LICENCIATURA EN CIENCIA Y

TECNOLOGA
DE LOS ALIMENTOS

QUMICA
DE LOS ALIMENTOS

NALISIS DEL CONTENIDO

DE PROTENAS
EN LOS ALIMENTOS

2015
Dra. Roxana Verdini

rverdini@fbioyf.unr.edu.ar
 Mtodos de anlisis del contenido
protenas en alimentos
La determinacin
de la CANTIDAD DE
PROTENA de un alimento no es sencilla y el
valor obtenido en cada caso depende del
MTODO utilizado.
Muchos ensayos dependen de la PRESENCIA
DE UNA DETERMINADA CADENA LATERAL
AMINOACDICA (Lowry, Biuret).
los resultados analticos se vern
condicionados por la proporcin del
aminocido en cuestin en las protenas
sometidas al ensayo y necesitarn ser
referidos a alguna protena estndar.
Otros mtodos se basan en la determinacin
del contenido de NITRGENO
TOTAL
(Kjeldahl).
 Mtodos de anlisis del contenido
protenas en alimentos

Existen numerosas fuentes de NITRGENO

NO PROTEICO q que p pueden interferir en
algunos mtodos de anlisis:

aminocidos
i id libres,
lib pptidos
tid
pequeos, cidos nucleicos,
fosfolpidos aminoazcares,
fosfolpidos, aminoazcares porfirina,
porfirina
algunas vitaminas, alcaloides, cido
rico, urea, iones amonio, etc.

Otras fuentes de interferencia pueden ser

los otros macronutrientes presentes en los
alimentos como hidratos de carbono y lpidos.
 Mtodos de anlisis del contenido
protenas en alimentos
Los mtodos mas comnmente empleados son:

Kjeldahl

Kjeldahl/Bethelot

Bi
Biuret
t

Lowry

Absorbancia a 280 nm

Fijacin de colorantes

Turbidimtrico
 Mtodos de anlisis del contenido
protenas en alimentos
Estos mtodos se fundamentan en:

determinaciones de nitrgeno

enlaces peptdicos

aminocidos
i id aromticos
ti

absortividad UV de las protenas

grupos amino libres

propiedades de dispersin de la luz

capacidad de adhesin de colorantes

 Mtodo de Kjeldahl
j

Es un mtodo oficial descrito en mltiples

p
normativas: AOAC, ISO, Farmacopeas y
distintas Directivas Comunitarias.

Se basa en los siguientes supuestos:

la
l proporcin
i ded nitrgeno
it no protenico
t i
en un producto alimenticio es demasiado
pequea para ser significativa,
significativa
una determinacin del contenido de
nitrgeno total (refleja con suficiente
precisin el contenido de protena del
alimento,
alimento
la proporcin que representa el nitrgeno
en la mayor parte de las protenas
alimenticias es de 16%.
 Mtodo de Kjeldahl
j

FUNDAMENTO

Involucra la conversin del nitrgeno

presente
t a sulfato
lf t d
de amonio
i por
DIGESTIN, DESTRUCCIN OXIDATIVA O
MINERALIZACIN con cido sulfrico.
sulfrico

Posteriormente el sulfato de amonio se

descompone por ALCALINIZACIN con
hidrxido de sodio y DESTILACIN del
amonaco liberado captndolo en una solucin
cida.

Finalmente se realiza una VALORACIN

del amonaco.
amonaco
 Mtodo de Kjeldahl
j
El cido sulfrico OXIDA LA MATERIA
ORGNICA y se combina con el amonio
formado.
Los elementos
L l carbono
b e hidrgeno
hid se
convierten en dixido de carbono y agua.
Durante la digestin se libera el nitrgeno
proteico para formar iones de amonio.
Esta determinacin incluye todo el
nitrgeno reducido presente (-NH2 y =NH),
de modo que los compuestos amoniacales,
urea y aminocidos libres son tambin
valorados.
valorados
El uso de perlas de vidrio sirve de ncleo
para la
l formacin
f i de
d burbujas.
b b j
 Mtodo de Kjeldahl
j
ECUACIONES

Digestin:

n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

Neutralizacin y destilacin

(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O

NH3 + H3BO3 NH4+ + H2 BO3-

Titulacin

H2BO3- + H+ H3BO3
 Mtodo de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA

En 1883 el investigador dans Johann

Kj ld hl desarroll
Kjeldahl d ll ell proceso bsico
b i d l
del
conocido mtodo actual de anlisis de
protenas por el mtodo Kjeldahl,
Kjeldahl ms
propiamente, para analizar nitrgeno
g
orgnico.

