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5 - Transformacion Vegetal
5 - Transformacion Vegetal
Curso 2011
Sistemas de transformacin vegetal
Transparencias 3-6
Transparencias 7-19
Todos los plsmidos Ti tienen una estructura similar. Las especies de Agrobacterium
sintetizan diferentes tipos de opinas y son referidas de acuerdo con ello. La
transparencia 12 muestra las regiones de homologa entre los plsmidos Ti de dos
cepas comunes de Agrobacterium, una de octopina (oct) y otra de nopalina (nop).
Dichas regiones abarcan principalmente la regin T y la regin vir. Una caracterstica
del plsmido Ti de octopina es que contiene tres regiones T cortas de 13, 1,5 y 7,8
Kpb, los cuales son transferidos independientemente unos de los otros, mientras que
el de nopalina lleva un nico plsmido Ti de 22 Kpb. Existen muchas otras opinas,
tales como manopina, agropina agrocitopina, etc. En los plsmidos representados en
esta transparencia se muestran cuatro regiones de homologa que contienen
respectivamente a los genes que codifican protenas involucradas en la sntesis de
auxinas y citoquininas (regin A), el origen de replicacin (regin B), los genes que
codifican protenas involucradas en el catabolismo de octopinas y nopalinas (regin C)
y los genes de virulencia (regin D).
Una vez inducidos los genes vir, se produce la escisin de la hebra T libre. Este evento
se inicia en el borde derecho, contina en direccin 5-3, y termina en el borde
izquierdo de la hebra antisentido. Un complejo de protenas denominadas VirD1/D2,
que funcionan como endonucleasas especficas, se une a la forma supercoiled del
plsmido Ti, relajan el plsmido, hace un corte entre la tercera y cuarta base de los
bordes derecho e izquierdo en la hebra antisentido de la regin T y liberan dicha
hebra. La reaccin de corte comprende la unin covalente de la protena VirD2 al
extremo 5 del borde derecho. Luego, la maquinaria de sntesis de ADN repara la
brecha entre los bordes derecho e izquierdo de la hebra antisentido. La protena VirD2
permanece unida al ADN-T durante todo el trayecto hasta la clula husped. Las
protenas VirD2 y VirE2 (una protena de unin a ADN de simple cadena) junto con la
hebra T constituyen el complejo T maduro. La unin de VirE2 ocurre antes de que la
hebra T sea transportada a travs del canal de pasaje a travs de las membranas de
la bacteria. Otra protena recientemente identificada, la protena VirE1, se une a VirE2,
facilitando la unin de VirE2 al ADN, pero no interviene en la exportacin de la hebra T
a la clula de la planta.
Una vez formado el complejo T maduro, ste interacta con distintos complejos
proteicos involucrados en su exportacin al citoplasma de la clula vegetal. El
dispositivo de transporte del complejo T contiene alrededor de 12 protenas que
forman dos componentes funcionales: un complejo secretorio que transporta sustratos
a travs de la membrana celular y un pilus filamentoso. La transparencia 18 muestra
un modelo que da cuenta de la estructura de estos complejos, elaborado sobre la base
de evidencia indirecta. El complejo secretorio est compuesto por la protena
codificada por el gen virD4 y por un conjunto de protenas codificado por el opern
virB, el que contiene once marcos abiertos de lectura. El pilus est compuesto
mayoritariamente por la protena VirB2 y, en menor proporcin, por la protena VirB5.
El pilus censara el contacto con la clula vegetal y traducira la informacin al
complejo secretorio para iniciar la exportacin del complejo T. Se piensa que la
protena VirB1 tiene actividad transglucosilasa e interviene en la degradacin de los
peptidoglicanos bacterianos. Las protenas VirB3 y VirB4 promoveran el ensamblado
del pilus. Adems de VirD4, VirB4 y VirB11 poseen tambin actividad ATPasa. Se
asume que el transporte del complejo T implica la hidrlisis de ATP y que por lo tanto
se trata de un proceso de transporte activo. La protena VirB6 participara en la
formacin del poro del complejo secretorio de transporte. Se desconocen an las
funciones de las protenas VirB7, 8, 9 y 10.
