PRACTICA 2

DEMOSTRACIN DEL ALTO PODER CATALITICO

DE LA AMILASA SALIVAL

INTRODUCCIN.

La hidrlisis del glucgeno ( almidn) puede ser catalizada por cidos por
enzimas. En la hidrlisis catalizada por cidos hay un rompimiento
desordenado de enlaces, con la formacin intermedia de todos los posibles
oligosacridos y con la conversin final de estos oligosacridos a glucosa. Las
enzimas son ms especficas con respecto a los enlaces rotos, por ejemplo la
alfa-amilasa cataliza la hidrlisis rpida y ordenada de enlaces internos alfa(1-
4) y no hidroliza los enlaces alfa(1-6), ni maltosa; La alfa-amilasa acta
rompiendo el glucgeno inicialmente en dextrinas ramificadas de peso
molecular mediano, formando solamente pequeas cantidades de maltosa;
posteriormente disminuye el peso molecular de las dextrinas, a travs de
rompimientos relativamente lentos dando glucosa y un oligosacrido con un
residuo de glucosa menos. Los productos finales de la degradacin son:
glucosa, maltosa e isomaltosa.

Debido a que durante la hidrlisis, ya sea catalizada por cidos por alfa-
amilasa, hay un incremento de grupo reductores, el progreso de la reaccin
puede ser observado midiendo la cantidad de azcares reductores por
reduccin del 3,5-dinitro salicilato. El grado porcentaje de hidrlisis se
determina comparando la cantidad del azcar reductor formado en un tiempo
dado con la cantidad del azcar presente despus de la hidrlisis acdica total

PRODUCTO BIOLGICO

Saliva humana obtenida al momento de realizar la prctica.

MATERIAL Y EQUIPO

8 tubos de ensaye de 18x150

 1 gradilla
6 pipetas serolgicas de 1 ml, 5 ml y 10 ml
1 vaso de precipitado de 50 ml
1 vaso de precipitado de 500 ml
Plancha de calentamiento
Espectrofotmetro
Cuba para espectrofotmetro

REACTIVOS

Glucgeno de hgado de rata

HCl 2 N
NaOH 1.2 N
Reactivo de 3,5-dinitro salicilato
Amortiguador de fosfatos 0.02 M pH=6.9
NaCl 0.005 M

TCNICA

A-. HIDRLISIS CIDA

1. Preparacin de la solucin de glucgeno:

Disolver 40 mg de glucgeno de hgado de rata en 5 ml de agua
destilada (esta solucin es de 8 mg/ml). (Nota 1)

2. Hidrlisis del glucgeno:

Numerar 8 tubos de 18x150(del 1al 8), y agregar lo siguiente:

TUBO NMERO

REACTIVO (ML) 1 2 3 4 5 6 7 8
Agua destilada 0.1 - - - - - - -
Soln de glucgeno - 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
HCl 2 N 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
 NaOH 1.2 N 1 1 - - - - - -

3. Introducir los tubos del 3 al 8 en bao de agua hirviendo.

4. retirar los tubos del 3 al 8 del bao de agua hirviente a intervalos de 3

minutos cada uno y neutralizar inmediatamente aadiendo a cada tubo
0.1 ml de NaOH 1.2 N

5. despus de 25 minutos retirar el tubo 8 del bao de agua hirviente y

aadir inmediatamente 1 ml de NaOH 1.2 N.

6. Aadir a todos los tubos (del 1 al 8), 1 ml del reactivo de 3,5

dinitrosalicilato e introducirlos en bao de agua hirviente por 5 minutos.

7. Sacar los tubos del bao de agua e introducirlos inmediatamente bao

de agua con hielo. Una vez fros, aadir a cada tubo 15 ml de agua,
mezclar por inversin y medir la absorbancia de cada tubo a 540 nm
utilizando el tubo 1 como blanco.

B-. HIDRLISIS ENZIMATICA.

1. recoleccin de la saliva.

