Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Microbio PDF
Microbio PDF
PRACTICAS DE LABORATORIO
ICA PER
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
2
Ramirez - Balqui
MICROBIOLOGIA Y MEDIOS
DE CULTIVO
PRACTICAS DE LABORATORIO
3
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
4
Ramirez - Balqui
MICROBIOLOGIA Y
MEDIOS DE CULTIVO
PRACTICAS DE LABORATORIO
RUC: 10215479761
Derechos reservados
5
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
6
Ramirez - Balqui
INTRODUCCION
Esta primera edicin, tiene como finalidad, al igual que publicaciones similares,
que el estudiante o profesional dedicado a la Microbiologa cuente con un pequeo
manual que facilite el trabajo de laboratorio.
Esta edicin, ha sido elaborada con algunos conceptos tericos, hay tambin
nuevas tablas, grficos y por supuesto se han agregado nuevos medios de cultivo; por
otro lado hay un reordenamiento de algunas tablas relacionadas con los discos de control
y susceptibilidad antimircrobiana. La presente edicin consta de siete captulos.
Finalmente el VII y ltimo captulo trata de los medios de cultivo, razn de ser del
presente manual. Se desarrolla en cada uno de stos su fundamento, composicin,
preparacin e interpretacin. Solamente un adecuado empleo de los medios de cultivo
permitir un correcto diagnstico bacteriano.
7
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
8
Ramirez - Balqui
CONTENIDO
Pg.
Introduccin
9
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
10
Ramirez - Balqui
BACTERIAS.
Conceptos generales
Desinfectantes y antispticos..
Tipos de desinfectantes
Quimioterpicos de sntesis y antibiticos....
Qumioterpicos de sntesis.
Antibiticos.
Resistencia Bacteriana a los antibiticos..
Bases genticas de la resistencia..
Mecanismos bioqumicos.
11
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
MEDIOS DE CULTIVO
Agar Almidn................
Agar Anaerbico (Brewer)
Agar Azida Sangre (Agar base con sangre y azida)
Agar Baird Parker (Agar selectivo para Estafilococos)
Agar Bismuto Sulfito de Wilson Blair...............
Agar Brolacin (Agar azul de bromo timol lactosa cistina)......................
Agar Brucella...............................................................................................
12
Ramirez - Balqui
13
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Cresol)....................
Agar Selectivo para Clostridios....................................................................
Agar para Dermatofitos (DTM)....................................................................
Agar Selectivo para Enterococos (Barnes)..................................................
Agar Selectivo para Estreptococos..............................................................
Agar Selectivo para Estafilococos N 110 (Chapman)................................
Agar Selectivo para Yersinia.......................................................................
Agar Sulfito..................................................................................................
Agar Thayer Martin...................................................................................
Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sucrosa (TCBS).....................................
Agar Verde Brillante (Kauffman) (Agar verde brillante rojo de fenol
lactosa)......................
Agar Violeta Cristal Rojo Neutro Bilis (VRVA)..............
Agar Xilosa Lisina y Desoxicolato (XLD)..................................................
Agua Peptonada
Agua Peptonada Tamponada................
Caldo Brila (Caldo verde brillante bilis lactosa).
Caldo Cianuro
Caldo de Enriquecimiento para Salmonella (Rappaport)
Caldo de Enriquecimiento para Vibrio cholerae..
Caldo Hajna para Gramnegativos.
Caldo Extracto de Malta...
Caldo Infusin Cerebro Corazn (BHI)..
Caldo Lactosado
Caldo Lauril Triptosa.
Caldo Malonato................
Caldo Manitol Salado
Caldo Mosto...
Caldo Nitrato..
Caldo Nutritivo
Caldo Peptonado...
Caldo Selenito
Caldo Tetrationato Base..
Caldo Tioglicolato (Medio Alternativo de la USP)
Caldo Triptosa..
Caldo Urea...............
Discos Bactrol (Discos de control y susceptibilidad antimicrobiana)
Medio Base para Fermentacin de Azcares y Alcoholes.
14
Ramirez - Balqui
ANEXOS:
Tabla 32: Diferenciacin de Enterobacteriaceaes mediante pruebas
bioqumicas
Tabla 33: Pruebas claves para la identificacin de las especies con mayor
significado clnico..
Tabla 34: Identificacin presuntiva de los estreptococos .
Tabla 35: Diferenciacin de los cocos grampositivos catalasa negativos..
Tabla 36: Caractersticas diferenciales de las especies Neisseria aisladas
frecuentemente..
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
15
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
16
Ramirez - Balqui
CAPITULO I
17
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
18
Ramirez - Balqui
Tras la Edad de Oro de la Bacteriologa, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y Koch,
la Microbiologa qued durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada,
estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la Qumica, que le
aportara varios avances metodolgicos fundamentales. Sin embargo, una corriente, en
principio minoritaria, dedicada a los estudios bsicos centrados con ciertas bacterias del suelo
poseedoras de capacidades metablicas especiales, incluyendo el descubrimiento de las que
afectan a la nutricin de las plantas, logr hacer ver la ubicuidad ecolgica y la extrema
diversidad fisiolgica de los microorganismos. De esta forma, se estableca una cabeza de
puente entre la Microbiologa y otras ciencias biolgicas, que lleg a su momento decisivo
19
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
cuando se comprob la unidad qumica de todo el mundo vivo, y se demostr, con material y
tcnicas microbiolgicas que la molcula de la herencia era el ADN. Con ello se asiste a un
ntimo y frtil intercambio entre la Microbiologa, la Gentica y la Bioqumica, que se plasma en
el nacimiento de la Biologa Molecular, base del espectacular auge de la Biologa desde
mediados de este siglo.
As pues, la sencilla definicin con la que se abri este apartado, esconda todo un cmulo de
contenidos y objetos de indagacin, todos emanados de una peculiar manera de aproximarse a
la porcin de realidad que la Microbiologa tiene encomendada. En las prximas pginas
ampliaremos y concretaremos el concepto al que hemos hecho rpida referencia.
Realizaremos un recorrido por su el desarrollo de la Microbiologa a lo largo de su historia, que
nos permitir una visin concreta de algunos de sus caractersticos modos de abordar su
objeto de estudio; finalmente, estaremos en disposicin de definir este ltimo, desglosado
como objeto material y formal.
20
Ramirez - Balqui
d) Cuarto periodo (desde principios del siglo XX hasta nuestros das), en el que los
microorganismos se estudian en toda su complejidad fisiolgica, bioqumica, gentica,
ecolgica, etc., y que supone un extraordinario crecimiento de la Microbiologa, el
surgimiento de disciplinas microbiolgicas especializadas (Virologa, Inmunologa, etc.), y la
estrecha imbricacin de las ciencias microbiolgicas en el marco general de las Ciencias
Biolgicas. A continuacin se realiza un breve recorrido histrico de la disciplina
microbiolgica, desglosando los perodos 3 y 4 en varios apartados temticos.
2.1. PERIODO PREVIO AL DESCUBRIMIENTO DEL MICROSCOPIO.
Si bien el descubrimiento efectivo de seres vivos no visibles a simple vista debi
aguardar hasta el ltimo tercio del siglo XVII, sus actividades son conocidas por la
humanidad desde muy antiguo, tanto las beneficiosas, representadas por las
fermentaciones implicadas en la produccin de bebidas alcohlicas, pan y productos
lcteos, como las perjudiciales, en forma de enfermedades infecciosas.
21
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Hubo que esperar un siglo ms hasta que una serie de naturalistas recomenzaran el
ataque a la teora preformacionista. Lazzaro Spallanzani (1729-1799) sostuvo una
disputa con J.T. Needham (1713-1781) en la que el primero demostr que los
"infusorios" no aparecan en muestras de maceraciones animales o vegetales sometidas
22
Ramirez - Balqui
Para complicar ms las cosas, la publicacin de "Sobre el origen de las especies" por
Darwin en 1859, fue utilizada por algunos preformacionistas para apoyar sus
argumentos. El mismo Haeckel, en una fecha tan tarda como 1866, se mostraba
escptico ante las pruebas aportadas por Pasteur.
Fue, efectivamente Louis Pasteur (1822-1895) el que asest el golpe definitivo y zanj
la cuestin a favor de la teora biognica. En un informe a la Acadmie des Sciences de
Pars, en 1860 ("Expriences rlatives aux gnrations dites spontanes") y en escritos
posteriores comunica sus sencillos y elegantes experimentos: calent infusiones en
matraces de vidrio a los que estiraba lateralmente el cuello, hacindolo largo, estrecho y
sinuoso, y dejndolo sin cerrar, de modo que el contenido estuviera en contacto con el
aire; tras esta operacin demostr que el lquido no desarrollaba microorganismos, con
lo que elimin la posibilidad de que un "aire alterado" fuera la causa de la no aparicin
de grmenes. Antes bien, comprob que los grmenes del aire quedaban retenidos a su
paso por el largo cuello sinuoso, en las paredes del tubo, y no alcanzaban el interior del
recipiente donde se encontraba la infusin, quedando sta estril indefinidamente. Slo
si se rompa el cuello lateral o si se inclinaba el frasco de modo que pasara parte de
lquido a la porcin de cuello, los grmenes podan contaminar la infusin y originar un
rpido crecimiento.
En 1861 Pasteur publica otro informe en el que explica cmo se pueden capturar los
"cuerpos organizados" del aire con ayuda de un tubo provisto de un tapn de algodn
como filtro, y la manera de recuperarlos para su observacin microscpica. De esta
forma quedaba definitivamente aclarado el origen de los microorganismos, y se abra la
Edad de Oro del estudio cientfico de las formas de vida no observables a simple vista.
23
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Los ltimos escpticos quedaron silenciados cuando en 1877 John Tyndall (1820-1893)
aplic su sistema de esterilizacin por calentamiento discontinuo (hoy conocida
precisamente como tindalizacin), que evidenci la existencia de formas microbianas de
reposo muy resistentes al calor, lo cual fue confirmado poco ms tarde por Ferdinand
Cohn al descubrir las esporas bacterianas.
Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades pticas de los
cristales de tartrato, vena suponiendo que estos compuestos tenan un orgen orgnico)
quien de nuevo intervino en el debate de forma decisiva. En 1857 demostr que los
agentes de la fermentacin lctica eran microorganismos, trabajando sobre un problema
que haba surgido entre los destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentacin
alcohlica se vio sustituida por una indeseable fermentacin lctica. Este fue el inicio de
una larga serie de estudios que habra de durar hasta 1876, en los que Pasteur
identific distintos microorganismos responsables de diferentes clases de procesos
fermentativos. As, en 1860 adscribe inequvocamente la fermentacin alcohlica a
ciertos tipos de levaduras, y en 1866, en sus tudes sur le vin resume sus hallazgos al
respecto, inaugurando la Microbiologa Aplicada, una de las primeras derivaciones
prcticas no empricas emanadas de la Biologa. A finales del siglo XIX eminentes
bilogos como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su actividad
en industrias y destileras.
24
Ramirez - Balqui
Los primeros cultivos puros fueron obtenidos por el miclogo Brefeld, quien logr aislar
esporas de hongos y cultivarlas sobre medios slidos a base de gelatina. Por su menor
tamao, este mtodo se haca inviable para las bacterias, por lo que se recurri a un
mtodo basado en diluciones: Lister, en 1878 realiz diluciones secuenciales de cultivos
mixtos, hasta lograr muestras en las que exista una sola clula. Pero la tcnica era
larga y tediosa y, adems, normalmente slo se lograban aislar clulas del tipo
bacteriano ms abundante en el cultivo original; sin embargo, el experimento sirvi para
confirmar la naturaleza "particulada" de los agentes de las fermentaciones.
Por aquella poca Koch buscaba con ahnco mtodos ms sencillos de cultivo puro,
indispensables para proseguir sus investigaciones sobre bacterias patgenas. Primero
(y quiz de forma un tanto casual) emple rodajas de patata como sustrato slido
nutritivo sobre el que se podan desarrollar colonias macroscpicas de bacterias que
presentaban morfologa caracterstica, que Koch interpret como resultantes del
crecimiento a partir de clulas individuales. Pero enseguida recurri a compactar el
25
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
tpico caldo de cultivo a partir de carne (diseado por Loeffler) aadindole gelatina
(1881). El medio slido as logrado era transparente, lo que permita visualizar
fcilmente los rasgos coloniales, y contena los nutrientes adecuados para el
crecimiento de una amplia gama de bacterias. stas eran inoculadas en la superficie del
medio con un hilo de platino pasado previamente por la llama, por la tcnica de siembra
en estra. Sin embargo, la gelatina presentaba los inconvenientes de ser atacada por
determinados microorganismos, y de tener un bajo punto de fusin; ambos problemas
se solventaron cuando en 1882 el mdico alemn Walter Hesse, siguiendo una
sugerencia de su mujer Fanny, introdujo el agar-agar (polisacrido extrado de algas
rojas) como nuevo agente solidificante. El trabajo de Koch ya citado tuvo la
trascendental consecuencia de derribar las ideas pleomorfistas, y supuso la primera
propuesta del concepto de especie dentro del mundo bacteriano. En 1887 Petri, un
ayudante de Koch, sustituy las engorrosas bandejas de vidrio cubiertas con campanas,
usadas hasta entonces para los cultivos slidos, por un sistema manejable de placas de
cristal planas, que se conoce como cajas de Petri.
Mientras tanto, en la ciudad de Jena se haba creado una atmsfera de progreso donde
confluan grandes naturalistas como Haeckel, Strassburger o Abb interaccionando con
una pujante editorial especializada en Biologa y Medicina (Gustav Fischer) y con una
poderosa industria ptica y qumica. Estas influencias recprocas se plasmaron en
numerosos proyectos que reflejaban la efervescencia de las ciencias naturales tras la
estela de Darwin (cfr. Jahn et al., 1985). Concretamente, la industria ptica de Abb y
Zeiss, que se mantena en conexin con la compaa vidriera Schott, pudo satisfacer la
necesidad de Koch de perfeccionar el microscopio compuesto, introduciendo lentes
acromticas y una iluminacin inferior provista de condensador. El mismo Abb
desarroll en 1878 el objetivo de inmersin en aceite. Por otro lado, la industria qumica
BASF, que por aquella poca se encontraba en pleno auge de patentes de nuevos
colorantes, suministr al laboratorio de Koch una serie de derivados de anilina que
tean las bacterias permitiendo su fcil visualizacin al microscopio en frotis de tejidos
infectados. En 1875 Carl Weigert ti bacterias con pirocarmn, un colorante que ya
26
Ramirez - Balqui
vena siendo usado desde haca unos aos en estudios zoolgicos. En aos sucesivos
se fueron introduciendo el azul de metileno (Koch, 1877), la fuchsina, y el violeta cristal.
En 1882-1883 Ziehl y Neelsen desarrollan su mtodo de cido-alcohol resistencia para
teir Mycobacterium tuberculosis. En 1884 el patlogo dans Christian Gram establece
una tincin de contraste que permite distinguir dos tipos bacterianos en funcin de sus
reaccin diferencial de tincin y que, como se vera mucho ms tarde, reflejaba la
existencia de dos grupos de bacterias con rasgos estructurales distintivos. En 1890
Loeffler logra visualizar flagelos bacterianos por medio de su tcnica de impregnacin
argntica. Como veremos ms adelante, la misma industria de colorantes alemana
previa a la primera guerra mundial fue decisiva tambin para los comienzos de la
quimioterapia.
En 1835 Agostino Bassi (1773-1856) demostr que cierta enfermedad del gusano de
seda (mal di segno), que haba hecho su aparicin en Lombarda, se deba a un hongo
(Botrytis bassiana). Cuatro aos ms tarde J.L. Schnlein descubri la asociacin de un
hongo con una enfermedad humana de la piel. En 1840 Henle, de la escuela fisiolgica
de Johannes Mller, plante la teora de que las enfermedades infecciosas estn
causadas por seres vivos invisibles, pero de nuevo la confirmacin de estas ideas tuvo
que esperar a que la intervencin de Pasteur demostrara la existencia de
microorganismos especficos responsables de enfermedades.
Hacia mediados del siglo XIX otra enfermedad infecciosa (pebrina) comenz a
diseminarse por los criaderos de gusano de seda de toda Europa, alcanzando
finalmente a China y Japn. A instancias de su maestro Jean Baptiste Dumas, Pasteur
acept el reto de viajar a la Provenza para investigar esta enfermedad que estaba
dejando en la ruina a los industriales sederos, a pesar de que nunca hasta entonces se
haba enfrentado con un problema de patologa. Es ms que probable que Pasteur viera
aqu la oportunidad de confirmar si sus estudios previos sobre las fermentaciones
podan tener una extensin hacia los procesos fisiolgicos del hombre y de los
animales. Es sorprendente que, al principio no se mostrara dispuesto a aceptar la idea
de que la pebrina fuera una enfermedad ocasionada por un agente extrao, creyendo
durante los dos primeros aos que se trataba de alteraciones meramente fisiolgicas.