El mtodo original fue sufriendo luego

algunas
l modificaciones.
df

Wilforth (1885)
Gunning (1889)
Arnold
Winkler
 Mtodo de Kjeldahl

UN POCO DE HISTORIA

En el mtodo original la digestin se

efectuaba con una mezcla de cido sulfrico y
anhdrido fosfrico y la oxidacin se
completaba
p mediante la adicin de
permanganato de potasio.

Las modificaciones
df d l mtodo
del d que han
h
resultado ms tiles emplean:
xido de mercurio como catalizador
de oxidacin (Wilfoth).
K2SO4 para aumentar t ell punto
t de
d
ebullicin del cido sulfrico (Gunning).
CuSO4 tambin como catalizador de
oxidacin (Arnold).
 Mtodo de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA
Los catalizadores permiten acortar el tiempo
de digestin y actan como transportadores de
O2 .
Cuando se usa Hg como catalizador, ste debe
ser precipitado mediante el agregado de tiosulfato
de sodio para liberar el NH3.
Otra modificacin ampliamente aceptada es la
introducida en la etapa de destilacin propuesta
por Winkler:
originalmente se utilizaba cido sulfrico
valorado para captar el amonaco,
amonaco
titulando posteriormente su exceso con
NaOH valorado.
valorado
 Mtodo de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA

La modificacin consiste en:

recibir el NH3 sobre una solucin de

cido brico,
valorarlo directamente con solucin
valorada de H2SO4 (Winkler) o HCl.

Ventajas: la solucin de cido brico no necesita

ser exactamente medida,
medida eliminando los errores en
la medicin del cido valorado en el colector y por
otra parte slo se requiere una solucin valorada
H2SO4 o HCl.
 Mtodo de Kjeldahl
j
ESQUEMTICAMENTE
 Mtodo de Kjeldahl
j
ESQUEMTICAMENTE
 Mtodo de Kjeldahl
j
UNIDADES DE DIGESTIN Y DESTILACIN
 Mtodo de Kjeldahl
j

ALGUNOS EQUIPOS

Los equipos
p mas modernos vienen con un
sistema de EXTRACCIN Y
NEUTRALIZACIN DE GASES:

una unidad Scrubber q

que bloquea
q el
paso y neutraliza las condensaciones
cidas,

una bomba de recirculacin de agua que

proporciona un gran caudal de vaco para
la aspiracin de los gases.
 Mtodo de Kjeldahl
j
UNIDADES DE DIGESTIN, SCRUBBER Y BOMBA
 Mtodo de Kjeldahl
j
DESTILADORES
 Mtodo de Kjeldahl
j
DESTILADORES Y TITULADORES
 Mtodo de Kjeldahl

VENTAJAS DEL MTODO

Apropiado para varios tipos de

productos.
d
Alta confiabilidad.
Usado como mtodo de referencia.

DESVENTAJAS DEL MTODO

Interfieren compuestos nitrogenados no

proteicos.
proteicos
Uso de catalizadores txicos o caros.
Eleccin del factor de conversin.
 Mtodo de Kjeldahl
j

FACTOR DE CONVERSIN
El contenido porcentual promedio de N en
las protenas de diversos alimentos es de
16%.
El factor para convertir N en protenas
sera entonces 100/16 = 6,25.
Este factor general de conversin no es sin
embargo exacto, ya que las protenas de
origen animal contienen generalmente menos
nitrgeno y las de origen vegetal ms.
As,
As el factor de conversin para la
protena del trigo es 5,7 y para la de
productos lcteos es 6,38.
 Mtodo de Kjeldahl
j

FACTOR DE CONVERSIN

Actualmente se conoce el contenido de N, y

por lo tanto el factor apropiado,
apropiado de una gran
cantidad de productos agrcolas.

Debido
bd a lla confusin
f que podra
d derivarse
d
del hecho de utilizar el factor general de
conversin 6,25
6 25 o el especfico para la
protena en estudio

Es necesario aclarar siempre en los

informes el factor de conversin utilizado
para ell clculo
l l ded protenas.
t
 Mtodo de Kjeldahl
j
FACTOR DE CONVERSIN
 Mtodo de Kjeldahl
j
ECUACIONES

