6.

Algas: Enumeracin por MPN

6.1. OBJETIVOS
Enumerar las poblaciones de algas del suelo utilizando el mtodo del
nmero ms probable (MPN).
Ajustar la humedad del suelo del suelo a un valor cercano a la
capacidad de campo (valor proporcionado por el instructor)
Adaptar el suelo al nuevo contenido de humedad incubando
durante una semana
Inocular tubos de medio de algas con diluciones del suelo
Observar los tubos para el crecimiento despus de cuatro semanas
de incubacin
Calcular las concentraciones de algas en el suelo a travs del
procedimiento de nmero ms probable (MPN)

6.2.TEORA
Las algas son organismos fototrficos eucariotas, que requieren luz para la
fotosntesis.
Por lo tanto, la mayora de las clulas de algas se encuentran tpicamente en
la superficie del suelo. Sin embargo, algunas algas pueden crecer
heterotrficamente y pueden encontrarse a profundidades de 1m (Maier et
al., 2000). Las algas son colonizadores importantes de los suelos en
desarrollo que carecen de materia orgnica. Tambin pueden ayudar en la
agregacin del suelo a travs de la secrecin de polisacridos extracelulares
(Killham, 1994).
El trmino algas se refiere a un grupo heterogneo de organismos que
pueden ser mviles o no mviles, y eucariotas o procariotas. Histricamente
las algas procariotas eran conocidas como las "algas verdes azules". Se cree
que alguna forma de algas procariotas fue el antepasado de los cloroplastos
encontrados en algas eucariotas y plantas. Estos organismos procariotas se
clasifican ahora como cianobacterias, es decir, como bacterias. Las
cianobacterias tambin son capaces de fijar el nitrgeno atmosfrico, y
algunas veces se encuentran en la superficie de los suelos ridos despus de
los eventos de lluvia. Las algas eucariotas tambin son comunes en tales
situaciones. De hecho, cuando se considera slo el suelo superficial, el
nmero de algas puede alcanzar 10.000 organismos por gramo de suelo seco
(Maier et al., 2000). Sin embargo, debajo de la superficie del suelo, los
nmeros de las algas son de magnitud ms bajos que las bacterias, los
actinomycetes, o los hongos, pues las algas necesitan luz para crecer.
Como las algas son organismos fotoautotrficos, los medios utilizados para
aislarlos se hacen exclusivamente con macro y micronutrientes esenciales.
Como no hay carbono oxidable presente, las bacterias heterotrficas de
crecimiento rpido no representan una amenaza competitiva.
Las algas pueden ser enumeradas y analizadas de otra manera en el suelo
por una serie de mtodos incluyendo el procedimiento de nmero ms
probable (MPN). El procedimiento de nmero ms probable es un mtodo
estadstico basado en la dilucin de organismos a la extincin, y evaluar si
un signo positivo de la presencia del organismo (como el cambio de color en
el medio o la formacin de gas) aparece en los tubos de replicar de una
dilucin dada. Como los clculos involucrados son muy tediosos, se han
publicado tablas especficas para un diseo de MPN en particular. La MPN
se utiliza comnmente en anlisis de suelos para ensayos como deteccin de
patgenos y anlisis de aguas residuales.
El procedimiento se ilustra en la Figura 6-1. Una serie de dilucin se hace
tanto como para la placa cultivable heterotrfica, que se cuenta en el
experimento anterior. Sin embargo, 5 tubos de medio se inocularn cada uno
con 1,0 ml de cada suspensin de dilucin (etapa 2). Los tubos se deben
incubar con la luz del sol o luces artificiales del crecimiento.
La evaluacin de la MPN en s misma es simple e implica poco ms que
contar los tubos que muestran un signo positivo de crecimiento
(generalmente un anillo de superficie verde o una pelcula) y usar los datos
en una tabla de MPN junto con la informacin de dilucin del suelo.
Consulte la seccin de clculo para obtener ms detalles.
6.3.PROCEDIMIENTO
MATERIALES
25 g de tierra fresca para cada tipo de suelo (*)
Un recipiente de plstico para cada tipo de suelo
Placas Petri (*)
Equilibrio de la mesa ( 0,01 g)
Agua desionizada
Envoltura de plstico
Bandas de goma
Bolgrafos
Sonda de diseccin

PRIMER PERIODO

1. Pesar una muestra de 25 g de suelo por el peso fresco en un recipiente de

plstico etiquetado, la modificacin de la humedad del suelo a un valor dado
a usted por el instructor.

