Trasformacin de clulas vegetales

Obtencin de plantas transgnicas

Diana Carranza Domnguez.

 NDICE:

1.- INTRODUCCIN

2.-Agrobacterium COMO MTODO DE

TRANSFORMACIN VEGETAL:

2.1.- Agrobacterium tumefaciens

2.1.1.- TRANSFORMACIN DE LA CLULA VEGETAL
CON EL PLSMIDO TI DE A. tumefaciens
- GENES op

- GENES onc

- ORIGEN DE REPLICACIN

- GENES vir

- BORDES DERECHO E IZQUIERDO

2.1.2- Ingeniera gentica de plantas usando T-DNA

- LIMITACIONES DE LOS PLSMIDOS TI

- SISTEMAS DE VECTORES DERIVADOS DEL PLSMIDO

TI:
Sistemas de vector binario
Sistemas de vector cointegrado

2.2.- Agrobacterium rhizogenes

3.- VECTORES VIRALES:

3.1- VIRUS DNA:

- Caulimovirus
- Geminivirus

3.2.- VIRUS RNA

 4.-VECTORES TRANSPOSONES

5.- TCNICAS DE TRANSFERENCIA GNICA

DIRECTA:
5.1.- TRANSFETERENCIA DE DNA A PROTOPLASTOS

5.2.- BOMBARDEO CON MICROPROYECTILES

5.3.- MICROINYECCIN

5.4.- MACROINYECCIN

5.5.- ELECTROPORACIN

5.6.- ULTRASONIDOS

5.7.-TRANSFORMACIN GNICA MEDIANTE

LSER

5.8.- TRANSFORMACIN MEDIADA POR POLEN

5.9.- TRANSFERENCIA GNICA POR IMBIBICIN

6.- GENES MARCADORES

6.1.- Marcadores que confieren viabilidad o letalidad bajo

condiciones de seleccin

6.1.1.- Marcadores de resistencia a herbicidas o antibiticos

6.1.2.- Marcadores auxotrficos
6.1.3.- Marcadores letales

6.2.- MARCADORES VISIBLES:

6.2.1.- Marcadores histolgicos.
6.2.2- Marcadores morfolgicos
6.2.3.- Marcadores de pigmentacin
 1.- INTRODUCCIN
Se ha realizado un esfuerzo considerable para el desarrollo de variedades de plantas
con una elevada produccin o un valor nutricional realzado. Aunque las principales
investigaciones se han dedicado a la mejora de los tres principales cereales maz, trigo
y arroz se han establecido tambin programas de mejora para otras plantas comestibles
y especies de horticultura. La tecnologa del DNA recombinante, ampliamente utilizada
con sistemas microbianos, es tambin una importante herramienta para la manipulacin
gentica directa de plantas, Existe un nmero de mtodos de transferencia de DNA y
vectores de expresin efectivos que se ocupan de un amplio rango de clulas vegetales.
Adems, las clulas vegetales son totipotentes se puede regenerar una planta entera a
partir de una sola clula as que se pueden producir plantas frtiles que porten gen(es)
forneo(s) en todas sus clulas (i.e., plantas transgnicas) a partir de clulas
genticamente modificadas. Si la planta transgnica florece y produce semillas viables,
el carcter deseado pasar a sucesivas generaciones.

Existen tres principales motivaciones para el desarrollo de plantas transgnicas. En

primer lugar, la adicin del gen o genes generalmente mejora el valor agricultor,
horticultor u ornamental de una planta. Segundo, las plantas transgnicas pueden actuar
como biorreactores para la produccin barata de protenas o metabolitos
econmicamente relevantes. Y por ltimo, la transgnesis de plantas proporciona
medios eficaces para el estudio de la accin de genes durante el desarrollo y otros
procesos biolgicos de las plantas.

Algunos de los caracteres genticamente determinados que pueden introducirse en

plantas mediante un nico gen o, potencialmente, mediante un pequeo cluster de
genes, incluyen actividad insecticida, proteccin frente a la infeccin viral, resistencia a
herbicidas, proteccin contra bacterias y hongos patgenos, reduccin de la senescencia,
tolerancia a estrs ambiental, pigmentacin alterada de las flores, mejora de la calidad
nutricional de las semillas... Adems, las plantas transgnicas pueden producir una
amplia variedad de compuestos tiles, incluyendo agentes teraputicos, polmeros, y
herramientas diagnsticas como fragmentos de anticuerpos. De forma alternativa,
pueden disearse para la sntesis de determinantes antignicos virales que, tras la
ingestin, pueden usarse como vacunas comestibles. Hasta la fecha, unas 140 especies
vegetales diferentes han sido genticamente transformadas, incluidas muchas especies
de forestales y de cultivo a lo largo de 50 pases repartidos por el mundo entero.

La transformacin de plantas se llev a cabo primero mediante el uso del plsmido

Ti de Agrobacterium tumefaciens, un fitopatgeno que en su ciclo vital normal
transforma genticamente las plantas que infecta. Serias limitaciones en el mecanismo
natural condujeron al desarrollo de vectores genticamente diseados basados en el
plsmido Ti: el vector binario y el vector cointegrado. Pese a que estos sistemas eran
eficientes en varias especies vegetales, las plantas monocotiledneas, incluidas los
principales cereales de cultivo (trigo, arroz y maz), no podan ser transformadas
mediante A. tumefaciens. Cuando las dificultades para la transformacin de algunas
especies vegetales resultaron evidentes, se desarrollaron un cierto nmero de
mecanismos alternativos a la transformacin mediada por A. tumefaciens: los mtodos
fsicos de transferencia del DNA. Muchos de estos mtodos requeran la eliminacin
de la pared celular de las clulas vegetales (es decir, requeran el uso de protoplastos).
Estos protoplastos pueden mantenerse en cultivo como clulas en crecimiento
independientes o, mediante un medio de cultivo especfico, pueden regenerarse las
paredes celulares y las plantas enteras. Adems, se han desarrollado mtodos de
transformacin para introducir genes clonados en un pequeo nmero de clulas de un
tejido vegetal, a partir del cual se puede desarrollar la planta entera, evitando as la
regeneracin a partir de protoplastos, en ocasiones compleja. En el presente, la mayor
parte de los investigadores usa los vectores derivados del plsmido Ti o el bombardeo
con microproyectiles (biolstica) para la transformacin de clulas vegetales.

En este trabajo pretendemos realizar un compendio de las tcnicas que a lo largo de

la historia se han utilizado para la transgnesis de plantas, no todas con buenos
resultados. Los avances en las tcnicas utilizadas por la Ingeniera Gentica han
permitido la mejora de estos mecanismos, alguno de los cuales se han ido dejando atrs
por no corroborar los resultados auspiciados. Aqu encontramos una muestra de ellos.
 2.- Agrobacterium COMO MTODO DE
TRANSFORMACIN VEGETAL:

2.1.- Agrobacterium tumefaciens

El mtodo mas utilizado para introducir genes forneos en una planta es la
capacidad natural de A. tumefaciens. Por ello, comenzaremos revisando los diferentes
estudios que permitieron descubrir como esta bacteria transformaba de forma natural
clulas vegetales con el plsmido Ti.

2.1.1.- Transformacin de la clula vegetal con el plsmido

Ti de A. tumefaciens
La biologa molecular y la ingeniera gentica en plantas se inician con el
descubrimiento y el estudio de A tumefaciens. Esta bacteria, Gram negativa, induce la
formacin de tumores, denominados agalla de la corona, generalmente en la unin del
tallo con la raz, en numerosas dicotiledneas y en muy pocas monocotiledneas y
gimnospermas (De Cleene y De Ley, 1976). Esta bacteria del suelo infecta a
dicotiledneas como parte de su ciclo vital insertando genes forneos en las mismas y
consiguiendo que se expresen en forma de protenas.

En 1947, Armin C. Braun del instituto Rokefeller de Investigacin Mdica, logr

cultivar tejido de la agalla libre de bacteria, pudiendo observar como los tumores
crecan in vitro en un medio bsico carente de auxinas y citoquininas (hormonas
necesarias para el crecimiento de clulas vegetales normales). Braun concluy que la
bacteria introduca en las clulas un principio tumorgeno.

En 1965, Menagu y Morel del instituto de investigaciones agronmicas de

Versalles, observaron que las clulas tumorgenas podan sintetizar una serie de
derivados de intermediarios metablicos de la mayora de los aminocidos, cetocidos y
azcares. Denominaron a estas sustancias qumicas opinas.

Fue en 1974 cuando Jeff Schell, Marc Van Montangu y sus colaboradores de la
Universidad de Gante, encontraron plsmidos muy desarrollados en las cepas virulentas
y observaron que eran transferidos desde estas a cepas no virulentas por conjugacin.

Luego el principio tumorgeno del que hablaba Braun, responsable de la

formacin de la crown gall (en ausencia de la bacteria) era la transferencia de un
fragmento de DNA llamado T-DNA que a su vez se localizaba en un plsmido al que se
denomin Ti (de inductor de tumores). Tras la transferencia el T-DNA se integraba en
el genoma nuclear de la planta y su expresin induca el fenotipo tumoral.
 Figura : Plmido Ti. El T-DNA est definido por los bordes derecho e izquierdo e incluye los genes para la
biosntesis de auxina, citoquinina y opina; estos genes son transcritos y traducidos slo en las clulas de la planta.
Fuera de la regin del T-DNA, hay un cluster de genes vir, un gen que codifica para un enzima(s) del catabolismo de
la opina, y un origen de replicacin (ori) que permite que el plsmido sea mantenido de forma estable en A.
tumefaciens

GENES op

Experimentos de conjugacin realizados en la Universidad de Leiden por Rob A

Schiperoort y sus colegas evidenciaron que este plsmido Ti le permita a la bacteria
degradar octopina o nopalina (opinas) y crecer sobre uno de esos compuestos, adems
determinaba si el tumor sintetizara una u otra opina y era esa opina la que induca,
especficamente, la transferencia del plsmido en la conjugacin. El gen op es el
responsable de la sntesis de opinas.

Basndose en el tipo de opinas codificadas por el plsmido Ti Dessaux et al en 1992

y Vudequin-Dransart et al en 1995 clasificaron a un amplio rango de agrobacterias en
distintas variedades segn indujeran la sntesis de octopina, nopalina, agropina,
succinamopina o crisopina. Las opinas formadas en los tumores pueden ser
metabolizadas por el Agrobacterium que lo inicia pero no por la mayora de las
bacterias del suelo (Tempe y Petit, 1982). Estas opinas sirven como fuente de carbono y
de nitrgeno para el Agrobacterium que indujo el tumor y para todos aquellos que
presenten los genes para el catabolismo de la opina producida, estos genes que permiten
la degradacin se localizan en el plsmido Ti pero fuera del T-DNA.

As, mediante la modificacin gentica de la planta, Agrobacterium crea un nicho

favorable para s mismo, utilizando la maquinaria de la clula vegetal para producir
sustancias que no va a utilizar esta pero que permiten el crecimiento de la bacteria, el
plsmidoTi simbitico es, por tanto, el elemento central de una interrelacin ecolgica
altamente evolucionada.

