3.2. DERIVADOS DE LA N-BENCILPIPERIDINA
El donepezilo (figura 5) fue aprobado en 1996 para el tratamiento de leve a

moderado de la EA. Fue diseñado como inhibidor bivalente de la AChE a partir de
la fisostigmina (IC 50 = 11,6±1,6 nM). La estructura del donepezilo ha sido
modificada y se observó el potencial efecto inhibitorio de sus derivados conservando
intacto el anillo de donepezilo, mientras que el anillo de indanona del donepezilo ha
sido sustituido por otros anillos heterocíclicos (Camps et al., 2008).
N
O
O
H3C
H3C
O
Figura 5. Estructura química del donepezilo.
2.3.3. DERIVADOS DE LA BENZOFENONA
Estos compuestos abarcan una función aromática y un grupo amino terciario

conectado por un espaciador adecuado. En particular, el núcleo de la benzofenona
como función aromática y la N, N-bencil metilamina como función amino terciaria
han sido más usados. En la figura 6 se presenta la estructura de dos inhibidores de
la AChE derivados de la benzofenona, Belluti et al., (2009) sintetizaron estos
compuestos y determinaron sus IC 50 , los cuales fueron 0,57 ± 0,04 µM y 1,41 ± 0,14
µM para A y B respectivamente.
16
A CH3 CH3
O N
O
CH3 O
B
CH3
O
O
H3C
N
O
Figura 6. Inhibidores de la AChE derivados de la benzofenona (Belluti et al., 2009).
2.3.4. ANÁLOGOS DEL DIBENZOFURANO
La rivastigmina (figura 7A) es una pequeña molécula que cruza la barrera

hematoencefálica fácilmente y posee propiedades inhibitorias de la AChE
(IC 50 = 2,07 µM) y la BuChE (Li et al., 2014). Fue aprobada en el año 2000 para el
tratamiento de leve a moderado de la EA. En 2007, fue reformulada para su
dosificación a través de parches transdérmicos. Esto ha resultado en una
disminución de los efectos secundarios comparados con la cápsula oral. Se han
sintetizado varios derivados de la rivastigmina, por ejemplo el compuesto 5-tio-1-
azaciclopentano [α] naftaleno (Figura 7B), exhibió la mayor actividad entre estos
(Bolognesi et al., 2004).
17
H3C O A
N
H3C O
CH3
N
H3C CH3
H3C NH B
O S H
O
H N
H3C
Figura 7. Rivastigmina (A) y su derivado 5-tio-1-azaciclopentano [α] naftaleno.
2.3.5. GALANTAMINA
La galantamina (figura 1) es un alcaloide terciario, quiral que se puede extraer de

diferentes especies de la familia de las Amarilidáceas incluyendo bulbos y flores de
narciso (Narcissus) y de la campanilla caucásica (Galanthus woronowii). La
galantamina se emplea en el tratamiento de los síntomas de leves a moderados de
la enfermedad de Alzheimer y otras alteraciones de la memoria como la demencia.
Además, se utiliza para las enfermedades neuromusculares o para antagonizar la
depresión respiratoria inducida por fármacos.
18
La galantamina es un inhibidor selectivo, reversible y competitivo de la
acetilcolinesterasa (IC 50 = 1,9 ± 0.16 µM) (Nair et al., 2011), así como un modulador
alostérico del receptor nicotínico neuronal de acetilcolina y fue aprobada como un
medicamento recetado por la Food and drugs administration (FDA) en 2001
(Lilienfeld, 2002). El costo de la obtención de la galantamina a partir de fuentes
naturales (especies del género Narcissus) es muy alto (Marques et al., 2011)
2.3.6. FISOSTIGMINA
La fisostigmina (figura 8), también conocida como eserina es un alcaloide aislado

de las semillas de Physostigma Venenosum, posee actividad inhibidora contra la
AChE (IC 50 = 1,0 nM). La fisostigmina puede penetrar el sistema nervioso central,
así que se ha emprendido el desarrollo de los derivados de la fisostigmina, esto
resultó en la obtención de análogos lipofílicos adicionales de la eserina, entre estos
destacan la fenserina y geneserina (Zhan et al., 2010).
H3C NH O H3C
O
N
N H CH3
CH3
Figura 8. Fisostigmina, el primer inhibidor de la AChE usado como medicamento
(Singh et al., 2013).
2.3.7. DERIVADOS DE LA HUPERZINA
Las Huperzinas A y B son alcaloides aislados de la hierba china Huperzia serrata,

la cual es un miembro del género Lycopodium, utilizada en la medicina herbal
tradicional. Induce una mejoría significativa de la memoria en sujetos de edad y
pacientes con la enfermedad de Alzheimer.
19
Ambos alcaloides son potentes inhibidores reversibles de la AChE. Huperzina A
(figura 9A) se ha encontrado más potente que la huperzina B (figura 9B) en la
inhibición de la AChE; Sin embargo, la huperzina B exhibió un mayor índice de
terapéutico en comparación con la huperzina A, esta ha sido aprobada en China
como un medicamento para el tratamiento de EA (Jiang et al., 2003).
Huperzina A Huperzina B
Figura 9. Huperzinas, huperzina A y huperzina B.
2.4. MÉTODOS PARA DETECTAR INHIBIDORES DE LA AChE
Para la detección de compuestos con actividad inhibitoria de la AChE se han

utilizado métodos espectrofotométricos como el método de Ellman (Ellman et al.,
1961; Yang et al., 2012); el fluorométrico (Rhee et al., 2003b); bioautografía
(Marston, 2011; Rhee et al., 2003a), HPLC-UV-VIS-MS y detección bioquímica
(Ingkaninan et al., 2000). A continuación se describe brevemente cada uno de ellos.
2.4.1. MÉTODO DE ELLMAN
De acuerdo con Ellman et al., (1961), la acetiltiocolina es hidrolizada por la AChE

produciendo tiocolina y acetato, la tiocolina reacciona con el ácido 5,5’- ditiobis (2-
nitrobenzoico) (DTNB) generando la 5-tio-2-nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina y el
anión 5-tio-2-nitrobenzoato (color amarillo) (Ver figura 10), el cual se detecta a
través del espectrofotómetro de UV-VIS a una λ= 412 nm.
Este método es el más empleado, porque el espectrofotómetro UV-VIS es de mayor
disponibilidad en muchos laboratorios, de fácil manejo y permite un análisis rápido;
sin embargo, es poco selectivo y la presencia de aminas y aldehídos, pueden
originar falsos-positivos en los estudios de inhibición de la AChE (Hernández, 2004).
20
-
I
O H3C +CH O H3C +
3 + CH3
N AChE - N
H3C S H3C O HS CH3
I
- CH3
Ioduro de acetiltiocolina Acetato Ioduro de tiocolina
OH
O
-
O
-
HS CH3 I O + OH
+
N CH3
+ N S O
+
O S N -
CH3
O
Ioduro de tiocolina Ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB)
-
OH O
O O
- - S
O + O O
O -
N S -
+ - +O
O S I CH3 N S N
+ -
N CH3 O O
CH3
5-tio-2-nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina 5-tio-2-nitrobenzoato (Amarillo)
Figura 10. Reacciones implicadas en la determinación de actividad de la

acetilcolinesterasa in vitro por el método de Ellman (Ellman et al., 1961).
Pagliosa et al., (2010) a través de este procedimiento encontraron que la AChE
extraída del cerebro de ratas de noventa días de edad fue inhibida más del 50% por
montanina a una concentración de 1 mM. La montanina fue obtenida de
Hippeastrum psittacinum y Hippeastrum vittatum las cuales son especies de la
familia Amaryllidaceae.
Chen et al., (2012) evaluaron la actividad inhibitoria de extractos metanólicos de
tofus fermentados de 15 marcas distintas contra la AChE a través del método de
Ellman mediante un lector de microplacas. La actividad inhibitoria del tofu No. 5
(procedente del sur de Sichuan Wutongqiao, el cual no contenía pimienta) fue la
mejor y presentó un IC 50 = 0.191 mg/mL.
21
Además, por medio de este método se han detectado extractos de plantas que
tienen actividad inhibitoria sobre la enzima AChE; por ejemplo, Torras-Claveira et
al., (2013) evaluaron la actividad inhibitoria de más de 100 plantas del género
Narcissus (Amaryllidaceae), en donde la galantamina fue encontrada en 97 y
sanguinina en 22 de estas. La sanguninina es un inhibidor de la AChE más potente
que la galantamina.
2.4.2. MÉTODO FLUOROMÉTRICO
En el método fluorométrico el Ioduro de 7-acetato-1-metilquinolina (IAMQ) (sustrato

fluorogénico) es hidrolizado por la acetilcolinesterasa para dar como producto, el
Ioduro de 7-hidroxi-1-metilquinolina (IHMQ) (figura 11), este es un compuesto
altamente fluorescente, el cual es detectado fluorométricamente (Hernández, 2004).
De acuerdo a Rhee et al., (2003b) para el ensayo de la acetilcolinesterasa (AChE);
los métodos fluorométricos son más sensibles que los colorimétricos; sin embargo,
el costo de los equipos para aquellos es relativamente mucho más alto.
+
O
O N I - AChE + +
HO N - -
CH3 I O CH3
H3C O CH3
IAMQ IHMQ Acetato
(λexc 320 nm; λemis 410 nm) (lexc 406 nm; lemis 505 nm)
Figura 11. Hidrólisis del Ioduro de 7-acetato-1-metilquinolina (IAMQ) a Ioduro de 7-

hidroxi-1-metilquinolina (HMQI) por la AChE (Rhee et al., 2003b).
2.4.3. BIOAUTOGRAFÍA
La bioautografía es un ensayo de detección de la actividad biológica de una muestra