Digestin:

n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

Neutralizacin y destilacin

(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O

NH3 + H3BO3 NH4+ + H2 BO3-

Titulacin

H2BO3- + H+ H3BO3
 Mtodo de Kjeldahl
j
CLCULOS

%N = V x N x 14 x 100
1000 p

%N = V x N x 0,014 x 100
p

V: mL de cido
N: normalidad del cido
P: gramos de muestra
,
0,014: equivalente
q volumtrico del N
 Mtodo de Kjeldahl
j
Mtodo de Kjeldahl/Berthelot
Este mtodo
E d combina
b l d
la digestin
hmeda
h d
del mtodo de Kjeldahl con la reaccin
colorimtrica de Bethelot.
Bethelot
Al producto de la digestin se le reduce la
acidez,
id ll
lleva a volumen
l fi l y luego
final l una
alcuota se somete a la reaccin
colorimtrica.
colorimtrica
El NH4+ presente en la digestin sulfrica
reacciona
i con ell fenol
f l e hipoclorito
hi l it ded sodio
di
en medio alcalino, formndose un complejo de
color azul.
azul
La intensidad del color producido es
directamente proporcional a la cantidad de N
amoniacal presente en la muestra.
 Mtodo de Kjeldahl
j

Mtodo de Kjeldahl
j /Berthelot

La absorbancia del complejo

p j de se lee
a 540 nm.

Se calibra con solucin de sulfato de

amonio.

Por lo tanto lo que se determina por

este
t mtodo
t d es NITRGENO TOTAL.
TOTAL
 Otros mtodos
m

Los alimentos son una matriz compleja

p j
por lo que se sugiere que estos mtodos
empricos
p e indirectos sean calibrados con
el mtodo de Kjeldahl.

Se espera una buena correlacin entre

estos dos tipos de determinaciones de
protena
cuando la l relacin
l N no
proteico/N proteico es baja y constante.

Son satisfactorios para leche y

cereales
l e insatisfactorios
i ti f t i para la
l
mayora de los vegetales y mezclas de
alimentos.
alimentos
 Otros mtodos
m

Mtodo de absorbancia a 280 nm

El mtodo se basa en la medicin de
absorbancia a 280
80 nm.
La mayora de las protenas muestran una
absorcin a 280 nm.,
nm la cual se atribuye al
grupo fenlico de la tirosina y al grupo
p
indlico del triptofano.
 Otros mtodos
m
Mtodo de absorbancia a 280 nm
Es un mtodo
E d simple,
l rpido
d y no
destructivo.
Es un mtodo directo para la
determinacin de protenas que puede
aplicarse
li en algunos
l sistemas
i t alimenticios.
li ti i
Es necesaria la calibracin con una
protena estndar.
Generalmente se toma una protena
p
como la Albmina Srica Bovina (BSA), que
es soluble en agua, para construir curvas
patrn
que sirvan ded referencia
f para
cuantificar otras protenas, que sern ms
precisas mientras la protena en cuestin
se parezca ms a la BSA.
 Otros mtodos
m
Mtodo de absorbancia a 280 nm
La solucin
l debe
d b ser clara
l e incolora,
l l
la
turbidez puede afectar los resultados.
El contenido de aminocidos aromticos
difiere considerablemente entre las distintas
protenas.
t
Los cidos nucleicos interfieren (anillos de
purina y pirimida), no as el amonio.
 Otros mtodos
m
Mtodo de Biuret
Comprende un ensayo colorimtrico de un
paso donde se cuantifica la formacin de un
p j estable entre p
complejo protenas y cobre ((II))
de configuracin desconocida.
El complejo presenta un color violeta
caracterstico, que se puede observar a
310nm o 540-560nm, el cual se da p por la
coordinacin de un tomo de cobre con cuatro
tomos de nitrgeno.
El complejo se basa en la desprotonacin de
los grupos amida para formar el enlace con el
cobre (II) o por el establecimiento de un
enlace coordinado entre el metal y los pares
d electrones
de l t lib
libres d los
de l tomos
t d oxigeno
de i
y de nitrgeno del pptido.
 Otros mtodos
m