GENES onc
Algunos de los genes del plsmido T-DNA (genes onc) eran los responsables de la
sntesis anormal de hormonas de crecimiento por parte de la planta, los altos niveles de
estas auxinas y citoquininas eran los que permitan una diferenciacin anormal de las
clulas de la planta y provocaban un crecimiento neoplsico. Existen principalmente
tres oncogenes de los cuales dos iamM (codifica la triptofano monooxigenasa) y iaaH
(codifica la iodoaceamida hidrolasa) codifican enzimas que inician la sntesis de una
nueva auxina biosinttica. Actan secuencialmente para convertir el trp en indol-3-
acetamida y luego en indol-3-acetico (IAA). El gen ipt (codifica la
isopenteniltransferasa) es el responsable de la sntesis de citokininas.

Mientras que estos genes estn implicados en la sntesis de auxinas y citoquininas

dos genes T-DNA modulan las actividades de las mismas. Se trata de 5 y 6b, el gen 5
influye en las respuestas de la planta a las auxinas mediante la sntesis autorregulada de
antagonistas (Krber et al, 1991) y la funcin concreta del gen 6b es desconocida,
algunos estudios sugieren que reduce la actividad de las citoquininas (Spanier et al,
1989; Gaudin et al, 1994) mientras que otros parecen demostrar que tiene un efecto
similar al de las auxinas (Tinland et al, 1989,1990). Los genes que regulan los niveles
hormonales en la clula infectada son muy importantes puesto que niveles demasiado
altos, pueden provocar la muerte de la misma, en lugar de la formacin del tumor.

Origen de replicacin
El ori permite que el plsmido Ti sea mantenido de forma estable en A tumefaciens.

Existen tres elementos genticos necesarios para la transferencia del T-DNA a la

planta, estas regiones crticas estn presentes en todos los plsmidos de Agrobacterium,
aunque su estructura y organizacin son muy distintas segn la especie y la variedad:

Bordes flanqueantes del T-DNA:

A la izquierda y derecha del T-DNA existen dos direct repeats de unos 24-25pb que
flanquean y definen el T-DNA (van Haaren et al, 1998). Estos bordes son secuencias en
cis necesarias para la transferencia (Zambryski et al, 1983) y normalmente todo el DNA
contenido entre los mismos es transferido a la planta. Parece que el borde derecho es
crtico en la transferencia del DNA y en el proceso tumorgeno mientras que el
izquierdo no afecta a la formacin del tumor.

Genes vir.

Genes de virulencia o regin vir codificada por el plsmido Ti en una regin de 35

kb localizada fuera del T-DNA, existen 25 genes vir reunidos en 7 operones. Recientes
investigaciones indican que la interaccin entre los genes vir y las secuencias de los
bordes inician el proceso de transferencia.

Genes codificados por el cromosoma bacteriano.

Estos genes son necesarios para la unin de la bacteria a la clula vegetal daada.
 GENES vir

Para que este proceso de transferencia tenga lugar es necesario que adems de
practicarle una herida a la planta esta sintetice una serie de compuestos que induzcan la
expresin de los genes vir (Bolton et al, 1986; Janssens et al, 1986; Stachel et al1986).
Se trata de derivados de aminocidos, azcares y una serie de compuestos derivados del
metabolismo del fenlpropanoico (principal va para la produccin de metabolitos
secundarios) y una serie de metabolitos secundarios que producen las clulas daadas.

Stachel et al en 1986, trabajando con Nicotiana tabacum identificaron un grupo de

compuestos que inducan la expresin de los genes vir al aadir Agrobacteriuum a
exudados de heridas practicadas a esta planta. Una de las sustancias ms activas
identificadas fue la acetosiringona, pero adems es necesario que se den una serie
condiciones para que la transferencia tenga lugar: deben utilizarse medios pobres en
azcares, de bajo pH y con niveles bajos de fosfato (Winans et al, 1988; Ankenbauer y
Nester, 1990; Canguelosi et al, 1990).

Vir A y vir G son dos genes reguladores necesarios para la activacin transcripcional
de los operones vir ( Stachel y Zambrynski, 1986a), mientras que estos dos genes son
expresados constitutivamente, los dems genes vir permanecen silenciados en ausencia
de ciertos factores, producidos por la planta, que activan su sntesis.

- Vir G, en base a la homologa de su secuencia de aminocidos, fue incluido en una

clase de genes reguladores positivos inducidos por factores externos (Nixon et al, 1986;
Winans et al, 1986).

- Vir A , pertenece a un segundo grupo de genes que dirige la activacin de protenas

reguladoras positivas de la expresin gnica (Ronson et al, 1987; Winans et al, 1986).
Presenta una alta homologa con quimiorreceptores proten kinasa transmenbrana
(Leroux et al, 1987) y se localizan en la membrana de Agrobacterium (Winans et al,
1989).

La induccin de los genes vir de Agrobacterium implica que el sistema de

reconocimiento de la bacteria detecte los compuestos fenlicos producidos por la planta
y transmita la informacin al interior de la clula bacteiana. Este proceso es mediado
por el producto de los genes vir A y vir G. El dominio periplsmico de la protena Vir A
detecta el pH externo y la presencia de inductores aunque no tiene que unirse
necesariamente a los mismos (Lee et al, 1992). Los inductores como la glucosa o la
acetosiringona son reconocidos por Vir A. En el caso de la induccin por azcares, es
necesario el producto del gen chv E, localizado en el cromosoma bacteriano, y que
codifica por una protena de unin periplsmica. La seal percibida por Vir A provoca
su autofosforilacin en un residuo de histidina especfico y esta es transmitida
posteriormente a Vir G por la fosforilacin del cido asprtico 52 del dominio receptor
de este (Jin et al, 1990). La unin de la protena citoplasmtica Vir G a las llamadas
cajas vir en las regiones promotoras de los operones vir provoca la activacin de la
trascripcin de forma eventual (Steck et al, 1988; Jin et al 1990; Powel y Kado, 1990;
Heido et al, 1994; Scheeren-Groot et al, 1994).
 Figura : Activacin de los genes vir.

Han sido identificados muchos de los loci cromosmicos que afectan a la expresin
de los genes vir. Mutaciones en ChvD, ros, miaA, ivr, chvG y chvI son algunos
ejemplos y su influencia en dicha expresin no est todava bien caracterizada, de
cualquier forma, la influencia cromosmica en la expresin y regulacin de los genes
vir y por tanto en la virulencia est mas que demostrada.

Una vez se ha producido el reconocimiento y la unin a la clula vegetal

susceptible, el siguiente paso en la tranformacin es la produccin de un T-DNA
intermediario denominado T-strand. La bacteria produce una copia lineal de cadena
sencilla a partir del T-DNA (Stachel et al, 1986). Juntos VirD1 y VirD2 reconocen las
repeticiones directas de los bordes del T-DNA y producen dos cortes entre el tercer y
cuarto nucletido final de cada secuencia repetitiva de los bordes (Yanofsky et al, 1986;
Wang et al, 1987; Pansegrau et al, 1993; Jasper et al, 1994; Scheiffele et al, 1995).
Estos dos cortes marcan los sitios de inicio y terminacin de la formacin de la T-
strand.

VirD1 acta como una topoisomerasa relajando la doble hlice (Ghai y Das, 1989)
aunque esto no pudo ser confirmado utilizando VirD1 purificado (Scheiffele et al,
1995). Tras el corte VirD2 permanece covalentemente unida al extremo 5 final de la T-
strand (Herrera-Estrella et al 1988; Young y Nester, 1988; Ward y Barnes, 1988)
mediante el residuo de tirosina nmero 29, de esta forma protege a la T-strand de la
accin de exonucleasas (Drremberg et al, 1989), a esta proteccin se suma la
proporcionada por VierE2 que tambin se une, pero a lo largo de toda la T-strand.

VirD2 acta como protena piloto impidiendo la deleccin de este extremo que es
imprescindible para la transferencia ya que su deleccin abole la transferencia mientras
que si se delecciona el borde izquierdo solo disminuye la eficacia del proceso (Joos et
al, 1983; Herman et al, 1990). Esta polaridad observada est en total concordancia con
el modo en el que se genera la T-strand, ya que su sntesis no puede iniciarse sin el
borde derecho mientras que la terminacin puede tener lugar sin el izquierdo aunque la
frecuencia sea baja.

Las protenas VirC estn implicadas en la formacin del complejo de borde, al

menos en el caso de los plsmidos Ti para la octopina (Toro et al, 1989). VirC1 se une a
la secuencia OD presente en el borde derecho, y dirige el corte realizado por VirD2 en
dicho borde (Toro et al, 1988), sin embargo, el modo en que VirC1 media la
interaccin entre VirD2 y OD es desconocido.

Aunque todo el DNA localizado entre los bordes derecho e izquierdo es transferido
la planta, en ocasiones, tambin se transfieren secuencias que no estn entre los mismos
(Joos et al, 1983; Herman et al, 1990; Martineau et al, 1994; Denis et al, 1995; Cluster
et al, 1995) seguramente debido a que el borde izquierdo no es procesado (Ramanathan
y Veluthamby, 1995). En el 20-25% de las lneas transgnicas se detectan secuencias
que no pertenecen al T-DNA y que se localizan corriente abajo del borde izquierdo
(Martineau et al, 1994). Incluso se ha demostrado que secuencias cromosmicas pueden
ser transferidas a la planta, aunque, con una frecuencia de 10-4 (Herman et al, 1994).

Una vez producida la T-strand, es necesario que esta sea transportada a travs de la
membrana bacteriana, diversos estudios demuestran que los productos del opern vir B
estn implicados en este proceso (Tompson et al, 1988; Ward et al, 1988; Shirasu et al,
1990). De hecho la mayora de los 11 ORFs codificados por este opern codifican
protenas que renen las caractersticas esenciales de un sistema de transporte a travs
de membrana.

Recientemente se ha observado que tras la induccin de los genes vir Agrobacterim

forma un pili, en ausencia del mismo no se produce la transferencia del T-DNA (Fullner
et al, 1996). Por tanto dicha transferencia se produce por un proceso de conjugacin en
el que estn implicados estos polipptidos cuya funcin concreta se trata de dilucidar en
estos momentos.

Bordes derecho e izquierdo

Una vez trasladado el T-DNA a la planta este debe insertarse en el genoma y para
ello son necesarias las unidades de repeticin de 25pb presentes en el borde derecho:

Derecho: 5-TGNCAGGATATATNNNNNNGTNANN 3
Izquierdo: 5-TGGAGGATATATNNNNNTGTAAANN 3

Durante la insercin del T-DNA en el DNA cromosmico de la planta, ste a

menudo experimente cortas delecciones debido al proceso de empalme entre ambos
DNAs. La insercin del T-DNA es aleatoria mientras que los bordes presentan cierta
homologa con aquellos lugares del DNA de la planta en los que se insertan.