Transparencias 20-31
Los vectores binarios surgen como una alternativa al uso de los vectores
cointegrativos debido a la fcil implementacin de su uso en todo tipo de laboratorios.
Estos vectores se basan en que la regin T y los genes vir se encuentran en dos
replicones separados. Cuando estos replicones son introducidos en Agrobacterium, los
productos de los genes vir pueden actuar en trans sobre la regin T procesando y
transfiriendo el ADN T a la clula vegetal. El plsmido que contiene la regin T es
denominado vector binario, mientras que el replicn que lleva los genes vir se
denomina plsmido helper o plsmido Ti desarmado. En general, el plsmido helper
contiene deleciones de la regin T y es incapaz de generar tumores. En la
transparencia 23 se muestran cuatro tipos de plsmidos binarios, todos los cuales
contienen genes con secuencias no homlogas que confieren resistencia a
kanamicina. Los plsmidos binarios son pequeos y fciles de manipular tanto en
Escherichia coli como en Agrobacterium. Generalmente, contienen sitios mltiples
para enzimas de restriccin dentro de la regin T donde puede clonarse fcilmente el
gen de inters. Muchos de los primeros plsmidos binarios tienen los genes de
seleccin para plantas cerca del borde derecho (por ejemplo, pBIN19). Ms
recientemente, los nuevos vectores binarios se desarrollaron con el gen marcador de
seleccin para plantas ms cerca del borde izquierdo, lo que asegura que el gen de
inters sea transferido antes que el gen selector (por ejemplo, pGreen0029). Debe
recordarse que el borde derecho precede borde izquierdo en la transferencia del ADN-
T.
Los vectores binarios que hoy se utilizan proveen un amplio nmero de genes
selectores para plantas. Esta gama de genes permite as responder a requerimientos
de las tcnicas de cultivo de tejidos y expandir el rango de especies transformables.
De esta forma, se han desarrollado en muchos casos diversas versiones de un mismo
vector binario. El vector pGreen, por ejemplo, permite realizar distintas combinaciones
de genes selectores con el propsito de desarrollar protocolos de seleccin con uno o
ms marcadores. Este grado de flexibilidad permitir tambin la incorporacin de
nuevos genes selectores en el futuro. En la mayora de los casos, la seleccin se basa
en el agregado de una sustancia txica para el tejido no transformado al medio de
cultivo (seleccin negativa). Al expresarse en las clulas transformadas, el gen
selector permite su supervivencia y la regeneracin de plantas a partir de las mismas.
Los genes de resistencia a antibiticos han sido frecuentemente utilizados como
selectores. El ms utilizado de ellos es el gen nptII que confiere resistencia al
antibitico kanamicina. Otros genes ampliamente utilizados son los que confieren
resistencia a espectinomicina e higromicina y los que confieren resistencia a
herbicidas, como glufosinato y glifosato. El uso de un determinado selector est
vinculado con la susceptibilidad especfica de cada especie vegetal, por lo que la
transformacin de una especie nueva implica generalmente ensayos con distintos
selectores. Es conveniente disponer de ms de un gen selector si se prev la
necesidad de retransformar una especie con varios transgenes de inters. El debate
sobre el uso de genes de resistencia a antibiticos en plantas transgnicas
comerciales promovi la bsqueda de selectores ms aceptables para la percepcin
pblica que no poseen propiedades txicas para el tejido (seleccin positiva).
Asimismo, se han desarrollado diferentes estrategias para eliminar los genes
selectores en el cultivo transgnico.
Transparencias 32-37
La transparencia 36 resume los tiempos estimados para cada uno de los pasos de un
protocolo de una transformacin estndar mediado por Agrobacterium tumefaciens.
Estos tiempos son variables y dependen de la especie a ser transformada, la variedad
elegida, el explanto utilizado y el protocolo elegido para la seleccin.