que ha migrado en una placa de cromatografía de capa delgada (CCD) con un
sistema de elución adecuado. Sólo se requieren pequeñas cantidades de muestra
y es ideal para la investigación de constituyentes de una planta, que a menudo se
presentan como mezclas complejas (Marston, 2011).
22
O
OH
O CH3 O
AChE
+
HO CH3
Ácido acético
Acetato de α−naftilo α-Naftol
H3C O
OH
+ +
+ N N N N
O CH3
α-Naftol Sal de Fast Blue B
CH3 H3C
O O
N N
N N
OH HO
Colorante diazoico (Púrpura)
Figura 12. Reacción de la AChE con el acetato de α-naftilo para formar el α-naftol y
la posterior formación de un colorante diazoico (púrpura) con la sal de diazonio (sal
de Fast Blue) (Marston, 2011).
En contraste con HPLC, muchas muestras se pueden evaluar al mismo tiempo por
CCD. Los solventes orgánicos, que causan la inactivación de las enzimas o la
muerte de los organismos vivos, pueden ser completamente eliminados antes de la
detección biológica. Muchos bioensayos son compatibles con CCD. Las
evaluaciones antimicrobianas, de radicales libres, de actividad antioxidante e
inhibición enzimática son algunos de los ensayos compatibles (Marston, 2011).
23
Rhee et al., (2003a) desarrollaron un método para detectar falsos positivos en la
determinación de la inhibición de la AChE mediante el método de Ellman, los cuales
se deben a que algunos aldehídos y/o aminas inhiben la reacción entre la tiocolina
y el DTNB, esta reacción es imprescindible en el método de Ellman porque produce
el anión 5-tio-nitrobenzoato el cual tiene su máxima absorción a 405 nm.
SatheeshKumar et al., (2010) determinaron la verdadera actividad inhibitoria de la
AChE mediante el ensayo en microplacas y bioautografía de ambos ensayos por el
método de Ellman del extracto hidroalcohólico de Trigonella foenum graecum L y
trigonelina purificada a partir del extracto. La trigonelina mostró un valor IC 50 de
233±0.12 µM; mientras que la galantamina usada como estándar de inhibidor de la
AChE, mostró un valor IC 50 de 1.27±0.21 µM.Según Marston, (2011) la actividad
inhibitoria de la AChE también se puede detectar por una reacción de diazotación
combinada con bioautografía, en la cual la AChE hidroliza el acetato de α-naftilo
produciendo ácido acético y α-naftol, seguida a esta reacción, el α-naftol reacciona
con la o-dianizidina diazo azul B (Fast Blue B Salt) produciendo un colorante
diazoico púrpura (figura 12).
2.4.4. HPLC-UV-VIS-MS Y DETECCIÓN BIOQUÍMICA
Ingkaninan et al., (2000) desarrollaron un método de cromatografía líquida de alta

eficiencia (HPLC) acoplada en línea con detectores de ultravioleta (UV), un
espectrómetro de masas (MS) y con detección bioquímica para la evaluación de la
actividad inhibitoria de la AChE.
Mediante la combinación del poder de separación de HPLC, la alta selectividad de
la detección bioquímica, y la capacidad de proporcionar la masa molecular y la
información estructural a través del espectro de masas, los inhibidores de la AChE
pueden ser identificados rápidamente. La detección bioquímica se basa en el
método Ellman (Ingkaninan et al., 2000) (Figura 13).
24
Figura 13. Esquema de HPLC acoplado en línea con UV-VIS-MS – Detección
Bioquímica (Ingkaninan et al., 2000).
2.5. PARQUE REGIONAL NATURAL UCUMARÍ (PRNU)
El Parque Regional Natural Ucumarí (PRNU) es una reserva natural ubicada al

sureste de Pereira. Adjunta al Parque Nacional Los Nevados, la Reserva de
Ucumarí cubre 42 km2 de terreno perteneciente a la cuenca media del río Otún
(Figura 14). La misión del parque es conservar el bosque andino dentro de una zona
agrícola (CARDER).
El PRNU limita al norte y al oriente con el Parque Natural de los Nevados, al sur con
la divisoria de aguas del río Otún y del río Quindío y por el occidente con la quebrada
Palo Blanco hasta su confluencia con el río Otún; posee un rango altitudinal entre
los 1850 y 2650 m. Tiene una temperatura promedio de 14 ºC, una pluviosidad de
2600 mm/año y una humedad del 87% (Rangel y Garzón, 1994).
25
Figura 14. Mapa del Parque Regional Natural Ucumarí (CARDER).
Hasta el momento se han encontrado 598 especies, pertenecientes a 113 familias
de plantas superiores, se estima que este número corresponde aproximadamente
a un 80% de todas las especies existentes en el PRNU. De las familias que
presentan el mayor número de especies se destacan la Solanaceae con 39
especies, la Orquidaceae con 35, la Asteraceae con 33 y la Melastomataceae con
31. En total estas cuatro familias abarcan alrededor del 20% de todas las plantas
superiores del Parque Regional Natural Ucumarí (Galeano y Bernal, 1993).
26
2.5.1. FAMILIAS DE PLANTAS A ESTUDIAR
Este estudio se realizó con 31 especies de plantas, recolectadas en el Parque

Regional Natural Ucumarí. Las familias a las que pertenecen las plantas colectadas
fueron: Apocynaceae, Asclepiedaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae,
Piperaceae, Solanaceae y Urticaceae. A continuación se hace una breve
descripción de cada una de las familias de plantas empledas en este estudio.
2.5.1.1. FAMILIA APOCYNACEAE
La familia Apocynaceae está constituida por cerca de 200 géneros y 2000 especies,
se encuentran comúnmente en las regiones tropicales y subtropicales, y tienen valor
ornamental (Figura 15). Estas plantas son también bien conocidas por los alcaloides
que contienen, muchos de cuales son venenosos, un buen número de estos ha
encontrado su lugar en la medicina moderna (Joselin et al., 2012).
Figura 15. Flores de especies de la familia Apocynaceae (A) Cynanchum ellipticum

y (B) Cynanchum formosum (Jürgens et al., 2009).
Son plantas herbáceas (hay muchas especies volubles o trepadoras), leñosas de

hojas enteras y opuestas. Las estípulas son muy raras. Fruto bacciforme o capsular
o formado por dos mericarpos distintos que constituyen sendos folículos o frutos
abayados. Semillas por lo común comprimidas (García, 1992).
Las especies de esta familia siempre poseen tubos laticíferos simples y floema
intraleñoso. El látex frecuentemente es blanco pero también pueden ser de color
amarillento a marfil (García, 1992).
27
2.5.1.2. FAMILIA ASCLEPIADACEAE
La familia Asclepiadaceae agrupa a unas 1700 especies (Correa y Gaviria, 2010).

Son plantas herbáceas, lianas, arbustos y árboles ocasionalmente, que crecen en
zonas despejadas, bosques en regeneración y raras veces en bosques maduros.
La inflorescencia es cimosa en cabezuela o capítulo. El fruto es una cápsula
indehiscente pequeña similar a un filamento (Figura 16) (Trujillo, 2008).
Figura 16. Oxypetalum cordifolium (Asclepiadaceae) (Tomado de:

http://plantasdecolombia.org).
2.5.1.3. FAMILIA ASTERACEAE
Son hierbas (rastreras o trepadoras), plantas leñosas (arbustos, árboles, bejucos).

Poseen hojas alternas y opuestas, simples o compuestas; flores dispuestas siempre
en capítulos, hermafroditas o unisexuales. Fruto en aquenino sésil, algunas veces
con un apéndice y frecuentemente con el vilano adherido a la testa; semillas sin
endospermo en íntimo contacto con el pericarpio (Correa y Gaviria, 2010).
Para la flora colombiana esta familia comprende numerosísimas especies que
crecen desde 0 metros sobre el nivel del mar hasta el páramo a 4.000 metros. Sin
embargo, la mayor distribución de las especies de esta familia está en los páramos
y subpáramos de las 3 cordilleras (Figura 17) (García, 1992).
28
Figura 17. Aster amellus L. (Asteraceae) (Münzbergová et al., 2011).
2.5.1.4. FAMILIA EUPHORBIACEAE
Son hierbas, arbustos, árboles y con frecuencia vegetales crasos. La mayoría de

las especies de ésta familia tienen en todos sus órganos tubos laticíferos. Las
semillas contienen gran cantidad de aceite y granos en forma de aleurona; hojas
sencillas o digitadas y las flores son unisexuales (Figura 18) (García, 1992).
Figura 18. Ricinus communis (Euphorbiaceae) (Tomado de:

29
Esta familia es una de las más grandes a nivel mundial y ocupa el sexto lugar en
diversidad después de Orchidaceae, Asteraceae, Fabaceae, Poaceae y Rubiaceae.
Está conformada por alrededor de 8700 especies distribuidas en 320 géneros
(Lagos, 2009).
2.5.1.5. FAMILIA RUBIACEAE
La familia Rubiaceae comprende cerca de 620 géneros, de los cuales 26 contienen

más de 100 especies. En Colombia se registran 105 géneros nativos distribuidos en
25 tribus (Gonzáles, 2011).
Pueden encontrarse en esta familia árboles o arbustos, hierbas o trepadoras.
Poseen hojas opuestas, simples; estípulas generalmente interpeciolares,
persistentes o caducas (Figura 19).
Figura 19. Faramea occidentalis (Rubiaceae) (Tomado de:

Flores perfectas o unisexuales; cáliz con el tubo unido al ovario formando un

hipanto, limbo con 4–5 dientes o lóbulos o espatulado; corola gamopétala,
actinomorfa, infundibuliforme, campanulada o rotada, lóbulos usualmente 4–6,
imbricados, valvados o abiertos; estambres en igual número y alternos con los
lóbulos de la corola, insertos en el tubo de la corola, anteras dehiscentes por
hendiduras longitudinales; ovario ínfero, usualmente 2-locular, coronado por un
disco carnoso, estilo simple o furcado con estigma terminal; numerosos óvulos en
cada lóculo. El fruto puede ser una baya o una cápsula (Henao, 2008).
30
2.5.1.6. FAMILIA PIPERACEAE
La familia Piperaceae comprende un número extenso de arbustos, hierbas y lianas

que se encuentran en lugares sombríos y húmedos de todo el mundo. Tienen tallos
nodosos, hojas esparcidas, flores en inflorescencias densas en espigas o en
racimos; androceo en 1-10 estambres y gineceo de 1-4 carpelos, generalmente
tricarpelar; ovario unilocular, con un rudimento seminal ortótropo de inserción basal;
fruto en baya o en drupa; semillas con embrión muy pequeño. Comprende de 10 a
12 géneros entre ellos se enceuntran el género Piper, Piperomia, Pothomarphe,
Ottonia, Sarchorhachis y Trianaeopiper; todos representados en la flora colombiana
(Figura 20) (Giraldo, 2012).
Figura 20. Piper sarmentosum (Piperaceae) (Zakaria et al., 2010).
2.5.1.7. FAMILIA SOLANACEAE
Las plantas de esta familia se pueden encontrar como hierbas, lianas, arbustos o
árboles pequeños, terrestres o epífitas, las cuales crecen en el interior de los
bosques o en zonas abiertas; poseen pelos estrellados y algunas veces tiene
espinas, su inflorescencia es cimosa, con frutos en baya o algunas veces en cápsula
(Figura 21); sus especies se caracterizan por biosintetizar alcaloides (Trujillo, 2008).
Especies como el borrachero (Brugamsia aurea) y la dama de noche (Cestrum
nocturnum), se caracterizan por ser venenosas y alucinógenas, debido a la
producción de alcaloides como escopolamina, que causa mareos, alucinaciones y
perdida del conocimiento. La escopolamina es el alcaloide producido en mayor
proporción por la dama de noche y la causa principal de los trastornos (Trujillo,
2008).
31
Figura 21. Withania somnifera (Solanaceae) (Vanden Berghe et al., 2012).
2.5.1.8. FAMILIA URTICACEAE
Las plantas de la familia Urticaceae son hierbas u ocasionalmente semiarbustos,

rara vez pequeños árboles o lianas, a menudo con pelos urticantes especializados
(Figura 22). Tienen hojas simples, opuestas o alternas, con tendencia a
mineralizarse con sílice o carbonato de calcio (Mañas et al., 1990).
Figura 22.Urera lianoides (Urticaceae) (Tomado de: http://plantasdecolombia.org).

Las flores de las especies pertenecientes a la familia Urticaceae son anemófilas, de
distribución monoica, dioica (plantas macho y hembra en distinto pie) o polígama,
pequeñas con inflorescencias axilares, con 4 ó 5 sépalos y 4 ó 5 estambres.
32
Dentro de la familia Urticaceae se distinguen 45 géneros y 700 especies,
ampliamente distribuidas en regiones tropicales y subtropicales y más escasas en
regiones templadas y frías (Mañas et al., 1990).
A continuación se presenta la tabla 2, donde se muestran algunas de las actividades
biológicas reportadas para especies pertenecientes a las familias antes antes
mencionadas en este trabajo.
Tabla 1. Actividades biológicas encontradas en las familias en estudio.
Genero /
Familia Actividad biológica Referencia
especie
Stærk et al.,
Apocynaceae Cynanchum Citotóxica
2000
Navarro et al.,
Asclepiadaceae Oxypetalum Antifúngica
2003
dos Santos et
Baccharis Antiinflamatoria
al., 2010
Odonne et al.,
Clibadium Antileishmaniasis
2009
Critoniella
Antiinflamatoria Jaimes, 2010
Asteraceae acuminata
Antiinflamatoria,
Rufatto et al.,
Mikania antialérgica y
2012
analgésica
Pentacalia Antimalárica y Morais et al.,
urbanii antileishmaniasis 2012
Thambiraj et
Acalypha Antioxidante
al., 2012
Euphorbiaceae
Alchornea Kouakou et
Inmunomoduladora
coelophylla al., 2013
Piper Yamaguchi et
Antioxidante
crassinervium al., 2006
Piperaceae
Piper Antibacterial, Roersch,
umbellatum citotóxica 2010
Pérez-Saad y
Cestrum Antiepiléptica Buznego,
Solanaceae 2008
Al-Oqail et al.,
Solanum Antimicrobiana
2012
Boehmeria Al-Shamma
Urticaceae Antimicrobiana
bullata et al., 1982
33
3. JUSTIFICACIÓN
Con este proyecto se pretende realizar un tamizado de los extractos vegetales de

las treinta y un plantas recolectadas en el Parque Regional Natural Ucumarí
(PRNU), para determinar cuales tienen actividad inhibitoria verdadera sobre la
acetilcolinesterasa, enzima clave para el tratamiento sintomático de la enfermedad
de Alzheimer.
Los productos naturales son fuente de la medicina herbal tradicional y sintética. Son
el sistema de atención primaria de salud en algunas partes del mundo (Marimuthu
et al., 2012). De los varios cientos de miles de especies de plantas en todo el mundo,
sólo una pequeña proporción se ha investigado tanto fitoquímica como
farmacológicamente. Cuando se considera que una sola planta puede contener
miles de constituyentes químicos las posibilidades de hacer nuevos
descubrimientos medicinales se hacen evidentes (Hostettmann, 1999).
Actualmente la investigación de productos naturales está enfocada en la búsqueda
de fármacos prometedores contra las enfermedades humanas. Por tanto,
investigadores de todo el mundo participan activamente en la detección de
productos naturales como inhibidores de la AChE (Khan et al., 2012).
Un gran número de plantas se ha utilizado en remedios de la medicina tradicional
para tratar la memoria y trastornos cognitivos, entre ellas se encuentra Huperzia
serrata (Qian Ceng Ta), la cual ha sido utilizada durante siglos en China para el
tratamiento de contusiones, la hinchazón y la esquizofrenia (Konrath et al., 2012).
Los aspectos botánicos de las plantas de Colombia se han estudiado a fondo desde
el siglo XVIII. Sin embargo, aunque las plantas se utilizan en gran medida en la
medicina tradicional en Colombia, ha habido poca investigación sobre sus
propiedades fitoquímicas (Gonzalez, 1980). La importancia de la diversidad de las
plantas medicinales de un país no sólo radica en su valor quimioterapéutico en la
medicina tradicional, sino también en su potencial como fuentes de nuevas
entidades químicas para el descubrimiento de fármacos (Vital y Rivera, 2011).
A pesar de que Colombia es uno de los países mas biodiversos del mundo y posee
ricas tradiciones culturales sobre el uso plantas, la comprensión científica de las
plantas medicinales sigue siendo en gran parte inexplorada. La flora del Parque
Regional Ucumarí posee gran potencial como fuente de metabolitos secundarios,
en ella se han encontrado plantas con actividad bactericida, antimicótica,
antioxidante y citotóxica (Niño et al., 2002), se propuso identificar nuevas plantas
que posean actividad inhibitoria de la enzima acetilcolinesterasa, lo cual constituiría
un aporte significativo a la búsqueda de nuevas sustancias con potencial para ser
usadas en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y contribuir, al mismo
tiempo al conocimiento de la flora Colombiana y a la valoración de la flora regional.
34
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Detectar inhibidores de la enzima acetilcolinesterasa (IAChE) en extractos

vegetales procedentes de treinta y un plantas pertenecientes a las familias
Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae,
Piperaceae, Solanaceae y Urticaceae.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Caracterizar por cromatografía de capa delgada (CCD) la presencia de

alcaloides, aldehídos y aminas, usando el reactivo de Dragendorff,
2,4-dinitrofenilhidracina y ninhidrina respectivamente como reveladores.
• Establecer la actividad inhibitoria de la enzima acetilcolinesterasa (IAChE) en

extractos vegetales mediante el método espectrofotométrico de Ellman en
microplacas.
• Comprobar por bioautografía la existencia de falsos-positivos (aldehídos y/o

aminas) como inhibidores de la enzima acetilcolinesterasa (IAChE).
35
5. SECCIÓN EXPERIMENTAL
5.1. REACTIVOS Y EQUIPOS

5.1.1. REACTIVOS
Se emplearon los solventes grado analítico: acetona, acetato de etilo, cloroformo,

diclorometano, metanol y n-hexano de las marcas Mallinckrodt, J.T Baker
(Phillipsburg, Estados Unidos) y Carlo Erba (Arese Milano, Italia). Los reactivos
Acetilcolinesterasa de Electrophorus electricus tipo VI-S, Ácido-5,5’- Ditiobis (2-
nitrobenzoico) (DTNB) (Reactivo de Ellman), ioduro de acetiltiocolina (IATC) y la
fisostigmina fueron de la marca Sigma-Aldrich (San Luis, Estados Unidos). La
galantamina (Reminyl) fue de la marca Janssen-Cilag (Zug, Suiza). Se utilizó buffer
Base-Tris, Promega (Fitchburg, Estados Unidos). Las cromatoplacas en aluminio de
silica gel 60 F 254 con un espesor de 0.25 μm fueron de la marca Merck (Darmstadt,
Alemania).
5.1.2. EQUIPOS
• Agitador magnético, Fisher (Leicestershire, Reino Unido).