Tras la insercin se produce la activacin de numerosos genes como los onc y op

que ya hemos descrito.
 2.1.2- Ingeniera gentica de plantas usando T-DNA

El uso de T-DNA en la ingeniera gentica de plantas se basa en cuatro grandes

descubrimientos y en el desarrollo de nuevas tcnicas. El primero fue la localizacin y
deleccin de los genes que gobernaban la formacin del tumor (ipt, iaaM e iaaH). El
segundo el desarrollo de marcadores tiles para detectar aquellas clulas vegetales que
haban sido transformadas por Agrobacterium. El tercero el desarrollo de vectores y
procedimientos genticos que permitan introducir genes forneos en el T- DNA y el
cuarto el desarrollo de varios sistemas de cultivo de tejidos que permitieron la infeccin
eficiente y la regeneracin de plantas transgnicas completas a partir de clulas
vegetales transformadas con el inserto de inters.

El proceso bsico de transformacin vegetal utilizando A. tumefaciens aparece

recogido en la figura adjunta:

Figura : Transformacin mediante Agrobacterium tumefaciens.

 Limitaciones de los plsmidos Ti

Los genes T-DNA aunque se localizan en un plsmido bacteriano, y tienen un

origen claramente procaritico, estn flanqueados por seales 5 y 3 que permiten su
expresin y funcionamiento en clulas vegetales (Gheisen et al, 1985).

El desarrollo de los vectores de transformacin vegetal se basa en la idea de que,

excepto las secuencias de los bordes, ningn otro gen del T-DNA es necesario para la
transformacin y la integracin en la clula vegetal. Por lo que pueden ser sustituidos
por un DNA exgeno, ya que cualquier DNA comprendido entre dichos bordes ser
transferido al genoma de la planta.

Pero estos los plsmidos Ti presentan ciertos inconvenientes, que como ya

mencionamos, tuvieron que ir siendo solventados poco a poco.

- Los genes onc tienen que ser eliminados, as las clulas vegetales transformadas no
proliferan en un tejido tumoral y pueden regenerar plantas normales. Pero esto acarrea
un inconveniente y es que al no formarse los tumores, las clulas transformadas son
fenotpicamente indistinguibles de las clulas normales, por ello deben usarse
marcadores que permitan seleccionar las clulas transformadas.

- Tambin deben eliminarse los genes que codifican las opinas, ya que la planta
desva parte de sus recursos para sintetizar estos compuestos y la produccin final
obtenida es menor.
- Los plsmidos Ti son largos para lo experimentos de de recombinacin de
DNA (200,800kb), luego los segmentos de DNA que no son necesarios para el clonage
se eliminan.

La eliminacin de estos segmentos de DNA es lo que se conoce con el nombre de

desarme del plsmido Ti.

SISTEMAS DE VECTORES DERIVADOS DEL PLSMIDO TI

Una vez superados los contratiempos sealados en el punto anterior, a tecnologa

del DNA recombinante se dedic a disear vectores basados en plsmido Ti natural.
Estos vectores, tienen una organizacin similar y constan de los siguientes
componentes:

- Un gen marcador seleccionable, como la neomicina fosfotransferasa que confiere

resistencia a la kanamicina a las clulas vegetales transformadas. La mayora de los
genes marcadores utilizados son de origen procaritico, por lo que deben ponerse bajo
el control de la planta, por ello se hace necesario aadir un promotor y una secuencia
de terminacin de poliadenilacin, que regulen y permitan la transcripcin de estos
genes en la planta bajo las seales adecuadas. (Normalmente, adems de un gen marcador
para seleccionar las clulas vegetales transformadas, se emplea un segundo marcador que puede
 consistir en un gen seleccionable o mas comnmente en un gen para la sntesis de opinas como la
nopalina. Este segundo marcador va a permitir que sean detectadas aquellas clulas transformadas que
escaparon del rgimen de seleccin inicial)

- Un origen de replicacin que le permita al plsmido replicarse en E.coli. En

algunos vectores tambin se ha aadido un origen de replicacin que funcione en
A.tumefaciens.

- La secuencia del borde derecho del T-DNA como mnimo, aunque algunos
vectores tambin incluyen la izquierda.

- Un polylinker que facilite la insercin del gen clonado en la regin del T-DNA
entre los dos bordes.

- Lugares nicos de reconocimento para endonucleasas de restriccin, necesarios

para clonar el gen o fragmento de DNA de inters en el T-DNA.

- Un gen marcador bacteriano para seleccionar las clulas de E.coli y

Agrobacterium que han incorporado el vector.

- El gen/genes que queremos introducir en la planta deben ser tambin aadidos, al

igual que los promotores necesarios para su expresin en la planta.

La adicin de estos elementos es lo que se conoce con el nombre de armado del

nuevo plsmido.

Puesto que sin los genes vir estos vectores no pueden insertar por s mismos el T-
DNA en la clula vegetal, se han diseado dos tipos de sistemas de vectores derivados
del plsmido Ti, estos sistemas son los que se utilizan en la actualidad:

- Sistema de vector cointegrado ( sistema cis): se introducen nuevos genes en un

plsmido Ti no oncognico mediante recombinacin homloga (Zambriyski et al,
1983; Deblaere et al, 1985).

- Sistema de vector binario (sistema trans): los nuevos genes son clonados en un
plsmido que contiene T-DNA no oncognico, este plsmido es posteriormente
introducido en una variedad de Agrobacterium que posee un plsmido Ti con una
regin vir intacta pero que carece de T-DNA.

En cualquiera de los dos casos, el DNA de inters primero se clona en Echerichia

coli y posteriormente se transfiere a Agrobacterium por conjugacin (Van Haute et al,
1983) o electroporacin (Mersereau et al, 1990).

Sistemas de vector binario:

El vector binario lleva:

- Orgenes de replicacin tanto para E. coli como para A. tumefaciens, o en su

defecto un origen de replicacin de amplio rango.
 - Un gen marcador seleccionable tanto para E.coli como para A. tumefaciens. Tanto
el gen marcador como los genes que se desea sean expresados por la planta van
insertados entre los bordes derecho e izquierdo.

El vector binario no lleva:

- Los genes vir

Todos los pasos de clonaje se realizan en E. coli antes de que el vector sea
introducido en A. tumefaciens. A. tumefaciens presenta un plsmido Ti con el set
completo de genes vir pero no consta de T-DNA. As el plsmido Ti defectivo sintetiza
lo genes vir que permiten la transferencia del T-DNA del vector binario.
Se tratara de un vector binario que contiene el gen de inters y el gen
marcador seleccionable entre los bordes del T-DNA y un plsmido Ti llamado ayudante
que contiene los genes vir necesarios para que la transferencia al genoma vegetal tenga
lugar (de Framond et al, 1983; Hoeckema et al, 1983). Este es el sistema que mas se
utiliza actualmente.

Figura: Vector binario.

Sistemas de vector cointegrado:

El vector cointegrado lleva:

- EL origen de replicacin de E.coli y no puede existir autnomamente en el interior

de A.tumefaciens.

- Marcador seleccionable que puede ser utilizado tanto en E. coli como en A.

tumefaciens.

- Marcador seleccionable para las clulas vegetales transformadas.

- Los genes diana (a insertar en l genoma de la planta).

- El borde derecho del T-DNA.

 - Una secuencia de DNA que presenta homologa respecto a un segmento del
plsmido Ti desarmado.

El plsmido desarmado Ti lleva:

- El borde izquierdo del T-DNA

- El cluster de genes vir

- Un origen de replicacin para A. tumefaciens.

Figura : Vector cointegrado

Pero este plsmido Ti desarmado carece de: borde derecho del T-DNA y de los
genes onc. El vector cointegrado tiene que integrarse en este plsmido Ti desarmado
para formar un plsmido Ti recombinante.
 Tanto el plsmido Ti desarmado como el vector cointegrado llevan secuencias de
DNA homlogas que proporcionan un lugar para la recombinacin homloga in vivo,
normalmente esta secuencias se localizan dentro del T-DNA. Tras la recombinacin
homloga el vector cointegrado se integra en el plsmido Ti y este proporciona los
genes vir, necesarios para la trasferencia del T-DNA a un amplio rango de clulas
vegetales. La nica forma de que estos vectores sean mantenidos en A. tumefaciens es
como parte de una estructura cointegrada.

El problema a la hora de utilizar estos vectores es que su gran tamao (normalmente

mayor de 10 kb) dificulta su manipulacin in vitro. Adems los plsmidos tan grandes
tienden a tener menos sitios de restriccin nicos para el proceso de clonaje. Por ello se
suelen utilizar vectores binarios de pequeo tamao basados en la secuencia del vector
binario pBIN19. Este vector presenta la ventaja de que sigue siendo funcional aunque la
mayor parte de su DNA sea deleccionada. As se puede construir un vector que, en lugar
de las 11,8 kb que presenta el original, solamente tenga 3-5 kb. Este vector mini binario
se denomina pCB301 y se muestra en la figura adyacente.

Figura : Vector Pcb301. Abreviaturas: oriV , parte del origen de replicacin; npt, gen de la neomicina
fosfotransferasa; trfA, parte del origen de replicacin; RB, borde derecho del T-DNA; MCS, sitio de clonaje
mltiple; LB, Borde izquierdo del T-DNA; P35s, promotor constitutivo del virus del mosaico de la coliflor; TP,
secuencia de la protena diana; T35s, secuencia de terminacin de la transcripcin del gen 35s del virus del mosaico de
la coliflor; bar, gen de la fosfinotricina acetiltransferasa. (Xiang et al., 1999)

Dado que ciertas regiones necesarias para la conjugacin han sido deleccionadas,
este vector no puede ser transferido a A. tumefaciens por conjugacin por lo que tienen
que usarse mecanismos alternativos como la electroporacin, de la que hablaremos mas
tarde.

Ventajas que ofrecen los vectores derivados de pCB301:

- El gen bar, se localiza adyacente a una regin promotora y a una regin de

terminacin de la transcripin, codifica por el enzima fosfinotricn acetltransferasa que
es insertada en el sitio de clonacin mltiple. Las plantas transformadas lo expresan y
son fcilmente detectadas.

- Adyacente al gen bar pero en orientacin opuesta se localiza un casete que

incluye: un promotor 35S; una secuencia de DNA que codifica protenas que se expresa
tanto en mitocondrias como en cloroplastos; un elemento de unin transnacional que
incrementa el nivel de expresin de la protena codificada por el gen anterior; una
porcin del sitio de clonacin mltiple y una secuencia de terminacin de la
transcripcin.
 - Estos vectores derivados son flexibles, fciles de usar y contienen una
amplia gama de sitios de restriccin nicos.

2.2.- Agrobacterium rhizogenes

Existe otra familia de plsmidos de Agrobacterium que podra servir de vectores de
genes para la obtencin de plantas sanas, genticamente modificadas. Provocan una
proliferacin de las races denominada raz en cabellera, en la plantas infectadas por
A. rhizogenes y se llaman plsmidos Ri (de root inducing). Las races, como el tejido de
la agalla, crecen rpidamente en un cultivo libre de bacterias.

Jacques Temp y sus colegas del Instituto nacional Francs de Investigaciones

Agronmicas, demostraron que las clulas de las races contienen opinas y T-DNA. Al
igual que los plsmidos Ti del mutante races de la nopalina, los plsmidos Ri dan
origen a clulas vegetales transformadas que pueden regenerar plantas frtiles intactas y
sanas.