27
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Tras una serie de tanteos, y en medio de una intensa actividad intelectual que le
obligaba a repasar continuamente los experimentos y las conclusiones extradas,
inmerso en el drama personal de la muerte de su padre y de dos de sus hijas en un
corto lapso de tiempo, Pasteur llega finalmente, en 1869, a identificar al protozoo
Nosema bombycis como el responsable de la epidemia, y por medio de una serie de
medidas de control, sta comienza a remitir de modo espectacular.
Este tipo de estrategias para demostrar el origen bacteriano de una enfermedad fue
llevado a una ulterior perfeccin en 1882, con la publicacin de "Die thiologie der
Tuberkulose", donde se comunica por primera vez la aplicacin de los criterios que
Henle haba postulado en 1840. Estos criterios, que hoy van asociados al nombre de
Koch, son los siguientes:
Fue asimismo Koch quien demostr el principio de especificidad biolgica del agente
infeccioso: cada enfermedad infecciosa especfica est causada por un tipo de bacteria
diferente. Estos trabajos de Koch abren definitivamente el campo de la Microbiologa
Mdica sobre firmes bases cientficas.
Durante las dos dcadas siguientes la Microbiologa experiment una autntica edad de
oro, en la que se aislaron y caracterizaron muchas bacterias patgenas. La Alemania
del Reich, que a la sazn se haba convertido en una potencia poltica y militar, se
28
Ramirez - Balqui
decidi a apoyar la continuidad de los trabajos del equipo de Koch, dada su enorme
importancia social y econmica, creando un Instituto de investigacin, siendo Koch su
director en el Departamento de Salud. De esta forma, en la Escuela Alemana se
aislaron los agentes productores del clera asitico (Koch, 1883), de la difteria (Loeffler,
1884), del ttanos (Nicolaier, 1885 y Kitasato, 1889), de la neumona (Fraenkel, 1886),
de la meningitis (Weichselbaun, 1887), de la peste (Yersin, 1894), de la sfilis
(Schaudinn y Hoffman, 1905), etc. Igualmente se pudieron desentraar los ciclos
infectivos de agentes de enfermedades tropicales no bacterianas que la potencia
colonial se encontr en ultramar: malaria (Schaudinn, 1901-1903), enfermedad del
sueo (Koch, 1906), peste vacuna africana (debida al ingls Bruce, 1895-1897), etc.
Ms tarde, Paul Ehrlich (1854-1919), que haba venido empleando distintas sustancias
para teir clulas y microorganismos, y que conoca bien el efecto de tincin selectiva
de bacterias por ciertos colorantes que dejaban, en cambio, incoloras a clulas
animales, concibi la posibilidad de que algunos de los compuestos de sntesis que la
industria qumica estaba produciendo pudieran actuar como "balas mgicas" que fueran
txicas para las bacterias pero inocuas para el hospedador. Ehrlich concibi un
programa racional de sntesis de sustancias nuevas seguido de ensayo de stas en
infecciones experimentales. Trabajando en el laboratorio de Koch, prob
sistemticamente derivados del atoxilo (un compuesto que ya Thompson, en 1905,
haba mostrado como eficaz contra la tripanosomiasis), y en 1909 inform de que el
compuesto 606 (salvarsn) era efectivo contra la sfilis. Aunque el salvarsn presentaba
algunos efectos colaterales, fue durante mucho tiempo el nico agente disponible contra
enfermedades producidas por espiroquetas, y sirvi para ilustrar brillantemente la
validez del enfoque de la llamada quimioterapia (trmino acuado por el mismo Ehrlich),
de modo que encauz toda la investigacin posterior.
29
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
30
Ramirez - Balqui
El qumico Berthelot haba sealado (1885) que los microorganismos del suelo podan
incorporar nitrgeno molecular directamente del aire. Fue igualmente Winogradsky el
primero en aislar una bacteria capaz de fijar nitrgeno atmosfrico (Clostridium
pasteurianum) y en explicar el ciclo del nitrgeno en la naturaleza (1890), siendo el
holands Martinus Beijerinck (1851-1931) el descubridor de Azotobacter como bacteria
aerobia fijadora de vida libre (1901). Ms tarde Beijerinck demostr por mtodos
qumicos que, en efecto, Azotobacter incorpora nitrgeno de la atmsfera mientras
crece (1908). La importancia de la fijacin de nitrgeno para la nutricin vegetal lleg
con los estudios sobre bacterias formadoras de ndulos en las races de las
leguminosas. Ya los experimentos cuantitativos sobre plantas creciendo en recipientes,
realizados por Boussingault a mediados del siglo XIX, haban indicado que las
leguminosas asimilaban nitrgeno de la atmsfera. En 1866 Voronin descubri las
bacterias de los ndulos radicales de esta familia de plantas. Frank, en 1879, demostr
que los ndulos parecan inducirse por las mismas bacterias albergadas en ellos, y
Ward (1887) us bacterias procedentes de ndulos machacados para inocular semillas,
logrando la produccin de ndulos en suelo estril, y describiendo en un bello trabajo el
proceso de infeccin, con su produccin de "hifas" (cordn de infeccin). Tras la
introduccin del concepto de simbiosis por De Bary, en 1878, fue Schindler (1884) el
primero en describir los ndulos radicales como resultado de una simbiosis entre planta
y bacterias. Los trabajos de Hermann Hellriegel (1831-1895) y de su colaborador
Hermann Willfahrt (1853-1904), que trabajaban en la Estacin Experimental de
Bernburg, comunicados en primer lugar en un congreso en Berln, en 1886, y
publicados en un artculo ejemplar en 1888, asociaron la fertilidad nitrogenada natural
de las leguminosas con la presencia de sus ndulos radicales, sealando que estos
ndulos se inducan por microorganismos especficos; de este modo lograron una
31
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
32
Ramirez - Balqui
La inmunologa es, en la actualidad, una ciencia autnoma y madura, pero sus orgenes
han estado estrechamente ligados a la Microbiologa. Su objeto consiste en el estudio
de las respuestas de defensa que han desarrollado los animales frente a la invasin por
microorganismos o partculas extraos, aunque su inters se ha volcado especialmente
sobre aquellos mecanismos altamente evolucionados e integrados, dotados de
especificidad y de memoria, frente a agentes reconocidos por el cuerpo como no-
propios, as como de su neutralizacin y degradacin.
33
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
A finales del siglo XIX existan dos teoras opuestas sobre los fundamentos biolgicos
de las respuestas inmunes. Por un lado, el zologo ruso Ilya Ilich Mechnikov (1845-
1916), que haba realizado observaciones sobre la fagocitosis en estrellas de mar y
pulgas de agua, estableci, a partir de 1883, su "Teora de los fagocitos", tras estudiar
fenmenos de englobamiento de partculas extraas por los leucocitos de conejo y de
humanos. Inform que existan fenmenos de eliminacin de agentes patgenos por
medio de "clulas devoradoras" (fagocitos) que actuaban en animales vacunados contra
el carbunco, y explic la inmunizacin como una "habituacin" del hospedador a la
fagocitosis. Ms tarde, ya integrado en el Instituto Pasteur, propugn la idea de que los
fagocitos segregan enzimas especficos, anlogos a los "fermentos" digestivos (1900).
Esta teora de los fagocitos constituy el ncleo de la teora de la inmunidad celular, de
modo que la fagocitosis se consideraba como la base principal del sistema de defensa
inmune del organismo.
Por otro lado, la escuela alemana de Koch haca hincapi en la importancia de los
mecanisnos humorales. Emil von Behring (1854-1917) y Shibasaburo Kitasato (1856-
1931), a resultas de sus trabajos sobre las toxinas del ttanos y de la difteria,
34
Ramirez - Balqui
La inmunoqumica cobra un gran impulso en las primeras dcadas del siglo XX con los
trabajos de Karl Landsteiner (1868-1943). Su primera contribucin de importancia haba
sido la descripcin, mediante reacciones de aglutinacin, del sistema de antgenos
naturales (ABC0) de los eritrocitos humanos (1901-1902), completada (en colaboracin
con Von Dungern y Hirzfeld), con las subdivisiones del grupo A y el estudio de su
transmisin hereditaria. Estos trabajos sirvieron de estmulo para avanzar en el
desentraamiento de la especificidad qumica de los antgenos que determinan la
formacin de anticuerpos. Landsteiner estudi sistemticamente las caractersticas de
inmunogenicidad y especificidad de reaccin de antgenos con anticuerpos, valindose
35
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
36
Ramirez - Balqui
Los avances en Inmunologa durante los ltimos aos han sido espectaculares,
consolidando a sta como ciencia independiente, con su conjunto propio de
paradigmas, ya relativamente escindida de su tronco originario microbiolgico. Entre los
hitos recientes hay que citar la tcnica de produccin de anticuerpos monoclonales a
partir de hibridomas, desarrollada originalmente por Csar Milstein y Georges Kohler en
1975, y que presenta una enorme gama de aplicaciones en biomedicina, o el
desentraamiento de los fenmenos de reorganizacin gentica responsables de la
expresin de los genes de inmunoglobulinas, por Susumu Tonegawa.
El botnico ruso Dimitri Iwanovski haba observado (1892) que la enfermedad del
mosaico del tabaco poda ser reproducida experimentalmente usando el fluido que
atravesaba los filtros de porcelana que normalmente retenan a las bacterias, pero
siendo incapaz de aislar y crecer el supuesto microorganismo, abandon la
investigacin. Pocos aos ms tarde (1898), y probablemente sin tener noticias del
trabajo de Iwanovski, Beijerink realiz experimentos similares con el mismo sistema, y
en otro rasgo de su genio, enfrentndose a los conceptos de la poca, avanz la idea
de que el agente filtrable (un contagium vivum fluidum, segn su expresin), deba de
incorporarse al protoplasma vivo del hospedador para lograr su reproduccin. Este tipo
de agentes infectivos que atravesaban los filtros de porcelana fueron llamados en
principio "virus filtrables", quedando ms tarde su denominacin simplemente como
virus. Aquel mismo ao de 1898 Loeffler y Frosch descubren los virus animales al
comprobar que un virus filtrable es responsable de la glosopeda del ganado. En 1901
Reed descubre el primer virus humano, el de la fiebre amarilla, y en 1909 Landsteiner y
Pope detectan el de la poliomielitis. A comienzos de siglo Copeman desarrolla su
tcnica de multiplicacin de virus animales en embriones de pollo, con la que P. Rous
asla y cultiva el virus del sarcoma aviar (1911).
Los virus bacterianos fueron descubiertos en 1915 por F.W. Twort, si bien su trabajo no
alcanz la elegancia y claridad del desarrollado poco ms tarde por el canadiense Flix
d'Hrelle (1917); fue ste quien acu el trmino bacterifago, y supuso correctamente
que el fenmeno de lisis por estos agentes deba de estar ampliamente difundido entre
las bacterias. Aunque su esperanza en la aplicacin de los fagos como elementos
37
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
En aos recientes han sido descubiertos dos nuevos tipos de entidades infectivas,
subvirsicas: T.O. Diener describi en 1967 la existencia de ARN desnudos infectivos
en plantas, a los que llam viroides, y en 1981 Prusiner puso de manifiesto que
determinadas enfermedades de mamferos se deben a partculas proteicas
aparentemente desprovistas de material gentico, a las que bautiz como priones.
38
Ramirez - Balqui
Los avances de Taxonoma Microbiana, vale la pena resear aqu los esfuerzos
tempranos para lograr un clasificacin bacteriana por parte de Cohn (1875) y Migula
(1894), que sustentaban su concepto de especie predominantemente sobre caracteres
morfolgicos. Pero hacia 1900 era evidente la arbitrariedad e insuficiencia de este tipo
de clasificaciones, de modo que los intentos posteriores hicieron uso de caracteres
bioqumicos (Orma Jensen, 1909), o de una mezcla de rasgos morfolgicos,
bioqumicos, patognicos y de tincin (Buchanan, 1915). El sistema de taxonoma
bacteriana adquiri un nuevo impulso a partir de la 1 edicin del "Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology" (1923), y de las propuestas de Kluyver y van Niel
("Prospects for a natural system of classification of bacteria", 1936). En cuanto a la
nomenclatura, no fue hasta 1958 en que cuaj un Cdigo Internacional de
Nomenclatura Bacteriolgica, aunque ya se vena aplicando desde haca tiempo el
procedimiento tipolgico para los microorganismos, con criterios similares a los de la
Zoologa y la Botnica.
39
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
sexualidad de los hongos con fines taxonmicos. En 1905 Maire demostr la existencia
de meiosis en la formacin de ascosporas, y Claussen (1907) evidenci fusin de
ncleos en Ascomicetos, mientras que Kniepp, hacia finales de los aos 30 haba
recogido un gran volumen de informacin sobre procesos sexuales en Basidiomicetos.
El sueco Lindegren (1936) realiza las primeras cartografas genticas en cromosomas
de Neurospora, durante su estancia en el laboratorio californiano de Morgan; este
ltimo, propugnador de la "teora de los genes" (1926), confiaba desde haca aos en
ampliar sus xitos, logrados en Drosophila, hacia el estudio de la gentica microbiana.
En 1941, otros dos discpulos de Morgan, Beadle y Tatum, aslan mutantes auxotrficos
de Neurospora, con lo que se inicia el estudio de la base bioqumica de la herencia, y
convierten a este hongo en una valiosa herramienta de trabajo en esta lnea de
investigacin.
Las estrategias diseadas por Beadle y Tatum fueron aplicadas por Luria y Delbrck
(1943) a cultivos bacterianos, investigando la aparicin de mutaciones espontneas
resientes a fagos o estreptomicina. La conexin de estos experimentos con las
observaciones previas de Griffith (1928) sobre la transformacin del neumococo, llev a
Avery y colaboradores (1944) a demostrar que el "principio transformante" portador de
la informacin gentica es el ADN. En 1949 Erwin Chargaff demuestra bioqumicamente
la transmisin gentica mediante ADN en Escherichia coli, y en 1952 Alfred Hershey y
Martha Chase, en experimentos con componentes marcados de fagos, ponen un
elegante colofn a la confirmacin de la funcin del ADN, con lo que se derribaba el
antiguo y asentado "paradigma de las protenas" que hasta mediados de siglo intentaba
explicar la base de la herencia. De esta forma, la Microbiologa experimental se sita en
pleno centro del nacimiento de la Gentica molecular, de la mano de los avances
paralelos en Bioqumica (anlisis por rayos X de la estructura del ADN debido a Maurice
Wilkins y Rosalind Franklin, modelo de Watson y Crick de la doble hlice del ADN, etc.),
dando origen esta confluencia a lo que se ha llamado la "edad de oro" de la Biologa
Molecular.
40
Ramirez - Balqui
41
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Los ARNs satlites son pequeas molculas de tamao similar al de los viroides
de plantas (330-400 bases), que son empaquetados en cpsidas de determinadas
cepas de virus (con cuyos genomios no muestran homologas). Se replican slo
en presencia del virus colaborador especfico, modificando (aumentando o
disminuyendo) los efectos patgenos de ste.
42
Ramirez - Balqui
43
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
44
Ramirez - Balqui
CAPITULO II
Microbiologa Mdica
Microscopa
Taxonoma bacteriana. Categoras taxonmicas
Cepas o clones. Biotipos
Nomenclatura de las bacterias
Patogenicidad y Virulencia
Mtodos inmunolgicos en microbiologa clnica
Mtodos moleculares en microbiologa clnica
Bacterias de inters mdico (clasificacin segn Bergey)
Bacterias de inters industrial
45
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
46
Ramirez - Balqui
I. MICROBIOLOGIA
En general, las bacterias son organismos unicelulares, desprovistos de clorofila que pueden
vivir libres o bien agruparse.
Su tamao varia entre 0.2 y 3 micras de dimetro. Aunque son verdaderas clulas, su
estructura presenta rasgos especiales:
Segn su forma o morfologa reciben distintos nombres bacilos, con forma de bastn; vibrio,
semejantes a una coma; o parecidos a un sacacorchos, como los espirilos.
Por ltimo, los cocos son de forma redondeada y pueden agruparse por parejas (diplococos),
en cadena (estreptococos) o de modo irregular (estafilococos).
En el mundo de las bacterias, las formas de alimentacin son muy variadas. Algunas viven en
el suelo y, partiendo de sustancias inorgnicas, son capaces de sintetizar su propio alimento;
presentan, por tanto, nutricin auttrofa.
47
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Dentro de este grupo podemos distinguir las que realizan la fotosntesis, si bien se trata de un
proceso algo distinto del que tiene lugar en las plantas; poseen variedades nicas de clorofila
(bacterioclorofila), y las que aprovechan la energa de ciertas reacciones qumicas (y no la del
sol) para construir sus propias sustancias. Entre sta ltima, llamadas quimiotrofas, se
encuentran:
Las bacterias sulfurosas, que adsorben azcar (o cido sulfhdrico) y lo combinan con
oxgeno.