• Balanza analítica, Ohaus Adventure (Distrito Federal, México).
• Baño termostático, Memmert WBU - 45 (Köln, Alemania).
• Cámara cromatográfica, Aldrich (San Luis, Estados Unidos).
• Lector de microplacas, Thermo Scientific Multiskan GO (Helsinki, Finlandia).
• Microplacas de fondo plano de 96 pozos, BD Falcon (Madrid, España).
• Minishaker, Ika Works IK-LP-3617000 (Wilmington, Estados Unidos)
• Potenciómetro, Fisher Scientific AB15 (Florida, Estados Unidos).
• Pipetas de precisión, Eppendorf 0-10, 10-100, y 100-1000 µL (Hamburgo,
Alemania).
• Rotaevaporador, Heidolph Laborata 4000 (Schwabach, Alemania).
• Vidriería en general, Schott Duran (Tirschenreuth, Alemania)
5.1.3. MATERIAL VEGETAL
El material vegetal correspondió a treinta y una (31) plantas pertenecientes a las

familias Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae,
Piperaceae, Solanaceae y Urticaceae, recolectadas en el Parque Regional Natural
Ucumarí (Pereira, Risaralda - Colombia), un voucher de cada una de ellas se
encuentra depositado en el Herbario de la Universidad de Antioquia (HUA) como se
reporta en la tabla 2.
36
Tabla 2. Lista de plantas a evaluar su actividad inhibitoria de la enzima
acetilcolinesterasa.
FAMILIA ESPECIE VOUCHER

Apocynaceae Cynanchum sp FJR 3964
Asclepiadaceae Oxypetalum cordofolium FJR 3981
Baccharis sp FJR 3972
Clibadium pentaneuron FJR 3966
Critoniela acuminata FJR 3968
Lepidaploa lehamannii FJR 3976
Asteraceae
Mikania banisteriae FJR 3965
Mikania lloensis FJR 3977
Pentacalya urbanii FJR 3963
Tilesia baccata FJR 3974
Acalypha diversifolia FJR 3967
Alchornea coelophylla FJR 3969
Euphorbiaceae
Alchornea sp FJR 3982
Hyeronima sp FJR 3971
Faramea sp FJR 3979
Rubiaceae
Rubiacea sp FJR 3973
Piper crassinervium FJR 4021
Piperaceae Piper pesaresanum FJR 3996
Piper umbellatum FJR 4012
Cestrum sp FJR 3978
Depprea aff sachapapa FJR 4024
Dunalia solanacea FJR 3992
Lycianthes radiata FJR 3993
Solanaceae Solandra coriacea FJR 4013
Solanum acerifolium FJR 3961
Solanum cf umbellatum FJR 3962
Solanum lepidotum FJR 3975
Solanum sp FJR 3970
Boehmeria bullata FJR 3989
Urticaceae Phenax uliginosus FJR 3990
Urera ballotaewfolia FJR 3998
37
5.2. METODOLOGÍA
5.2.1. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES
La parte aérea del material vegetal recolectado se secó en estufa a una temperatura
de 50 ºC por 72 horas, se molieron para ser extraídas. Se realizaron cinco
extracciones sucesivas de siete días cada una por el método de maceración pasiva,
empleando los solventes hexano, diclorometano y metanol, los extractos fueron
concentrados en rotaevaporador a presión reducida a 50 ºC hasta sequedad,
marcados y almacenados a 4 ºC hasta su utilización.
5.2.2. CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA
Los extractos crudos fueron caracterizados a través de una marcha fitoquímica por
medio de cromatografía de capa delgada (CCD) (Mosquera et al., 2004) (Tabla 3).
Los extractos de metanol se eluyeron con la mezcla de solventes cloroformo –
isopropanol en proporción (95:5); en tanto que los extractos de diclorometano fueron
eluidos con el sistema cloroformo – acetato de etilo - isopropanol en proporción
(78:20:2), los extractos de n-hexano no fueron caracterizados. Se utilizaron
cromatoplacas en aluminio de sílica gel 60 F 254 . Los extractos de metanol y
diclorometano fueron evaluados con el reactivo de Dragendorff, el cual reacciona
con los alcaloides presentes originando una coloración naranja en el fondo blanco
de la placa (Yin y Sun, 2011). Además, se evaluó la presencia de aldehídos en los
extractos usando 2,4 – dinitrofenilhidracina (Sandner et al., 2001), la cual reacciona
con los aldehídos formando fenilhidrazonas (coloración naranja); de igual forma se
evaluó la presencia de aminas mediante la reacción con ninhidrina, la cual produce
coloración púrpura en presencia de aminas (Xu et al., 2008).
Tabla 3. Reveladores y controles usados para evaluación fitoquímica de los

extractos crudos.
Núcleo fitoquímico Revelador usado Control positivo

Alcaloides Dragendorff Fisostigmina
Aldehídos 2,4- dinitrofenilhidracina Benzaldehído
Aminas Ninhidrina Dietilamina
38
5.2.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA SOBRE LA
La actividad enzimática fue medida, usando una adaptación del método descrito por
Nair et al., (2011) basado en el método de Ellman (Ellman et al., 1961) en
microplacas, siguiendo la siguiente metodología:
Las soluciones utilizadas en el ensayo se prepararon de la siguiente manera: buffer
A (50 mM Tris HCl, pH 8,0); buffer B (50 mM Tris HCl, pH 8,0, conteniendo 0,1%
albúmina de suero bovino (ASB) en buffer A); buffer C (50 mM Tris–HCl, pH 8,0,
que contenía 0,1 M de NaCl y 0,02 M MgCl 2 ·6H 2 O en búfer A). En la tabla 4 se
describe datalladamente la preparación de cada una de las soluciones usadas en el
ensayo in vitro.
Tabla 4. Preparación de las soluciones para la evaluación de la actividad inhibitoria

de la AChE (Nair et al., 2011).
Ajuste de
Solución Composición
pH
Buffer Tris Disolver 3,0285 g de Tris HCl en 500 mL de
A
HCl 50 mM. agua desionizada. 8
Buffer Tris
HCl 50 mM, Disolver 0,0007 g de ASB en 100 mL de
B
con 0,1% de buffer Tris HCl 50 mM. 8
ASB.
Disolver 0,1138 g de (DTNB) reactivo de
DTNB 3 mM
Ellman, 0,585 g de NaCl, 0,4066 g de
C en buffer Tris
MgCl 2 ·6H 2 O en 100 mL de buffer Tris HCl 50 8
HCl 50 mM.
mM.
Ioduro de
Disolver 0.0866 g de IATC en 20 mL de agua
acetiltiocolina No se
D desionizada.
(IATC), 15 ajustó
Preparar al momento de realizar el ensayo.
mM.
Preparación de las soluciones de los extractos metanólicos: Se pesó 1 mg de cada

extracto en estudio y se disolvió en 1000 µL de la solución A (Ver tabla 4) para
obtener la solución del extracto a una concentración de 1000 ppm. De las soluciones
de 1000 ppm de cada extracto metanólico se prepararon las disoluciones seriadas,
como se ilustra en la Figura 23.
En cada pozo se añadieron 25 µL del extracto en estudio a (1, 10, 100 y 100) ppm.
Seguidos de 125 µL de solución 3 mM de DTNB (solución C), 50 µL de buffer Tris
HCl 50 mM, con 0,1% de ASB y 25 µL de la solución AChE 0,3 U/mL. La placa se
incubó por 15 minutos a 37 °C, luego se midió la absorbancia a 405 nm utilizando
39
un lector de microplacas Multiskan GO cada 45 s (tres veces). Entonces se agregó
el ioduro de acetiltiocolina (25 µL, 15 mM) y la absorbancia se leyó cada 45 s (cinco
veces).
1 mg de
100 µL
extracto 100 µL
100 µL
1000 µL solución A
900 µL solución A
1000 ppm 900 µL solución A
100 ppm 900 µL solución A
10 ppm
1 ppm
Figura 23. Preparación de las diferentes concentraciones de los extractos
metanólicos.
1
• Transferir 25 µL de extracto (1, 10, 100 o 1000) ppm a cada pozo
• Adicionar 125 µL de la solución C.

2
• Adicionar 50 µL de la solución B.
3
• Adicionar 25 µL de la solución AChE 0,3 U/mL.

4
• Incubar por 15 minutos a 37 °C.

5
• Leer la absorbancia a 405 nm (Acti).

6
• Añadir 25 µL de IATC 15 mM (solución D).

7
• Leer la absorbancia a 405 nm, cada 45 segundos por 5 veces (Actf).

8
Figura 24. Esquema para la determinación de la actividad inhibitoria de la AChE por

el método espectrofotométrico de Ellman en microplacas (Nair et al., 2011).
40
Donde:
Act i = actividad inicial de la enzima
Act f = actividad final de la enzima
Para la detección de la capacidad inhibitoria de los extractos contra la AchE por

microplacas se usó:
• Un blanco fotométrico: 250 µL de Buffer Tris HCl 50 mM.