Transparencias 38-42
Genes reporteros
Transparencias 43-52
Los genes reporteros son ampliamente usados en muchos vectores de expresin para
medir la actividad de distintas regiones reguladoras. Idealmente, un gen reportero
debe ser fcil de ensayar, si es posible en condiciones no destructivas del tejido. Se
requiere tambin que la actividad endgena asociada al gen reportero sea muy baja o
inexistente en las plantas a transformar. Actualmente, se cuenta con un pequeo
nmero de genes reporteros de uso frecuente, siendo los ms utilizados el de la -
glucuronidasa, la protena de fluorescencia verde, los de luciferasa y, en menor grado,
el de cloranfenicol acetiltransferasa. La transparencia 44 enumera los orgenes y tipos
de ensayos que se utilizan para detectar las actividades asociadas con estos genes.
Los genes reporteros han utilizados desde muy temprano como indicadores de que la
transformacin vegetal realmente ha ocurrido. En general, los genes reporteros son
codificados por enzimas que actan sobre sustratos que normalmente no estn
presentes en la clula husped. Uno de los genes reporteros ms comnmente
utilizado en plantas es el gen de la -glucuronidasa (uidA) de Escherichia coli. La
protena GUS es bastante estable y conserva su actividad an cuando est fusionada
a otras protenas. La actividad GUS puede detectarse a travs de una sencilla
reaccin histoqumica usando una variedad de sustratos que estn disponibles
comercialmente. Desafortunadamente, la mayora de los sustratos son caros y la
reaccin histoqumica es destructiva, por lo que este ensayo no puede realizarse en
tejido vivo. Sin embargo, la deteccin de la actividad GUS es muy sensible,
pudindose detectar a nivel de unas pocas clulas. La transparencia 45 muestra la
tincin de vulos, sacos embrionarios y lculos enteros de Arabidopsis thaliana
mediante la reaccin histoqumica de la enzima -glucuronidasa luego de la infiltracin
con Agrobacterium tumefaciens. En este caso, el gen uidA est regulado por un
promotor constitutivo y lo que se visualiza son los tejidos inicialmente transformados
por este mtodo. A: fotografa de una flor completa donde se observan varios vulos
teidos. B: Fotografa ampliada de un segmento floral donde se pueden ver vulos
completamente teidos y vulos no teidos. C: Tincin del embrin o saco
embrionario, en vez del vulo entero. D: Cavidad del lculo completamente teido.
Los genes reporteros son comnmente usados para explorar la localizacin espacio-
temporal de la expresin gnica. Para ello, las regiones reguladoras de los genes que
se desea estudiar son ligadas al gen reportero y las construcciones as obtenidas son
transferidas al genoma de la planta. El panel de la parte superior de la transparencia
46 muestra la expresin del gen reportero uidA mediada por el promotor tejido
especfico AtpT2 en flores y frutos de Arabidopsis thaliana. 1) Expresin del gen uidA
en flores, 2) La expresin del gen uidA es confinada a la porcin entre la silicua y el
pecolo. 3 y 4). Cortes histolgicos del fruto donde se observa la expresin del gen
uidA en clulas del estrato superior (3) y en algunas clulas del tejido vacuolar (4). El
panel de la parte inferior de la transparencia muestra la expresin del gen reportero
uidA bajo la regulacin de un promotor tejido especfico AtpT2 en races de Nicotiana
tabacum. (5) y (6): Fotografas de las races completamente teidas debido a la
expresin del gen uidA. (7): Corte transversal de raz mostrando la expresin del gen
uidA.
luciferasa
ATP + luciferina + O2 oxiluciferina + ampicilina + PPi + CO2 + luz
Transparencias 53-99
Transparencias 55-82
En 1987, Klein et al. reportaron que era posible introducir ADN plasmdico en clulas
epidrmicas de Allium cepa mediante bombardeo con partculas de tungsteno, y que el
gen marcador cat de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa era expresado en
niveles muy altos. Poco despus, numerosos investigadores pusieron a prueba este
mtodo en diferentes organismos obteniendo resultados positivos. Desde entonces, el
bombardeo de micropartculas se constituy en el segundo mtodo de transformacin
gentica de plantas ms empleado, luego del de Agrobacterium. El bombardeo de
micropartculas es considerado un mecanismo universal, ya que, por su naturaleza,
permite introducir ADN desnudo virtualmente en cualquier tipo de tejido o clula. Ha
sido utilizado para introducir y expresar material gentico no slo en el genoma de
plantas superiores sino tambin en bacterias, protozoarios, algas, hongos, clulas y
tejidos animales (insectos, peces, aves y mamferos) y an animales y plantas in vivo.