Las bacterias ferricas, que viven en aguas dulces o saladas en las que existe hierro en
disolucin; absorben estos compuestos y los combina con el oxgeno.
Las bacterias hidrgenas, que combinan hidrgeno y oxgeno dando agua como
subproducto de su actividad.
Las bacterias nitrificantes, que oxidan ciertos compuestos nitrogenados.
Estos cuatros tipos de bacterias aprovechan la energa que se libera en las reacciones
descritas.
Sin embargo, la mayora de las bacterias dependen de otros seres vivos para alimentarse.
Estas bacterias, hetertrofas, pueden ser saprofitas y vivir a expensas de la materia orgnica
en descomposicin, los parsitos si viven sobre o dentro de animales o vegetales vivos, o
simbiticas cuando se asocian a otros organismos para obtener ambos un beneficio mutuo.
Las bacterias viven en todo tipo de medios: en el agua, en la tierra y en los seres vivos. En este
ltimo caso pueden tener efectos benficos para el organismo en el que se encuentran, como
sucede por ejemplo con unas bacterias del intestino del hombre, que producen una sustancia
muy importante: la vitamina K..
En muchos casos las bacterias producen enfermedades cuando se hallan presentes en los
animales y en las plantas. En tal caso reciben el nombre de bacterias patgenas.
Las "insignificantes" bacterias han producido grandes epidemias a lo largo de la historia, como
lo es el caso de la peste o el clera. Pero tambin son responsables de enfermedades muy
comunes entre nosotros, tales como el canto o las anginas.
Por su simplicidad ante organismos ms complejos, las bacterias son muy utilizadas en la
investigacin bioqumica y gentica.
Algunos bacilos tienen la propiedad de formar estructuras de resistencia o esporas cuando las
condiciones se vuelven adversas.
48
Ramirez - Balqui
Los mecanismos parasexuales mediante los cuales realizan intercambios de material gentico
son:
En la conjugacin, una clula donadora emite un apndice tubular llamado pili o fimbria que
comunica su citoplasma con el de la clula receptora. Por esto puente puede pasar una porcin
del cromosoma donador.
II. MICROSCOPIA.
Un microscopio simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que amplifica una
imagen y permite la observacin de mayores detalles de los posibles a simple vista. El
microscopio ms simple es una lente de aumento o un par de anteojos.
El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos
separados estos deben estar como mnimo a esa distancia.
Tericamente la mxima resolucin que se puede alcanzar es de 0,2 m dada por una luz con
longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y
con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo,
pero no puede aumentar la resolucin.
Compuestos por:
Fuente luminosa que ilumina la muestra.
Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra.
Platina sobre la cual se coloca la muestra.
Objetivo que recibe la luz que atraves la muestra.
Ocular que recibe directamente la imagen formada por el objetivo.
49
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
La muestra a observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz. Con este
tipo de microscopio se deben utilizar mtodos de tincin porque el campo claro de este
no produce un nivel til de contraste.
Este aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las distintas
partes de una clula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por
regiones de mayor ndice de refraccin experimenta una deflexin y queda fuera de fase
con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras
longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos pticos del objetivo y
del condensador, anula la amplitud de la porcin fuera de fase inicial del haz de luz y
produce un contraste til sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen
corresponden a las porciones densas del espcimen; las partes claras de la imagen
corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan
para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.
Microscopio de campo oscuro El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las
estructuras del espcimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro est
equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta.
En consecuencia el campo visual se observa como un fondo oscuro sobre el cual
aparecen pequeas partculas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia
el objetivo.
El efecto es similar a las partculas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un
proyector de diapositivas en una habitacin oscura. La luz reflejada por las partculas de
polvo llega hasta la retina del ojo y las hacen visibles.
La resolucin de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo
oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede
detectar partculas individuales ms pequeas en las imgenes de campo oscuro,
debido al contraste creado.
Microscopio de fluorescencia Una molcula que fluorece emite luz de longitud de onda
que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz
ultravioleta. Se usa para revelar molculas fluorescentes naturales, como la vitamina A
y algunos neurotransmisores. Al ser escasas las molculas autofluorecentes su
aplicacin ms difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la
deteccin de antgenos o anticuerpos en procedimientos de coloracin
50
Ramirez - Balqui
Se insertan distintos filtros entre la fuente de luz ultravioleta y la muestra para producir
luz monocromtica o casi monocromtica, o entre el espcimen y el objetivo
permitiendo que la estrecha banda de longitudes de onda de fluorescencia llegue hasta
el ojo o incida en una emulacin fotogrfica u otro procedimiento analtico.
El mtodo sirve para detectar cidos nucleicos, protenas que contienen determinados
aminocidos. Mediante longitudes de ondas especficas para la iluminacin se puede
obtener mediciones espectrofotomtricas para cuantificar el DNA y el RNA de cada
clula.
Microscopio de polarizacin Este microscopio es una simple modificacin del
microscopio ptico, contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la fuente de
luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador entre el
objetivo y el observador.
51
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
La ventaja de los microscopios electrnicos frente a los pticos esta en que la longitud
de onda del haz de luz es aproximadamente 1/200, lo cual aumenta la resolucin.
El condensador forma el haz y modifica el dimetro del haz que incide en el plano del
espcimen. El haz que atraviesa la muestra se coloca en foco y se aumenta por medio
de un objetivo y se aumenta aun ms con una o ms lentes proyectoras. La imagen final
se visualiza sobre una planilla cubierta por fsforo. Las porciones de la muestra que han
sido atravesadas por los electrones aparecen brillantes, las porciones que absorvieron o
esparcieron los electrones por su densidad inherente o debido al agregado de metales
pesados durante la preparacin del espcimen aparecen oscuras. Se coloca una placa
fotogrfica o un detector de video por encima o por debajo de la pantalla del visor, con
la finalidad de obtener un registro permanente de la imagen sobre la pantalla.
Las muestras se preparan sobre la misma base que la del microscopio ptico pero
requieren mtodos ms finos.
Los preparados la restriccin que tienen es que en cada paso se trabaja con
especimenes de magnitud 3-4 rdenes menores o ms finos que los utilizados para el
microscopio ptico. Debido a la gran resolucin de estos microscopios electrnicos la
calidad de la fijacin, es decir el grado de preservacin de la estructura subcelular debe
ser la mejor posible.
52
Ramirez - Balqui
El material a examinar puede estar fijado o no; en el primer caso se elimina el fijador del
tejido por medio de lavados, antes de procesarlo. Se infiltra el tejido con un
crioprotector, como el glicerol y se congela rpidamente a unos 160 grados
centgrados.
53
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de electrones a
travs de la superficie un tubo de televisin. Los electrones reflejados desde la
superficie y los electrones forzados hacia el exterior de la superficie son captados por
uno o ms detectores y reprocesados para formar una imagen tridimensional en una
televisin.
Se pueden tomar fotografas para registrar los datos o la imagen en una cinta de video.
Se pueden usar otros detectores para medir los rayos X emitidos desde la superficie, la
catodoluminiscencia de las molculas del tejido por debajo de la superficie y los
electrones de Auger emitidos en la superficie.
Se pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos X emitidos cuando el
haz de bombardea el corte histolgico, y mediante analizadores apropiados se
construye un mapa que muestra la distribucin en los cortes de los elementos que
tienen nmero atmico mayor de 12, en concentracin suficiente para producir rayos X
en cantidad tal que se pueda analizar.
Para clasificar una bacteria, primero hay que aislarla para obtener un cultivo puro. Esto se
consigue distribuyendo la muestra, de manera que al sembrar las bacterias se desarrollen
separadamente y se pueda aislar un clon en concreto. Despus este se ha de sembrar en
diferentes medios de cultivo, convenientemente preparados para realizar diferentes pruebas y
observar el tipo de crecimiento que se produce en ellos, por ejemplo ver si puede degradar la
lactosa o no, etc.
Niveles Taxonmicos:
Taxonoma.- Conjunto de tcnicas y procedimientos para ordenar y agrupar a los seres vivos
en grupos afines o taxones.
Sistemtica.- Se encarga de agrupar a los seres vivos de acuerdo a criterios de semejanzas y
diferencias y relaciones evolutivas. Establece rboles genealgicos:
54
Ramirez - Balqui
Reino
Phylum
Clase
Orden
Familia
Gnero
Especie
Robert Whittaker, bilogo estadounidense, propuso que los seres vivos se pueden clasificar en
cinco reinos:
Bacterias (importancia)
a) cocos Estafilococos:- Estreptococos:
b) Bacilos lactobacilos
c) Espirilos
Existen as mismo bacterias que son importantes para todos los seres vivos llamadas que son
fijadoras del N2 nitrgeno.
V. NOMENCLATURA.
55
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Carolus Linnaeus, a mediados del siglo XVIII, orden a todos los seres vivos en dos
Reinos bien definidos: el Reino Animalia que agrupaba a los animales, organismos
mviles y hetertrofos; y el Reino Plantae que inclua a los vegetales, individuos
inmviles, auttrofos y fotosintticos. Segn el esquema de los dos reinos, los protozoos
se incluyeron en el Reino Animalia y el resto de microorganismos en el Reino Plantae.
Sin embargo, esta clasificacin encontr pronto dificultades ya que existan numerosos
microorganismos que posean caractersticas intermedias que no permitan su clara
adscripcin a uno de los dos reinos preestablecidos. En 1866 Ernst Haeckel propuso un
tercer reino, el Reino Protista, para reordenar todos los seres vivos con organizacin
biolgica sencilla ya fueran unicelulares, cenocticos o multicelulares, pero todos ellos
carentes de especializacin tisular y en los que cada individuo era capaz de realizar las
funciones propias y especficas que los tejidos de organismos superiores, animales y
plantas, tenan encomendadas. Segn Haeckel, el Reino Protista incluira bacterias,
algas, hongos y protozoos. Sin embargo, la validez del Reino Protista fu cuestionada a
medida que se obtena ms informacin acerca de la estructura interna de los
microorganismos debido a los avances en microscopa electrnica.
En 1937 Chatton dividi el mundo de los seres vivos en dos grandes grupos segn
tuvieran o no membrana nuclear. Aparecieron as los trminos eucariota para definir
organismos con clulas nucleadas que van desde los protozoos, algas y hongos hasta los
animales y plantas; y procariota para agrupar clulas sin membrana nuclear, como es el
caso de las bacterias. La dicotoma eucariota-procariota fue utilizada por los taxnomos
como una caracterstica filogentica de primera magnitud.
Aparecieron de esta forma los esquemas de cinco reinos en los que los microorganismos
procariotas constituyeron un grupo taxonmico filogenticamente independiente. El ms
aceptado de todos ellos fue el de Whittaker, que en 1969 propuso un sistema de
clasificacin de los seres vivos basado en los dos niveles de organizacin celular y las
56
Ramirez - Balqui
tres formas principales de nutricin (fotosntesis, absorcin e ingestin) que dieron lugar a
los Reinos Monera (procariotas), Protista (eucariotas unicelulares), Plantae (eucariotas
fotosintticos), Animalia (eucariotas fagotrofos) y Fungi (eucariotas osmotrofos). En el
esquema de Whittaker los microorganismos quedaron incluidos en los Reinos Monera
(bacterias), Protista (protozoos y microalgas) y Fungi (hongos filamentosos y levaduras).
Hasta este momento se utilizaron caractersticas morfolgicas y fisiolgicas hasta que el
desarrollo de la biologa molecular permiti utilizar los constituyentes moleculares como
nuevos criterios clasificatorios.
As, en 1987, Woese utilizando el 16S rRNA como reloj molecular comprob que, a travs
de la secuenciacin de esta molcula, los procariotas quedaban divididos en dos grupos.
El primero de ellos incluye las bacterias ms comunes, aisladas en su mayora del
cuerpo, suelo y agua denominndose eubacterias. El segundo grupo incluye las bacterias
que producen metano (metangenas), ciertas bacterias del azufre que pueden crecer en
ambientes muy cidos y calientes (termfilas extremas) y bacterias que viven en
ambientes salinos (halobacterias). Estas bacterias se denominaron arqueobacterias.
En 1990 Carl Woese propuso un nuevo taxn superior a Reino que denomin Dominio
(Dominio Reino Divisin Clase Orden Familia Gnero Especie).
Todos los seres vivos se agruparan en 3 dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya. De los
cuales, dos son exclusivamente microbianos y estn compuestos nicamente por clulas
procariotas pertenecientes al Reino Monera (Bacteria y Archaea) y el tercero (Eukarya),
formado por eucariotas, incluira entre otros los Reinos Protista, Plantae, Animalia y
Fungi.
57
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
disponible en cultivo puro; debe ser genticamente estable y debe crecer en cultivos a
gran escala. Otra caracterstica importante es que el microorganismo industrial crezca
rpidamente y produzca el producto deseado en un corto perodo de tiempo. El
microorganismo debe tambin crecer en un relativamente barato medio de cultivo
disponible en grandes cantidades. Adems, un microorganismo industrial no debe ser
patgeno para el hombre o para los animales o plantas. Otro requisito importante es la
facilidad de separar las clulas microbianas del medio de cultivo; la centrifugacin es
dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales ms favorables para
esto son aquellos de mayor tamao celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias
filamentosas) ya que estas clulas sedimentan ms fcilmente que las bacterias
unicelulares e incluso son ms fciles de filtrar.
a). Levaduras
Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de aos para la fabricacin de
pan y bebidas alcohlicas. La levadura que sin duda fue la primera y an hoy en da
sigue siendo la ms utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que
se emplean diferentes cepas para la fabricacin de cerveza, vino, sake, pan y
alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la
lactosa que se explota en pequea escala para la produccin de alcohol a partir del
suero de la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de cido ctrico.
Trichosporum cutaneum desempea un importante papel en los sistemas de
digestin aerbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de oxidacin
de compuestos orgnicos, incluidos algunos que son txicos para otras levaduras y
hongos, como los derivados fenlicos.
58
Ramirez - Balqui
c). Bacterias.
Entre las especies bacterianas de inters industrial estn las bacterias del cido
actico, Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en cido
actico. El gnero Bacillus es productor de antibiticos (gramicidina, bacitracina,
polimixina), proteasas e insecticidas. Del gnero Clostridium cabe destacar
Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azcares originando acetona y
butanol. Las bacterias del cido lctico incluyen, entre otras, las especies de los
gneros Streptococcus y Lactobacillus que producen yogur. Corynebacterium
glutamicum es una importante fuente industrial de lisina. El olor caracterstico a tierra
mojada se debe a compuestos voltiles (geosmina) producido por Streptomyces
aunque su principal importancia radica en la produccin de antibiticos como
anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc.
59
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
60
Ramirez - Balqui
CAPITULO III
Conceptos bsicos.
Clases de nutrientes.
Medios de cultivo.
Metabolismo energtico
Captacin de energa en las bacterias quimiotrofas.
Captacin de energa en las bacterias fototrofas: Fotofosforilacin.
Obtencin de energa en Halobacterium.
El oxgeno y el metabolismo bacteriano.
61
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
62
Ramirez - Balqui
CAPITULO IV
Conceptos bsicos.
Clases de nutrientes.
Medios de cultivo.
Metabolismo energtico
Captacin de energa en las bacterias quimiotrofas.
Captacin de energa en las bacterias fototrofas: Fotofosforilacin.
Obtencin de energa en Halobacterium.
El oxgeno y el metabolismo bacteriano.
63
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
64
Ramirez - Balqui
Las biosntesis de nuevos componentes celulares son procesos que requieren energa
procedente del medio ambiente. En el captulo anterior vimos los principales modos de
captacin y obtencin de energa existentes en las bacterias.
Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de energa, las bacterias se pueden
dividir en:
litotrofas: son aquellas que slo requieren sustancias inorgnicas sencillas (SH2 S0, NH3,
NO2-, Fe, etc.).
organotrofas: requieren compuestos orgnicos (hidratos de carbono, hidrocarburos, lpidos,
protenas, alcoholes...).
65
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Otros conceptos:
autotrofas estrictas son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia orgnica
como fuente de carbono.
Mixotrofas son aquellas bacterias con metabolismo energtico litotrofo (obtienen energa de
compuestos inorgnicos), pero requieren sustancias orgnicas como nutrientes para su
metabolismo biosinttico.
Sean autotrofas o hetertrofas, todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos
qumicos, que se pueden clasificar (segn las cantidades en que son requeridos) como:
macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y
micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo...)
El mundo bacteriano, como conjunto, exhibe una gigantesca versatilidad metablica de uso de
nutrientes: desde auttrofos que obtienen su carbono por reduccin del CO2 y los dems
elementos a partir de fuentes igualmente inorgnicas, hasta hetertrofos capaces de usar
amplia gama de fuentes orgnicas de carbono.