Mtodo de Biuret
 Otros mtodos
m

Mtodo de Biuret
Despus de la adicin del reactivo de
cobre se requiere de tiempo para desarrollar
una coloracin de Biuret estable; es necesario
considerar la posible influencia de aminocidos
libres que forman buffer en configuracin tris
y amoniaco.
El complejo tiene dos mximos a 330 y a
545 nm.
La lectura se hace usualmente a 545 nm,
dado q
que a la longitud
g de onda de 330 es mas
susceptible a las interferencias.
 Otros mtodos
m
Mtodo de Biuret
Es rpido,
rpido simple y no detecta nitrgeno de
fuentes no proteicas o no peptdicas.
Es necesaria la calibracin con una protena
estndar.
Altas concentraciones de carbohidratos,
carbohidratos
lpidos pueden causar opalescencia en la solucin
f
final.
.
Las sales de amonio tambin interfieren en la
reaccin.
Se ha encontrado poca aplicacin en anlisis
de alimentos debido a la presencia de
interferentes como azcares reductores que
p
reducen el ion cprico en medio alcalino
produciendo resultados insatisfactorios.
Ejemplo: leche.
 Otros mtodos
m
Mtodo de Lowry
El mtodo
t d ded Lowry
L combina
bi l reaccin
la i ded
Biuret con la reduccin del reactivo de Folin-
Ciocalteu (cidos fosfomolbdico y fosfotngstico)
por la oxidacin de tirosina, triptofano, cistena,
cistina de las cadenas polipeptdicas (Nielsen,
1988).
1988)
El proceso de oxido-reduccin se acompaa de
lla formacin
f i de
d un color
l azull caracterstico.
t ti
Los quelatos de cobre en la estructura del
pptido
tid facilitan
f ilit l transferencia
la t f i de
d electrones
l t d
de
los grupos funcionales amino al cromforo cido.
Este
E t mtodo
t d es til para determinar
d t i pequeas

cantidades de protena en una disolucin.
El desarrollo
d ll de
d color
l es dependiente
d di t del
d l pH,
H
que se debe mantener entre 10 y 10.5.
 Otros mtodos
m
Mtodo de Lowry
 Otros mtodos
m
Mtodo de Lowry
Tiene mayor sensibilidad que el mtodo del
Biuret.
La respuesta del color vara de acuerdo al
tipo de protena.
La
L iintensidad
t id d del
d l color
l no es estrictamente
t i t t
proporcional a la concentracin de protena.
Los iones potasio, magnesio, EDTA e
hidratos de carbono interfieren en la
reaccin.
i
Es menos afectado por la turbidez de la
muestra.
Es afectado p por la presencia
p de azcares
reductores al igual que el mtodo de Biuret.
 Otros mtodos
m
Mtodos de adhesin de colorante

Controlando el pH y la fuerza inica del medio

los g
grupos
up funcionales cidos y bsicos de las
fu
protenas pueden interactuar con grupos orgnicos
de carga opuesta.
Al realizarse la unin se presenta coloracin o
bien un cambio de sta.
Comnmente se usan colorantes sulfonados los
cuales reaccionan a pH cido con el grupo -amino
d la
de l lisina
li i y ell grupo guanidina
idi d
de l arginina,
la i i ell
imidazol de la histidina y un nmero limitado de -
amino
am n tterminales.
rm na .
Pueden adherirse colorantes ANINICOS o
CATINICOS
N ((BRADFORD).
DF D).
 Otros mtodos
m

Mtodos de adhesin de colorante aninico

El COLORANTE ANINICO se une a los
grupos catinicos de los residuos bsicos de
las protenas (histidina, arginina, lisina) y
forman un complejo insoluble.
El colorante en exceso permanece soluble y
se relaciona inversamente con la
concentracin de protenas.
El mtodo con el colorante NARANJA 12
est descripto en la AOAC para leche fluida,
helados, leche en p polvo descremada (=480
nm).
Algunos compuestos no proteicos como
almidn o metales pueden unirse al colorante.
 Otros mtodos
m
Mtodo de Bradford
Se basa en lla unin
b del
d l colorante
l Coomassie
Blue G-250 a las protenas.
Las protenas (aminocidos bsicos y
aromticos) se unen a la forma azul para
f
formar un complejo
l j protena-colorante
t l t con un
coeficiente de extincin mayor que el
colorante libre.
libre
Este mtodo es sensible, simple, rpido,
b
barato
t y pocas sustancias
t i i t fi
interfieren en su
determinacin.
Entre
E llas sustancias que interfieren
f estn

los detergentes y las soluciones bsicas.
No interfieren los carbohidratos.
 Otros mtodos
m