El voluntario debe enjuagarse perfectamente la boca con agua y

masticar un pequeo fragmento de parafina limpia para estimular la
produccin de la saliva. Recoger 2 ml de saliva en un vaso de 50 ml.
Cuando todo este listo para la hidrlisis enzimtica preparar una
dilucin de 1:80, 1:10 1:15 de sta saliva. Utilizar la saliva para la
hidrlisis inmediatamente despus de diluida. (Nota 2)

2. Preparacin de la solucin de glucgeno.

Disolver 32 mg de glucgeno de hgado de rata en 4 ml de NaCl 0.005
M (el in cloruro activa la alfa-amilasa). (Nota 3)

3. Hidrlisis del glucgeno.

Numerar 8 tubos de 18x150 (del 1 al 8), y aadirles lo siguiente:
 TUBO NMERO

REACTIVO
1 2 3 4 5 6 7 8
(ml)
Agua destilada 0.1 - -- - - - - -
Solucin de
- 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
glucgeno
Saliva diluida 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Reactivo de 3,5
1 1 - - - - - -
dinitrosalicilico

4. Incubar a temperatura ambiente.

5. Aadir a los tubos 3 al 8 a intervalos de 2 minutos cada uno, 1 ml de

reactivo de 3,5 dinitrosalicilato. Introducir todos los tubos (del 1 al 8)
en un bao de agua hirviente durante 5 minutos.

6. Enfriar los tubos en bao de agua fra. Una vez fros aadir a cada uno
de los tubos 18 ml de agua, mezclar por inversin y medir la
absorbancia a cada uno de los tubos a 540 nm utilizando el tubo uno
como blanco. ( Nota 4).

NOTAS.

1. Puede utilizarse en lugar de la solucin de glucgeno una solucin de

almidn preparada de la siguiente manera:

Moler 2 gr. de almidn en un mortero que contenga 15 ml de agua

destilada fra. Verter esta suspensin lentamente en 185 ml de agua
hirviendo, agitando constantemente. Enfriar a temperatura ambiente
antes de usar.
2. La concentracin de alfa-amilasa es diferente en diversas muestras de
saliva; depende del estado fisiolgico y de la constitucin gentica del
donante. Se necesitan, pues, probar distintas diluciones de saliva par a
que la concentracin de la enzima catalice la hidrlisis de modo que
marche a una velocidad adecuada para ser medida.
 3. Puede utilizarse en lugar de la solucin de glucgeno una solucin de
almidn preparada en la forma indicada en la nota 1 sustituyendo el
agua destilada por amortiguador de fosfato 0.02 M (pH=6.9.
4. Si la velocidad de hidrlisis es demasiado rpida para dar una velocidad
lineal durante los primero 4 minutos, o demasiado lenta para ser
apreciada, repetir el anlisis con otra dilucin de saliva.

CALCULOS

Los clculos para obtener l % de hidrlisis son iguales para la hidrlisis

acdica y la enzimtica.

Tubo 2 0 % de hidrlisis
Tubo 8 100 % de hidrlisis
Tubo x Tubos del 3 al 7

% de hidrlisis = Absorbancia del tubo x X 100

(Tubos 3-7) Absorbancia del tubo 8

REFERENCIAS

1. Plummer, David T. An introduction to practical biochemistry 2a Mc

graw-hill company (UK) limited, 1979 pp197, 188, 272-274.
2. Rendina, George Dr. Tcnicas de bioqumica aplicada 1a Nueva
Editorial interamenricana, S.A., Mx. 1974. pp82 y 83

REPORTE

1. Mencionar 3 fuentes naturales de alfa-amilasa.

2. Describir que tipo de enzima es la alfa-amilasa
3. Escribir con formulas de reaccin que ocurre entre un azcar reductor y
el 3,5 dinitrosalicilato.
4. Escribir los datos y resultados obtenidos, en la siguiente tabla.
 HIDRLISIS ACIDICA HIDRLISIS ENZIMATICA

Tubo % A % DE TIEMPO % A % DE TIEMPO

# T HIDROLISIS T HIDROLISIS

5. Graficar los resultados obtenidos (% de hidrlisis Vs tiempo).

6. Que se concluye a partir de los datos obtenidos?