EFECTO DE LA APLICACIN DE POLIAMINAS EXOGENA SOBRE LA

EMBRIOGENESIS SOMATICA DE LA CAA DE AZCAR (Sacharum spp.

Hbrido). RELACIN CON ALGUNOS COMPUESTOS NITROGENADOS.
Cid, M.; Lezcano, Y.; Pina, D.; Nieves, N.
Laboratorio de Cultivo de Clulas y Tejidos, Centro de Bioplantas, UNICA, Carr. Morn km 9, CP 69450,
Ciego de Avila, Cuba. E$-mail: mariela@bioplantas.cu

Introduccin
En el metabolismo de los compuestos nitrogenados se ha puesto una marcada atencin en
los ltimos aos, especialmente las poliaminas, los cuales influyen marcadamente en los
procesos fisiolgicos y por tanto en la calidad de las plantas. Las poliaminas (putrescina,
espermidina y espermina) se consideran reguladores del crecimiento y desarrollo de las
plantas, por su efecto demostrado sobre el crecimiento, la divisin y la diferenciacin celular
a bajas concentraciones. Por su capacidad de unirse a macromolculas como cidos
nucleicas, protenas y fosfolpidos pueden alterar la expresin gnica, la actividad de ciertas
enzimas, as como variar la fluidez y permeabilidad de las membranas biolgicas (Waie y
Rajam, 2003).
En caa de azcar no se ha establecido an un protocolo repetitivo mediante el cual se
logre una elevada produccin de embriones somticos de forma sincrnica y con elevada
calidad, as como existe muy poca informacin acerca de los procesos bioqumicos que
ocurren en el transcurso de stos y que puedan utilizarse como herramientas para el manejo
de los mismos.
El objetivo del trabajo es evaluar la influencia del suplemento de poliaminas exgenas en la
histodiferenciacin y regeneracin de callos de caa de azcar.

Materiales y mtodos.
En el experimento se utilizaron segmentos de 1 cm de la hoja mas interna de plantas de
caa de azcar (Saccharum spp.) var CP52-43, un hbrido proveniente de CP43-64 x CP38-
34, Canal Point, FL, USA.
Se utiliz como medio basal las sales y vitaminas de Murashige y Skoog (1962) (MS) con un
suplemento de arginina (50 mg. l-1). Para el establecimiento de los callos se utiliz un
suplemento de cido 2,4-Diclofenoxiactico (2,4-D) (13.5 mol. l-1) durante 30 da.
Posteriormente los callos se subcultivaron cada 15-20 das en un medio MS suplementado
con arginina (50 mg. l-1) y cido 2,4-D (4.5 mol. l-1) y se mantuvieron en condiciones de
oscuridad a 25 C. La diferenciacin y maduracin de los embriones se realiz sobre el
medio descrito por Tapia et al. (1999), el cual contiene el medio basal MS y se suplementa
con cido naftalen actico (ANA) (5,37 mol. l-1) y sacarosa (60 g. l-1). El conteo y
clasificacin de los embriones se realiz a los 14 das acorde al desarrollo y morfologa de
los embriones en globular, escutelar temprano, escutelar tardo y germinados (al menos una
hoja emitida y color verde). La germinacin y desarrollo de los embriones a plantas se llev
a cabo en condiciones in vitro, en frascos de cultivo de 200 ml, sobre un medio semislido
compuesto por las sales y vitaminas MS y solidificado con agar 7 g. l-1. A los 21 das los
embriones germinados se pasaron a medio MS y a los 35 das se realiz el conteo y
evaluacin del desarrollo de las plantas obtenidas a partir de los embriones somticos
germinados, teniendo en cuenta: Nmero de plantas por callo, altura (cm), nmero de hojas
y nmero de races.
Los tratamientos ensayados fueron 0 (control), 5, 10 mM de Putrescina combinado con
Espermidina y Espermina (0 y 1,0 M) los que se emplearon en medio de induccin y
mantenimiento de callos con estructuras embriognicas. Se evaluaron como indicadores
bioqumicos los contenidos de protenas solubles totales (Bradford, 1976), prolina libre
(Bates et al., 1973). Las evaluaciones de estos indicadores se realizaron en los siguientes
momentos: Tiempo 0 (Al finalizar la fase de induccin), Tiempo 1 (Al finalizar la fase de
mantenimiento, Tiempo 3 y 4 (a los 14 y 21 das en el medio de histodiferenciacin
respectivamente.
Resultados
En la tabla 5 se muestra el conteo de embriones en las diferentes combinaciones de
putrescina con espermidina y espermina a los 14 das de la fase de histodiferenciacin.