Estos plsmidos Ri parecen ser vectores desarmados sin violencia exterior y los
procedimientos para transformar plantas utilizndolos son bastante similares a los de A.
tumefaciens por lo que no nos extenderemos mas y daremos paso a otro tipo de tcnicas
que permiten la transferencia directa de DNA
 3.- VECTORES VIRALES:
Los vectores virales no han satisfecho las expectativas sobre su uso en Ingeniera
Gentica de plantas, pero s tienen el potencial de complementar las tecnologas
existentes de transferencia directa de genes y transformacin mediante Agrobacterium
de manera efectiva. Se pueden infectar de forma sistmica plantas completas e
investigar as la expresin gnica en los diferentes tejidos. La infeccin sistmica tiene
lugar de forma tpica en das o semanas, no en meses, y las partculas virales se
acumulan en altos niveles conduciendo a la amplificacin gnica y a la posibilidad de
expresin a gran escala. Sin embargo, los virus descubiertos hasta ahora no se integran
en el genoma husped, y la transmisin a travs de la lnea germinal no ha sido posible.
Tambin existen problemas con respecto a la existencia de un rango de hospedadores
limitado y problemas de empaquetamiento segn el tamao del inserto en vectores
virales.

Existen dos grupos diferenciados de virus vegetales, los virus DNA y los virus
RNA. En general, los virus de RNA tienen su ciclo en el citoplasma mientras que los
virus de DNA pueden tener su replicacin asociada al ncleo. De esta manera, los virus
de DNA presentan mecanismos de regulacin similares a los de la planta husped,
mientras que los virus de RNA tienen mecanismos de regulacin generalmente
diferentes. Los virus DNA constituyen slo el 1-2% de los virus vegetales que se
conocen (Lebeurier, 1986). Pueden subdividirse en dos grupos: los caulimovirus de
doble cadena y los geminivirus de cadena sencilla. Debido a que es ms fcil trabajar
con virus DNA, la mayor parte del trabajo en desarrollo de vectores virales se lleva a
cabo en estos virus.

1.- VIRUS DNA

Caulimovirus:

Figura : Visin al microscopio de partculas virales de caulimovirus infectando un tejido vegetal.

Existen al menos doce miembros de la Familia Caulimoviridae (Hull y Davies,

1983), y de ellos el mejor caracterizado es el virus del mosaico de la coliflor (CaMV).
 El CaMV posee un genoma con DNA de doble cadena de aproximadamente 8
kilobases, y con un rango limitado de hospedadores, en su mayora crucferas como la
coliflor y el nabo. Los fidos son los vectores de transmisin naturales; sin embargo,
tambin se puede producir infeccin mediante inoculacin mecnica y agroinfeccin
(uso de Agrobacterium como vector para facilitar la infeccin viral de plantas).

El DNA viral se transcribe en el ncleo de las clulas infectadas mediante la RNA

polimerasa II codificada por el genoma vegetal. Se producen dos transcritos
principalmente, un RNA 35s correspondiente al DNA viral completo con una repeticin
terminal de 180 pb, y un RNA mensajero subgenmico 19s que termina en el mismo
punto que el RNA 35s. Hay ocho pautas de lectura abierta potenciales (ORFs). El
transcrito 19s probablemente codifica el ORF IV, responsable del desarrollo de los
sntomas (Baughman et al., 1988). Se ha propuesto que los otros ORFs son traducidos
desde el transcrito 35s mediante un mecanismo (relay race) en el que los ribosomas
paran despus de pasar el codn de terminacin de un transcrito, y se reinician en el
siguiente codn de iniciacin del transcrito. Tambin se ha sugerido que los ORFs IV y
V podran expresarse como una larga protena precursora que sera posteriormente
modificada para producir dos protenas funcionales.

El virus se replica mediante el priming del transcrito 35s con un tRNA-met

codificado por el hospedador, seguida de la sntesis de la cadena menos (-) de DNA
catalizada por una reversotranscriptasa codificada por el virus.

El ORF II es un factor de transmisin por fidos (Daubert et al., 1983) y no es

esencial para la infectividad viral como un hecho natural. Gronenborn et al. (1981)
clonaron con xito DNA extrao en el ORF II y encontraron que mayor tamao de
DNA que se poda introducir de esta manera era de aproximadamente 250 pb. Brisson et
al. (1984) remplazaron ORF II con un pequeo (234 pb) de bacteriano que codifica para
la dihidrofolato reductasa (dhfr), el cual fue expresado y propagado de forma estable en
plantas de nabo. Este gen confiere resistencia al metotrexato, y las plantas de nabo que
fueron infectadas con CaMV que contena este gen dhfr resultaron resistentes a dicho
compuesto. Se encontr que cuando alguna de las construcciones tena una extensa
regin no codificante entre el final de ORF I y el principio de dhfr, entonces la
construccin era inestable para el trnsito a la planta y expresaba el gen en menor
medida. Esta sensibilidad al tamao de las secuencias intergnicas hallada en CaMV
muestra lo cuidados que hay que ser en el diseo de este tipo de vectores.

En el vector CaMV simple el tamao lmite de los insertos clonados es

probablemente de unas 800 pb (mediante deleccin y adicin). Se sugiri otra
aproximacin diferente, que es la construccin de mutantes complementarios, tales que
el vector mutante transporte el DNA extrao y slo unas pocas de las funciones de
CaMV, y el otro mutante porte todos los ORFs de CaMV (pero es deficiente en los
ORFs que portan el vector. Esta aproximacin ha sido testada (Choe et al., 1985); se
contruyeron pares de complementarios, mutantes no infectivos CaMV que se usaron en
una infeccin mixta. Se consigui una infeccin con xito, pero sucesos de
recombinacin eliminaron el DNA exgeno. La alta frecuencia de recombinacin de
CaMV se haba observado ya con anterioridad (Walden y Howell, 1982). Quizs, si los
mutantes defectivos complementarios pudiesen construirse sin homologa, o con muy
poca, esta aproximacin del diseo del vector resultara fructfera. Pazkowski et al.
(1986) intentaron tambin usar la complementacin como una ruta para la utilizacin de
CaMV como vector; remplazaron el ORF IV (traducido del transcrito 19s) con la regin
codificadora de NPTII. Desafortunadamente, este mutante no fue infectivo tanto por s
mismo como cuando era complementado por la cepa salvaje del virus. El gen NPTII se
expres a partir del promotor viral cuando el virus mutante fue transferido a los
protoplastos de nabo mediante transferencia directa de genes, pero no hubo escape del
virus, y las secuencias virales se asociaron slo con DNA genmico de alto peso
molecular.

Otra aproximacin a la complementacin en los vectores CaMV sera introducir un

genoma de un virus defectivo complementario dentro del genoma de la planta mediante
agroinfeccin (transformacin mediada por Agrobacterium). ste podra constituir un
sistema equivalente al sistema de clulas COS para la propagacin de vectores basados
en el virus SV40 defectivo de mamferos (Gluzman, 1981). La validez de este mtodo
en vectores basados en CaMV an empieza a investigarse. El trabajo de Pazkowski et
al. (1986) dio lugar a la demostracin de que los productos gnicos de los genomas de
CaMV mutantes clonados en plantas pueden ser expresados. Shewmaker et al. (1985)
clonaron una copia entera de CaMV en una gran variedad de especies vegetales, y
mostraron que tanto el transcrito 19s como el 35s son expresados (a distintos niveles
segn la especie). Adems, Walden ha conseguido plantas de tabaco (fuera del rango de
hospedadores normal de CaMV) que contienen dmeros de CaMV y muestra que el
homogenizado de la hoja de estas plantas es infeccioso cuando se inocula en nabo; pero
an no est claro si el virus se replica en el tabaco, o s la infeccin del nabo est
mediada por los transcritos 19s y 35s. Quizs el tabaco, que es ms susceptible a
transformacin gentica, pueda usarse como modelo para este sistema.

Recientemente nuevos estudios proponen el uso de estos virus como vectores. El

ms prometedor, desarrollado por Hull et al. (2005) propone un sistema de activacin de
transgn mediada por el virus CaMV. A pesar de ello, el sistema de transformacin
vegetal mediada por caulimovirus sigue, hoy en da, sin constituir un sistema eficaz y
con aplicabilidad en este terreno

Geminivirus:

Figura : Visin al microscopio de partculas virales de geminivirus infectando un tejido vegetal.

 Los geminivirus (revisado por Davies et al., 1987; Harrison, 1985; Stanley, 1985)
son virus DNA de cadena sencilla que se replican en el ncleo de las clulas mediante
un DNA intermediario de doble cadena. Copias clonadas de varios miembros de los
gemini virus son transmisibles a un amplio rango de hospedadores, que incluyen tanto a
monocotiledneas como a dicotiledneas (Harrison, 1985).

En la literatura se presentan evidencias de algunas enfermedades causadas por

geminivirus desde hace varios siglos. Estas enfermedades se caracterizan por presentar
sntomas como enrollamiento de la hoja, rugosidad, mosaicos amarillos, enanismo de la
planta, clorosis y generalmente una disminucin en el rendimiento. Sin embargo, fue en
la dcada de los aos 1970 cuando se determin que el agente causal de una enfermedad
que produca un mosaico dorado en yuca era un virus con caractersticas nicas que
incluan una morfologa geminada (dos icosahedros unidos por un lado) y un genoma
circular de DNA de cadena sencilla. A partir de entonces, el nmero de geminivirus
registrados ha ido creciendo aceleradamente hasta llegar a ser una de las familias ms
numerosas. Los geminivirus son una familia de virus patgenos de plantas que son
transmitidos por insectos vectores a una gran variedad de plantas monocotiledneas y
dicotiledneas. La distribucin geogrfica del insecto vector es la responsable de la
distribucin paralela del geminivirus que transmite. La familia Geminiviridae se divide
en tres gneros segn su espectro de huspedes (si infectan mono o dicotiledneas), a su
insecto vector (mosca blanca o chicharrita), y a su estructura genmica (mono o
bipartita). Aquellos virus transmitidos por la chicharrita tienen, por lo general, genomas
monopartitos, mientras que los transmitidos por la mosca blanca tienen genomas
bipartitos. Los miembros de esta clase han sido recientemente propuestos como vectores
vegetales.

Adems del inters que los geminivirus despertaron como agentes causales de
muchas enfermedades de importancia econmica, el hecho de tener un genoma de
DNA atrajo la atencin de muchos grupos que se dedicaron a explorar la posibilidad de
usar los geminivirus como vectores para la introduccin de material gentico en plantas.
Una segunda razn poderosa era la perspectiva de usar los geminivirus como modelos
de estudio de manera similar a los trabajos realizados con bacterifagos a mediados del
siglo pasado o un poco ms tarde con algunos virus de DNA (SV40, adenovirus) en
sistemas animales. La posibilidad de usar los geminivirus como vectores para introducir
DNA forneo en plantas ha ido perdiendo inters al verificarse que estos virus presentan
restriccin al aumento de tamao de su genoma, es decir, cuando se les introducen
genes forneos que aumentan el tamao del genoma los virus quimricos tienden a
eliminar ese DNA en un intento de recuperar su tamao original. Por otro lado, los
geminivirus s estn respondiendo a las expectativas de ser usados como modelos para
estudiar algunos procesos moleculares en plantas.