A su vez, dentro de los hetertrofos, podemos encontrar muchos tipos de nutricin muy
distintos, desde bacterias metilotrofas que slo usan metano o metanol como fuente de
carbono y energa, hasta los muy verstiles Pseudomonas, que pueden recurrir a degradar
ms de 100 tipos de fuentes de C, incluyendo sustancias tan "exticas" como hidrocarburos
alifticos y cclicos. De cualquier modo, entre los hetertrofos, una de las fuentes ms tpicas
de carbono consiste en glucosa.
Aunque dentro del mundo de los procariotas se encuentre tanta variedad de nutriciones, las
bacterias que pueden nutrirse solamente de sustancias inorgnicas sencillas (H 2O, CO2, N2,
NO3--, NH3, SO4=, fosfatos, etc.) son minora, pero sus procesos metablicos son muy
interesantes. De hecho, existen tipos metablicos que slo han evolucionado en
procariotas.
66
Ramirez - Balqui
sencillas, el carbono procede del CO2, y el resto de elementos a partir de sales inorgnicas, por
lo que pueden vivir en soluciones de sales minerales.
Lo habitual, sin embargo, es que muchas bacterias recurran, siempre que puedan, a tomar de
los medios ciertos compuestos ms complejos, ya que carecen de ciertas rutas biosintticas.
Ps
aw
Pw
67
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
valor de 100, que es la humedad del aire encima del agua destilada. O sea, la a W =
humedad relativa/100).
El CO2
El anhdrido carbnico es requerido por todo tipo de bacterias:
Las autotrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente
de energa la luz (en el caso de las fotoautotrofas) u oxidaciones de determinadas
sustancias inorgnicas (los quimioautolitotrofos).
Las arqueobacterias metanognicas pueden usar el CO2 como aceptor de los
electrones procedentes de la oxidacin del H2, proceso por el que obtienen su energa:
68
Ramirez - Balqui
Fsforo
Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgnico o inorgnico. Las bacterias que
pueden usar los fosfatos orgnicos (merced a la posesin de fosfatasas) no dependen
absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgnicos. Los
fosfatos orgnicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gram-
negativas) periplsmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina).
El fsforo se usa principalmente para la sntesis de los cidos nucleicos y los fosfolpidos,
pero aparece tambin en coenzimas y en protenas.
Sales minerales
Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl --) y de cationes para la clula.
Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente
+ ++ ++ ++
grandes: K , Mg , Ca , Fe .
El in potasio (K+):
interviene en la activacin de una variedad de enzimas, incluyendo las que participan
en la sntesis de protenas.
En Gram-positivas est asociado con los cidos teicoicos de la pared.
El in magnesio (Mg++):
estabiliza ribosomas, membranas y cidos nucleicos;
como cofactor en muchas reacciones, especialmente las que implican transferencia de
grupos fosfato. Por ejemplo, en las reacciones que requieren ATP, el Mg++ puede unir
la enzima al sustrato durante el mecanismo de accin de la primera.
Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintticas.
El in calcio (Ca++):
es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinasas.
69
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Muchas de las bacterias que pueden usar amonio como nica fuente de nitrgeno
tambin pueden usar nitratos.
70
Ramirez - Balqui
Los electrones para la reduccin llegan al complejo por medio de una ferredoxina,
que los transfiere al componente II, que queda reducido al tiempo que por cada
dos electrones transferidos se hidroliza una molcula de ATP. La nitrogenasa-
reductasa reducida se asocia entonces con la nitrogenasa (componente I), y le
transfiere los electrones. Una vez reducida la molibdoferroprotena, sta transfiere
los electrones (y los protones) al N2, hasta convertirlo en dos molculas de
amoniaco. (El centro activo es FeMoCo).
Debido a lo "caro" que resulta fijar nitrgeno, no es extrao comprobar que este
proceso est regulado de forma muy estricta ante la presencia en el medio de
fuentes combinadas de nitrgeno (nitratos, amonio, aminocidos):
la actividad nitrogenasa se ve inhibida ante la presencia de N combinado;
ante N combinado, se reprime la transcripcin de los genes codificadores
de la nitrogenasa y dems funciones relacionadas (genes nif).
71
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
I. MEDIOS DE CULTIVO
El conocimiento de la nutricin microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el
laboratorio. Como acabamos de ver, en general, todos los microorganismos tienen parecidos
requerimientos de macro- y micronutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que
cada nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacterias y otras, as como la
cantidad relativa de cada nutriente. Los microbilogos, en su trabajo cotidiano, estn
acostumbrados a manejar multitud de "recetas" o frmulas correspondientes a muchos tipos de
medios de cultivo.
72
Ramirez - Balqui
Un medio de cultivo es una solucin acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide
en estado de gel) en la que estn presentes todas las sustancias necesarias para el
crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s). Los medios de cultivo se pueden
clasificar, en primera instancia, en tres grandes tipos:
3). En tercer lugar, podemos fabricar un tipo de medio "mezcla" de los anteriores,
denominado medio semisinttico: llevan algunas sustancias qumicas cuya naturaleza y
cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composicin indefinidas.
Cualquiera que sea el tipo de medio, de los tres que acabamos de citar, podemos
elaborar dos tipos de "versiones", segn su estado aparente:
medios lquidos (por ejemplo, los dos de la tabla)
medios slidos: derivan de los lquidos simplemente aadiendo a la solucin nutritiva
un coloide en estado de gel, que solidifica (da consistencia) a esta solucin.
73
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
El gelificante ms usado es el agar-agar, extrado de algas rojas (p. ej. Gelidium), del
cual existen versiones ms o menos purificadas (las ms puras estn ms enriquecidas
en el polisacrido agarosa; son las que se emplean para los medios definidos, con objeto
de evitar la introduccin de sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las
interpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la bacteria).
El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los
100oC, lo que permite su uso para la inmensa mayora de bacterias, que son mesfilas.
Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautotrofos) se suele recurrir a un
gelificante inorgnico, el silicagel o gel de slice.
Medios selectivos son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de
microorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos slidos que
incorporan ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero
permiten el crecimiento de otras. (P. ej. medios que llevan violeta cristal inhiben el
crecimiento de bacterias Gram-positivas.
Medios diferenciales son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o ms tipos
de bacterias en funcin de su distinto comportamiento respecto de algn nutriente del
medio. Ese comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de
una sustancia indicadora presente en el medio.
Ejemplos:
en el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metablicos de bacterias
producen cambios de color y precipitacin de sales cuando producen cidos por
fermentacin de ciertas fuentes de carbono.
El medio llamado agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual
revela la capacidad (y el tipo) de hemolisis de ciertas bacterias.
Este medio es selectivo contra muchas bacterias Gram-positivas debido al violeta cristal,
y tambin contraselecciona muchas Gram-negativas debido a las sales biliares (que son
agentes tensioactivos que desorganizan muchas membranas externas). En cambio, las
Enterobacterias estn evolutivamente adaptadas a soportar sales biliares en su hbitat
natural (el intestino de vertebrados superiores), y pueden crecer en este medio.
74
Ramirez - Balqui
Las bacterias requieren aporte continuo y de acceso inmediato de energa, que es usada en
procesos de:
biosntesis (anabolismo)
transporte activo
translocacin de protenas a travs de la membrana citoplsmica
movimiento flagelar
bioluminiscencia
En bacterias, al igual que en eucariotas, la conservacin intracelular de energa ocurre
principalmente por medio de la sntesis de ATP:
La hidrlisis de ATP hasta ADP y P genera una variacin de energa libre Go'= -31 kJ (-7,3
kcal). La sntesis de ATP a partir de ADP y P requiere una Go' de +31 kJ. Los mtodos
usados por las bacterias para generar este ATP son principalmente:
fosforilacin a nivel de sustrato;
fosforilacin oxidativa;
fotofosforilacin (durante la fotosntesis).
Cada uno de estos procesos implica uno o varios pasos de reacciones redox exergnicas,
pero la manera en que esas reacciones exergnicas se acoplan a la sntesis de ATP vara
entre la fosforilacin a nivel de sustrato y las otras dos.
75
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
En esta reaccin se libera energa libre, cuyo valor viene expresado por la frmula:
G0'= - n F E0'
n = n de electrones transferidos
F = constante de Faraday = 96,6 kJvolt-1equivalentes--1
E0' es la diferencia entre los potenciales de reduccin del donador (pareja D/DH 2) y del
aceptor (pareja A/AH2).
Una reaccin redox exergnica de este tipo se puede acoplar a la consecucin de trabajo til:
formacin de un compuesto rico en energa;
formacin de un gradiente de concentracin y/o de carga elctrica a ambos lados de una
membrana.
Por lo tanto, los seres vivos, para poder obtener su moneda energtica (principalmente ATP),
han de captar alguna fuente de energa externa, del medio ambiente. Veamos, pues, cules
son los tipos de energa que captan las bacterias y los correspondientes tipos de
metabolismos energticos:
1. Si la energa procede de radiaciones (en los cuantos de una determinada longitud de onda
de la luz visible): bacterias fototrofas, que a su vez pueden ser:
a. fotolitotrofas: captan energa lumnica en presencia de sustancias inorgnicas;
b. fotoorganotrofas: captan energa lumnica con requerimiento de sustancias orgnicas.
2. Si la energa se desprende a partir de molculas qumicas en reacciones biolgicas de
xido-reduccin: bacterias quimiotrofas, que a su vez pueden ser:
a. quimiolitotrofas: captacin de energa qumica a partir de sustancias inorgnicas;
b. quimiorganotrofas: captacin de energa qumica a partir de sustancias orgnicas.
Veamos ahora lo que diferencia a grandes rasgos a la fosforilacin a nivel de sustrato respecto
de la fosforilacin oxidativa y la fotofosforilacin:
76
Ramirez - Balqui
77
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Hay una gran variedad de fermentaciones microbianas, y cada tipo libera uno o varios
productos de fermentacin caractersticos. Algunos ejemplos:
Recordemos que la c.t.e. est formada por una serie ordenada de molculas
transportadoras situadas (en bacterias) en la membrana citoplsmica (y en sus
invaginaciones), molculas que sufren oxidaciones y reducciones reversibles:
DH2 + A AH2 + D
78
Ramirez - Balqui
Como resultado de todo ello, tenemos que existen determinados puntos de la c.t.e.
(llamados bucles o lazos translocadores de protones) en los que el efecto neto es la
salida de protones al exterior de la membrana citoplsmica (concretamente, en los puntos
donde confluyen un transportador de H y otro de electrones). Es decir, existe una
translocacin de protones hacia el exterior ligada a las reacciones redox que ocurren en
la c.t.e.
Por otro lado, la membrana es impermeable a los protones, por lo que los protones
translocados a resultas del funcionamiento de las c.t.e. no pueden entrar directamente.
Por lo tanto, se crea un gradiente electroqumico de protones, compuesto de gradiente
osmtico de esos iones H+ (pH) y un gradiente de carga elctrica (). Este gradiente
es una forma de energa potencial que puede realizar trabajo.
El valor de este gradiente electroqumico de protones o fuerza protn motriz (f.p.m.) es:
Como ya dijimos, esta p (f.p.m.) es capaz de realizar trabajo, bajo la forma de:
transporte activo
alimentar el motor flagelar
sntesis de ATP.
Veamos, pues, cmo se produce esta sntesis de ATP a partir del gradiente de
protones:
La sntesis de ATP ocurre gracias al complejo ATP-asa, funcionando como ATP-
sintetasa. Este complejo consta de varios polipptidos que conforman dos porciones:
79
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
2H+ (ext) + ADP (int) + P (int) 2H+ (int) + ATP (int) + H2O (ext)
Vase en la Fig. la c.t.e. de Paracoccus, una bacteria que posee un sistema similar al
de las mitocondrias, donde se observan 3 sitios donde termodinmicamente la
variacin de energa libre es suficiente para apoyar la sntesis de una molcula de
ATP.
Vase tambin la c.t.e. de E. coli, cuando usa el O2 como aceptor final de electrones.
En esta cadena podemos constatar algo relativamente frecuente en las cadenas
bacterianas:
Por ejemplo, cuando Azotobacter (fijador aerobio de N2) crece fijando nitrgeno, usa
una ramificacin que gasta muchsimo oxgeno como aceptor final (aunque el
80
Ramirez - Balqui
rendimiento en ATP es menor); con ello logra evitar que entre oxgeno al citoplasma,
con lo que protege a la nitrogenasa de la inactivacin por oxgeno.
Respiraciones anaerbicas
Como ya hemos dicho, en algunas bacterias, al final de la c.t.e. puede existir un aceptor
diferente del oxgeno (respiracin anaerobia). Los aceptores y sus respectivos productos
reducidos (A AH2) son:
NO3-- N2
SO42- SH2
fumarato succinato
CO2 CH4
Fe3+ Fe2+
Con estos aceptores se obtiene menos energa que con el oxgeno, porque la pareja
O2/H2O es ms oxidante que las otras.
81
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
El uso disimilativo de nitrato se llama desnitrificacin, y ocurre por medio de una serie
de fases donde el N va cambiando su estado de oxidacin:
Las arqueobacterias metanognicas son los nicos seres vivos capaces de obtener
energa acoplando la oxidacin del hidrgeno molecular con el uso de CO 2 como aceptor
de electrones (actuando en estas condiciones como quimiolitotrofos):
Tipos de quimiolitotrofos
Insistamos en el hecho de que la capacidad de obtener energa por fosforilacin oxidativa
a partir de donadores inorgnicos de electrones slo ha evolucionado en ciertos grupos
de procariotas. Cada grupo fisiolgico usa un tipo de donador inorgnico:
bacterias de hidrgeno (H2)
bacterias del hierro (Fe2+)
bacterias del azufre (S , S ).
2- 0
Pero a excepcin del H2, los dems donadores inorgnicos de electrones tienen un
potencial de oxidacin E0' menor que el del NADH, por lo que la oxidacin de estos
donadores inorgnicos slo puede generar energa, pero no poder reductor de modo
directo. Para obtener poder reductor emplean transporte inverso de electrones: parte del
gradiente electroqumico creado se emplea en hacer que electrones viajen por la c.t.e. (o
una parte de ella) en sentido inverso, para poder reducir el NAD.
82
Ramirez - Balqui
En Oxifotobacterias, algas y plantas verdes, H2A = H2O, como agente reductor. Por lo tanto,
al oxidarse se genera O2.
En Anoxifotobacterias el reductor exgeno ("H2A") puede ser H2, S=, S2O3-, etc.
Las clorofilas del centro de reaccin son mucho menos abundantes que las del
complejo antena. Tpicamente son 4 molculas, de las cuales dos estn asociadas a
protenas, de modo que en este estado actan como "trampas" para los cuantos de
luz. Como veremos, estas clorofilas especiales, tras excitarse, se oxidan, por lo que
se denominan clorofilas fotoactivas. La luz convierte a estas clorofilas desde su
estado basal a su estado excitado, en el que tienen un E0' negativo, por lo que
entonces pueden ceder electrones (oxidarse) fcilmente.
83
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Complejo antena
Es un conjunto de pigmentos captadores de luz, en gran nmero (desde unos 50 hasta
miles). Sobre ellos incide la luz solar, de manera que se van transfiriendo la energa de
unos a otros, en paquetes (excitones), pero sin oxidarse, en un fenmeno conocido como
resonancia inductiva.
El complejo antena acta como un "embudo", captando energa lumnica, y canalizndola
hacia el centro de reaccin, donde como veremos enseguida, esta energa podr ser
convertida a una forma til.
84
Ramirez - Balqui
Antes de dar una visin ms detallada, veamos un pequeo resumen del modo de
funcionamiento del centro de reaccin:
Llega un cuanto de luz al par de bacterioclorofilas especiales. La bacterioclorofila
(Bcfla.) se excita (Bclfla*);
la Bclfla* excitada se oxida (pierde un electrn) Bclfla+;
el electrn es captado rpidamente por el aceptor inmediato (la bacteriofeofitina), que
a su vez lo pasa a la quinona cercana.
En todo este proceso se va produciendo una separacin de cargas, porque el
electrn va quedando cada vez ms separado de la Bclfla+ oxidada. El electrn pasar
a otra quinona situada fuera del C.R., convirtindose en un electrn de alta energa.
Los electrones no pueden salir del ciclo. Cuando los electrones pasan por la confluencia
entre una quinona y un complejo de citocromos se produce translocacin de protones al
exterior, lo que supone p, que a su vez se puede convertir en ATP.
85
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Como los electrones no pueden salir del ciclo, no se crea poder reductor. Por lo tanto,
este poder reductor ha de venir de otra fuente, y no del funcionamiento del fotosistema.
(Fuente qumica, que permite un flujo invertido de electrones).
Fotofosforilacin acclica
En Anoxifotobacterias: FFA anoxignica
El fotosistema I (FSI) se excita y la Bclfla. Se oxida (Bclfla+). Los electrones cedidos por el
C.R. sirven para reducir (junto con protones) al NAD (P)+ hasta NAD (P)H + H+ (es decir,
se crea poder reductor).