Hasta el presente, constituye el nico medio que permite transformar organelas
celulares, como mitocondrias y cloroplastos de modo reproducible.
Las transparencias 63-64 ilustran los distintos pasos del procedimiento de bombardeo.
El primer paso involucra la preparacin de las micropartculas, la precipitacin del ADN
sobre las mismas y el ensamblaje de las distintas partes del can que comprenden el
sistema de impulsin de los microproyectiles. Para ello, se desenrosca el soporte de la
membrana de ruptura, se escoge una membrana de ruptura del espesor apropiado y
se la coloca en el soporte correspondiente. A continuacin, se ajusta el soporte al
extremo del tubo de salid de gas. El espesor de la membrana de ruptura vara segn la
presin de helio con la que se quiera trabajar (existen membranas que van de los 300
psi hasta los 2.200 psi). La presin de ruptura determina el poder de la onda de
choque que impacta en la cmara. Si se incrementa la presin de helio, se incrementa
la aceleracin de las micropartculas y, en consecuencia, su penetracin en el tejido
blanco.
Existen modelos alternativos al can PDS 1000/He que permiten regular la presin
del gas a la cual se desea producir el bombardeo. La regulacin se efecta por medio
de una vlvula elctrica, dentro de un rango de presiones de 200 a 1500 psi. Al
accionar un control elctrico, la fuerza electromagntica generada por un solenoide
produce el desplazamiento de una aguja que perfora las membranas de ruptura
permitiendo la salida del helio (en contraste con el can PDS1000/He en que la
membrana de ruptura se rompe pasivamente por exceso de presin). El dispositivo
que se muestra en la transparencia 67 fue desarrollado en EMBRAPA-CENARGEN
(Brasil) y ha sido utilizado exitosamente en la transformacin de Glycine max,
Phaseolus vulgaris, Gossypium hirsutum, entre otros.
El Genebooster (transparencia 68) es otro tipo de can gnico, producido por ELAK
(Budapest) y desarrollado por el Centro de Biotecnologa Agrcola del Instituto de
Ciencias Vegetales de Hungra. Mediante este dispositivo, las partculas son
impulsadas hacia el tejido blanco por liberacin de nitrgeno comprimido a alta
presin. En este caso, los controles de presin y vaco se encuentran en una unidad
separada de la cmara de disparo. El proceso de disparo es controlado por un sistema
electrnico automtico. La energa del disparo es ajustada segn el espesor de la
pared celular del tejido blanco. Los ajustes de los parmetros de cada disparo pueden
ser archivados por una computadora conectada al dispositivo. Este can ha sido
usado con xito en la transformacin de Oryza sativa y tambin para obtener
expresin transitoria en estudios de promotores especficos para diferentes tejidos
(hoja, hipoctilo, embrin, escutelo, callo, cotiledn) de varias especies vegetales.
Entre sus ventajas, pueden mencionarse: a) control automtico de los disparos; b)
registro computarizado de los ajustes de cada disparo; c) control continuo de la
energa de disparo; d) alta penetracin a travs de paredes celulares; e) alta
frecuencia de transformacin en especies recalcitrantes; f) bajo costo (gas barato,
placas de retencin reciclables).