• Un control negativo: todos los reactivos a excepción del extracto, el cual fue
reemplazado por 25 µL de Buffer Tris HCl 50 mM.
• Controles positivos: galantamina y fisostigmina a una concentración de
147,32 ppm y 100 ppm respectivamente.
5.2.4. REGISTRO Y EVALUACIÓN DE DATOS
• Se realizarán seis determinaciones individuales para cada extracto, dos

triplicados en ensayos independientes.
• El dato de la cinética enzimática se usó como control y se determinó con

todos los reactivos a excepción del extracto a evaluar en cada ensayo
(control negativo).
• Los datos de la actividad inicial (Act i ) se leyeron con todos los reactivos
usados en la preparación de las muestras a excepción del yoduro de
acetilcolina, con lo cual se tiene en cuenta los efectos de la hidrólisis
espontánea.
• Los datos de la actividad final (Act f ) se leyeron cuando se adicionó el yoduro

de acetiltiocolina.
• El porcentaje de la actividad inhibitoria (%AI) de la acetilcolinesterasa se

determinó comparando las velocidades de reacción de las muestras en
relación con el control negativo (el cual contiene todos los reactivos excepto
la muestra), se empleó la ecuación 1 (Nair et al., 2011):
�𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 �𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑓𝑓 �−𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖 (𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑖𝑖 )�

%𝑨𝑨𝑨𝑨 = �1 − � 𝑥𝑥 100 (1)
𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛 (𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑛𝑛 )
41
Donde:
Act n = actividad del control negativo
Todos los análisis se realizaron por triplicado. El análisis estadístico se realizó

mediante ANOVA seguido por el test de Tukey. Las diferencias se consideraron
significativas a P ≤ 0.05. Todos los análisis se realizaron mediante Microsoft Excel
2013.
5.2.5. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA VERDADERA

SOBRE LA ACETILCOLINESTERASA POR BIOAUTOGRAFÍA
La actividad inhibitoria sobre la acetilcolinesterasa de los extractos vegetales de

metanol y diclorometano se efectuó por cromatografía de capa delgada, con base
en la metodología descrita por Marston, (2011), mediante el método de Ellman
sobre cromatografía de capa delgada (bioautografía). La cromatoplaca se
desarrolló como se describió anteriormente. Después, la placa de IAChE fue
rociada uniformemente usando un atomizador con una solución 3mM ATCI y 3 mM
de DNTB en buffer A. Luego se secó a temperatura ambiente y seguidamente se
reveló con una solución de AChE 3 U/mL. Los inhibidores de la acetilcolinesterasa
se mostraron como manchas blancas en el fondo amarillo de la placa
cromatográfica. Para este bioensayo se utilizaron como control positivo
galantamina 147,73 ppm (Nair et al., 2011) y la fisostigmina 100 ppm (Marston,
2011).
Para determinar los falsos positivos, se desarrolló otra placa en paralelo a la de la

actividad inhibitoria con igualdad de condiciones. Se incubó a 37 °C durante 30
minutos una solución enzima-substrato (3 U/mL AChE y 3 mM IATC). Se roció la
placa con una solución 3 mM de DTNB. A continuación se secaron a temperatura
ambiente y seguidamente se revelaron con una solución enzima-substrato. Los
falsos inhibidores de la acetilcolinesterasa se visualizaron como manchas blancas
en el fondo amarillo de las placas cromatográficas.
Si las manchas blancas solo fueron observados en ensayo de IAChE, y no en el de

los falsos positivos, se consideró que hubo actividad inhibitoria verdadera (Rhee et
al., 2004).
42
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA
Los resultados de la caracterización fitoquímica de los extractos de metanol y

diclorometano de 31 plantas recolectadas en el Parque Regional Ucumarí
evaluadas en este trabajo se muestran en las tabla 5; con el signo (+) se confirma
la presencia del núcleo fitoquímico en estudio y con el signo (-) la ausencia de este
en los extractos evaluados.
Las plantas pertenecientes a la familia Asteraceae se caracterizaron por la
presencia de Alcaloides en todas las especies en estudio de los estractos
metanólicos, en tanto solo los extractos de diclorometano de las especies Baccharis
sp y Critoniela acuminata presentaron alcaloides. La especie Pentacalya urbanii
mostró presencia de aldehídos en los extractos de metanol y diclorometano,
además, Clibadium pentaneuron y Tilesia baccata mostraron evidencia de estos,
solo en el extracto de diclorometano. Las especies de esta familia también
evidenciaron presencia de aminas en todos los extractos metanólicos, sin embargo,
los extractos de dilorometano no evidenciaron presencia de aminas.
Las especies de la familia Euphorbiaceae presentaron aldehídos en los extractos
de metanol y diclorometano, con la excepción de Acalypha diversifolia, la cual solo
evidenció presencia de aldehídos en el extracto metanólico. Además, las especies
de esta familia no mostraron presencia de aminas y alcaloides en los extractos de
diclorometano, en los extractos se evidenció presencia aminas en todas las
especies y solo las especies Acalypha diversifolia y Alchornea sp mostraron
alcaloides.
Mavar et al., (2004) hallaron alcaloides en el extracto metanólico de Alchornea
cordifolia (Euphorbiaceae), sus hojas son ampliamente utilizadas en la medicina
tradicional africana, desde Senegal hasta Uganda. Hay mucha convergencia en su
uso tradicional en África tropical como antiinflamatorios: para el tratamiento del
chancro, heridas, cicatrización, úlceras, caries, dolor de muelas, inflamación de las
encías y conjuntivitis
Los extractos metanólicos de las plantas de la familia Solanaceae evaluados se
caracterizaron por la presencia de alcaloides, en tanto, solo mostró presencia de
estos el extracto de diclorometano de Lycianthes radiata. Cestrum sp y Solanum cf
umbellatum fueron las únicas especies que evidenciaron aldehídos en el extracto
metanólico, en tanto, los extractos de diclorometano mostraron presencia de
aldehídos, a excepción de Cestrum sp y Depprea aff sachapapa. Todos los
extractos de metanol de esta familia expusieron presencia de aminas.
43
Tabla 5. Caracterización fitoquímica de los extractos de metanol y diclorometano.
Alcaloides Aldehídos Aminas

FAMILIA ESPECIE VOUCHER
MeOH DCM MeOH DCM MeOH DCM
Apocynaceae Cynanchum sp FJR 3964 + - + - + -
Asclepiadaceae Oxypetalum cordofolium FJR 3981 + - - - + -
Baccharis sp FJR 3972 + + - - + -
Clibadium pentaneuron FJR 3966 + - - + + -
Critoniela acuminata FJR 3968 + + - - + -
Lepidaploa lehamannii FJR 3976 + - - - + -
Asteraceae
Mikania banisteriae FJR 3965 + - - - + -
Mikania lloensis FJR 3977 + - - - + -
Pentacalya urbanii FJR 3963 + - + + + -
Tilesia baccata FJR 3974 + - - + + -
Acalypha diversifolia FJR 3967 + - + - + -
Alchornea coelophylla FJR 3969 - - + + + -
Euphorbiaceae
Alchornea sp FJR 3982 + - + + + -
Hyeronima sp FJR 3971 - - + + + -
Faramea sp FJR 3979 + - - + + -
Rubiaceae
Rubiacea sp FJR 3973 + - - + + -
Piper crassinervium FJR 4021 - - + - - -
Piperaceae Piper pesaresanum FJR 3996 + + - - + +
Piper umbellatum FJR 4012 + - - - + -
Cestrum sp FJR 3978 + - + - + -
Depprea aff sachapapa FJR 4024 + - - - + -
Dunalia solanacea FJR 3992 + - - + + -
Solanaceae Lycianthes radiata FJR 3993 + + - + + -
Solandra coriacea FJR 4013 + - - + + -
Solanum acerifolium FJR 3961 + - - + + -
Solanum cf umbellatum FJR 3962 + - + + + -
Solanum lepidotum FJR 3975 + - - + + -
Solanum sp FJR 3970 + - - + + -
Boehmeria bullata FJR 3989 + + + + + +
Urticaceae Phenax uliginosus FJR 3990 + + + + + +
Urera ballotaewfolia FJR 3998 + + - - + +
Cynanchum sp (Apocynaceae) reportó la presencia de alcaloides, aldehídos y

aminas únicamente en el extracto metanólico. El extracto metanólico de la especie
Oxypetalum cordifolium (Asclepiadaceae), mostró presencia de alcaloides y aminas.
Lasisi et al., (2012) encontraron alcaloides en extractos etanólicos de hojas y raíces
44
de Alafia barteri en un porcentaje de 3%; Vital y Rivera, (2011) encontraron
alcaloides en el extracto metanólico de las hojas de Voacanga globosa ambas
plantas pertenecientes a la familia Apocynaceae.
Las especies de la familia Urticaceae evidenciaron la presencia de alcaloides,
aldehídos y aminas, con la excepción de Urera ballotaewfolia, la cual no expuso
presencia de aldehídos.
Toyang y Verpoorte, (2013) reportaron un número relativamente pequeño de
especies del género Vernonia (Asteraceae) que contienen alcaloides. Sotoing et al.,
(2012) detectaron alcaloides en el extracto acuoso de Crassocephalum bauchiense
(Asteraceae). Estas referencias concuerdan con los resultados obtenidos en este
trabajo.
Hasta la fecha se han aislado alrededor de 90 alcaloides del indol de 15 especies
de la familia Rubiaceae. Dos grupos principales de compuestos alcaloidales
conocidos como, alcaloides semi-indol o alcaloides indol sencillos y los alcaloides
sesquiterpénicos del indol se han identificado en Uncaria rhynchophylla. Los
alcaloides del indol son compuestos heterocíclicos aromáticos, que tienen una
estructura bicíclica que consta de un anillo de benceno fusionado a un anillo de
pirrol. Se encuentran principalmente en ocho familias de plantas, de las cuales
Apocynaceae y Rubiaceae proporcionan las mejores fuentes (Ndagijimana et al.,
2013).
Investigaciones fitoquímicas llevadas a cabo sobre especies de Piper han
conducido al aislamiento de muchos productos naturales bioactivos. Del género
Piper, 44 especies fueron sometidas a investigaciones fitoquímicas o de
bioactividad, siendo P. cubeba la más intensamente estudiada con cerca del 8%,
seguida en número de investigaciones por P. longum y P. aduncum con 7%, P.
methysticum y P. tuberculatum con 6%, P. santuario, P. nigrum y P. crassinervium
con un 5%. Teniendo en cuenta el tipo de compuestos, se ha encontrado la
prevalencia de alcaloides en la mayoría de las especies. Se han reportado
actividades relacionadas con el sistema nervioso central como sedante y relajante,
antiprotozoaria, citotóxica, antimicrobiana, anticáncer, insecticida, antioxidante,
actividad inhibidora frente a varias enzimas, antiinflamatoria, anticoagulante,
alelopática, cicatrizante y actividad antiviral (López et al., 2010).
Gomes et al., (2009) reportaron que los alcaloides provenientes de las especies
Atropa belladona, Brugmansia arbórea, Capsicum annuum, Datura inoxia, Datura
stramonium, Hyoscyamus niger, Mandragora officionarum, Nicotiana tabacum y
Withania somnifera, pertenecientes a la familia solanaceae tienen actividades
neurobiológicas. Además, concluyeron que los alcaloides fueron los principales
compuestos con actividad neurológica, los cuales demostraron un alto grado de
actividad en el sistema nervioso central.
45
ABUNDANCIA RELATIVA DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN
LOS EXTRACTOS VEGETALES
90,32% 96,77%
54,84%
35,48%
22,58%
12,90%
Metanol Diclorometano Metanol Diclorometano Metanol Diclorometano