El FSII se excita por la luz (y como acabamos de decir, enva los electrones al FSI va
c.t.e.). Este FSII+ s puede regenerarse extrayendo los electrones del H2O,
desprendindose O2.
En resumen, el FSI+ acta como un aceptor final de electrones procedentes del FSII. A su
vez, el FSII+ (oxidado) se reduce directamente por el agua (merced a un complejo
enzimtico que contiene Mn, llamado complejo ltico del agua o "reloj oxidante del agua").
86
Ramirez - Balqui
una cromoprotena especial llamada bacteriorrodopsina, que forma "parches" de color prpura
en sus membranas citoplsmicas.
El retinal, como base de Schiff (con una carga positiva), tiene en principio la configuracin 13-
cis. Esta forma del retinal absorbe un cuanto de luz de = 565 nm, de lo que resulta un
bombeo de un protn fuera de la membrana. Para regenerar la base de Schiff, la forma neutra
anterior pasa conformacin todo-trans, capta un protn y pasa a la forma protonada 13-cis.
El funcionamiento del sistema crea, pues, un gradiente de protones, cuya disipacin a favor de
ATP-asas de membrana es convertido a ATP. Obsrvese que funciona como una bomba de
protones, que saca H+ al exterior.
H2O2 catalasa
H2O + 2 O2
H2O2 + NADH + H+
peroxidasa
2 H2O + NAD+
87
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Este radical es muy txico, de modo que todas las bacterias aerobias y anaerobias
aerotolerantes presentan el enzima superxido dismutasa (SOD), que cataliza la
conversin del superxido en oxgeno molecular y agua oxigenada, que a su vez se
destruye por los mecanismos que acabamos de ver:
2 O2 -
+ 2 H+
SOD
O2 + H2O2
Bacterias aerobias: Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas
ocasiones) como aceptor final de electrones para la captacin de energa qumica.
Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxgeno inferiores a la atmosfrica
(del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%). A estas bacterias se las califica como
microaerfilas.
Algunas microaerfilas lo son permanentemente (microaerfilas estrictas).
Otras se comportan como microaerfilas slo cuando crecen usando determinadas
fuentes de energa qumica o de nitrgeno (microaerfilas condicionales).
Bacterias anaerobias: Son aquellas que pueden crecer en ausencia de oxgeno, debido
a que pueden usar aceptores finales distintos del oxgeno, o porque poseen
metabolismo estrictamente fermentativo.
88
Ramirez - Balqui
CAPITULO V
89
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
90
Ramirez - Balqui
Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en funcin de su fondo
gentico, en relacin con los nutrientes, y en unas hipotticas condiciones ideales (ptimas).
Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores
ambientales, es decir, una serie de agentes fsicos y qumicos que
No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. As,
unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio
ser neutras o beneficiosas para otra.
Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre los
efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden
simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciacin (si la hubiera) o de
reproduccin.
91
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
92
Ramirez - Balqui
93
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
94
Ramirez - Balqui
dN
- KT .N
dt
O sea, y como se puede constatar en el grfico adjunto, la accin del calor supone la
muerte de una fraccin constante (KT) de la poblacin sobreviviente en cada momento.
La cintica de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos, sino que la
muerte se debe a la destruccin o inactivacin irreversible de una molcula o estructura
esencial (como p. ej. el ADN cromosmico o por creacin de un dao irreparable en la
membrana).
95
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Ejemplos
96
Ramirez - Balqui
Microorganismo Condiciones
La mayora de clulas vegetativas, de bacterias, 80oC, 5-10 min.
levaduras y hongos
bacilo tuberculoso 58oC, 30 min.
bacilo tuberculoso 59oC, 20 min.
bacilo tuberculoso 65oC, 2 min.
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis 60oC, 60 min.
La mayora de esporas de bacterias patgenas 100oC, pocos min.
esporas del patgeno Clostridium botulinum 100oC, 5,5 horas
esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 100oC, muchas horas
esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 120oC, 15 minutos
(Hay que tener en cuenta que, en la prctica, a veces hay que emplear
condiciones diferentes; por ejemplo: si queremos esterilizar grandes volmenes de
lquido, habr que prolongar el tratamiento, 30 o 40 min., ya que el centro del
recipiente donde va el lquido tarda ms en alcanzar la temperatura de
esterilizacin. Los medios de cultivo que incluyen glucosa deben esterilizarse a
115oC, ya que a temperaturas superiores la glucosa "carameliza"; por lo tanto, en
estas ocasiones, el tiempo tambin es mayor: 30 min).
La accin rpida del calor hmedo depende en buena parte del alto valor de calor
latente del agua (540 calg-1); ello hace que los objetos ms fros (como las
muestras a esterilizar) se calienten rpidamente por condensacin de agua en su
superficie.
97
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Durante las fases de tipo a) mueren todas las clulas vegetativas de la muestra,
pero permanecen viables las esporas, que quedan activadas para germinar.
Durante las fases de tipo b) se produce la germinacin de las esporas activadas
en la respectiva fase anterior. En la siguiente fase de tipo a) morirn las clulas
vegetativas procedentes de la germinacin en la fase anterior; y as
sucesivamente, hasta que al cabo de unos cuantos ciclos no queda ningn
microorganismo en la muestra.
98
Ramirez - Balqui
1-2 seg.).- Pero no siempre es imprescindible esterilizar la leche, sino que puede
bastar eliminar los posibles microorganismos patgenos que pueden contaminarla,
y que son ms sensibles al calor que los saprfitos inofensivos. Con esta
inactivacin parcial de la poblacin microbiana de la leche logramos que sta se
conserve durante unos das, sin alterar apenas sus cualidades organolpticas y
nutricionales. He aqu los procedimientos ms habituales para conseguir esto:
99
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
ej., especies patgenas de Neisseria), el efecto de este tratamiento sobre otras muchas
es, sobre todo, bacteriosttico, sin contar aquellos organismos psicrfilos o psicrotrofos.
Aplicaciones de la congelacin:
100
Ramirez - Balqui
Por ello, este mtodo es usado en el laboratorio para guardar cultivos durante
largas temporadas. El inconveniente de emplear nieve carbnica o nitrgeno
lquido es que hay que reponerlos con relativa frecuencia. Como veremos
enseguida, hay mtodos menos engorrosos y caros de mantener viables muestras
microbianas durante largos periodos de tiempo.
III. LIOFILIZACION.
La liofilizacin es la desecacin al vaco de una muestra previamente congelada. Aplicada a
bacterias, es uno de los mtodos que mantiene por ms tiempo la viabilidad bacteriana (varios
aos). Para obtenerla, el cultivo bacteriano se adiciona de leche o suero (vase epgrafe
anterior), se congela sobre nieve carbnica (-78oC), y se conecta a una bomba de vaco, que
provoca la desecacin. La eliminacin de toda el agua sobre la muestra congelada aumenta la
viabilidad de sta, que se guarda en ampollas cerradas de vidrio a temperatura ambiente,
hasta su uso, que como vemos, puede ser incluso muchos aos despus.
Ejemplos:
Mycobacterium tuberculosis (el bacilo tuberculoso) es muy resistente al aire (en ausencia
de luz), de ah que pueda aguantar varios meses a partir de los esputos de enfermos.
101
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
En cambio, el vibrin colrico (Vibrio cholerae) muere expuesto al aire al cabo de slo dos
horas.
c
E h.
102
Ramirez - Balqui
Rayos x: 9000-91 eV
Luz UV: 91-3.3 eV
Visible: 3.3-1.5 eV
Fuentes de radiaciones:
Las fuentes naturales nos llegan desde el espacio: radiaciones de la luz solar (visible +
UV) y los rayos csmicos. Sin embargo, la capa de ozono de la alta atmsfera sirve de
pantalla, evitando que lleguen a la biosfera las longitudes de onda del ultravioleta de
menos de 190 nm, que son las ms energticas.
1) Si la energa es E>10 eV, hablamos de radiaciones ionizantes: son los rayos X y los
rayos ..
El fotn de gran energa incide sobre el tomo, provocando la expulsin de un electrn
de gran energa (fotoelectrn), y quedando el tomo en forma ionizada (cargado
positivamente). El electrn expulsado suele tener energa suficiente para originar una
nueva ionizacin, de la cual surge otro electrn de alta energa, etc. producindose
una cadena de ionizaciones, con transferencia linear de energa, hasta que sta
se disipa en el material: el ltimo electrn de la cadena es captado por otro tomo o
103
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
En su regreso a su nivel energtico previo, el electrn puede dar origen a una variedad
de fenmenos:
fluorescencia: emisin de energa a una longitud de onda mayor que la del fotn
incidente;
fotosensibilizacin: la energa se transfiere a otra molcula;
reacciones fotoqumicas: se origina un cambio qumico;
emisin de calor: la energa simplemente se disipa en colisiones entre molculas.
La luz visible y UV pueden dar origen a reacciones fotoqumicas, aparte de calor. Pero
la radiacin infrarroja slo conduce a disipacin de calor, si bien ciertas bacterias
fotosintticas anoxignicas pueden aprovechar el infrarrojo para la fotosntesis.
En general, los microorganismos son ms resistentes a las radiaciones ionizantes que los
seres superiores. Por ejemplo, la dosis de reduccin decimal (D10) para las endosporas
de ciertas especies de Clostridium es de 2000-3000 Gy. Las clulas vegetativas de la
bacteria Deinococcus radiodurans (observe el nombre especfico) es de 2.200 Gy. Otras
especies ms "normales" poseen una dosis de reduccin decimal en torno a 200-600 Gy.
Compare estos datos con el valor de slo 10 Gy como dosis letal para humanos.
104
Ramirez - Balqui
Las fuentes de radiaciones ionizantes son los aparatos de rayos x, los rayos y los
radioistopos, como el Co60 o el Cs137.
Los efectos de las radiaciones ionizantes son letales, tanto directos como indirectos, as
como mutagnicos. Los efectos letales directos se logran a altas dosis de radiacin,
mientras que los letales indirectos y mutagnicos se consiguen a menores dosis.
1. Efecto letal directo: por impacto de cuantos de radiacin ionizante sobre alguna
molcula esencial para la vida. Los estudios cuantitativos demuestran que debe de
existir una molcula vital nica que, al ser alterada, provoca la muerte (teora del
golpe nico). Esta molcula debe ser el ADN (ya que obviamente es absolutamente
esencial y suministra una sola copia de la mayora de los genes bacterianos), y no
las protenas, de las que existen muchas copias en la clula, y que podran
regenerarse. Los daos al ADN son, principalmente: roturas en ambas cadenas, y
entrecruzamiento entre dichas cadenas, que no puedan repararse.
H + O2 HO2
2 HO2- H2O2 + O2
105
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios qumicos en las
molculas absorbentes, de modo que aparecen molculas alteradas denominadas
genricamente fotoproductos. Los fotoproductos originan la inactivacin de
macromolculas, aunque, como veremos enseguida, el ADN dispone de mecanismos
para paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas.
A dosis muy altas de rayos UV se forman tambin dmeros entre pirimidinas de las
dos cadenas, es decir, se provocan entrecruzamientos de las dos hebras que
igualmente afectan a la replicacin y a la transcripcin, aunque este tipo de daos
reviste menos significacin biolgica.
106
Ramirez - Balqui
A) Reparacin fotoenzimtica
Se debe a la actuacin de una enzima denominada fotoliasa o enzima
fotorreactivante, que muchas bacterias sintetizan de manera constitutiva. Las
fotoliasas reparan directamente los dmeros de pirimidina, en una reaccin
que requiere luz visible de 300-500 nm de longitud de onda (luz azul). Estas
enzimas poseen dos grupos prostticos coloreados (cromforos):
flavina reducida (FADH2)
una pterina.
Mecanismo
1. La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La fotoliasa
reconoce el dmero de pirimidina, y se une a l, formando un complejo
enzima-sustrato [E-S].
2. La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz ( = 300-
500), se excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dmero de
pirimidina, rompindolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar.
107
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Mecanismo:
1. Un complejo formado por dos subunidades de la protena UvrA y una de la
UvrB (Uvr [A2B]) se une cerca del dmero de pirimidina, usando la energa
de la hidrlisis del ATP, y merced a su actividad helicasa, desenrolla
localmente la doble hlice.
2. Se une la protena UvrC, con lo que se completa el complejo Uvr [A2BC],
es decir, la correndonucleasa, unido a la cadena daada del ADN, cerca
del dmero.
3. La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el
dmero: corta el 8 enlace fosfodister "a la izquierda" del dmero (o sea,
hacia el lado 5') respecto de la localizacin del dmero y corta el 4 o 5
enlace fosfodister "a la derecha" (en direccin 3' del dmero). Por lo tanto,
se produce y libera un fragmento de unos 12 nucletidos de longitud, que
incluye al dmero de pirimidina, al mismo tiempo que se retira la
escinucleasa, que se separa en sus polipptidos constituyentes.
4. Queda, pues, un hueco de cadena sencilla en el ADN. Este hueco es
ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II
(codificada por el gen uvrD), que llevan a la sntesis de nuevo ADN para
rellenar el hueco (por supuesto, en sentido 5'--->3'), tomando como molde
la cadena intacta, y usando como cebador ("primer") el extremo 3'-OH que
se haba generado en la fase anterior.
5. Finalmente, la actuacin de la ADN-ligasa sella la cadena (regeneracin
del enlace fosfodister del lado 5').
Mecanismo:
1. Numerosas unidades de protena RecA recubren la zona de cadena
sencilla de la mella posreplicativa, formando estructuras helicoidales.
108
Ramirez - Balqui
Descripcin del sistema en una clula normal (no sometida a daos al ADN):
109
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
110
Ramirez - Balqui
Por ejemplo, una lmpara de 15 watios emite una energa de 38m wattscm -2seg.-
1
, a una muestra situada a 1 metro de la lmpara.
El uso prctico de la luz UV como agente esterilizante est limitado, ya que tiene
poco poder penetrante: no entra en objetos slidos, y adems se ve apantallada
por el cristal y penetra poco en los lquidos. Su aplicacin concreta ms frecuente
es en el control de infecciones por va area: lmparas de desinfeccin en salas
de hospitales y de laboratorios de investigacin. En Microbiologa se emplea la luz
UV como agente mutagnico en bacterias (en muchos estudios que requieran
obtener mutantes correspondientes a cualquier tipo de fenotipos, para conocer las
correspondientes bases genticas).
Ciertas bacterias (entre ellas las fotosintticas, y las que se propagan va area)
poseen abundantes pigmentos de tipo carotenoide que las protegen de estos
efectos fotosensibilizadores. (Los carotenoides captan la energa del oxgeno
singlete y la reenvan al estado basal, no excitado).
111
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
112
Ramirez - Balqui
Bacterias barotolerantes:
Crecen a la presin atmosfrica, pero aguantan hasta unas 500 atmsferas. Su hbitat son las
aguas ocenicas, entre los 2000 y los 4000 metros de profundidad.
Bacterias barfilas:
Crecen ptimamente a ms de 400 atmsferas. Podemos distinguir entre barfilas moderadas
(facultativas) y barfilas extremas (obligadas):
Las barfilas moderadas son aquellas bacterias que pueden crecer a presin atmosfrica,
aunque su ptimo est a unas 400 atmsferas. Habitan profundidades entre los 5000 y 7000
metros.
Las barfilas extremas presentan ptimos de crecimiento a muy altas presiones (por encima de
600-700 atmsferas), y son incapaces de crecer a presin atmosfrica. Se han llegado a
aislar a ms de 10000 metros de profundidad. Debido a que a esas profundidades la
temperatura del agua es de slo 2-3oC, suelen ser simultneamente crifilas. Este tipo de
bacterias est empezando a ser investigado actualmente, y su manejo es engorroso, ya que
hay que cultivarlas en cmaras especiales presurizadas que suministran las altas presiones
que requieren.
113
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
A) En medios hipotnicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular la que ejerce
todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la
membrana citoplsmica tienda a sufrir una presin de turgor excesiva.
En un medio con baja osmolaridad (p. Ej., aguas fecales) aumenta la concentracin del
MDO, lo cual supone un aumento de la osmolaridad del periplasma, que presiona contra el
peptidoglucano. De esta manera la presin de turgor del protoplasto se transmite al
periplasma y de l al peptidoglucano, que es la estructura ms resistente.
B) En medios hipertnicos (cuando la aw del exterior es menor que la del citoplasma). Las
bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar la
osmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua del
ambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la
concentracin de un soluto muy soluble en agua en el interior celular, soluto llamado
genricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr por varios posibles
mecanismos:
bombeando iones al interior;
sintetizando una molcula orgnica osmticamente activa;
bombeando sustancias osmoprotectoras.