El genoma del virus latente de la yuca (Cassava Latent Virus CLV) consiste en
dos componentes denominados DNA 1 y DNA 2. El DNA 1 codifica funciones
esenciales para la replicacin, pero no para la infeccin sistmica o la transmisin clula
a clula (Townsend et al. 1986); tambin se ha descubierto que este DNA 1 codifica una
protena de la cubierta que no es esencial para la infectividad (Stanley y Townsand,
1986). Ward et al. (1988) mostraron que, aunque la deleccin del gen que codifica para
la protena de la cubierta suprime la infectividad mediante inoculacin manual con
molculas lineales de DNA 1 y DNA 2, los mutantes en los que se remplaza por
secuencias de tamao similar son totalmente infecciosos. Cuando el gen de esta protena
se sustituye por el gen CAT bacteriano y el DNA 1 diseado se inocula en Nicotiana
benthamiana junto con el tipo salvaje de DNA 2, las plantas desarrollan sntomas
normales de infeccin, y CAT se expresa sistemticamente en altos niveles (80
unidades/mg de protena soluble) 10 das despus de la inoculacin. Los mutantes
defectivos de complementacin de CLV sufren frecuentemente recombinacin para
originar el virus de tipo salvaje (Ward et al., 1988). Sin embargo, no se observ
inestabilidad en la expresin vrica del den CAT, presumiblemente porque no exista
una presin selectiva para la deleccin del gen.

Hayes et al. (1988) realizaron un trabajo similar con el virus del mosaico dorado
del tomate (TGMV). El TGMV tiene un genoma bipartito de dos molculas circulares
de DNA de cadena sencilla, aproximadamente de 2,5 kb (DNA A y DNA B). La nica
homologa entre las dos cadenas es la llamada regin comn de unas 200 pb. Hayes et
al. (1988) encontraron que, cuando las plantas de tabaco de tipo salvaje son
agroinfectadas con bacterias que contienen (dentro del mismo T-DNA) o dmeros de
DNA A y DNA B, o un dmero parcial de A y un dmero de B, o un dmero de B y un
dmero parcial de A con ausencia de una parte del gen que codifica la protena de la
cubierta, la infeccin sistmica se consigue fcilmente. La infeccin sistmica se
consigue tambin cuando las plantas son agroinfectadas con una mezcla con una cepa
que contiene un dmero de A y otra cepa que contiene un dmero de B. Se ha sugerido
que la partcula A puede codifica las funciones necesarias para la replicacin, y que la
partcula B codifica las funciones relacionados con la transmisin clula a clula y el
desarrollo de los sntomas.

Hayes et al. (1988) construyeron vectores en los cuales la regin que codifica NPTII
sustituye a la regin que codifica la protena de la cubierta, y realizaron a partir de aqu
sistemas de agroinfeccin en plantas de tabaco. Estos vectores contenan o 1,6 copias
repetidas en tndem de la regin que codifica NPTII del DNA A del TGMV
(pBIN19A1.6 neo), o lo mismo ms dos copias de del DNA B de TGMV (pBIN19A1.6
neoB2) entre los bordes del T-DNA de Agrobacterium. Las plantas de tabaco de tipo
salvaje fueron agroinfectadas con pBIN19A1.6 neoB2, y las plantas transgnicas B2
(que contenan el DNA B de TGMV integrado en el genoma) fueron agroinfectadas con
pBIN19A1.6 neo. Cuatro de las 20 plantas del primer tipo, y 18 de las 20 del segundo
fueron infectadas sistemticamente tal y como se determin mediante un anlisis dot
blot de DNA usando sondas especficas para DNA A y DNA B de TGMV. Ningunas de
las plantas neo-infectadas mostraron sntomas. Las infecciones fueron confirmadas
mediante Southern Blot; se encontraron formas del DNA viral superenrrolladas y en
crculo abierto del tamao esperado. Cuando se usaron plantas del tipo salvaje sin neo
pBIN19A1.6B2 para infectar plantas de tabaco, la infeccin fue ms eficiente.

Tambin se construyeron plantas que contenan A1.6neo integrado en su

cromosoma. Mediante Southern blot reencontr en el DNA de la planta las formas
mononmricas del DNA A neo de TGMV (con la regin codificante de NPTII en lugar
del gen de la protena de la cubierta. El tamao del NTPII expresado en el DNA A de
TGMV es de 2708 pb, en comparacin con el DNA A de la cepa salvaje, que es de 2588
pb. El tamao lmite de este vector ha sido ampliado mediante la introduccin de la
regin codificante para la glucuronidasa (GUS) en el sitio de NPTII; es un aumento de
600 pb.
 Existen varias diferencias interesantes entre el trabajo con CMV y con TGMV. La
prdida de infectividad observado en los mutantes CLV por deleccin de gen para la
protena de cubierta no se ha observado en los mutantes TGMV por deleccin del gen
para la protena de cubierta, lo cual sugiere que quizs el tamao obligado en CMV es
ms reducido en CMV que en TGMV. Adems, la construccin de TGMV produjo
plantas asintomticas, a diferencia de CMV. Debido a que el gen marcador, el
hospedador y el mtodo de infeccin difieren en los dos experimentos, no est claro si
las diferencias observadas fueron debidas a los virus o a la forma en que los
experimentos fueron llevados a cabo.

Los vectores basados en geminivirus parecen constituir una enorme promesa en

cuanto a aplicabilidad. Pueden proporcionar mecanismos eficientes de amplificacin
gnica en plantas, tanto por infeccin sistmica de plantas con el vector proporcionando
un rpido ensayo de expresin gnica, o por producir plantas transgnicas para un
dmero parcial del vector proporcionando amplificacin gnica heredable. An no se ha
determinado el lmite en cuanto al tamao del DNA forneo que se puede replicar por
un vector de este tipo, pero no est limitado por restricciones en cuanto a
encapsulamiento, como en el caso de los caulimovirus. Adems, el rango de
hospedadores de los geminivirus es muy elevado.

2.- VIRUS RNA

La utilidad potencial de los virus RNA es an incierta. No existen ensayos de
infecciones directas de las formas cDNA de los virus RNA. As, la infeccin mediante
transcritos RNA sintetizados in vitro es la nica ruta obvia de disear virus de RNA
(Fraley et al., 1986). Tambin se ha sugerido que la elevada tasa de error durante la
sntesis viral de RNA causara inestabilidad en genes forneos (van Vloten-Doting et
al., 1985). No existe presin selectiva a la hora de corregir errores producidos en estos
genes forneos, en contraste con las mutaciones producidas en los genes virales
endgenos, aunque es una cuestin bastante discutida.

Existen un par de investigaciones sobre genes forneos expresados en vectores

virales de RNA. French et al., 1986 inform de la expresin del gen bacteriano CAT
mediado por transcritos de RNA de una protena de fusin de la cubierta del virus del
mosaico de bromo en protoplastos de cebada. Como se usaron protoplastos, es difcil
comparar los resultados con otros obtenidos con diferentes vectores de origen viral.
Takamatsu et al. (1987) tambin realizaron experimentos similares con el virus del
mosaico del tabaco, pero los resultados fueron poco consistentes

Todos estos resultados sugieren que la utilizacin de virus RNA como vectores para
la transformacin de plantas es poco factible en este momento.
 4.- VECTORES TRANSPOSONES:
Los transposones son fragmentos de DNA que pueden realizar saltos de una zona
del DNA a otra in vivo. Un buen ejemplo lo constituye el elemento Ac (McClintock,
1951), que crea una duplicacin de 8 pb en el sitio de integracin y puede escindirse a s
mismo de forma precisa de una parte del genoma e integrarse en otra, en una posicin
distal. Este descubrimiento condujo a la posibilidad del uso de los transposones como
vectores de transferencia gnica.

El elemento Ac del maz se transfiri a plantas de tabaco por medio de una

transformacin mediada por Agrobacterium. En dichas plantas se observ su escisin y
reintegracin en cualquier sitio tal y como ocurre en el hospedador natural (maz),
(Baker et al., 1986).

Se han clonado varios genes de plantas usando transposones. Un gen mutado

portando un inserto transposn se aisla primero usando un transposn previamente
clonado como sonda para encontrar el elemento y el DNA flanqueante; el DNA
flanqueante se usa posteriormente como sonda para aislar el gen desde la lnea salvaje.
A pesar de ello, su aplicabilidad como vectores no est del todo definida.
 5.- TCNICAS DE TRANSFERENCIA
GNICA DIRECTA
Adems de las tcnicas de transferencia gnica basadas en el uso de Agrobacterium,
existen otro tipo de tcnicas basadas en la utilizacin de tratamientos qumicos, fsicos y
elctricos para introducir DNA en las clulas. Estas tcnicas son denominadas
comnmente como tcnicas de transferencia gnica directa (DGT).

Aunque la transferencia gnica mediada por Agrobacterium resulta efectiva en

varias especies, las plantas monocotiledneas, incluidos los principales cereales (arroz,
maz y trigo) no son transformadas fcilmente por Agrobacterium tumefaciens. Estas
dificultades en la transformacin de determinadas especies vegetales crean la necesidad
de desarrollar otros procedimientos alternativos para la transferencia gnica. Comienza
as el desarrollo de las tcnicas de transferencia gnica directa.

5.1.- TRANSFETERENCIA DE DNA A PROTOPLASTOS

La incorporacin y expresin de DNA mediante protoplastos fue el primer mtodo
de transferencia gnica que se demostr que funcionaba en plantas. La tcnica se basa
en el principio de que la pared celular es la principal barrera para la captacin de DNA,
as que esta puede ser temporalmente extrada; posteriormente distintos mtodos
simples pueden ser utilizados para la transferencia gnica.

Los protoplastos tiene un gran inters en lo que se refiere al proceso de extraccin

de la pared celular (mediante enzimas de restriccin), pues este va a aislar las clulas de
una en una a partir del tejido utilizado, por lo que las clulas diana para la transferencia
es una gran poblacin de unidades individuales.

Para la transformacin, las clulas son obtenidos a partir de distintos tejidos, que
van a depender de la planta utilizada y del objetivo del estudio. Para los anlisis de
expresin transitoria, no se necesitan clulas en divisin, solo se necesitan clulas
capaces de sobrevivir 24-72 horas tras el tratamiento, por lo que los protoplastos pueden
ser aislados a partir de casi cualquier tipo de tejido. Para la transformacin estable se
necesitan clulas en divisin, por lo que el nmero de tejidos que van a servir como
fuente de protoplastos es ms restringido.