2. Cubra los envases con un envoltorio Saran, asegure el envoltorio con una
banda de goma y perfore el envoltorio dos veces con una sonda para
permitir que entre aire. Pesar el suelo y envolver para rastrear la prdida de
humedad del suelo durante la incubacin a temperatura ambiente durante
una semana.

SEGUNDO PERIODO

MATERIALES

Suelo incubado del Perodo 1

Equilibrio de la mesa ( 0,01 g) (*)
Pesando platos (*)

1 estril, 95 ml de agua en blanco para cada tipo de suelo

30 9 ml de blanks de solucin de Bristol modificada para cada tipo

de suelo

10 pipetas estriles de 1 ml para cada tipo de suelo

 1 estante para tubos de ensayo con al menos 5 aberturas
1 estante para tubos de ensayo con al menos 25 aberturas para cada
tipo de suelo
Bombilla de pipeta
Bolgrafos
Sonda de diseccin
mezclador Vortex

1. Vuelva a pesar la muestra de suelo con el envoltorio y la banda de goma y

registrar los pesos para determinar el contenido de humedad del suelo
despus de la incubacin durante una semana.

2. Preparar una serie de diluciones de 10 veces de 10-1 a 10-6 g de suelo ml-1

usando 10 g del suelo, una muestra de 95 ml y cinco de 9 ml que contienen
una solucin de Bristol modificada (vase la figura 6-1).

3. Para cada una de las diluciones 10-2 a 10-6, inocular cinco blancos de 9 ml
de solucin de Bristol modificada, transfiriendo aspticamente, por ejemplo,
1 ml del contenido del tubo B a cada uno de cinco esbozos, como se muestra
en la etapa 2 de la Figura 6 -1. Incubar los tubos tapados cuatro semanas en
un invernadero, o cmara de crecimiento.

Paso 1

Haga una serie de diluciones de 10 veces

Paso 2

Etiquete todos los tubos abajo con el suelo y la dilucin. Transferir 1,0 ml
de cada tubo en 5 tubos de replicacin. Vortex los tubos anteriores con
frecuencia. Vaya a 3.

Paso 3

Despus de asegurarse de que el contenido de todos los tubos de dilucin

han sido bien suspendidos por vrtex, incubar los tubos de 4 semanas en un
rea clida, iluminado. La serie de dilucin que hizo en 1 puede ser
descartada.

Figura 6.1 Esquema que muestra el procedimiento para determinar los

conteos de algas en el suelo mediante anlisis de MPN.

TERCER PERIODO

MATERIALES

Tubos incubados del Perodo 2.

1. Observe sus tubos y registre el nmero de tubos que muestran un signo
positivo de crecimiento para cada dilucin. Calcular el nmero de algas en
base al peso del suelo seco y los lmites de confianza superior e inferior del
95% como se describe en la seccin de Clculo. No olvide tener en cuenta
cualquier secado que pueda haber ocurrido durante el perodo de incubacin
inicial.
6.4. TRUCOS DEL OFICIO
HACER:
Tenga cuidado al preparar las diluciones del suelo-no permita que el
suelo se asiente
Proporcionar luz natural ligera apropiada o usar una cmara de
crecimiento.

NO HAGA: (*)

Abandone las algas! Permita varias semanas de incubacin. (*)

6.5. PELIGROS POTENCIALES

Nada obvio, pero nunca subestime el ingenio estudiantil!

6.6. CLCULOS
En la siguiente discusin se darn dos ejemplos de aplicacin de MPN a la
enumeracin de algas. El procedimiento de dilucin utilizado se muestra en
la Figura 6-1. Suponga que las cantidades reales de suelo seco en cada tubo
varan de 8,2 x 10-3 g (tubo B) a 8,2 x 10-7 g (tubo F). (Recuerde que se
pesaron originalmente 10 g de suelo hmedo, por lo que el peso seco real
del suelo depende de la humedad del suelo en el momento de la dilucin).