+
1. En el caso de los iones, el in bombeado suele ser el potasio (K ), por un sistema de
antiporte K+/H+. Ahora bien, para que no se desequilibre la fuerza inica, la entrada de
K+ suele ir en paralelo con una salida de otros cationes, que suelen ser poliaminas
(como la putrescina). Se ha propuesto que existe un sistema de antiporte K+/putrescina
que en ciertas bacterias tiende a mantener la fuerza inica mientras aumenta la
tonicidad interior, como sistema para compensar la alta tonicidad del medio. La seal
que desencadena el transporte de iones potasio es directamente la presin de turgor
de la membrana y no la osmolaridad externa.
114
Ramirez - Balqui
En ciertas enterobacterias lo que ocurre es una inhibicin del uso metablico del
glutamato, por lo que este se acumula.
Igualmente se da una acumulacin de trehalosa por induccin de una ruta biosinttica e
inhibicin de la ruta catablica.
Ahora bien, si el medio es muy hipertnico, estos mecanismos ya son incapaces de evitar
la salida de agua desde el citosol, lo cual conlleva una retraccin de la membrana
citoplsmica. La prdida de agua puede suponer la deshidratacin del citoplasma, lo que
conlleva la detencin del crecimiento.
En Gram-positivas se produce una plasmolisis autntica (retraccin de la membrana
citoplsmica respecto de la pared rgida suprayacente)
En Gram-negativas no existe autntica plasmolisis, ya que la pared celular y la
membrana citoplsmica se retraen al mismo tiempo. Las bacterias entricas crecen
lentamente por encima de 0.65M de NaCl.
115
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Halfilos moderados: suelen ser bacterias marinas que viven en 3.5% de NaCl, y que ven
inhibido su crecimiento a concentraciones mayores o menores de sales. Los halfilos
moderados tienen requerimientos concretos de una aw equivalente a la de agua de mar,
+ +
as como concentraciones determinadas de iones Na . El papel jugado por este Na es:
mantenimiento de los sistemas de membrana citoplsmica y transporte;
estabilizacin de la pared celular;
requerimiento por parte de muchas enzimas.
Dejando aparte las bacterias halfilas, hay algunas bacterias halotolerantes (como por
ejemplo, S. aureus), pero la inmensa mayora de los procariotas viven a valores de
actividad de agua de 0.98. Por ello, un mtodo que ya se conoca empricamente en la
antigedad para conservar ciertos alimentos era el desecarlos o salarlos, o aadirles
grandes cantidades de azcar (como en las mermeladas).
Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH 6 y pH 8, pero su pH interno es
siempre 7.6 o muy cercano a ese valor.
Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias, stas se pueden clasificar
en:
Neutrfilas, si crecen de modo ptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8.
Acidfilas, si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5.
Alcalfilas, si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5.
116
Ramirez - Balqui
La mayor parte de las bacterias son neutrfilas. Muchas bacterias neutrfilas modifican el pH
del medio, y resisten entornos relativamente cidos o alcalinos. Por ejemplo, algunas bacterias
fermentativas excretan cidos, mientras otras alcalinizan el medio, p. ej., produciendo amonio a
partir de desaminacin de aminocidos.
Si el pH interior cae en torno a 6 o 5.5, bacterias como E. coli o S. typhimurium inducen una
respuesta de tolerancia a cidos, consistente en ATPasas translocadoras de protones
(expulsan protones al exterior) y chaperonas (protenas celadoras) para corregir las protenas
desnaturalizadas.
Existen algunos notables procariotas cuyo pH ptimo es muy bajo (acidfilos extremos u
obligados): Algunas eubacterias del gnero Thiobacillus (T. thiooxidans, T. ferrooxidans) y las
arqueas del gnero Sulfolobus tienen su ptimo a pH 2, y generan ellas mismas estos bajos pH
al oxidar sulfuros hasta cido sulfrico. (Sulfolobus es un notable ejemplo de procariota
extremfilo: su hbitat son fuentes termales cidas y solfataras: es un termoacidfilo). De
hecho, estas bacterias necesitan esas altas concentraciones de H+ para mantener la integridad
de sus membranas y envueltas: a pH neutro esas envueltas se desintegran.
Las especies alcalfilas obligadas tienen ptimos de pH en torno a 10-11. Por ejemplo,
Bacillus alcalophilus, cuyo pH interno es de 9. Sus hbitats tpicos son suelos carbonatados y
lagunas alcalinas (algunos son tambin halfilos, como Natronobacterim gregoryi).
117
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
118
Ramirez - Balqui
CAPITULO VI
Conceptos generales.
Desinfectantes y antispticos.
Tipos de desinfectantes.
Quimioterpicos de sntesis y antibiticos. Introduccin.
Quimioterpicos de sntesis
Antibiticos
Resistencia bactriana a los antibiticos
Bases genticas de la resistencia
Mecanismos bioqumicos implicados en la resistencia a antibiticos
119
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
120
Ramirez - Balqui
I. CONCEPTOS GENERALES
Existen ciertas sustancias qumicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo
ejercer dos tipos de efectos diferentes:
bacteriostticos: cuando impiden el crecimiento bacteriano;
bactericidas: cuando destruyen (matan) las bacterias.
En general, si no slo nos referimos a las bacterias, sino a cualquier tipo de microorganismos,
hablamos respectivamente de agentes microbiostticos y microbicidas. Ahora bien, para
una misma sustancia qumica, la lnea de demarcacin entre un efecto microbiosttico y otro
microbicida depende muchas veces de la concentracin de dicha sustancia y del tiempo
durante el que acta.
Cmo podemos saber que un microorganismo est "muerto"? El nico criterio vlido es la
prdida irreversible de la capacidad de divisin celular, es decir, de la prdida de viabilidad, y
se suele comprobar empleando tcnicas con placas de Petri (es decir, confirmando que no
crecen en medios slidos adecuados). (Pero ni siquiera esto es garanta de que una bacteria
"no viable" est "muerta": hay bacterias viables pero no cultivables. Como se ve, demostrar que
una bacteria est "muerta" es algo bastante complicado).
Antes de proceder al estudio de las diversas molculas que pueden afectar el crecimiento y/o
la viabilidad de los microorganismos, veamos unas cuantas definiciones bsicas.
Agentes esterilizantes son aquellos que producen la inactivacin total de todas las
formas de vida microbiana (o sea, su "muerte" o prdida irreversible de su viabilidad).
(Tambin existen agentes fsicos esterilizantes, como ya vimos en los dos captulos
anteriores).
Agentes desinfectantes (o germicidas) son agentes (sobre todo qumicos)
antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patgenos (infecciosos) de un
material. Pueden (y en muchos casos suelen) presentar efectos txicos sobre tejidos vivos,
por lo que se suelen emplear slo sobre materiales inertes.
Agentes antispticos son sustancias qumicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis
o putrefaccin de materiales vivos. Se trata de desinfectantes con baja actividad txica
hacia los tejidos vivos donde se aplican.
Quimioterpicos son compuestos qumicos con actividad microbicida o microbiosttica,
con una toxicidad suficientemente baja como para permitir su administracin a un
organismo superior, en cuyos fluidos corporales y tejidos permanece estable un cierto
tiempo a concentraciones tales que los hace eficaces como antimicrobianos dentro del
organismo.
121
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Sin embargo, cuando se aplican menores concentraciones del agente, se pueden encontrar
cinticas diferentes, expresables como curvas sigmoidales:
Como se ve, hay un margen en el que la curva sigue una cintica de primer orden, pero dicha
cintica no se puede extrapolar: obsrvese que a tiempos prolongados la curva se hace casi
paralela al eje de abscisas, lo cual indica que queda una fraccin de clulas viables.
Existe una estrecha relacin entre la concentracin del agente y el tiempo necesario
para matar una determinada fraccin de la poblacin bacteriana, segn la siguiente
expresin:
c n . t K
Esta ecuacin nos dice qu relacin existe entre la variacin de la concentracin del
agente y el tiempo para matar una fraccin de la poblacin microbiana.
Por ejemplo:
los fenoles poseen un coeficiente de dilucin n = 5 6; ello implica que aun
pequeos cambios en la concentracin provocan cambios muy acentuados en el
tiempo para lograr un mismo efecto: as, si reducimos la concentracin de fenol
desde un valor dado a su mitad, necesitamos emplear 64 veces ms de tiempo para
conseguir matar una misma proporcin de bacterias.
En cambio, los hipocloritos (constituyentes de las lejas) tienen coeficiente n = 1, lo
que se refleja en que pequeos cambios en la concentracin requieren pequeos
cambios en el tiempo de aplicacin.
122
Ramirez - Balqui
pH.
El pH afecta tanto a la carga superficial neta de la bacteria como al grado de ionizacin
del agente. En general, las formas ionizadas de los agentes disociables pasan mejor a
travs de las membranas biolgicas, y por lo tanto son ms efectivos.
los agentes aninicos suelen ser ms efectivos a pH cidos;
los agentes catinicos muestran ms eficacia a pH alcalinos.
Temperatura
Normalmente, al aumentar la temperatura aumenta la potencia de los desinfectantes.
Para muchos agentes la subida de 10 grados supone duplicar la tasa de muerte. Pero
con el fenol, la subida de 10 grados representa multiplicar por 5 o por 8 la eficacia.
Ejemplos:
los agentes mercuriales se inhiben por sustancias que lleven grupos sulfhidrilo (-SH).
las sales cuaternarias de amonio se inhiben en presencia de jabones y lpidos.
Por lo tanto, para el empleo eficaz de muchos desinfectantes hay que contar con este
factor, determinando previamente el gasto de materia orgnica inerte, o calculando la
potencia neta del desinfectante en presencia de la materia orgnica.
123
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Para solucionar algunos de estos inconvenientes se han puesto a punto otros mtodos
de valoracin:
124
Ramirez - Balqui
3). Alcoholes.
a). etanol
b). isopropanol
3). Colorantes
a). derivados de la anilina
b). derivados de la acridina (flavinas)
125
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Detergentes inicos:
detergentes catinicos (grupo activo con carga positiva)
detergentes aninicos (grupo activo con carga negativa)
126
Ramirez - Balqui
3.1.2. Fenoles.
Son rpidamente bactericidas a bajas concentraciones, causando:
daos a membranas, con prdida de constituyentes citoplsmicos;
inactivacin irreversible de oxidasas y deshidrogenasas de membrana;
desnaturalizacin de protenas.
Tienen baja solubilidad en agua, por lo que se emplean en frmulas que incluyen
agentes emulsificadores (jabones) que, adems, aumentan su actividad.
127
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
3.1.2.1. Fenol.
El fenol o cido carblico, histricamente uno de los primeros
desinfectantes en usarse, slo se emplea en la actualidad como patrn
para ensayar el poder desinfectante de otros compuestos.
3.1.2.2. Cresoles.
Son los alquil-fenoles. El radical alqulico puede estar en posicin orto,
meta o para, dando respectivamente el orto-cresol, el meta-cresol y el para-
cresol. Normalmente se emplea la mezcla de los tres, denominada
tricresol.
128
Ramirez - Balqui
3.1.3. Alcoholes.
Los alcoholes desorganizan las bicapas lipdicas penetrando en la regin
hidrocarbonada de los lpidos. No afectan a las endosporas, por lo que no son
esterilizantes. Su accin desinfectante mejora conforme aumenta la longitud de la
cadena aliftica de los alcoholes, hasta aquellos con 8 a 10 tomos de carbono
(C8-C10), ya que los alcoholes de cadenas ms largas de C 10 tienen una baja
solubilidad en agua.
3.1.3.2. Isopropanol.
Es menos voltil y ms efectivo que el etanol. Se emplea igualmente en
desinfeccin de termmetros. Sin embargo, su efecto txico (narctico) es
mayor y ms duradero que aquel.
129
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Los ms efectivos son los derivados del mercurio y de la plata (actan a menos
de 1 ppm).
130
Ramirez - Balqui
3.3.2.1. Halgenos.
Son bactericidas muy tiles y muy potentes. El iodo no tiene parangn
como desinfectante de la piel, y el cloro no tiene igual en el tratamiento
de aguas.
131
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
ClOH H+ + ClO-
132
Ramirez - Balqui
Son muy selectivos hacia bacterias Gram-positivas, sobre las que son
efectivos a slo 0,2-2 ppm. En cambio, las Gram-negativas suelen ser
resistentes, debido a su membrana externa.
133
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Usos comerciales:
como gas, en la descontaminacin de habitaciones;
como formalina (solucin acuosa al 35%);
como paraformaldehido (polmero slido de 91-99% de pureza).
3.3.4.2. Glutaraldehdo.
Es menos txico y ms potente que el formaldehdo, y no se afecta por
materiales con protenas. Cada vez se emplea ms como esterilizante
fro de instrumental quirrgico. Es el nico recomendado para esterilizar
equipamiento de terapia respiratoria.
3.3.4.4. -propionil-lactona.
Es 25 veces ms activa que el formaldehdo. Acta como gas en
presencia de 80-90% de humedad relativa, aunque es poco penetrante.
134
Ramirez - Balqui
V. QUIMIOTERPICOS DE SNTESIS
5.1. INHIBIDORES EN LA RUTA DE BIOSINTESIS DEL TETRAHIDROFOLATO (THF).
La ruta biosinttica del cido tetrahidroflico est ilustrada en la Fig.1. El THF es lo que
se denomina habitualmente "donador de unidades de 1 tomo de carbono", y los seres
vivos lo requieren en ciertas rutas biosintticas:
biosntesis de los aminocidos Met, Gly. Adems, las Eubacterias lo necesitan para el
grupo formilo del fMet-ARNt (el ARN transferente que incorpora la formil-metionina al
comienzo de la protena).
Biosntesis de las purinas y pirimidinas, y sobre todo del dTMP.
Biosntesis del pantotnico.
Como veremos a continuacin, sobre algunos pasos de esta ruta acta una serie de
agentes quimioterpicos, muchos de ellos con gran importancia clnica.
135
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Sin embargo, se vio que este mismo compuesto no inhiba a los mismos
estreptococos in vitro, es decir, en tubo de ensayo o en placas de Petri. Cul era
la razn de este disimilar comportamiento de esta sustancia in vivo e in vitro? La
explicacin la encontr el matrimonio Trfoul (que a la sazn trabajaba en el
Instituto Pasteur): el metabolismo de los ratones rompe el Rojo de Prontosilo, que
por s mismo es inactivo contra las bacterias, generando el compuesto activo (con
actividad antibacteriana): la sulfanilamida (para-aminobencenosulfonamida).
Ejemplos:
sulfapiridina (por unin del grupo piridina)
sulfatiazol (con el grupo tiazol)
sulfadiazina (con el grupo pirimidina)
sulfaguanidina.
136
Ramirez - Balqui
5.1.2. SULFONAS.
Son derivados de la dapsona (4,4'-diamino-difenilsulfona). Aunque no se usa
contra infecciones normales, ha encontrado una importante aplicacin en el
tratamiento de la lepra (producida por Mycobacterium leprae); de hecho es el
quimioterpico de eleccin para esta enfermedad. Probablemente su mecanismo
de accin est basado en actuar como competidor del PABA.
137
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
y macrfagos, que son las clulas donde penetra el bacilo tuberculoso (que es un
parsito intracelular)
Al igual que el PAS, las sulfonas parecen actuar como competidores del PABA,
pero se desconoce la razn por la que estos dos compuestos sean tan especficos
de las especies patgenas de Mycobacterium.
Tienen efectos bactericidas, con alta afinidad hacia la enzima DHFR bacteriana,
pero baja hacia la DHTR de animales. Esto deriva del hecho de que, aunque la
mayor parte de los seres vivos tienen DHFR, la enzima bacteriana difiere en
estructura respecto de la de mamferos.
5.2. ISONIAZIDA.
Es la hidrazida del cido isonicotnico (tambin conocida por sus iniciales inglesas, INH).
Como se puede ver, es un anlogo estructural de dos vitaminas: la nicotinamida y el
piridoxal.
e incluso
intracelularmente, lo que permite su empleo contra las especies patgenas de
Mycobacterium, y en general contra bacterias cido-alcohol resistentes (Nocardia,
Corynebacterium).
138
Ramirez - Balqui
5.3. QUINOLONAS.
El cido nalidxico (4-oxo, 8-azaquinolina) se sintetiz en 1962, y encontr su aplicacin
en el tratamiento de infecciones por Gram-negativas del tracto urinario, donde se
concentra.
El bloqueo de las quinolonas sobre la girasa supone que sta queda "congelada" en la
fase en que el ADN est unido al enzima. Ello provoca la acumulacin de roturas de
doble cadena, lo que conduce a la muerte de la bacteria.
En la seccin 3.5 de este captulo (sobre antibiticos que inhiben el metabolismo de los
cidos nucleicos) veremos algunos que actan sobre las subunidades de tipo A.
5.4. NITROFURANOS.
Los nitrofuranos, como por ejemplo la nitrofurantona, tienen efecto contra Gram-positivas
y Gram-negativas, sobre todo en la orina, siendo poco efectivos en otros fluidos
corporales.