La subsiguiente captacin de DNA a los protoplastos aislados puede ser efectiva

mediante distintos mtodos fsicos y qumicos que van a crear poros en la membrana o
bien mediante mecanismos de endocitosis que van a permitir el paso de molculas
externas a travs de la membrana. El mtodo qumico ms efectivo es el mtodo que usa
polietilen glicol (PEG) en combinacin con cationes divalentes (Ca++ o Mg++). El
mecanismo de la captacin de DNA inducido por el PEG no est completamente
entendido, pero implica la contraccin del volumen del protoplasto debido a la alta
presin osmtica originada por el PEG, seguido de la creacin de vesculas endocticas
que incorporan el complejo catin/DNA. Muchos factores van a influir en la eficacia del
proceso de transformacin, principalmente la concentracin de PEG, el pH del tampn
de transformacin y la cantidad de cationes divalentes. Los protoplastos de distintas
especies muestran distinta sensibilidad al estrs producido por el tratamiento de
transformacin con PEG y en todos los casos un porcentaje de la poblacin de
protoplastos es daada. Con la optimizacin del procedimiento se pueden llegar a
alcanzar frecuencias de transformacin estable del 1-5% (Spangenberg & Potrykus,
1995).

La mayor alternativa al tratamiento con PEG para la transformacin de protoplastos

es la electroporacin. En este mtodo los protoplastos son suspendidos en un tampn
con gran conductividad que contiene el DNA. Se aplican pulsos cortos de alto voltaje
que pasa a travs de la solucin, causando la aparicin de poros de forma reversible en
la membrana, que van a permitir la entrada de molculas externas. Se han hecho una
gran cantidad de trabajos con el fin de optimizar esta tcnica. Se utilizan pulsos de bajo
voltaje (300-500 V/cm) durante largos periodos de tiempo (30-100 ms) o voltajes altos
(1000-10000 V/cm) con pulsos cortos. Los efectos de los parmetros elctricos son
obviamente modificados por la conductividad del tampn de electroporacin, y a
cualquier conductividad dada, la composicin inica va a influir tambin en la
captacin del DNA o en la supervivencia celular. Como es de esperar, las condiciones
optimas de transformacin varan segn la planta de la que es obtenido el protoplasto.
Uno de los principales factores es el tamao del protoplasto, pues a mayor tamao es
ms elevado es el campo elctrico necesario para la electroporacin.

Las principales ventajas del mtodo de transformacin de protoplastos son que en

los ensayos de expresin transitoria permiten la transformacin de un nmero muy
elevado de clulas individuales, facilitando los ensayos cuantitativos con buenos niveles
de replicacin. Este mtodo tambin permite la produccin de muchas lneas
independientes, la seleccin de microcayos derivados de protoplastos es eficiente y
mediante la inmovilizacin de los protoplastos en sustratos como agarosa o alginato se
pueden manipular con facilidad un gran nmero de cayos. Estos tributos permiten la
seleccin de eventos que ocurren a muy baja frecuencia como la recombinacin
homloga entre transgnes (Baur et al., 1990).

La principal limitacin del uso de estas tcnicas es que en muchas de las especies
vegetales en las que se aplican estas tcnicas de forma usual (i.e. aquellas especies
recalcitrantes a la transformacin mediante Agrobacterium) la generacin de las plantas
a partir de cultivos de protoplastos no es eficiente. Por esta razn, muchos laboratorios
han elegido el uso de bombardeo de partculas como mtodo alterativo para la
transferencia gnica, pues esta tcnica permite el uso de explantos multicelulares a
partir de los cuales es ms fcil de regenerar plantas.

5.2.- BOMBARDEO CON MICROPROYECTILES

El bombardeo con microproyectiles o biolstica, es el mtodo alternativo al
plsmido Ti ms importante para transferir DNA a plantas. La tcnica consiste en baar
partculas esfricas de oro o tungsteno (aproximadamente de 0,4-1,2 micrmetros de
dimetro, o del tamao de algunas clulas bacterianas) con DNA, el cual ha sido
precipitado con CaCl2, espermidina o polietilen glicol. Las partculas baadas con DNA
son aceleradas a altas velocidades (300-600 metros / segundo) con un equipo especial
llamado pistola de partculas (o pistola de genes). La versin original de esta pistola de
partculas utilizaba una pequea cantidad de plvora para acelerar las micropartculas.
Actualmente se usa helio a altas presiones como fuente para la propulsin. Los
proyectiles acelerados van a penetrar la pared celular y la membrana de la clula,
aunque la densidad de partculas utilizadas no va a resultar significativamente daina
para la misma. El alcance de la penetracin de las partculas en las clulas vegetales
puede ser controlada variando la intensidad del estallido, alterando la distancia que las
partculas han de atravesar para alcanzar la clula o utilizando partculas de diferentes
tamaos.

Una vez dentro de la clula, el DNA se separa de las partculas y, en algunos casos,
es integrado dentro del genoma de las plantas. El bombardeo con microproyectiles es
utilizado para transferir DNA exgeno a suspensiones celulares de plantas, a cultivos de
callos, a tejidos meristemticos, a embriones inmaduros y a polen, todos ellos obtenidos
a partir de un amplio rango de plantas diferentes, incluidas monocotiledneas y
confieras, plantas menos susceptibles de la infeccin por Agrobacterium. Adems, este
mtodo a sido utilizado para transferir DNA a cloroplastos y mitocondrias.

De forma convencional, los plsmidos de DNA disueltos en tampn son

precipitados sobre la superficie de los microporoyectiles. Este procedimiento tiene
como objetivo aumentar la frecuencia de clulas transformadas al aumentar la cantidad
de plsmido de DNA; no obstante, una elevada cantidad de plsmido puede resultar
inhibitoria. Se estima que aproximadamente 10,000 clulas son transformadas con cada

bombardeo. Con esta tcnica, las clulas transformada, que son detectadas por la
expresin de unge marcador, a veces solo expresan el DNA transferido de forma
transitoria.

La configuracin de los vectores que son utilizados en biolstica para introducir

genes forneos a plantas influye tanto en la integracin como en la expresin de dichos
genes. De este modo, la transformacin resulta ms eficaz cuando se usa DNA linear en
vez de circular. Adems, los plsmidos de tamaos superiores a 10 Kb, a diferencia de
los pequeos, pueden ser fragmentados durante el bombardeo con microproyectiles,
produciendo una tasa menor de clulas transformadas. Aun as, si el fragmento de DNA
que se va a incorporar en el genoma de la planta es de gran tamao, este va a ser
introducido utilizando cromosomas artificiales de levadura (YACs), queque estn
diseados para contener marcadors de seleccin de la planta, as como marcadores de
seleccin de levaduras. Como un sistema para verificar si la transformacin de las
clulas vegetales a tenido lugar, distintas cantidades de DNA obtenidas de Cochliobolus
heterostrophus son clonadas en el vector, de modo que la talla del YAC ser de 80 a
550 kb. Posteriormente, el vector con el DNA del hongo ser transferido a las clulas
vegetales. Aquellas clulas transformadas resistentes al antibitico kinamicina sern
aisladas. Se confirmar posteriormente la presencia en estas clulas del segundo gen
marcador, el cual va a conferir resistencia al antibitico higromicina, y que se encuentra
localizado en el otro brazo del vector YAC. La presencia de ambos genes marcadores en
las clulas transformadas indican que el vector completo, as como el DNA forneo
presente en el mismo, ha sido transferido de forma eficaz.
El mtodo de bombardeo de micropartculas es una de las tcnicas de transferencia
gnica ms importante, ya que por su naturaleza totalmente fsica, es independiente del
tipo de clula blanco y ha sido utilizado no slo para introducir ADN exgeno a clulas
vegetales, sino a clulas de una gran variedad de organismos tales como bacterias, algas,
hongos, clulas animales, y an animales y plantas intactas.
La biobalstica ha sido utilizada con xito para producir plantas transgnicas a partir
de una gran variedad de tejidos vegetales, entre los que se incluyen hojas, meristemos,
embriones en desarrollo, embriones maduros, callos embriognicos, suspensiones
celulares, etc. Los principales logros en la obtencin de plantas transgnicas por medio
de este mtodo, incluyen especies de gran inters econmico como son la soja, el maz,
el arroz, el sorgo, la papaya, la caa de azcar, el trigo y el esprrago. Tambin se ha
utilizado para transformar microorganismos como levaduras, el moho Aspergillus y el
alga Chlamydomonas.
Esta metodologa de transformacin tiene ciertas limitaciones. Algunos tejidos
oponen una resistencia natural a la penetracin de las partculas, dada por cutculas
endurecidas, paredes celulares lignificadas o superficies vellosas. Sin embargo, los
principales limitantes del mtodo continan siendo la baja relacin entre el total de
clulas sometidas al bombardeo y el nmero de clulas que logran incorporar de manera
permanente la informacin gentica transferida.

5.3.- MICROINYECCIN
La transformacin estable va inyeccin de DNA en el ncleo celular (Jaenisch &
Mintz, 1974) es una tcnica que ha sido aplicada en clulas animales desde hace ya
veinte aos, convirtindose en el mtodo de transferencia gnica ms utilizado, sobre
todo en mamferos. La microinyeccin ofrece la ventaja de que es uno de los dos
mtodos, junto con la transformacin mediada por lser, que permite la transferencia
gnica a una clula concreta. La clula continuars su desarrollo y es transgn
expresado lo har tambin en su progenie. Esto constituye una poderosa herramienta
para analizar la expresin gnica diferencial en distintos tipos celulares y para el
marcaje de clulas en el estudio de morfognesis vegetal.

En plantas la aplicacin de la microinyeccin resulta ms dificultosa que en

animales y , aunque se han hecho importantes avances en la aplicacin de esta tcnica
en clulas vegetales, su uso continua resultando muy complicado. La principal
dificultad que se encuentran en plantas es la presencia de pared celular, la cual no es
solo una barrera fsica que hace necesario el uso de capilares mucho ms gruesos para
llevar a cabo la microinyeccin, sino que tambin dificulta mucho la visualizacin del
ncleo, lo que hace que la microinyeccin tenga lugar muchas veces en el citoplasma.
Otro problema es la presencia de grandes vacuolas en las algunas clulas vegetales, pues
si el DNA es transportado a su interior, este ser degradado antes de alcanzar el ncleo.

En los primeros estudios, la dificultad de atravesar la pared celular para llevar a los
investigadores a utilizar sistemas de protoplastos. A mediados de los aos ochenta, se
consigui llevar a cabo la transformacin de tabaco y alfalfa va microinyeccin de
protoplasto con el plsmido de DNA de Agrobacterium (Cossway et al., 1986; Reich et
al., 1996). Un ao despus, consigui llevarse acabo de forma exitosa la microinyeccin
de cromosomas aislados (Griesbach et al., 1987; de Laat and Plaas, 1987).
 Aunque en principio la transformacin de clulas mediante microinyeccin ocurre
solo de manera transitoria, al menos en clula tisulares, se a observado que las clulas
de la lnea germinal transformadas son capaces de generar plantas (Simmond et al.,
1992) y la inyeccin en polen funciona en la fertilicin in vitro (Kranz & Loerz, 1990).

A pesar de que la microinyeccin es una de las tcnicas de transferencia gnica ms

precisa, pues permite introducir el DNA en compartimentos intracelulares especficos,
las dificultades de su aplicacin hacen que hoy en da, no se plantea la aplicacin de la
microinyeccin como una tcnica de transformacin rutinaria, aunque si puede
utilizarse para la introduccin de DNA en determinadas clulas.