Figura 25. Porcentajes de abundancia relativa de metabolitos secundarios en los

extractos vegetales demetanol y diclorometano.
De acuerdo con la figura 25 destaca:
• El 90,32% de los extractos de metanol presentaron alcaloides, en tanto solo

el 22,58% de los extractos de diclorometano presentó estos compuestos,
Zhang et al., (2015) aislaron 37 alcaloides del extracto metanólico de los
bulbos de planta Tabernaemontana officinalis (Apocynaceae), de los cuales
4 exhibieron actividad citotoxicidad contra tres tipos de cáncer humano.
Torras-Claveria et al., (2009) expone que los alcaloides son característicos
de extractos polares como los de metanol, etanol y agua.
• La mayoría de los extractos de metanol (96,77%) tienen aminas, en contraste

con los de diclorometano (12,90%), esta tendencia se da debido a que al
igual que en los tejidos animales, las aminas libres presentes en el interior o
fuera de las células de los tejidos vegetales se encuentran en sus formas
catiónicas lo que implica interacciones iónicas, debido a esta característica
estas se encuentran presentes en extractos polares como los metanólicos y
en soluciones ácidas de ácido perclórico, tricloroacético o clorhídrico
(Bouchereau et al., 2000).
46
6.2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA SOBRE LA
La actividad inhibitoria sobre la acetilcolinesterasa (E.C. 3.1.1.7.) se determinó

usando una adaptación del método descrito en la literatura (Nair et al., 2011).
Fueron evaluados los 31 extractos metanólicos a las concentraciones de: 0,1, 1, 10
y 100 ppm. En la tabla 6 se presentan los resultados obtenidos de este ensayo.
Tabla 6. Actividad inhibitoria sobre la AChE de extractos metanólicos.

% Actividad Inhibitoria
FAMILIA ESPECIE VOUCHER Concentración (ppm)
0,1 1 10 100
Apocynaceae Cynanchum sp FJR 3964 ND ND ND ND
Asclepiadaceae Oxypetalum cordofolium FJR 3981 ND ND ND ND
Baccharis sp FJR 3972 ND ND ND 8,35
Clibadium pentaneuron FJR 3966 ND ND ND ND
Critoniela acuminata FJR 3968 ND ND ND 8,04
Lepidaploa lehamannii FJR 3976 ND ND ND ND
Asteraceae
Mikania banisteriae FJR 3965 ND ND ND 3,04
Mikania lloensis FJR 3977 ND ND ND 23,43
Pentacalya urbanii FJR 3963 ND ND ND ND
Tilesia baccata FJR 3974 ND ND ND 24,24
Acalypha diversifolia FJR 3967 ND ND ND 16,17
Alchornea calophylla FJR 3969 ND ND ND 18,92
Euphorbiaceae
Alchornea sp FJR 3982 ND ND ND 3,11
Hyeronima sp FJR 3971 ND ND ND ND
Faramea sp FJR 3979 ND ND ND ND
Rubiaceae
Rubiacea sp FJR 3973 ND ND ND ND
Piper crassinervium FJR 4021 ND ND ND 6,47
Piperaceae Piper pesaresanum FJR 3996 ND ND ND 14,15
Piper umbellatum FJR 4012 ND ND ND ND
Cestrum sp FJR 3978 ND 4,89 5,49 8,65
Depprea aff sachapapa FJR 4024 ND ND ND 4,51
Dunalia solanacea FJR 3992 ND ND ND ND
Lycianthes radiata FJR 3993 ND ND ND ND
Solanaceae Solandra coriacea FJR 4013 ND ND ND 5,94
Solanum acerifolium FJR 3961 ND ND ND 14,15
Solanum cf umbellatum FJR 3962 ND 4,89 5,49 8,65
Solanum lepidotum FJR 3975 ND ND ND 4,51
Solanum sp FJR 3970 ND ND ND 8,95
Boehmeria bullata FJR 3989 ND ND ND ND
Urticaceae Phenax uliginosus FJR 3990 ND ND ND ND
Urera ballotaewfolia FJR 3998 ND ND ND ND
* ND: Actividad inhibitoria no detectada
47
Conforme a los resultados obtenidos en la tabla 6, los extractos metanólicos de la
familia Solanaceae fueron los que presentaron más especies con actividad
inhibitoria sobre la acetilcolinesterasa (ver figura 26), Solanum acerifolium con un
14,15% de inhibición a 100 ppm fue la especie de esta familia con mayor actividad.
Este valor es alto en relación con la α–Solanina un glucoalcaloide purificado de
Solanum tuberosum (papa) el cual mostró una actividad inhibitoria sobre la AChE
de 44,3% a 8,68 ppm (Mukherjee et al., 2007), debido a que en el extracto los
compuestos responsables de esta actividad se encuentran en concentraciones
bajas. Además, Cestrum sp con 8,65%, Solandra coriacea con 5,94%, Solanum cf
umbellatum con 8,65% y Solanum sp con 8,95% mostraron actividad actividad
inhibitoria sobre la AChE a 100 ppm.
NÚMERO DE PLANTAS CON ACTIVIDAD CONTRA

ACETILCOLINESTERASA
9
8
7
5 4
3 3
3 2
1 1 2
0 0 0 0
Activas Total
Figura 26. Número de plantas con actividad contra acetilcolinesterasa.
La familia Asteraceae fue la segunda en cuanto a cantidad de especies con

actividad inhibitoria, en la cual se destacaron Mikania lloensis y Tilesia baccata con
actividades inhibitorias de 23,43% y 24,24% a 100 ppm respectivamente. Ercetin et
al., (2012) determinaron que la actividad IAChE del extracto metanólico de las flores
de Calendula officinalis L fue de 22,37% a 1000 ppm y la del extracto de acetato de
etilo de las flores Calendula arvensis L fue de 31,24% a 1000 ppm, ambas especies
pertenecientes a la familia Asteraceae.
48
Comparando estos resultados se puede establecer que los extractos de Mikania
lloensis y Tilesia baccata mostraron actividad significativa, la cual puede deberse a
alcaloides con importancia farmacológica. Baccharis sp con una actividad de 8,35%
y Critoniela acuminata con 8,04% igualmente presentaron actividad.
La familia Euphorbiaceae se destacó en este estudio con los extractos de Acalypha

diversifolia y Alchornea coelophylla con porcentajes de inhibición de 16,17% y
18,92%, respectivamente; de acuerdo a la caracterización fitoquímica Alchornea
coelophylla no evidenció la presencia de alcaloides, esto coincide con la
investigación realizada por Aderogba et al., (2013) en la cual detectaron que la
actividad inhibitoria sobre la AChE de Croton penduliflorus (Euphorbiaceae) se
debió principalmente a compuestos fenólicos tales como el aldehído protocatéquico
54,6%, la quercetina 3-O-ramnósida 60%, el kaempferol 7-O-ramnósido 68,3% y el
ácido p-hidroxybenzoico 51,6%, todos estos evaluados a 1000 ppm.
Piper crassinervium y Piper pesaresanum presentaron porcentajes de inhibición de
6,47% y 14,15% respectivamente. La familia Piperaceae contiene un gran número
de especies que han reportado actividades biológicas importantes como insecticida,
antibacteriana, antifúngica, antioxidante, entre otras. El género Piper contiene
alrededor de 2000 especies y es considerado como el más importante y estudiado
de dicha familia, al comprobarse que las actividades biológicas mostradas por
algunas especies se debe principalmente a la presencia de metabolitos secundarios
como amidas, alcaloides y compuestos fenólicos, presentes en cada especie (López
et al., 2010).
Vinutha et al., (2007) clasificaron los extractos activos en cuatro categorías con
relación al porcentaje de actividad inhibitoria de AChE, potente (> 50%), moderada
(30% – 50%), baja (< 30%) o nula (< 5%) a una concentración de 100 ppm. Con
respeto a esta clasificación 33,33% de los 31 extractos metanólicos evaluados
presentaron actividad inhibitoria baja y el 66,67% actividad nula.
Torras-Claveira et al., (2013) evaluaron la actividad inhibitoria de 105 plantas del
género Narcissus (Amaryllidaceae), la galantamina fue encontrada en 97 de estas;
la sanguinina un inhibidor de la AChE más potente que la galantamina fue
encontrada en 22 de las 105 especies evaluadas, estas investigaciones indican que
en las plantas se pueden encontrar inhibidores de la AChE con mayor
biodisponibilidad, menores efectos adversos con respecto a los medicamentos
actuales y mayor eficiencia en la inhibición.
De acuerdo con la caracterización fitoquímica, la mayoría de los extractos con

actividad inhibitoria presentaron alcaloides, con excepción de Alchornea coelophylla
y Piper crassinervium. Este hecho hace necesario descartar los falsos positivos
mediante un ensayo adicional, para el cual Rhee et al., (2004) desarrollaron un
método combinando la bioautografía y el método de Ellman.
49
6.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA VERDADERA SOBRE
LA ACETILCOLINESTERASA POR BIOAUTOGRAFÍA
La determinación de los falsos inhibidores de la AChE fue realizada mediante