VI. ANTIBITICOS.
Los antibiticos son sustancias normalmente de bajo peso molecular producidas por seres
vivos (antibiticos naturales) o modificadas artificialmente a partir de ellas (antibiticos
semisintticos), que a pequeas concentraciones tienen efectos antimicrobianos (microbicidas
o microbiostticos), tras ser administrados por va adecuada a un organismo receptor.
Se conocen unos 5 000 antibiticos distintos, y cada ao se descubre unos 300 nuevos. Su
importancia econmica se pone de manifiesto al pensar en las 100.000 TM de antibiticos
producidas al ao, por un valor equivalente a 400.000 millones de pesetas.
139
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
La mayora de los antibiticos son molculas complejas, con regiones hidrofbicas que facilitan
el transporte al interior celular. Muchos poseen varios anillos, algunos de los cuales mejoran la
interaccin de la molcula con su diana macromolecular.
Para estudiarlos es ms til agrupar a los antibiticos no por clases segn su naturaleza
qumica, sino en funcin de las "dianas" sobre las que actan y con las que interfieren:
A) antibiticos que interfieren con la biosntesis de la pared celular
B) antibiticos que actan sobre la membrana celular
C) antibiticos que inhiben la sntesis de protenas
D) antibiticos que actan sobre la sntesis de cidos nucleicos.
Los antibiticos ms abundantes, y los mejor estudiados, son los que interfieren con enzimas
de la biosntesis del peptidoglucano de las eubacterias, y los que interfieren con la funcin del
ribosoma.
6.1.2. CICLOSERINA.
Producido por Streptomyces orchidaceus, este antibitico muestra cierto parecido
estructural con la D-alanina, lo que explica el hecho de que acta como inhibidor
competitivo de las dos reacciones secuenciales de la sntesis del PG donde
aparece la D-ala:
140
Ramirez - Balqui
La cicloserina tiene mayor afinidad que el sustrato natural (D-ala) hacia las dos
enzimas.
6.1.3. VANCOMICINA.
Es un glucopptido complejo producido por Streptomyces orientalis. Se une rpida
e irreversiblemente con el extremo D-alanil-D-alanina del pentapptido del
precursor del PG que se halla unido al undecaprenil-P (a nivel de membrana
citoplsmica), de modo que inhibe la reaccin de transglucosidacin.
6.1.4. RISTOCETINA.
Es un antibitico parecido al anterior, producido por Nocardia lurida, y que, al igual
que la vancomicina inhibe la transglucosidacin, siendo activo frente a Gram-
positivas.
6.1.5. BACITRACINA-A.
Producida por Bacillus subtilis variedad "tracy" (de ah su nombre), es un
antibitico polipeptdico provisto de un anillo tiazol, bactericida frente a muchos
Gram-positivos as como frente al Gram-negativo Neisseria. Es demasiado txico
(sobre todo nefrotxico) como para ser administrado sistmicamente, pero tiene
uso tpico (p. ej., en ciruga del colon).
141
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Ncleo Ejemplos
Penm Penicilinas
Cefn Cefalosporinas
Carbapenem Tienamicina
Oxacefn Moxalactam
Clavm Clavulnico
Monobactam aztreonm
PENICILINAS
Como ya sabemos, las penicilinas fueron los primeros antibiticos naturales en
descubrirse, pero en general, todos los -lactmicos tienen el mismo mecanismo
de accin. Nos concentraremos en estudiar las penicilinas.
La penicilina natural, purificada por primera vez en los aos 40, es la penicilina-G
(o benzil-penicilina), en la que el radical acilo es el grupo bencilo (fenilactico).
Esta penicilina presenta una serie de limitaciones e inconvenientes:
tiene un espectro estrecho: acta frente a estreptococos del grupo A y otros
cocos Gram-positivos, pero no frente a la mayora de bacterias Gram-
negativas.
Es sensible a cidos, por lo que no puede ser administrada va oral (se inactiva
a su paso por el estmago).
Es susceptible a enzimas inactivadoras (penicilinasas) producidas por muchas
bacterias.
Se elimina rpidamente por la orina (no permanece mucho tiempo en el
organismo receptor).
En algunos individuos puede provocar respuestas de hipersensibilidad (alergia
a la penicilina).
142
Ramirez - Balqui
143
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Esta es la base de las "recadas" de muchas infecciones, una vez que se ha dado
por terminado el tratamiento de un paciente con un antibitico -lactmico.
As pues, las PBPs 1 a 3 son esenciales para la bacteria, y son las dianas de las
penicilinas que explican la actividad bactericida. Se ha propuesto que el grupo -CO-
N- del anillo -lactmico funciona como un anlogo estructural del sustrato de las
transpeptidasas implicadas en la reaccin de entrecruzamiento (transpeptidacin)
entre el pptido del PG naciente y el del PG aceptor. La penicilina se combina con
el sitio activo de la transpeptidasa, dando un complejo enzima-penicilina (peniciloil-
transpeptidasa) inactivo y bastante estable.
144
Ramirez - Balqui
Desde un punto de vista biosinttico, derivan de los dos mismos aminocidos que
las penicilinas, pero aqu, uno de los metilos (-CH3) de la valina se incorpora al
anillo en vez de quedar fuera, haciendo que el anillo B sea el anillo dihidrotiazina.
MONOBACTMICOS
Tienen un ncleo monocclico (slo el anilo -lactmico). El derivado semisinttico
aztreonam se puede usar contra bacterias Gram-negativas aerobias (estrictas o
facultativas) como Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas y Enterobacterias.
CARBEPNICOS
Se basan en el ncleo del carbapenm. Ejemplos son las tienamicinas (como el
imipenm). Poseen un espectro muy amplio, con actividad intensa contra casi todas
las bacterias de inters mdico, incluyendo resistentes a otros antibiticos -
lactmicos: Staphylococcus aureus, Streptococcus, Pseudomonas, Bacteroides,
Haemophilus, Neisseria, etc.
INHIBIDORES DE LA -LACTAMASA
Un ejemplo tpico es el cido clavulnico (una oxa--lactama): tiene poca actividad
como antibitico, pero se une a las -lactamasas, inactivndolas
irreversiblemente. Actualmente los mdicos lo recetan con frecuencia en
combinacin con alguna ampicilina (una aminopenicilina, como vimos): la mezcla
ampicilina + clavulnico tiene efectos sinrgicos (se potencian el uno al otro). El
clavulnico pasa fcilmente a travs de porinas al espacio periplsmico de muchas
bacterias Gram-negativas, donde se acumula, y all inactiva a las -lactamasas;
mientras tanto, la ampicilina, "salvada" de la inactivacin de las lactamasas, puede
ejercer su efecto bactericida (por bloqueo de la transpeptidacin del PG).
145
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
POLIMIXINAS
Producidas por Bacillus polymyxa, son decapptidos cclicos con aminocidos en
L y D, y con abundancia del "raro" L-diaminobutrico (L-DAB), y que llevan unido
una cadena aliftica C8 (el 6-metil-octanoico).
TIROCIDINA-A Y GRAMICIDINA-S
Producidas por Bacillus brevis, son antibiticos plenamente cclicos, con efectos
similares a la polimixina.
6.2.2. IONOFOROS.
Los antibiticos ionforos actan aumentando grandemente la permeabilidad de la
membrana hacia iones inorgnicos especficos. Forman canales que atraviesan la
membrana, dejando un hueco central que permite el paso de cationes concretos,
lo que se traduce en una disipacin de los gradientes electroqumicos a
ambos lados de la membrana (destruyendo, por tanto, la capacidad de obtencin
de energa de las bacterias).
146
Ramirez - Balqui
VALINOMICINA
Es un depsipptido cclico, formado por la ciclacin de tres unidades del siguiente
mdulo:
D-hidroxibutrico-D-valina-Lactato-L-valina
GRAMICIDINA A
Es un antibitico a base de aminocidos alternantes en configuraciones D y L, que
forma una estructura helicoidal. Disipa iones K+, as como Na+ e H+. La
configuracin permite al antibitico formar una especie de cilindro donde la cadena
sigue una hlice que est estabilizada por puentes de H casi paralelos al eje del
cilindro, dejando un canal central de 0.4 nm de dimetro, y con las cadenas
laterales de los aminocidos dirigidas hacia auera, formando una especie de vaina
hidrfoba. Esto permite que la molcula se inserte a travs de la membrana,
dejando un canal por el que pueden pasar iones, con la consiguiente destruccin
del gradiente electroqumico.
147
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
dejan un canal central de uno 0,7 nm de dimetro, y con los grupos polares hacia
afuera. Esta estructura permite el paso libre de iones, as como el que se escapen
metabolitos (como la glucosa) desde la clula al exterior.
148
Ramirez - Balqui
149
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Efectos de la estreptomicina:
Diana de la estreptomicina: La estreptomicina ejerce su efecto antibitico
unindose a una zona concreta del ARNr 16S del ribosoma eubacteriano.
150
Ramirez - Balqui
Pues bien, cuando una bacteria que posee una mutacin puntual que inactiva una
determinada protena (fenotipo mutante) se pone en un medio con estreptomicina
u otro antibitico aminoglucsido, con cierta frecuencia la lectura errnea del
ARNm del gen mutante ("errneo") conduce a que la protena sea funcional,
generndose un fenotipo silvestre. A este fenmeno se le denomina supresin
fenotpica (en este caso inducida por estos antibiticos), para distinguirlo de la
supresin genotpica, que como veremos oportunamente, regenera el fenotipo
pero por medio de cambios en el genomio.
Sin embargo, hay que controlar bien las dosis, ya que puede provocar supresin
de mdula sea (aplasia medular); de hecho, casi no se emplea en pases de
Occidente, aunque se receta demasiado en el Tercer Mundo.
151
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
transferasa, cerca del sitio del ribosoma donde encaja el extremo aminoacil del
ARNt, en el sitio A.
Lincomicina y clindamicina.
La lincomicina est producida por Streptomyces lincolniensis, y la clindamicina es
un derivado clorado del anterior, mucho ms eficaz y con mejor absorcin
intestinal. Son tiles para tratar infecciones donde no pueda aplicarse penicilina, y
contra anaerobios como Bacteroides.
Mecanismo de accin: Se une a la protena L15, que forma parte del centro
peptidil-transferasa. Bloquea el paso de translocacin interfiriendo
especficamente con la liberacin del ARNt desacilado, es decir, impide que el
ARNt "descargado" (una vez que ha cumplido su misin al transferirse el pptido
naciente al aa-ARNt del sitio A) salga del sitio P; por lo tanto, el pp-ARNt cargado
y situado en el sitio A no puede translocarse al sitio P, y se produce la parada de
la sntesis de proteinas.
152
Ramirez - Balqui
cido fusdico
Es un derivado esteroideo producido por hongos del gnero Fusarium, usado
contra estafilococos resistentes a -lactmicos. Se une al factor de elongacin
EFG, inhibiendo la liberacin del complejo EFG-GDP, por lo que el pp-ARNt queda
fijado en el sitio P, lo cual impide que se pueda unir el complejo ternario EFTu-
GTP-ARNt.
Kirromicina y pulvomicina
Se unen al factor EFTu. La kirromicina bloquea la liberacin del complejo binario
EFTu-GDP; la pulvomicina bloquea la adicin de aa-ARNt al EFTu para formar el
complejo ternario.
Actinomicina-D (Dactinomicina)
Observar en la figura que su grupo cromforo tiene tres anillos y es planar; de
cada anillo de los extremos sale una lactona pentapeptdica. Esta estructura es
importante para entender su mecanismo de accin:
Mitomicina C
Al entrar a la clula es convertida a su forma hidroquinona, que es muy reactiva,
funcionando como un agente alquilante bifuncional que origina
entrecruzamientos entre las dos hebras del ADN. Las consecuencias de ello
son:
las dos hebras no pueden separarse durante el intento de replicacin, por lo
que sta se detiene.
A continuacin el ADN entrecruzado es atacado y destruido por las nucleasas
de la propia clula.
153
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Novobiocina y coumermicina
Se unen a la subunidad B de las ADN girasas bacterianas, impidiendo el
superenrollamiento negativo del ADN al competir por el sitio de unin de esta
subunidad al ATP.
Rifampicinas
Son antibiticos producidos por Streptomyces mediterranei, con buena actividad
contra bacterias Gram-positivas y contra Mycobacterium tuberculosis. Se han
usado en clnica molculas naturales (como la rifampicina) as como derivados
semisintticos (como la rifampina). Constan de un anillo cromforo aromtico
atravesado por un largo puente de naturaleza aliftica.
Estreptolidigina
Se une tambin a la subunidad de la ARN polimerasa, pero su efecto es inhibir
la fase de elongacin de la transcripcin.
Ya el mismo Paul Ehrlich, al introducir por primera vez la quimioterapia en protozoos, se dio
cuenta (1907) de que algunas cepas desarrollaban resistencia a la droga durante el curso del
tratamiento.
Tras el optimismo inicial que acompa a los xitos de la introduccin de las sulfamidas y
penicilinas (aos 40 y 50), se constat igualmente un fenmeno de surgimiento de resistencias
bacterianas a estas drogas. Si bien la quimioterapia ha doblegado las grandes epidemias
bacterianas del pasado, las enfermedades infecciosas siguen con nosotros, constituyendo un
serio problema.
154
Ramirez - Balqui
Sin embargo, algunos quimioterpicos de ltima generacin han vuelto a levantar esperanzas:
las fluoroquinolonas estn manteniendo e incluso incrementando su efectividad. Por otro lado,
hay que pensar en un dato de tipo evolutivo: la mayor parte de las especies bacterianas han
sido seleccionadas de modo natural con fenotipos sensibles a antibiticos; los cambios
genticos mutacionales que las convierten en resistentes puede que disminuyan su adaptacin
a otros factores ecolgicos, de modo que probablemente la presin de los antibiticos en
realidad conduzca en muchos casos a un equilibrio entre cepas sensibles y cepas resistentes.
De hecho se ha comprobado un descenso en la frecuencia de cepas resistentes a los
antibiticos que se introdujeron hace ms tiempo, lo que quiz indique que para ellos se est
alcanzando dicho equilibrio.
Aclaraciones de nomenclatura:
llamamos cepa insensible a aquella cuyo fenotipo silvestre le permite "resistir" de modo
natural a un determinado antibitico. La base de esta insensibilidad suele ser alguna
estructura de la bacteria que acta como barrera (como por ejemplo, la membrana externa
de Gram-negativas, que dificulta el paso de muchos agentes antibacterianos).
Llamamos cepa resistente a una variante surgida por cambios genticos a partir de un
fenotipo silvestre originalmente sensible.
155
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
este problema clnico. Una cepa bacteriana puede volverse resistente a un antibitico por dos
tipos principales de mecanismos:
1). mutacin en un gen cromosmico;
2). introduccin de un plsmido R de resistencia. Este segundo mecanismo supone el
problema ms serio, ya que:
a. est muy extendido;
b. puede conferir resistencia a varios antibiticos a la vez;
c. a diferencia del mecanismo mutacional, no suele suponer una desventaja adaptativa (no
disminuye la tasa de crecimiento de la bacteria ni le hace perder sus propiedades de
virulencia).
156
Ramirez - Balqui
Veamos un poco de historia: en los aos 50, poco despus de la introduccin de los
primeros antibiticos, se detect en Japn un espectacular aumento de pacientes de
disentera bacilar resistentes al tratamiento con varios de estos antibiticos. Las cepas
de Shigella dysenteriae aisladas de estos pacientes posean el fenotipo SuR, StrR, CmR,
TetR. Se comprob que los genes correspondientes a esas resistencias formaban parte
de un gran plsmido. Los plsmidos de este tipo se denominan plsmidos R. Pero an
ms: los mismos pacientes tenan en sus intestinos cepas de Escherichia coli (que
como sabemos ya, es un simple comensal que forma parte de nuestra flora endgena)
que eran igualmente resistentes a esos antibiticos. Ello sugera que este tipo de
plsmidos se poda transferir de unas especies a otras. La explicacin estribaba en un
fenmeno de intercambio dependiente de contactos clula-clula, llamado
conjugacin.
Aparte de los plsmidos R conjugativos existen otros no conjugativos, que sin embargo
pueden ser transferidos entre distintas bacterias por otros medios:
los plsmidos no conjugativos movilizables pueden ser transferidos por otro plsmido
conjugativo compatible residente en la misma clula.
por transduccin (mediante bacterifagos);
por transformacin (ADN desnudo del plsmido puede ser captado por una bacteria
sensible receptora;).
157
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Otro ejemplo de esta facultad de diseminacin y evolucin lo tenemos en que desde que
los hospitales hacen uso frecuente de detergentes catinicos como desinfectante, ha
crecido la proporcin de cepas de Staphylococcus resistentes a dichos agentes.