Como se aprecia en la tabla 5(A y B), el mejor comportamiento en la formacin de

embriones correspondi al tratamiento donde la putrescina se aplic sola en la dosis ms
baja (5mM) con diferencias estadsticas con el control en el experimento en el que se
combin con espermidina 5 (A). Sin embargo, cuando se duplic la dosis (10 mM) los
resultados fueron los ms bajos en ambos experimentos, con diferencias estadsticas de
significacin con todos los tratamientos. La espermidina aplicada sola y combinada con
putrescina 5 (A) disminuy la produccin de embriones con diferencias estadsticas con el
control. Cuando se combin con la dosis ms baja de putrescina tuvo un ligero incremento,
pero siempre por debajo del control con diferencias estadsticas.

Tabla 5(A): Conteo y clasificacin de embriones somticos de caa de azcar a los 14 das
de la fase de histodiferenciacin en los tratamientos de putrescina y espermidina
exgenas.
Es
PUT ESC. ESC.
d GLOBUL GERMIN TOTAL
TEMP TARD
mM M

0 0 20,9b 45,8a 9,6bc 1,4b 77,7b

0 1 9,7cd 26,4bc 4,4bc 0,7b 41,2cde

5 0 27,8a 49,1a 23,7a 13,2a 113,8a

5 1 7,7cd 33,7ab 10,3bc 0,4b 52,2c

10 0 5,7d 9,9d 3,1c 0b 18,7f

10 1 12,9c 20,6cd 9,5bc 0,7b 43,7cd

Sig * * * * *

ES 0.7 1.7 0.9 0.5 3.0

Medias con letras desiguales en una misma columna indican diferencias

estadsticas segn prueba no parametrica de Kruskal Wallis y Student-Newman-
Keuls para un grado de confiabilidad del 5% y (n=16).

Al aplicar la espermina sola o combinada (tabla 5 B), independientemente de la dosis,

disminuy el nmero de embriones totales con diferencia con el control y el tratamiento en el
que se aplic la putrescina sola, en la dosis ms baja (5mM).
Tabla 5(B): Conteo y clasificacin de embriones de caa de azcar a los 14 das de la fase
de histodiferenciacin en los tratamientos de putrescina y espermina exgenas.
Put Esm GLOBULA ESC. ESC.
GERMIN TOTAL
mM M R TEMP TARD

0 0 37,9a 32,9b 8,8a 7,5b 87,2a

 0 1 26,7ab 20,8bc 2,3b 2,6c 52.6bc

5 0 37,37a 42,6a 11,5a 10,3a 101,87a

5 1 28,8ab 11,0cd 1,0b 1,2c 42,1bc

10 0 8,9c 3,56d 1,5b 3,2c 17,3c

10 1 15,3bc 9,06d 2,4b 2,0c 28,93bc

Sig * * * * *

ES 1.8 1.7 0.4 0.4 3.5

Medias con letras desiguales en una misma columna indican diferencias

estadsticas segn prueba no parametrica de Kruskal Wallis y Student-Newman-
Keuls para un grado de confiabilidad del 5% y (n=16).

El impacto de las poliaminas sobre la embriognesis somtica es evidente, aunque los