En 1996 hizo su aparicin la pistola gnica de mano como una alternativa al can
PDS 1000/He. En contraste con los caones gnicos convencionales, en que el
tamao del tejido blanco est limitado por el tamao de la cmara y el explanto es
sujeto a vaco durante el bombardeo, este nuevo diseo no requiere vaco, permite
trabajar con virtualmente cualquier tipo de clulas o tejido blanco y provee una
herramienta para transformar organismos in vitro o in vivo. El instrumento que se
muestra en la transparencia 69 es comercializado por la compaa BioRad. La pistola
trabaja con microproyectiles de oro recubiertos de ADN o ARN que son precipitados en
la pared interna de un cartucho de plstico y acelerados por un flujo de helio a presin.
Es posible preparar 50 cartuchos a la vez conteniendo cantidades conocidas de
microproyectiles, los cuales pueden conservarse hasta dos meses previos a su
utilizacin. Los cartuchos se colocan en un soporte (figura C), el cual se ensambla en
la pistola y se dispara. El sistema es rpido, verstil y permite la co-transformacin con
ms de un transgn. En la prctica los dos sistemas de helio, el can PDS1000/He y
la pistola Helios, se complementan, dado que en el primero el vaco provee
condiciones ambientales ms controladas en su cmara de disparo, mientras que el
ltimo permite trabajar con una amplia variedad de tejidos o clulas blanco, incluidos
organismos vivos. La transparencia muestra la pistola gnica (figura A), el porta
cartuchos (figura C), y un dispositivo (figura B) utilizado para preparar hasta 50
cartuchos por vez. El esquema inferior muestra el diseo interno de la pistola gnica.
La pistola gnica constituye una valiosa herramienta para transferir ADN o ARN en
organismos vivos sin utilizar cmara de vaco. Debido a que la pistola puede ser
dispuesta muy cerca del tejido a ser bombardeado, la trayectoria de las partculas es
reducida y la desaceleracin por friccin es muy baja. Estos cambios reducen el
trauma en tejidos frgiles y facilitan las manipulaciones. Sin embargo, los parmetros
de bombardeo deben ser ajustados de acuerdo con el tipo de tejido blanco. Algunos
reportes mencionan que una desventaja del sistema es la poca reproducibilidad entre
experimentos. Sin embargo, este problema es frecuente en todos los sistemas de
bombardeo de partculas. Algunos autores recomiendan tomar recaudos especiales
para controlar mejor este problema, tales como trabajar con material vegetal crecido
en las mismas condiciones o utilizar explantos de misma edad fisiolgica.
Un dispositivo de bajo costo, que puede usarse como alternativa a los instrumentos
ms sofisticados, es el can de chorro de partculas (PIG; Particle Inflow Gun). El
mismo puede ser fcilmente construido en el laboratorio con medios relativamente
econmicos. Este can hace uso de una vlvula elctrica para generar un chorro de
helio a baja presin, el cual acelera las micropartculas dentro de una cmara de vaco
(28-30 pulgadas de Hg) y las proyecta hacia las clulas blanco. La micropartculas
recubiertas de ADN son dispuestas en una jeringa con filtro que se acopla a un
adaptador conectado a la vlvula solenoide. Este instrumento ha sido exitosamente
usado para transformar Glycine max, Zea mays, Manihot esculenta y Musa spp. Existe
una versin del PIG en el cual se ha eliminado la cmara de vaco y que se ha usado
para transformar Oryza sativa. A pesar del bajo costo del sistema, su uso no ha sido
tan difundido como el de los caones mencionados anteriormente.