bioautografía por aspersión, combinada con el método de Ellman (Marston, 2011),
se emplearon las mismas condiciones cromatográficas usadas en la caracterización
fitoquímica.
De acuerdo con Rhee et al., (2003a) y la figura 27, los extractos metanólicos de las
plantas Baccharis sp (131), Mikania banisteriae (124), Mikania lloensis (136), Tilesia
baccata (133) y Alchornea sp (140) tienen actividad inhibitoria falsa, esto es debido
a que dieron positivos en la prueba de falsos inhibidores de la AChE.
En cuanto a los extractos de Critoniela acuminata (127), Acalypha diversifolia (126)
y Alchornea coelophylla (128) se puede concluir que tienen actividad inhibitoria
verdadera; sin embargo, el extracto metanólico de Alchornea coelophylla no
evidenció alcaloides (ver tabla 6); por lo tanto y en asociación con lo reportado por
Aderogba et al., (2013) la actividad inhibitoria sobre la AChE se puede deber a la
presencia de compuestos fenólicos.
De la figura 28 se puede concluir que los extractos metanólicos de las plantas Piper
crassinervium (167), Solanum cf umbellatum (121) y Solanum lepidotum (134)
mostraron actividad inhibitoria verdadera contra la acetilcolinesterasa, no obstante
las plantas Cestrum sp (137), Depprea aff sachapapa (170), Solanum acerifolium
(120) y Solanum sp (129) mostraron falsa actividad inhibitoria, estas especies
presentaron aldehídos y/o aminas, lo cual puede ser causante de su falsa actividad
inhibitoria.
Conforme a la figura 29 se puede considerar que los extractos de diclorometano de
las plantas Oxypetalum cordofolium (139), Baccharis sp (131), Clibadium
pentaneuron (125) y Critoniela acuminata (127) tienen actividad inhibitoria falsa
contra la acetilcolinesterasa.
Acorde con la figura 30 se puede observar que ninguno de los extractos de

diclorometano de las plantas estudiadas mostraron actividad inhibitoria verdadera,
esto se puede deber a que solo 4 especies evidenciaron la presencia de alcaloides
(ver tabla 6), a los cuales se les atribuye en gran parte la actividad inhibitoria contra
la acetilcolinesterasa (Asadabadi et al., 2009).
50
A
Falsos positivos de los extractos metanólicos. Los extractos evaluados fueron:
Cynanchum sp (123), Oxypetalum cordofolium (139), Baccharis sp (131), Clibadium
pentaneuron (125), Critoniela acuminata (127), Lepidaploa lehamannii (135),
Mikania banisteriae (124), Mikania lloensis (136), Pentacalya urbanii (122), Tilesia
baccata (133), Acalypha diversifolia (126), Alchornea coelophylla (128), Alchornea
sp (140), Hyeronima sp (130), Faramea sp (138), Galantamina (GAL), Fisostigmina
(ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI).
51
A
Falsos positivos de los extractos metanólicos.Los extractos evaluados fueron:
Rubiacea sp (132), Piper crassinervium (167), Piper pesaresanum (148), Piper
umbellatum (163), Cestrum sp (137), Depprea aff sachapapa (170), Dunalia
solanacea (145), Lycianthes radiata (146), Solandra coriacea (164), Solanum
acerifolium (120), Solanum cf umbellatum (121), Solanum lepidotum (134), Solanum
sp (129), Boehmeria bullata (142), Phenax uliginosus (143), Galantamina (GAL),
Fisostigmina (ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI).
52
A
fueron: Urera ballotaewfolia (150) (extracto metanólico), Cynanchum sp (123),
Oxypetalum cordofolium (139), Baccharis sp (131), Clibadium pentaneuron (125),
Critoniela acuminata (127), Lepidaploa lehamannii (135), Mikania banisteriae (124),
Mikania lloensis (136), Pentacalya urbanii (122), Tilesia baccata (133), Acalypha
diversifolia (126), Alchornea coelophylla (128), Alchornea sp (140), Hyeronima sp
(130), Galantamina (GAL), Fisostigmina (ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído
(ANI).
53
A
fueron: Faramea sp (138), Rubiacea sp (132), Piper crassinervium (167), Piper
pesaresanum (148), Piper umbellatum (163), Cestrum sp (137), Depprea aff
sachapapa (170), Dunalia solanacea (145), Lycianthes radiata (146), Solandra
coriacea (164), Solanum acerifolium (120), Solanum cf umbellatum (121), Solanum
lepidotum (134), Solanum sp (129), Galantamina (GAL), Fisostigmina (ESE),
Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI).
54
Con base en lo anteriormente expuesto, se puede concluir que las evaluaciones por
cromatografía de capa delgada combinada, funcionaron satisfactoriamente para la
detección de aldehídos y aminas en los extractos de metanol y diclorometano, los
cuales dieron resultados como falsos-positivos en la inhibición de la AChE. Los
extractos con actividad inhibitoria verdadera contra la AChE se resumen se
presentan en la tabla 7, la cual es debida fundamentalmente a la presencia de
alcaloides.
Tabla 7. Extractos metanólicos con verdadera actividad inhibitoria de la AChE.
Marcha fiquímica
Familia Especie Voucher
Critoniela
Asteraceae FJR 3968 + - +
acuminata
Acalypha
FJR 3967 + + +
diversifolia
Euphorbiaceae
Alchornea
FJR 3969 - + +
coelophylla
Piper
Piperaceae FJR 4021 - + +
crassinervium
Solanum cf
FJR 3962 + + +
umbellatum
Solanaceae
Solanum
FJR 3975 + - +
lepidotum
Piper crassinervium y Alchornea coelophylla presentaron una actividad inhibitoria

verdadera de 6,47% y 18,92% respectivamente (ver figura 31). Alchornea
coelophylla es la planta que mayor actividad mostró; sin embargo en la
caracterización fitoquímica ninguna de estas plantas evidenció presencia de
alcaloides pero si de aldehídos y aminas, por lo tanto esta actividad se puede deber
a compuestos de naturaleza glucósida, flavonoides o xantonas (Mukherjee et al.,
2007; Aderogba et al., 2013). Giraldo, (2012) reportó la presencia de flavonoides en
en el extracto metanólico de Piper crassinervium.
55
EXTRACTOS CON ACTIVIDAD INHIBITORIA
VERDADERA CONTRA ACETILCOLINESTERASA
18,92%
16,17%
IC50 = 1,22 mg/mL
8,04% 8,65%
6,47% 5,49%
4,89% 4,51%
Critoniela Acalypha Alchornea Piper Solanum cf Solanum

acuminata diversifolia coelophylla crassinervium umbellatum lepidotum
1 ppm 10 ppm 100 ppm
Figura 31. Extractos con actividad inhibitoria verdadera contra acetilcolinesterasa.
El género Solanum es el mayor género de la familia de las solanáceas, consta de

más de 1.700 especies distribuidas por todo el mundo. Varias especies del género
Solanum se utilizan en la medicina popular de diferentes países, Brasil, India,
Taiwán, Alemania, Sudáfrica y Kenia, como remedio para diversas dolencias, como
hipoglucemia, antiespasmódico, epilepsia, el tratamiento de la bronquitis, dolores
en el cuerpo y el cáncer. El género Solanum es una rica fuente de muchas clases
de compuestos como compuestos fenólicos y alcaloides (Al-Oqail et al., 2012).
Solanum cf umbellatum fue la única especie que mostró actividad inhibitoria contra
la acetilcolinesterasa a 1, 10 y 100 ppm, com porcentajes de inhibición de 4,89%,
5,49% y 8,63% respectivamente. Debido a esto es la única planta en estudio que
se la determinó la concentración inhibitoria media (IC 50 ) con un valor de 1,22 mg/L.
Este hecho hace que esta especie pueda ser objeto de futuras investigaciones en
las que se pueda aislar el o los compuestos remposables de esta actividad, para
poder estudiados individualmente y obtener mejores resultados, puesto que los
extractos crudos son matrices muy complejas y es muy probable que hayan
compuestos que interfieran con la calidad de los resultados.
56
Tabla 8. Detección in vitro de inhibidores de la acetilcolinesterasa por el método de
Ellman en plantas de la flora colombiana.
OBJETIVO GENERAL: Detectar actividad inhibitoria de la enzima acetilcolinesterasa en extractos de diclorometano y

metanol de treinta y un plantas pertenecientes a las familias Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae,
Piperaceae, Rubiaceae, Solanaceae y Urticaceae.
OBJETIVOS META, LOGRO O