mecanismos exactos a travs de los cuales ellas ejercen un efecto esta al nivel de hiptesis
(Minocha y Jain, 2000). Existen diferentes ejemplos del comportamiento de estas aminas en
los procesos embriognicos. El Hadrami y DAuzac (1992) observaron un incremento en el
potencial embriognico de callos de rboles de goma (Hevea brasiliensi) con la adicin de
arginina, espermidina o la combinacin de putrescina, espermidina y espermina. El mayor
efecto fue logrado con la combinacin de las tres poliaminas. En trabajos con berenjena
(Solanum melongena), increment casi seis veces en el nmero de embriones somticos
con aplicaciones exgenas de 0.5 mM de putrescina en la etapa de mantenimiento de los
callos, acompaado por un incremento en los niveles de poliaminas, mientras que la
espermidina y la espermina no tuvieron efecto estimulatorio sobre la embriognesis, ms
bien fueron inhibitorias a altas concentraciones Yadav y Rajam (1997).
No siempre se encuentra un comportamiento similar, ya que Sargent et al. (1998) notaron
respuestas diferentes en genotipos de caa de azcar (Saccharum Spp) y sorgo (Sorghum
bicolor) con aplicaciones exgenas de las tres poliaminas en la fase de mantenimiento del
callo. Mientras que unos genotipos formaron callos de forma rpida y eficiente otros no lo
hicieron y en la respuesta embriognica, luego de liberar las poliaminas del medio, lo ms
significativo fue la regeneracin a plantas, en lo cual tambin se encontr una respuesta
diferencial en los genotipos evaluados. La respuesta embriognica en cuanto a la aplicacin
de poliaminas exgenas es, evidentemente, dependiente de la especie y del genotipo. En
los resultados aqu analizados se encontr que la putrescina a 5 mM elev la produccin de
embriones, aunque la dosis mayor (10 mM) fue ms bien inhibitoria. Para la espermidina y la
espermina, independientemente de las dosis empleadas y si se combin o no con
putrescina, no ejercieron efectos positivos sobre el proceso embriognico, sino que
inhibieron el mismo de forma significativa como es el caso de la espermidina sola y ambas
en todas las combinaciones con putrescina. Esto pudiera estar asociado con los niveles
endgenos de estos compuestos y el umbral de sensibilidad del genotipo a sus mecanismos
de accin.

Tabla 6 (A): Indicadores morfolgicos de las plntulas de caa de azcar a los 35 das de la
germinacin de los embriones somticos en los tratamientos con putrescina y
espermidina exgenas.
PUT+ESD LONG
No. No.
No. PLANT PLANT
mM M HOJAS RACES
(cm)
 0 0 15.4bc 1,5bcd 4,7b 2,4b
0 1.0 6.9cd 2,1a 5,2a 2,4b
5 0 28.6a 1,6bcd 4,5b 2,9a
5 1.0 1.9d 1,6bc 4,6b 2,1b
10 0 1.7d 1,1de 3,7c 1,7b
10 1.0 1.0d 1,9ab 4,4b 2,4b
Sig * * * *
ES 1.56 0.4 0.5 0.6
Medias con letras desiguales en una misma columna indican diferencias
estadsticas segn prueba no parametrica de Kruskal Wallis y Student-Newman-
Keuls para un grado de confiabilidad del 5% y (n=16).
Es interesante sealar que en todas las combinaciones de putrescina con espermidina
(Tabla 6A) se encontr una marcada reduccin en la formacin de plantas,
independientemente de las dosis empleadas. Algo similar ocurri en el experimento con
espermina (Figura 6B), aunque esto no se vio tan marcado. Resulta curioso que en estas
ltimas combinaciones se registr un aumento en la longitud de las plantas, con diferencias
estadsticas con el control y con los tratamientos en los cuales cada amina se aplic
independiente.

Tabla 6 (B): Indicadores morfolgicos de las plntulas de caa de azcar a los 35 das de la
germinacin de los embriones somticos en los tratamientos con putrescina y
espermina exgenas.
PUT+ESM LONG
NO.
No. PLANT PLANT NO. HOJAS
mM mM RAICES
(cm)
0 0 14.7b 0,7d 3,9ab 1,5a
0 1.0 6.9bcd 0,8d 3,9ab 2,0a
5 0 23.6a 0,9cd 4,0ab 1,8a
5 1.0 2.2d 1,4ab 4,2a 1,5a
10 0 4.5c 1,2bc 4,1ab 1,9a
10 1.0 4.7cd 1,4ab 4,4a 1,8a
Sig * * * *
ES 0.76 0.031 0.047 0.077
Medias con letras desiguales en una misma columna indican diferencias
estadsticas segn prueba no parametrica de Kruskal Wallis y Student-Newman-
Keuls para un grado de confiabilidad del 5% y (n=16).