Transparencias 83-93
Luego de la digestin, los protoplastos deben ser aislados y lavados. Por otro lado,
con el objetivo de optimizar la transferencia de ADN a protoplastos, se utilizan distintas
tcnicas que incrementan la permeabilidad de las membranas plasmticas. Es comn
el uso de policationes tales como polietilenglicol (PEG), polivinil alcohol (PVA) y DEA-
dextrano que actan como fusgenos e incrementan la endocitosis del ADN debido a
que sus cargas positivas interaccionan con las cargas negativas del ADN y de la
membrana plasmtica. Adems del uso de fusgenos, los tratamientos con Ca 2+ y
calor pueden incrementar la precipitacin del ADN. La obtencin de la primera planta
transgnica viable derivada de protoplastos de Nicotiana sp. se report en 1984. La
transformacin de protoplastos en soluciones que contienen PEG provee frecuencias
relativamente bajas de plantas transgnicas. Sin embargo, debido al gran nmero de
clulas disponibles en estos sistemas, si se dispone de buenos mtodos de seleccin
y de protocolos de regeneracin eficientes, es siempre posible obtener plantas
transgnicas. Una contribucin a la transformacin mediada por PEG fue la fusin con
liposomas. En este caso, el ADN es previamente incorporado a liposomas, a partir de
las cuales es transferido a las clulas. Los liposomas estn constituidos por lpidos de
carga neutra similares a los que componen la membrana plasmtica y pueden ser
producidos en diversos tamaos. El ADN es empaquetado in vitro y luego transferido a
los protoplastos. Para hacer ms eficiente la fusin se utilizan tratamientos con PEG u
otros policationes. Aunque el sistema es muy laborioso y la eficiencia de
transformacin es baja, se ha reportado la obtencin de plantas transgnicas de
tabaco y trigo por esta tcnica. La transparencia 84 muestra un esquema
representativo del aislamiento y purificacin de protoplastos de hojas de Nicotiana
tabacum. Las hojas cosechadas son puestas en contacto con la solucin enzimtica
durante 16 h, al cabo de las cuales se procede a separar los protoplastos del tejido no
digerido.
Transparencias 94-95
En 1990 se report una nueva tcnica de transferencia de ADN que utiliza fibras muy
finas, conocidas como whiskers, para generar orificios en las paredes celulares. Las
fibras ms utilizadas en este mtodo son cristales de carburo de silicio de 0,3-0,6 m
de dimetro y 10-100 m de longitud. Las fibras de silicio se agregan a una
suspensin conteniendo el tejido vegetal (por ejemplo suspensiones celulares,
embriones o callos) y ADN plasmdico, y luego se mezclan con un agitador tipo Vortex.
Como resultado de la agitacin, los whiskers penetran la pared celular y la membrana
plasmtica, permitiendo el ingreso del ADN. La eficiencia de la tcnica depende del
tamao de la fibra, los parmetros de mezcla (agitacin), la forma de los recipientes
utilizados, el material vegetal y las caractersticas de las clulas vegetales,
especialmente el espesor de la pared celular. Las principales ventajas de este mtodo
residen en su bajo costo y en la rapidez y sencillez con que pueden realizarse los
ensayos. Sus principales desventajas son la baja eficiencia de transformacin, la
disminucin de la capacidad regenerativa de los tejidos daados por el proceso y la
necesidad de trabajar con extrema precaucin debido a la toxicidad del carburo de
silicio para la salud humana. Aunque el proceso ha sido utilizado con callos friables,
este tipo de callo est limitado a unos pocos genotipos de maz y avena. Muchos
cereales producen callos embriognicos muy compactos y duros que no son
fcilmente transformables por este mtodo. Sin embargo, se han introducido mejoras a
la tcnica que permitieron la transformacin transitoria y estable de Oryza sativa,
Triticum sp., Hordeum vulgare, Zea mays, Nicotiana tabacum, Lolium multiflorum,
Lolium perenne, Festuca arundinacea y Agrostis stolonifera, sin necesidad de iniciar
suspensiones celulares. La transparencia 95 muestra la transformacin de
suspensiones celulares de maz con whiskers de carburo de silicio. Las suspensiones
celulares fueron puestas en una solucin conteniendo los whiskers y el ADN
plasmdico portando los genes uidA y bar. La mezcla fue agitada con la ayuda de un
dispositivo de tipo Vortex (figura A). La incorporacin del ADN fue corroborada por la
expresin transitoria del gen uidA (figura B). Las clulas transformadas formaron callos
en seleccin con fosfinotricina (figura C) y regeneraron plantas transgnicas (figuras D,
E y F). El tratamiento con herbicida revel que las plantas han heredado el gen bar en
forma mendeliana (figura F). Este trabajo fue el primero en que se report la
produccin de plantas transgnicas mediante whiskers de carburo de silicio.
Transparencias 96-99
Transparencia 100