5.4.- MACROINYECCIN
La trasformacin mediante la inyeccin de DNA en el interior de cavidades que
contienen meristemos u rganos sexuales de la planta parece ser un paso obvio para la
introduccin de DNA en la planta. Esta tcnica ofrece la oportunidad de un mayor y
ms ntimo contacto entre el DNA y la lnea germinal.

La metodologa de esta tcnica es sencilla: la solucin que contiene el plsmido de

DNA ser inyectado en la cavidad que rodea la inflorescencia en desarrollo. El
inconveniente es que ser necesario utilizar una gran cantidad de plsmido. La potencial
ventaja de esta tcnica es por tanto su simplicidad, ya que puede ser utilizada en todas
las plantas sin necesidad de la preparacin de cultivos tisulares.

En los primeros estudios llevados a cabo, se utiliz DNA genmico de plantas que
contena genes cuyo efecto poda ser valorado morfolgicamente. Algunos estudios
afirmaron la transformacin, mientras otros dieron resultados negativos, como
consecuencia de la difcil interpretacin de los resultados a causa de las
contaminaciones que pueden ocurrir cuando se utilizan genes marcadores naturales de la
planta.

El inters en esta tcnica aument en 1987 cuando se consigui la transformacin

del centeno mediante la inyeccin de DNA en el floral tiller (de la Pena et al., 1987). En
este trabajo, se utiliz el gen de la neomicina fosfotransferasa como marcador y la
evidencia de la transformacin se basaba en la seleccin con kinamicina y el anlisis por
Southern, aunque la transmisin a la progenie no pudo ser confirmada.

Se realizaron tambin experimentos con cebada, en la que se consigui llevar a cabo

la transferencia del gen GUS (Rogers & Rogers, 1992), aunque no se encontraron
evidencias moleculares claras de la transformacin.

Aunque los distintos experimentos llevados a cabo sugieren que no se puede

descartar esta tcnica como un mtodo de transformacin funcional, lo cierto es que
actualmente no existen evidencias de que la macroinyeccin sea una tcnica
reproducible para la transformacin de plantas.
 5.5.- ELECTROPORACIN
El principio de esta tcnica de transformacin se basa en el conocimiento de que la
aplicacin en la membrana celular de pulsos elctricos cortos y de alto voltaje hace que
en esta aparezcan, de forma temporal, poros que van a permitir la entrada en el interior
de la clula de macromolculas presentes en la solucin extracelular (Neumann &
Rosenheck, 1972). Los poros van a crearse en el componente lipdico de la membrana,
por lo que tras el tratamiento, la membrana volver a su estado normal. Este proceso
permite a las clulas suspendidas en un tampn con plsmidos de DNA incorporar al
interior celular el ADN tras la electroporacin, resultando en una trasformacin
transitoria o estable. Inicialmente, la aplicacin de la electroporacin como mtodo de
transformacin fue desarrollado en bacterias, levaduras y sistemas animales.
Posteriormente se aplic a protoplastos de plantas como una alternativa a los procesos
de captacin de DNA exgeno inducidos qumicamente.

La electroporacin es un mtodo relativamente sencillo, aunque su aplicacin a

protoplastos es relativamente difcil, como consecuencia de las limitaciones tcnicas
que supone el cultivo y la regeneracin de protoplastos. No obstante, est tcnica
comenz a utilizarse ya a principios de los ochenta, asumiendo de forma general que la
pared celular no es permeable a macromolculas del tamao de los cidos nucleicos, por
lo que se requera un tratamiento con pectinasas.

Electroporacin de polen y microsporas:

El polen y las microsporas son clulas que en principio resultan adecuadas para la
electoporacin, pues son clulas sencillas, totipotentes por definicin. Tras la
electroporacin, existen dos mtodos para la obtencin de las plantas transgnicas: la
induccin de la andrognesis in vitro y la utilizacin del polen transgnico para la
fertilizacin normal de las plantas. En el caso de la induccin de la andrognesis in
vitro, se a conseguido llevar a cabo la integracin transitoria del transgn, pero de
momento no la integracin permanente del mismo. En el caso de la fertilizacin normal,
aunque se han conseguido la integracin del transgn, no se ha conseguido evidencias
de la transmisin de este a la progenie y la reproducibilidad del mtodo resulta
complicada.

Electroporacin de tejidos:

Estudios de expresin transitoria:

Tras los estudios iniciales que demostraron la viabilidad de la transferencia gnica

mediante electroporacin, Dereck et al (1990) aplicaron esta tcnica a tejidos obtenidos
a partir de las hojas de arroz, maz, trigo y cebada. El estudio demostr que era posible
la transferencia gnica a clulas intactas organizadas en tejidos. Estos estudios
suscitaron el inters en el potencial de la electroporacin para la transformacin de
especies de cultivo no susceptibles a la transformacin con Agrobacterium. Los
siguientes estudios demostraron la transformacin transitoria de distintos tejidos
obtenidos de diversas especies de cultivo (Xu et al., 1990; Akella et al., 1993; Dillen et
al., 1995).

Estos estudios demostraron tambin la permeabilidad de muchas paredes celulares al

DNA y otras macromolculas, en contra de lo asumido inicialmente, estableciendo la
electroporacin como una tcnica adecuada para la transferencia gnica.

Estudios de transformacin estable:

La obtencin de plantas transformadas de forma estable a partir de tejidos sometidos

a electroporacin se consigui por primera vez en arroz (Li et al., 1992), a partir de
semillas maduras pre-cultivadas. Poco despus se consigui en maz, aunque esta vez a
partir de embriones inmaduros. En cada caso, se aplicaron cultivos estndar y
procedimientos de seleccin mediante Kinamicina tras la trasferencia gnica. La
integracin fue adems confirmada por anlisis moleculares.

Posteriormente, se consiguieron plantas transgnicas de caa de azcar mediante la

electroporacin de meristemos basales (Arencibia et al., 1992) as como plantas de maz
transformadas a partir de suspensiones celulares (Laursen et al., 1994). Queda as
demostrado que la electroporacin es una tcnica vlida para la transformacin estable
de especies vegetales.

5.6.- ULTRASONIDOS
El tratamiento con ultrasonidos o sonicacin es un mtodo fsico para la
transferencia de plsmidos de DNA a protoplastos y clulas intactas. Esta tcnica se
basa en la aplicacin se ondas de ultrasonido que van a crear, en primer lugar, la
formacin de burbujas, con la consecuente generacin de elevada presin y temperatura.
En segundo lugar, los ultrasonidos van a provocar la generacin de corrientes alrededor
de las burbujas. La velocidad de estas corrientes estarn relacionadas con el efecto que
va a producir el tratamiento con ultrasonidos; de forma general, el tratamiento fuerte
con ultrasonidos se asocia con la inhibicin de la sntesis de polisacridos y protenas,
as como con la destruccin de algunas macromolculas. De hecho, antes de disponer de
los enzimas de restriccin, esta tcnica era utilizada para el fraccionamiento de DNA
(Hagen et al., 1970). Los primeros experimentos realizados en plantas y animales
mostraron los importantes efectos fsicos que la sonicacin tiene en las clulas; el Vicia
faba produce la rotura de la pared celular de las clulas de la raz (Miller et al., 1974)
mientras que en clulas animales produce alteraciones en la permeabilidad de la
membrana plasmtica (Chapman, 1974). En base a estas observaciones, la sonicacin
comenz a emplearse para la transferencia gnica a protoplastos, clulas en suspensin
y pedazos intactos de tejidos.

El proceso utilizado para transferir DNA es el mismo independientemente del tipo

de clulas de la planta con el que se vaya a trabajar. El plsmido de DNA es transferido
al medio de sonicacin , en el cual se encuentran ya resuspendidas previamente las de
inters. La mezcla es tratada con pulsos de ultrasonidos de una intensidad que
previamente ha sido seleccionada y de una duracin que va a depender
fundamentalmente del tipo de clula. El factor ms importante que afecta a la entrada de
DNA en la clula mediante sonicacin es la composicin del medio de sonicacin as
como la cantidad de plsmido. Joersbo y Brunstedt (1990) encontraron que los
experimentos llevados a cabo con elevadas cantidades de DNA (80-110 g/ml) y el
medio de sonicacin suplementado con sacarosa producen una mayor expresin
transitoria de los genes.

Una de las principales ventajas que ofrece la sonicacin es la simplicidad y

velocidad de la tcnica, as como su bajo coste. Adems, la sonicacin es un mtodo de
transferencia gnica muy verstil, que permite introducir DNA exgeno desde
protoplastos a clulas en suspensin y tejidos. No obstante, esta tcnica tiene tambin
alguna limitacin, como es el hecho de que las ondas de ultasonidos pueden causar
dao en las clulas a causa de la elevada temperatura que produce, lo que limitan el uso
de esta tcnica.

5.7.- TRANSFORMACIN GNICA MEDIANTE LSER

La transformacin de las clulas vegetales mediante la irradiacin con lser se basa

en llevar a travs del objetivo pulsos de luz de alta energa a las regiones del tejido
diana de menos de 1 m de dimetro. Esta tcnica resulta muy til para manipular
componentes celulares y orgnulos, porque el rayo puede ser dirigido directamente a
esta rea seleccionada. El hecho de que con el lser, agujeros de dimensiones definidas
pueden ser creados en la pared y membrana celular, permitiendo la entrada pasiva de
DNA a travs de los al interior de la clula, hace de esta herramienta una posible forma
de vencer la barrera para introducir DNA en la clula. Este proceso puede ser ayudado
por la creacin de un gradiente osmtico entre la clula y el tampn hipotnico que
favorezca la entrada de DNA a favor de gradiente.

El experimento tpico comienza introduciendo agregados de cultivos en suspensin

o explantos de tejidos en un medio hipertnico durante 1-3 horas. Este medio va a
inducir que las clulas situadas en la zona exterior de los agregados se plasmolicen hasta
el 80-90% de su volumen total. Despus, los cultivos son filtrados y trasladados a una
cmara de cultivo. El DNA, disuelto en medio lquido es aadido a las clulas, las
cuales son inmediatamente irradiadas con el lser. Las clulas pre-plasmolizadas,
cuando son introducidas en el medio hipotnico que contiene el DNA, introducen
rpidamente el DNA a travs de las perforaciones hechos por el lser. Este hecho s ve
maximizado porque las clulas plasmolizadas captan mayores cantidades de lquido que
las clulas no tratadas previamente. El dao causado a las clulas por el tratamiento con
lser es mnimo debido al hecho de que las perforaciones hechas con el lser son muy
pequeas y pueden ser rpidamente cerradas tras el tratamiento. La forma en la que el
tratamiento con lser es llevado a cabo es enfocando el rayo en la superficie de las
clulas elegidas y posteriormente desplazndolo en una lnea fina para perforar clulas
sucesivas.
 Una de las principales ventajas de la transformacin por lser es la elevada
precisin del mtodo. Como el lser es dirigido con un microscopio se pueden ver y
elegir exactamente las clulas que van a ser tratadas. As, esta tcnica resulta aplicable
para la transformacin de clulas de los meristemos, que son competentes para la
regeneracin. La microinyeccin que tiene en estos aspectos caractersticas similares,
aunque esta ha de ser llevada a cabo en las clulas de forma individual. La
transformacin con lser es una tcnica que puede ser llevada a cabo en un nmero de
clulas mucho mayor, aunque la subsiguiente trasferencia de ADN est mucho menos
controlada.