Ejemplo 01.
La figura 6-2 muestra la apariencia de los tubos despus de la
incubacin. Los tubos sombreados indican signos positivos de
crecimiento y los tubos vacos muestran signos negativos de
crecimiento.
 Figura 6.2 Resultados hipotticos de un ensayo de enumeracin de
algas por MPN discutido bajo el Ejemplo 1 en la seccin de Clculos.
Los crculos sombreados representan tubos con un signo positivo de
crecimiento. Los crculos vacos representan tubos sin signo de
crecimiento y por lo tanto son negativos.

Elija 1 como el nmero de tubos replicados de la mayor dilucin

(menos concentrados en el suelo) que tenga el mayor nmero de tubos
positivos. Aqu, las repeticiones del Tubo B no cuentan porque las del
Tubo C provienen de una dilucin ms alta. Por el contrario, el nmero
de tubos del tubo D que muestran un signo positivo de crecimiento es
menor que los del tubo C. As, 1 = 5.
Elija 2 y 3 para que sea el nmero de tubos en las siguientes dos
diluciones ms altas que muestren un signo positivo de crecimiento.
As, 2 = 3 y 3 = 1. Mire hacia abajo la primera columna en la Tabla
6-1 para encontrar su valor para 1. Haga lo mismo en la columna 2.
A continuacin, busque dnde su valor de 3 (a travs de la parte
superior) intersecta la fila definida por sus valores de 1 y 2. En este
ejemplo, el valor es 1,1 organismos ml-1.
Divida el valor tabular por la concentracin de suelo en la dilucin a la
que le asign D2 (Tubo D) para obtener el nmero de organismos por
gramo de suelo seco:
 1,1
Por lo tanto: 8,5105 =

1,3410104 1

Los lmites superior e inferior de confianza del 95% se calculan a partir

de la Tabla 6-2. En este experimento, ha utilizado una dilucin en serie
de 10 veces con cinco tubos por dilucin. Observando en la Tabla 6-2,
encuentre la proporcin de dilucin que us (10) en la fila superior y
luego encuentre donde cruza 5 tubos por dilucin (a 3,30).
El lmite superior de confianza es:
1,34104 3,30 = 4,42104 1

El lmite inferior de confianza es:

1,34104
= 4060 1
3,30

Tabla 6.1 Nmeros ms probables para uso con el diseo experimental

en este ejercicio. De Alexander (1982). Los valores en negrita se
explican en la seccin Clculo
Ejemplo 02
La Figura 6-3 muestra que 1 = 4, 2 = 3 y 3 = 0. Supongamos que
2 tena 8.2 x 10-4 g de suelo ml-1.El MPN es por lo tanto 0.27
organismos ml-1 o 329 clulas de algas g-1 suelo. Tenga en cuenta que
este valor es menor que el del Ejemplo 1. Esto es intuitivo ya que
menos tubos contenan algas, incluso en diluciones de suelo
relativamente bajas. El lmite de confianza superior es 1086 y el lmite
de confianza inferior es 100 g-1 de suelo.

Figura 6.3 Resultado hipottico de un ensayo de enumeracin de algas

por MPN discutido bajo el Ejemplo 2 en la seccin de Clculos. El
procedimiento de dilucin se describe en la Figura 5-1. Los crculos
sombreados representan tubos con un signo positivo de crecimiento.
Los crculos vacos representan tubos sin signo positivo de crecimiento.
 Tabla 6.2 Factores para el clculo de los intervalos de confianza
superior e inferior del 95% para un anlisis MPN del diseo
presentado en este ejercicio de laboratorio. De Alexander (1982).

6.7. PREGUNTAS Y PROBLEMAS

1. Calcular las poblaciones de algas en su suelo.
2. Calcular los lmites de confianza superior e inferior del 95%.
3. Cmo se relacionan los conteos de algas con la profundidad del perfil
del suelo?
4. En qu condiciones esperara que las algas tuvieran una ventaja
competitiva sobre los microorganismos heterotrficos en el suelo?

6.8. REFERENCIA BIBLIOGRFICA

Alexander,M. (1982) Most probable number methods for microbial
populations. In: Methods of Soil Analysis, Part 2: Chemical and
Microbiological Properties, 2nd edition, pp. 815820. American
Society of Agronomy, Inc., Soil Science Society of America, Inc.,
Madison,Wisconsin.
Killham, K. (1994) Soil Ecology, Cambridge University Press,
Cambridge, UK.
Maier, R.M., Pepper, I.L., and Gerba, C.P. (2000) Environmental
Microbiology. Academic Press, San Diego.