ACTIVIDADES METODOLOGÍA TIEMPO RECURSOS SUPUESTO
ESPECÍFICOS RESULTADO
Caracterizar por
cromatografía de El GBPN
capa delgada (CCD) proporcionará
Equipos en
la presencia de la mayor
estado
alcaloides, aldehídos Caracterización Encontrar cantidad de
defectuoso,
y aminas, usando el fitoquímica de alcaloides, los los recursos
Cromatografía agotamiento
reactivo de alcaloides, cuales son 4 meses necesarios
de capa delgada de
Dragendorff, aldehídos y responsables de para
reactivos,
2,4- aminas IAChE completar
anormalidad
dinitrofenilhidracina y cada una de
académica.
ninhidrina las etapas del
respectivamente trabajo
como reveladores.
El GBPN
Establecer la
proporcionará
actividad inhibitoria Equipos en
la mayor
de la enzima Detectar actividad estado
cantidad de
acetilcolinesterasa Medición de inhibitoria de la defectuoso,
Método de los recursos
(IAChE) en extractos actividad enzima agotamiento
Ellman en 4 meses necesarios
vegetales mediante inhibitoria de acetilcolinesterasa de
microplacas para
el método los extractos en los extractos reactivos,
completar
espectrofotométrico metanólicos anormalidad
cada una de
de Ellman en académica.
las etapas del
microplacas.
trabajo
El GBPN
Comprobar por proporcionará
Equipos en
bioautografía la la mayor
estado
existencia de falsos- cantidad de
Identificación Cromatografía defectuoso,
positivos (aldehídos Descartar los recursos
de extractos de capa delgada agotamiento
y/o aminas) como extractos con 4 meses necesarios
con IAChE combinada con de
inhibidores de la IAChE falsa para
falsa bioautografía reactivos,
enzima completar
anormalidad
acetilcolinesterasa cada una de
académica.
(IAChE). las etapas del
trabajo
57
7. CONCLUSIONES
• Mediante la caracterización fitoquímica se logró comprobar la presencia

alcaloides en todos los extractos metanólicos a excepción de Alchornea
coelophylla y Piper crassinervium, especies que a pesar de esto, presentaron
actividad inhibitoria verdadera.
• Mediante bioautografía se determinó que los extractos metanólicos de las

especies Critoniela acuminata, Acalypha diversifolia, Alchornea coelophylla,
Piper crassinervium, Solanum cf umbellatum y Solanum lepidotum,
presentaron actividad inhibitoria verdadera sobre la acetilcolinesterasa.
Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla mostraron la mayor actividad
verdadera con valores del 16,17% y 18,92 respectivamente.Se determinó la
concentración inhibitoria media de Solanum cf umbellatum (IC 50 = 1,22
mg/L).
• El presente trabajo es un aporte a la bioprospección de la flora del Parque

Regional Natural Ucumarí y un avance en la búsqueda de metabolitos
secundarios que puedan ser empleados en el tratamiento de la enfermedad
de Alzheimer.
58
8. RECOMENDACIONES
• Continuar con la búsqueda de plantas con actividad inhibitoria sobre la

acetilcolinesterasa, en la medida de lo posible evaluar la actividad sobre
fracciones de alcaloides de los extractos o con alcaloides purificados, debido
a que los extractos crudos son matrices complejas de compuestos; en las
cuales algunos compuestos pueden interferir en la calidad de los resultados.
59
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70
ANEXOS
71
Anexo 1. Cálculos de porcentaje de actividad inhibitoria sobre la enzima
acetilcolinesterasa.
Para calcular el porcentaje de actividad inhibitoria (% A.I.) de la AChE de los

extractos a cada concentración se procedió de la siguiente manera:
El dato de cinética control negativo, el cual se usó como control, se leyó con todos
los reactivos a excepción del extracto a evaluar.
Los datos de actividad inicial (Act i ) se leyeron con todos los reactivos a excepción
de la enzima para corregir errores por hidrólisis espontánea. Los datos de actividad
final (Act f ) se leyeron cuando se adicionó el ioduro de acetiltiocolina.
Concentración Control Actividad Actividad %

Planta del extracto negativo inicial final Actividad
metanólico (Act n ) (Act i ) (Act f ) Inhibitoria
0,484 0,687
Solanum cf 0,485 0,688
100 ppm
umbellatum 0,224 0,483 0,689 8,65
(137) promedio promedio
0,484 0,688
El porcentaje de A.I. de la AChE se calculó como se describe a continuación:
�𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 �𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑓𝑓 �−𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖 (𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑖𝑖 )�

%𝑨𝑨𝑨𝑨 = �1 − � 𝑥𝑥 100
𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛 (𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑛𝑛 )
Donde:
Act n = actividad del control negativo
(0,741 − 0,537)
%𝑨𝑨𝑨𝑨 = �1 − � 𝑥𝑥 100 = 8,65%
0,224
72
Anexo 2. Pruebas fitoquímicas por CCD.
Para el análisis fitoquímico por CCD se desarrollará el cromatograma de los

extractos a estudiar y este se revelará con los reveladores particulares para cada
núcleo que se describen a continuación:
Anexo 3. Prueba de Dragendorff para alcaloides.
Positivo: Mancha de color naranja.

Preparación del revelador Dragendorff:
Solución A: 2,125 g de subnitrato de bismuto (Nitrato básico de Bismuto) + 25 g de
ácido tartárico + 80 mL de agua
Solución B: 20 g de KI + 50 mL de agua.
La mezcla de la solución A y B origina la solución patrón.
Revelador: 50 mL de la solución patrón + 500 mL de agua + 100 g de ácido
Tartárico. El revelador puede durar varias semanas, antes de que se descomponga.
Rociar o fumigar la placa con revelador Dragendorff, apropiado para detectar
alcaloides; los cuales se visualizan como manchas de color zapote.
Control positivo: Fisostigmina o galantamina.
Anexo 4. Prueba de ninhidrina para aminas.
Positivo: Mancha de color púrpura.

Preparación del revelador Ninhidrina:
Se disolverán 200 mg de ninhidrina en 95 mL de butanol y 5 mL de etanol al 10 %
Las placas se deben rociar con el revelador y se calentar hasta 105 ºC de 5 a 10
minutos se deberá observar el color producido (Púrpura).
Control positivo: Dietilamina
73
Anexo 5. Prueba de 2,4 - dinitrofenilhidracina para aldehídos.
Positivo: Mancha de color naranjado.

Preparación del revelador (2,4 DNFH):
Disolver 0,4 g de (2,4 DNFH) en 100 mL de ácido clorhídrico 2 M.
Control positivo: Acetofenona, benzaldehído.
No se debe calentar la cromatoplaca.
74

DETECCIÓN in Vitro DE INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA EN PLANTAS DE LA FLORA COLOMBIANA POR EL MÉTODO DE ELLMAN

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DETECCIÓN in vitro DE INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA EN

PLANTAS DE LA FLORA COLOMBIANA POR EL MÉTODO DE ELLMAN

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

DIRECTOR DEL PROYECTO

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

DETECCIÓN in vitro DE INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA EN

DUVAN ALBERTO VALENCIA PRECIADO

Con la connotación: _______________.

Para la constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy 2 de Marzo de

Dedicado a mis padres y hermanos por toda la paciencia, cariño y comprensión

Duvan Alberto Valencia Preciado

• A mi madre, Ruby Consuelo Preciado Landazuri por ser mi gran amiga

• A mi padre, William Alberto Valencia Cajiao por haberme dado un gran

• A todos los miembros de mi familia, por la paciencia, los consejos y el

• A mis profesores, Oscar Marino Mosquera y Jaime Niño Osorio, por

• A mis compañeros del Grupo de Biotetecnología – Productos naturales,

• A la Universidad Tecnológica de Pereira por brindarme todas las

TABLA DE CONTENIDO ......................................................................................... 3

Tabla 1. Actividades biológicas encontradas en las familias en estudio. ............... 33

Figura 1. Estructura de la galantamina, (McNulty et al., 2009). ............................. 12

Anexo 1. Cálculos de porcentaje de actividad inhibitoria sobre la enzima

En el presente trabajo se exhiben los resultados de un estudio dirigido a evaluar la

"Demencia" es un término general que describe una variedad de enfermedades y

Colombia es un país con una gran riqueza de especies de plantas pertenecientes a

2.1. LA ACETILCOLINESTERASA (AChE)

La enzima acetilcolinesterasa (AChE; código enzimático 3.1.1.7) juega un papel vital

Acetilcolina Colina Acetato

Figura 2. Reacción entre la acetilcolinesterasa y la acetilcolina (Milkani et al., 2011).

2.2. INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común de demencia en las

2.3. CLASIFICACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA

Varios derivados naturales, semisintéticos y sintéticos han sido descubiertos o

2.3.1. DERIVADOS ANÁLOGOS DE LA TETRAHIDROACRIDINA

La tacrina (9-amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina) (figura 4) fue el primer fármaco

El donepezilo (figura 5) fue aprobado en 1996 para el tratamiento de leve a

Figura 5. Estructura química del donepezilo.

2.3.3. DERIVADOS DE LA BENZOFENONA

Estos compuestos abarcan una función aromática y un grupo amino terciario

Figura 6. Inhibidores de la AChE derivados de la benzofenona (Belluti et al., 2009).

2.3.4. ANÁLOGOS DEL DIBENZOFURANO

La rivastigmina (figura 7A) es una pequeña molécula que cruza la barrera

La galantamina (figura 1) es un alcaloide terciario, quiral que se puede extraer de

La fisostigmina (figura 8), también conocida como eserina es un alcaloide aislado

2.3.7. DERIVADOS DE LA HUPERZINA

Las Huperzinas A y B son alcaloides aislados de la hierba china Huperzia serrata,

Figura 9. Huperzinas, huperzina A y huperzina B.

2.4. MÉTODOS PARA DETECTAR INHIBIDORES DE LA AChE

Para la detección de compuestos con actividad inhibitoria de la AChE se han

2.4.1. MÉTODO DE ELLMAN

De acuerdo con Ellman et al., (1961), la acetiltiocolina es hidrolizada por la AChE

Ioduro de acetiltiocolina Acetato Ioduro de tiocolina

5-tio-2-nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina 5-tio-2-nitrobenzoato (Amarillo)

Figura 10. Reacciones implicadas en la determinación de actividad de la

2.4.2. MÉTODO FLUOROMÉTRICO

En el método fluorométrico el Ioduro de 7-acetato-1-metilquinolina (IAMQ) (sustrato

IAMQ IHMQ Acetato

Figura 11. Hidrólisis del Ioduro de 7-acetato-1-metilquinolina (IAMQ) a Ioduro de 7-

La bioautografía es un ensayo de detección de la actividad biológica de una muestra

α-Naftol Sal de Fast Blue B

2.4.4. HPLC-UV-VIS-MS Y DETECCIÓN BIOQUÍMICA

Ingkaninan et al., (2000) desarrollaron un método de cromatografía líquida de alta

2.5. PARQUE REGIONAL NATURAL UCUMARÍ (PRNU)

El Parque Regional Natural Ucumarí (PRNU) es una reserva natural ubicada al