No obstante, esta tcnica tiene tambin una importante limitacin, el gran coste del
equipo necesario para llevarla a cabo y la gran habilidad necesaria para manejar el lser.

5.8.- TRANSFORMACIN MEDIADA POR POLEN

Dado que la funcin del polen es transmitir DNA, por lo que siempre ha existido un
gran inters en la transformacin mediada por gametos. No obstante, hasta la llegada de
los marcadores heterogneos y de las tcnicas moleculares de anlisis, la obtencin de
evidencias de la transformacin resultaban difciles de interpretar, dado que los
marcadores clsicos como un resultado de la contaminacin del polen en vez de cmo
resultado de la transformacin. En 1986, se consigui obtener la transformacin de maz
por polinizacin con una mezcla de polen y de DNA (Otha, 1986). Esto increment
notablemente el inters en este tipo de tcnicas. En este experimento, el plsmido de
DNA con el gen nptII fue aplicado a las flores tras la polinizacin. La transformacin
fue confirmada por existencia a antibiticos o Southen blot. El objetivo del mtodo es
que el DNA sea transportado durante la fecundacin al interior de los vulos, pues en
este estado el DNA tiene ms posibilidades de ser integrado.

Esta publicacin gener un gran inters, aunque los experimentos que despus se
llevaron a cabo en arroz y otras plantas obtuvieron resultados generalmente negativos.

5.9.- TRANSFERENCIA GNICA POR INBIBICIN

La introduccin de DNA durante la imbibicin de tejidos de plantas deshidratados
es un mtodo que ha sido estudiado desde los aos sesenta. Durante la deshidratacin
ocurren cambios fsicos y qumicos como la expansin rpida de la clula, la rotura de
la pared, los cambios estructurales en la membrana, etc., que sugieren que en estas
condiciones el DNA puede ser captado.

En 1989, Toepfer et al. consiguieron la incorporacin y expresin transitoria del

plsmido de DNA con el gen nptII, mediante la imbibicin de cereales en una solucin
con DNA. Seis aos ms tarde, en 1995, se consigui la transformacin estable de arroz
expresando el gen GUS mediante la imbibicin de embriones.
 La gran ventaja de esta tcnica es su simplicidad y que no requiera un equipamiento
especializado. Sin embargo, esta tcnica solo puede ser aplicada a determinados
rganos.
 6.- GENES MARCADORES:
Los genes marcadores desempean un papel crucial en los procedimientos de
transformacin, pues estos pueden ser utilizados para determinar si el DNA introducido
en las clulas de la planta mediante distintos tratamientos se ha integrado en el genoma
de la misma de manera efectiva. Los genes marcadores van a ser utilizados
generalmente para la transformacin estable. Estos genes van a permitir a clulas vivas,
tejidos o plantas completas crecer bajo condiciones que no previenen el crecimiento de
los tejidos no transformados o confieren un fenotipo que permite diferenciar
inequvocamente los tejidos transformados de los que no lo estn.

Visualizacin de la expresin del gen:

Los genes marcadores que pueden ser detectados en los tejidos de la planta
directamente constituyen una herramienta muy importante. En los estudios de expresin
transitoria, algunos marcadores pueden indicar el nmero y la localizacin de las clulas
transfectadas, ambos parmetros resultan importantes para llevar a cabo la
transformacin estable. En los transformantes estables, es posible determinar si un gen
introducido se expresa en todas las clulas de un tejido determinado o en elevados
niveles en algunas clulas o tipos celulares concretos. Esta informacin frecuentemente
proporciona una mayor percepcin del papel funcional de un gen durante el desarrollo
vegetal. El sistema de gen marcador de la -D-glucuronidasa (GUS) se ha probado que
resulta muy verstil en numerosas investigaciones (Jefferson, 1989). Una limitacin
tpica de este sistema, sin embargo, es que el procedimiento histoqumico para la
deteccin de la expresin de GUS requiere generalmente sacrificar el tejido. Por ello
tambin se han desarrollado marcadores usados para visualizar la expresin gnica en
tejidos vegetales vivas. Alguno de estos ya se han constituido como marcadores muy
tiles para la transformacin de la planta entera (Meyer et al., 1987; Herman & Marks,
1989) o para determinar el destino de las clulas transformadas en tejidos quimricos.

Criterios para la eleccin de marcadores de seleccin:

Los marcadores de seleccin confieren un fenotipo dominante en las clulas

transformadas porque invariablemente causan la adicin de un nuevo carcter no
asociado normalmente con las clulas sin transformar. Los caracteres que pueden ser
usados para seleccionar clulas transformadas de clulas no transformadas se dividen en
dos clases: aquellos que confieren o viabilidad o letalidad celular en presencia de un
agente selectivo; y aquellos que confieren a las clulas transformadas algunas
caracterstica fsica distinguible. Las frecuencias de transformacin de clulas vegetales
son generalmente bajas, as que muchos sistemas de transformacin usan marcadores
que aseguren la supervivencia de las clulas transformadas en presencia de un agente
selectivo.

Cuando se desarrolla un procedimiento de seleccin con un gen marcador deben

considerarse tambin la naturaleza del tejido diana y el sistema de introduccin del
DNA. Por ejemplo, los tejidos verdes pueden ser ms sensibles a agentes que afecten a
procesos localizados en plastos que las clulas de callo. Adems, la exposicin de las
clulas del callo a elevados niveles de estos agentes durante el proceso de seleccin
pueden afectar a la regeneracin de las plantas verdes o al desarrollo plastdico. Con
otros agentes selectivos, la supervivencia de clulas transformadas bajo condiciones
selectivas puede verse afectada por la liberacin de compuestos txicos (por ejemplo
compuestos fenlicos) por las clulas no transformadas circundantes.

Los marcadores de seleccin que requieren un agente selectivo pueden no se muy

tiles en los procedimientos de seleccin como el desarrollo de quimeras a elevada
frecuencia. Esto es debido a que los sectores transformados de las plantas quimricas
frecuentemente dependen delas clulas no transformadas para el aporte de nutrientes.
Por ello se han usado marcadores visibles para seleccionas plantas quimeras generadas
por biolstica en meristemos apicales.

6.1.- MARCADORES QUE CONFIEREN VIABILIDAD O

LETALIDAD BAJO CONDICIONES DE SELECCIN:
6.1.1- Marcadores de resistencia a herbicidas o antibiticos.

El repertorio de marcadores de seleccin que resultan en la resistencia a

antibiticos, herbicidas u otras fitotoxinas es actualmente muy extenso. La resistencia a
estos agentes es conferida por uno d estos tres mecanismos: detoxificacin por
modificacin enzimtica o secuestro; reduccin de la afinidad por el agente de seleccin
y sobreexpresin de una molcula diana de tipo salvaje. En general, los marcadores que
operan por los dos primeros mecanismos, son ms efectivos y, en consecuencia, su uso
est ms extendido.

6.1.2.- Marcadores auxotrficos.

Las mutaciones auxotrficas que requieren suplementos nutricionales son raras

en plantas. En consecuencia, son escasas las investigaciones en la que se documenta la
complementacin del mutante auxotrfico mediante la transformacin vegetal. Por
ejemplo, la enzima treonina dehidratasa es deficiente en mutantes de Nicotiana
plumbaginifolia la cual requiere isoleucina. El gen de levadura que codifica esta enzima
ILV1, fue introducido en secuencias reguladoras de la planta e introducido en las clulas
mutantes mediante Agrobacterium (Colau et al., 1987). Otro ejemplo es el caso en el
que el gen de la nitrato reductasa de tabaco es utilizado para complementar mutantes de
nicotina tabacum deficientes para esta enzima (Vaucheret et al., 1990). Las plantas
transformadas van a poder crecer en presencia de nitrato mientras que los mutantes
originales no.

6.1.3.- Marcadores letales.

Los marcadores letales para las clulas pueden ser tener diferentes aplicaciones.
Por ejemplo, estos marcadores pueden ser usados para seleccionar mutaciones que
suprimen la expresin de un gen. Adems, los agentes que seleccionan para la prdida
del marcador pueden tambin ser tiles para eventos de seleccin positiva / negativa
(Capecchi, 1989)
 Algunos marcadores codifican protenas extremadamente txicas para la planta,
las cuales bajo el control de un promotor determinado slo se expresarn en ciertos
tejidos o en respuesta a estmulos externos.

6.2.- MARCADORES VISIBLES:

6.2.1.- Marcadores histolgicos.

Los marcadores histolgicos confieren fenotipos distinguibles en presencia de

un sustrato que es suplementado de manera exgena. Los agentes histolgicos clsicos
incluyen sustratos cromognicos que reaccionan con constituyentes celulares (Gahan,
1984; Vaughn, 1987). Los anticuerpos tambin pueden ser usados para detectar
protenas en un procedimiento conocido como inmunohistoqumica (Harlow y Lane,
1988; Harris y Outlaw, 1990). De forma similar, la expresin gnica en cuanto a niveles
de mRNA puede ser visualizada por hibridacin in situ (Raikhel et al., 1989).

6.2.2.- Marcadores morfolgicos.

El uso de marcadores morfolgicos en la transferencia gnica a plantas se ve

incrementado a medida que el control de los genes relacionados con caracteres
morfolgicos se va haciendo posible. Las plantas transgnicas que sobreexpresan
peroxidasa extracelular son susceptibles de marchitarse, y la sobreexpresin de
fitocromos tiene numerosos efectos pleiotrpicos. La morfologa de las plantas que
selectivamente expresan un producto txico de un gen en un tejido especfico tambin
puede ser detectada.

6.2.3.- Marcadores de pigmentacin.

Las plantas son organismos vistosamente coloreados. Las mutaciones que

afectan a la sntesis de pigmentos son raramente perjudiciales y se han usado de manera
destacable como marcadores en plantas durante decenas de aos. Muchos de los
pigmentos ms universales (y coloridos) nicos en plantas son las antocianinas o los
compuestos similares relacionados con flavonoides. Hace unos aos se clonaron un
cierto nmero de genes asociados a la produccin de antocianinas (Mol et al., 1988;
Ludwig y Wessler, 1990). Algunos de ellos son genes estructurales que codifican
enzimas involucrados en la biosntesis de las antocianinas, mientras que otras codifican
factores en trans que regulan la expresin de los genes estructurales a nivel
trasncripcional.

Se han llevado a cabo tres aproximaciones generales para la utilizacin de los

genes clonados de antocianinas como marcadores dominantes en los tejidos de plantas
transformadas.

- Supresin de los alelos salvajes endgenos mediante el uso RNA antisentido,

la adicin de copias extra del gen o protenas dominantes inhibidoras negativas.
- Complementacin de alelos mutantes.
- Transactivacin de alelos silentes,