158
Ramirez - Balqui
159
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Como sabemos, los -lactmicos forman complejos covalentes estables con algunas de
las PBPs (peniciloil-PBPs), que hacen que estas autolisinas se inactiven. Pues bien,
existen indicios de que las -lactamasas seran unas "autolisinas" evolucionadas que en
vez de formar complejos estables con los -lactmicos, se habran especializado en
cortar el anillo lactmico (dando peniciloico) a expensas de su actividad transpeptidasa
original.
Resistencia al cloranfenicol
La resistencia al cloranfenicol suele deberse a una enzima inactivante de dicho
antibitico, denominada cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT), que normalmente est
codificada por genes plasmdicos. Uno de los genes de CAT de Gram-negativas ms
estudiados forma parte del transposn Tn9.
160
Ramirez - Balqui
Las fosforilaciones y adenilaciones se dan sobre grupos -OH susceptibles, mientras que
las acetilaciones recaen sobre determinados grupos -NH2.
Resistencia a la eritromicina
Ciertos plsmidos de cepas de Staphylococcus aureus y de Streptococcus codifican una
metilasa de ARN inducida por la presencia de eritromicina: esta enzima modifica por
metilacin un determinado nucletido del ARNr 23S de la subunidad grande del
ribosoma. Concretamente introduce dos metilos en el N de una determinada adenina,
usando S-adenosilmetionina (SAM) como donador. Esto produce un cambio
conformacional en el ribosoma que disminuye su afinidad hacia la eritromicina y hacia la
lincomicina (resistencia cruzada a los dos antibiticos).
161
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
Resistencia a trimetoprim
Muchos plsmidos R llevan un gen que codifica una dihidrofolatorreductasa (DHFR) muy
resistente al trimetoprim.
Resistencia a meticilina
En muchos hospitales medran cepas muy peligrosas de Staphylococcus aureus
resistentes al -lactmico meticilina. Estas cepas producen una forma especial de
protena PBP2 (la llamada PBP2a) que posee una baja afinidad por los -lactmicos,
incluyendo la meticilina. Parece que el gen codificador correspondiente reside en un
transposn.
162
Ramirez - Balqui
REFERENCIA BIBLIOGRAFICAS
1). ABRAHAM, E.P. (1981): Antibiticos beta-lactmicos. Inv. y Ciencia 59 (agosto): 30-41.
2). AHARONOVWITZ, Y., G. COHEN, J.F. MARTIN (1992): Penicillin and cephalosporin
biosinthetic genes: structure, organization, regulation and evolution. Annu. Rev. Microbiol.
46: 461-496.
3). ANRAKU, Y. (1988): Bacterial electron transport chains. Ann. Rev. Biochem. 57: 101-
132.
4). ANRAKU, Y., R.B. GENNIS (1987): The aerobic respiratory chain of Escherichia coli.
Trends Biochem. Sci. 12: 262- 266.
5). BAARBER, J. (1987): Photosynthetic reaction centres: a common link. Trends Biochem.
Sci. 12: 321-326.
6). BAGG, A., J.B. NEILANDS (1987): Molecular mechanism of regulation of siderophore-
mediated iron assimilation. Microbiol Rev. 51: 509-518.
7). BALDRY, P. (1981): La batalla contra las bacterias. Revert, Barcelona.
8). BASTARRECHEA, F., L. SERVIN-GONZALEZ, A.A. COVARRUBIAS (1986): Regulacin
de la asimilacin de compuestos nitrogenados en Escherichia coli. En: Bioqumica y
Biologa Molecular (coordinador: L. Cornudella). Salvat, Barcelona, pgs. 192-197.
9). BROCK, T.D. (1961): Milestones in Microbiology (reedicin de 1975). American Society
for Microbiology, Washington, D.C.
10). CAMPBELL, W.H., J.R.KINGHORN (1990): Functional domains of assimilatory nitrate
reductases and nitrite reductases. Trends Biochem. Sci. 15:315-319.
11). COLEMAN, G., W.J. COLEMAN (1990): Cmo producen oxgeno las plantas. Inv. y
Ciencia (abril): 50-
12). COLLARD, P. (1976): The development of Microbiology. Cambridge University Press,
Cambridge. Existe versin espaola: "El desarrollo de la Microbiologa", Ed. Revert.
13). CROSA, J.H. (1989): Genetics and molecular biology of siderophore-mediated iron
transport in bacteria. Microbiol. Rev. 53: 517-530.
14). CSONKA, L.N., A.D. HANSON (1991): Prokaryotic osmoregulation: genetics and
physiology. Annu. Rev. Microbiol. 45: 569-606.
15). CSONKA, L.N., W. EPSTEIN (1996): Osmoregulation. En: "Escherichia coli and
Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology", 2 edicin (F.C. Neidhart, ed.).
American Society for Microbiology Press. Washington, D.C., pgs. 1210-1223.
16). CUNDLIFFE, E. (1989): How antibiotic-producing organisms avoid suicide. Ann. Rev.
Microbiol. 43: 207-233.
17). de KRUIJF, P. : Cazadores de microbios. Biblioteca Cientfica Salvat.
18). DEBR, P. (1995): Louis Pasteur. Barcelona: Crculo de Lectores-Ediciones Debate.
19). DEMMING, J.W. (1987): Ecological strategies of barophilic bacteria in the deep ocean.
Microbiol. Sci. 3: 205-211.
20). DICKERSON, R.E. (1980): El citocromo c y la evolucin del metabolismo energtico. Inv.
y Ciencia (mayo): 76-88.
21). DUBOS, R. Louis Pasteur. Biblioteca Salvat de Grandes Biografas.
22). F.E.M.S. (1996): Extremophiles. Nmero especial de la revista FEMS Microbiology
Reviews, 18 (mayo).
23). FERGUSON, S.J. (1987): Denitrification: a question of the control and organization of
electron and ion transport. Trends Biochem. Sci. 12: 354-357.
163
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
24). FOSTER, J.W. (1992): Beyond pH homeostasis: the acid tolerance response of
Salmonellae. ASM News 58: 266-270.
25). FRANKLIN, T.J., G.A. SNOW (1989): Biochemistry of antimicrobial action (4th edition).
Chapman and Hall, Londres. Para los contenidos del presente tema, se recomienda el
captulo 3.
26). FRANKLIN, T.J., G.A. SNOW (1989): Biochemistry of antimicrobial action. Chapman and
Hall, Londres.
27). FRANKLIN, T.J., G.A. SNOW (1989): Biochemistry of antimicrobial action (4th edition).
Chapman and Hall, Londres. Se recomienda leer el captulo 8.
28). GARCIA LOBO, J.M., F. DE LA CRUZ (1990): Mecanismos de formacin de
transposones bacterianos con resistencia a mltiples antibiticos. En: "Microbiologa
1990" (coordinado por J. Casadess y F. Ruiz-Berraquero). pp. 45-51. Secretariado de
Publicaciones de la Universidad de Sevilla.
29). GARLAND, P.B. (1981): The evolution of membrane-bound bioenergetics systems: the
development of vectorial oxidoreductions. En: "Molecular and cellular aspects of microbial
evolution", pgs. 273-283. (Eds.: M.J. Carlile, J.F. Collins, B.E.B. Moseley). Cambridge
University Press, Cambridge.
30). HARDER, W., L. DIJKHUISEN (1983): Physiological responses to nutrient limitation. Ann.
Rev. Microbiol. 37: 1-23.
31). HARRISON Jr., A.P. (1984): The acidophilic thiobacilli and other acidophilic bacteria that
share their habitat. Ann. Rev. Microbiol. 38: 265-292.
32). HERRERO, A., E. FLORES (1990): Las cianobacterias: fotosntesis y fijacin de
nitrgeno. En "Microbiologa 1990", pg. 112-121. Univ. de Sevilla.
33). HOOPER, A.B., A.A. DISPIRITO (1985): In bacteria which grow on simple reductants,
generation of a proton gradient involves extracytoplasmic oxidation of substrate.
Microbiol. Rev. 49: 140-157.
34). HOWARD-FLANDERS, P. (1982): Reparacin inducible del ADN. Inv. y Ciencia 64
(enero): 28-37.
35). INGRAHAM, J.L., A.G. MARR (1996): Effect of temperature, pH and osmotic stress on
growth. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular
biology", 2 edicin (F.C. Neidhart, ed.). American Society for Microbiology Press.
Washington, D.C., pgs. 1570-1578.
36). JAHN, I., R. LTHER, K. SENGLAUB (eds.) (1990): Historia de la Biologa. Labor,
Barcelona. (Original alemn: VEB Gustav Fischer Verlag, Jena 1985).
37). JONES, C.W. (1982): Bacterial respiration and photosynthesis. ASM, Whashington, D.C.
38). KLEINHAUF, H., H. von DHREN (1987): Biosynthesis of peptide antibiotics. Ann. Rev.
Microbiol. 41: 259-289.
39). KOLTER, R., F. MORENO (1992): Genetics of ribosomally synthesized peptide
antibiotics. Annu. Rev. Microbiol. 46: 141-164.
40). KRIEG, N.R. (1988): Bacterial classification: an overview. Can. J. Microbiol. 34: 536-540.
41). KRULWICH, T.A. (1990): Bacterial energetics. Academic Press, Londres.
42). KRULWICH, T.A., A.A. GUFFANTI (1989): Alkalophilic bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 43:
435-463.
43). KUSHNER, S.R. (1987): DNA repair. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium.
Cellular and molecular biology". (F.C. Neidhart, ed.). American Society for Microbiology.
Washington, D.C. (1987), pgs. 1044-1053.
164
Ramirez - Balqui
44). LESSIE, T.G., P.V. PHIBBS, jr. (1984): Alternative patways of carbohydrate utilization in
Pseudomonads. Ann. Rev. Microbiol. 38: 359-387.
45). LINDAHL, T., B. SEDGWICK, M. SEKIGUCHI, Y. NAKABEPPU (1988): Regulation and
expression of the adaptative response to alkilating agents. Ann. Rev. Biochem. 57: 133-
157.
46). LOSADA, M. (1977): Los distintos tipos de fotosntesis y su regulacin. Inv y Ciencia
(abril): 6-8.
47). MADIGAN, M.T., B.L. MARRS (1997): Extremfilos. Inv y Ciencia 249 (junio): 60-66.
48). MARGULIS, L., K.V. SCHWARTZ (1985): Cinco Reinos. Labor, Barcelona.
49). MARTIN, J.F., P. LIRAS (1989): Organization and expression of genes involved in the
biosynthesis of antibiotic and other secondary metabolites. Ann. Rev. Microbiol. 43: 173-
206.
50). MATIN, A. (1978): Organic nutrition of chemolithotrophic bacteria. Ann. Rev. Microbiol.
32: 433-468.
51). MATIN, A., E.A. ANGER, P.H. BLUM, J.E. SCHULTZ (1989): Genetic basis of starvation
survival in nondifferentiating bacteria. Ann.Rev. Microbiol. 43: 293-316.
52). MAURER, I.M. (1969): A test for stability and long-term effectiveness in disinfectants.
Pharm. J. 203: 529-534.
53). MILLER, K.J., J.M. WOOD (1996): Osmoadaptation by rhizosphere bacteria. Annu. Rev.
Microbiol. 50: 101-136.
54). MURRAY, R.G.E. (1984): Higher taxa, or a place for everithing...?. En: "Bergey's manual
of Systematic Bacteriology". Williams & Wilkins, Baltimore.
55). MYERS, T. (1988): Failing the test: germicides or use dilution technology? ASM News 54:
1921.
56). NEIDHART, F.C., J.L. INGRAHAM, M. SCHAECHTER (1990): Physiology of the bacterial
cell: a molecular approach. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. Consultar el
captulo 8.
57). NEIDHART, F.C., J.L. INGRAHAM, M. SCHAECHTER (1990): Physiology of the bacterial
cell: a molecular approach. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. Consultar el
cap. 5, especialmente pgs. 148-171.
58). NEIDLANS, J.B. (1982): Microbial envelope proteins related to iron. Ann. Rev. Microbiol.
36: 285-309.
59). NELSON, N., L. TAIZ (1989): The evolution of H+-ATPases. Trends Biochem. Sci. 14:
113-116.
60). NICHOLS, D.G. (1987): Bioenergtica: introduccin a la teora quimiosmtica. Ed.
Revert, Barcelona. (Versin original: "Bioenergetics- an introduction to the
Chemiosmotic Theory", Academic Press, Londres, 1982., pero acaba de salir -1993- la
segunda edicin inglesa).
61). PARMEGGIANI, A., G.W.M. SWART (1985): Mechanism of action of kirromycin-like
antibiotics. Ann. Rev. Microbiol. 39: 557-577.
62). POOLE, R.K., W.J. INGLEDEW (1987): Patways of electrons to oxygen. En: "Escherichia
coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology". (F.C. Neidhart, ed.).
American Society for Microbiology. Washington, D.C. (1987), pgs. 170-200.
63). RADMAN, M., R. WAGNER (1988): Fidelidad en la duplicacin del ADN. Inv. y Ciencia
145 (octubre): 20-29.
64). REES, D.C., H. KOMIYA, T.O. YEATES, J.P. ALLEN, G. FEHER (1989): The bacterial
165
Microbiologa y Medios de Cultivo Prctica de Laboratorio
photosynthetic reaction center as a model for membrane proteins. Ann. Rev. Biochem.
58: 607-633.
65). RUPP, W.D. (1996): DNA repair mechanisms. En: "Escherichia coli and Salmonella
typhimurium. Cellular and molecular biology", 2 edicin (F.C. Neidhart, ed.). American
Society for Microbiology Press. Washington, D.C., pgs. 2277-2294.
66). SALYERS, A.A., B.S. SPEER, N.B. SHOEMAKER (1990): New perspectives in
tetracycline resistance. Molec. Microbiol. 4: 151-156.
67). SANCAR, A., G.B. SANCAR (1988): DNA repair enzymes. Ann. Rev. Biochem. 57: 29-67.
68). SANCAR, G.B., A. SANCAR (1987): Structure and function of DNA photolyases . Trends
Biochem. Sci. 12: 259-261.
69). SANDERS, C.C. (1987): Chromosomal cephalosporinases responsible for multiple
resistance to newer beta-lactam antibiotics. Ann. Rev. Microbiol. 41: 573-593.
70). SLONCZEWSKI, J.L., J.W. FOSTER (1996): pH-regulated genes and survival at extreme
pH. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology", 2
edicin (F.C. Neidhart, ed.). American Society for Microbiology Press. Washington, D.C.,
pgs. 1539-1550.
71). SPENCER, M.E., J.R. GUEST (1987): Regulation of citric acid cycle genes in facultative
bacteria. Microbiol Sci. 4: 164-168.
72). STACKEBRANDT, E. (1988): Phylogenetic relationships vs. phenotypic diversity: how to
achieve a phylogenetic classification system of the eubacteria. Can. J. Microbiol. 34: 552-
556.
73). TABITA, F.R. (1988): Molecular and cellular regulation of autotrophic carbon dioxide
fixation in microorganisms. Microbiol. Rev. 52: 155-189.
74). TEMPEST, D.W., O.M. NEIJSSEL (1984): The status of YATP and maintenance energy as
biologically interpretable phenomenon. Ann. Rev. Microbiol. 38: 459-486.
75). TRIEU-CUOT, P., M. ARTHUR, P. COURVALIN (1987): Origin, evolution and
dissemination of antibiotic resistance genes. Microbiol. Sci. 4: 263-266.
76). Van VERSEVELD, H.W., G. BOSMA (1987): The respiratory chain and energy
conservation in the mitochondrion-like bacterium Paracoccus denitrificans. Microbiological
Sci. 4: 329-333.
77). VINING, L.C. (1990): Functions of secondary metabolites. Ann. Rev. Microbiol. 44: 395-
427.
78). WALKER, G.C. (1996): The SOS response of Escherichia coli. En: "Escherichia coli and
Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology", 2 edicin (F.C. Neidhart, ed.).
American Society for Microbiology Press. Washington, D.C., pgs. 1400-1416.
79). WOMBLE, D.D., R.H. ROWND (1988): Genetic and physical map of plasmid NR1:
comparison with other IncFII antibiotic resistance plasmids. Microbiol. Rev. 52: 433-451.
80). WOOD, H.G., S.W. RAGSDALE, E. PEZACKA (1986): The acetyl-CoA pathway: a newly
discovered pathway of autotrophic growth. Trends Biochem. Sci. 11: 14-17.
81). YOUVAN, D.C., B.L. MARSS (1987): Mecanismo molecular de la fotosntesis. Inv. y
Ciencia 131 (agosto): 34-41.
82). ZACCAI, G., H. EISENBERG (1990): Halophilic proteins and the influence of solvent on
protein stabilization. Trends Biochem. Sci. 15: 333-337.
83). ZUBER, H. (1986): Structure of ligth-harvesting antenna complexes of photosynthetic
bacteria, cyanobacteria and red algae. Trends Biochem. Sci. 11: 414-419.
166
Ramirez - Balqui
167