En trabajos anteriores otros autores obtuvieron incrementos en la formacin y desarrollo de

plantas completas a partir de embriones somticos. Sargent et al. (1998) en dos especies
monocotiledneas (sorgo y caa de azcar) lograron mejorar la regeneracin de embriones
somticos con aplicaciones exgenas de putrescina o combinaciones de sta con otras
aminas como la espermidina y la espermina, aunque este comportamiento no fue similar
para todos los genotipos. Cid et al. (2005) obtuvieron incrementos de los indicadores
fisiolgicos de plantas regeneradas a partir de embriones somticos de caa de azcar con
la aplicacin exgena de putrescina (1 mM) en la fase de histodiferenciacin.
Los resultados del trabajo dejan claro que la putrescina aplicada en dosis bajas (5 mM) en la
etapa de iniciacin de callos de caa de azcar favorece significativamente el proceso de la
embriognesis somtica de este cultivo, al menos para las variedad ensayada (CP-5243), ya
que no slo increment la produccin de embriones, sino que tambin favoreci la
regeneracin a plantas. Sin embargo, cuando esta amina se aplic combinada con la
espermidina y la espermina, productos finales en su cadena biosinttica, la respuesta fue
mas bien inhibitoria, tanto en la formacin de embriones como en la regeneracin a plantas
y las caractersticas de las mismas, excepto en las combinaciones con espermina que
indujeron una mayor talla de stas. Evaluar los niveles endgenos de estas aminas hubiese
permitido conocer el balance de las mismas en cada tratamiento y momento, para tratar de
esclarecer sus mecanismos de accin sobre la embriognesis somtica de este cultivo.

En los indicadores bioqumicos evaluados no se encontraron evidencias claras de una

relacin directa de la accin de las poliaminas sobre el proceso embriognico que involucre
a otros metabolitos nitrogenados como las protenas solubles y la prolina libre. En resultados
precedentes del autor y de otros grupos de trabajo s se ha referido esta accin a travs de
estos compuestos del metabolismo del nitrgeno, lo que hace pensar que los cambios
pudieron producirse en las etapas ms tempranas del proceso embriognico, ya que los
tratamientos se aplicaron en el momento de la induccin, o sea, que su accin comenz
desde la propia iniciacin de los callos, en momentos que no se evaluaron estos
indicadores. Por otra parte, no conocer los niveles endgenos de las poliaminas en el
material, no permite definir si en los tratamientos en los cuales se afect el proceso pudo
estar dado porque se sobrepas el umbral de tolerancia para el cultivo, o si el balance
adecuado no se alcanz como se esperaba.

Bibliografa:
Bates, LS.; Waldron, RP.; Teare, LD. 1973. Rapid determination of free proline for water-
stress studies. Plant and Soil. 39(1): 205-207.
Bradford, MM. 1976. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quanties
of Protein-Dye Binding. Ann. Bioch. 72: 248-254.
Cid, M.; Gonzlez, R.; Castillo, R.; Lezcano, Y.; Pina, D.; Nieves, N. 2005. Effect of
exogenous putrescine on histodifferentiation and regeneration of plants in sugarcane
(Sacharum spp. hbrido) callus. Relationship with some nitrogenous components. Taller
Int. BioVeg2005, ISBN: 959-16-0075-5, pp87.
El Hadrami, I.; DAuzac, J. 1992. Effects of polyamines biosynthetic inhibitors on somatic
embryogenesis and cellular polyamines in Hevea brasiliensis. J. Plant Physiol. 140:33-
36.
Minocha, R.; Jain, SM. 2000. En: Jain SM, Minocha SC (eds) Molecular Biology of Woody
Plants. Kluwer, Dordrecht pp 315-339.
Murashige, T.; Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue culture. Physiol Plant. 15: 473-497.
Sargent, HR.; Godwin, ID.; Adkins, SW. 1998. The effect of exogenous polyamines on
somatic embryogenesis and plant regeneration from Sorghum bicolor and Saccharum
spp. ISHS Acta Horticulturae 461:465: 75 123.
Tapia, R.; Castillo, R.; Nieves, N.; Blanco, MA.; Gonzlez, JL.; Snchez, M.; Rodrguez, Y.
1999. Induccin, maduracin y encapsulacin de embriones somticos de caa de azcar
(saccharum sp. hbrido) Var. Cp52-43. Biotecnologa Aplicada. 16(1): 20-23.
Waie, B.; Rajam, MV. 2003. Effect of increased polyamine biosynthesis on stress
responses in transgenic tobacco by introduction of human S-adenosylmethionine Gene.
Plant Science 164 727-734.
Yadav, JS.; Rajam, MV. 1997. Spatial distribution of free and conjugated polyamines in
leaves of Solanum melongena associated with differential morphogenetic capacity:
efficient somatic embryogenesis with putrescine. Journal of Experimental Botany 48:
15371545.