Mtodo de Bradford

Los aminocidos que son reconocidos por el

colorante son arginina, fenilalanina, triptofano
y prolina.
El azul de Coomasie libre se detecta a 470
nm mientras q
que la forma unida a p
protenas a
595 nm.
Esto se debe a que el Coomassie se une
preferencialmente a los aminocidos
mencionados y cambia de un estado
catinico a uno aninico.
 Otros mtodos
m
Mtodo de Bradford
 Otros mtodos
m
Espectroscopia infrarroja
Se aprovecha la absorcin del grupo amida
del enlace peptdico.
Ventajas:
Es un mtodo rpido
rpido, anlisis de
multicomponentes
No destructivo
destructivo.
Desventajas
Interferido por agua.
Proceso de calibracin complejo
complejo.
 Otros mtodos
m
Espectroscopia infrarroja reflectante
La muestra se ilumina
l con seis longitudes
l d
de onda cercanas a la radiacin infrarroja y
se detecta la luz reflejada.
reflejada
Consideracin
Es necesaria la calibracin contra un
conjunto de muestras estadsticamente
significativas, analizadas por mtodos de
referencia tradicionales.
Ventajas
Rpido,
Rpido anlisis de multicomponentes.
multicomponentes
Aplicable a materiales slidos.
Cuantifica protena en presencia de
agua.
 Determinacin
m de la secuencia de
aminocidos
La
L d t mi
determinacin
i d
de l
la composicin
m i i
proporciona una informacin sobre una
protena.
protena
A veces se necesita identificar la secuencia
de los aminocidos,
aminocidos para lo que se cuenta con
dos mtodos:
secuenciacin
i i de
d lal cadena
d polipeptdica
li tdi
en equipos automatizados llamados
secuenciadores de protenas.
protenas
anlisis con espectrometra de masas
d los
de l pptidos
tid generados
d y sus masas
moleculares respectivas.
 Determinacin
m de la secuencia de
aminocidos
Por
P ell tamao
t m d
de l
las m l l
molculas, se
hidrolizan con proteasas especficas, para
posteriormente secuenciar e identificar ms
fcilmente porciones de 10 a 20 aminocidos
de los ppptidos
p generados.
g
La combinacin de proteasas especficas y
los pptidos generados alimentados a bases
de datos que tengan la informacin de
g
digestiones enzimticas, permiten
p ir
completando las secuencias.
Se ensaya el orden posible de los pptidos
al compararlos con bases de datos que tengan
la informacin de digestiones enzimticas
provenientes de protenas cuya secuencia ha
sido ya elucidada.
 Determinacin
m de la secuencia de
aminocidos
Pehr
P h Edman
Edm d
descubri
b i una secuencia
i de
d
reacciones que permiten identificar los N-
terminales y que al realizarse repetidamente
permiten identificar la secuencia completa de
los p
polipptidos
p p en cuestin.
El reactivo utilizado por Edman es el
fenilsiotiocianato que reacciona con el amino
terminal para producir el feniltiocarbamilo del
p p
pptido.
El conocimiento de la secuencia de
protenas es cada vez ms necesario para
identificar la presencia de variantes naturales
a la luz de los nuevos alimentos de origen
transgnico.
 Determinacin
m de protenas
p por
p
electroforesis
Pueden
P d realizarse
li electroforesis
l t f i en
condiciones nativas en las que las protenas
migran conservando su diversidad y
propiedades fsicas, especialmente su punto
isoelctrico y p
peso molecular.
Es posible utilizarla en una sola dimensin o
en dos dimensiones (2D).
(2D) Se les denomina 1D
o 2D-PAGE (por sus siglas en ingls,
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida).
Una vez realizadas las separaciones,
generalmente se contina con una digestin
proteoltica y la separacin de los fragmentos
por electroelucin o para su anlisis por
espectroscopia de masas (MS).
 Determinacin
m de protenas
p por
p
electroforesis
La
L PAGE puede d ll
llevarse a cabo b en
condiciones denaturalizantes si se utilizan
tiol-reductores fuertes como mercaptoetanol
y ditiotreitol (DTT) y un detergente
desnaturalizante fuerte: el dodecil sulfato de
sodio (SDS).
El tratamiento con ambas sustancias las
despliega y las cargas negativas conferidas
por los g
p grupos
p sulfato del SDS p permite la
migracin de las molculas hacia el nodo, de
acuerdo con su peso molecular
exclusivamente.
l i t
 Determinacin
m de protenas
p por
p
electroforesis
Las
L tcnicas
t i 2D permiten
mit una segunda
d
separacin que discrimina protenas que en 1D
se traslapan,
traslapan por ejemplo,
ejemplo cuando son
especies moleculares mltiples, aun cuando se
trate de pprotenas p
purificadas.
Para el primer paso en una 2D-SDS-PAGE
se aplica una separacin por carga elctrica
(isoelectroenfoque) y una segunda separacin
por p
p peso molecular.
Esta poderosa tcnica se ha convertido en
un sinnimo de Protemica y el mejor mtodo
para la resolucin de mezclas complejas de
protenas.
 Determinacin
m de protenas
p por
p
electroforesis
Las
L tcnicas
t i 2D permiten
mit una segunda
d
separacin que discrimina protenas que en 1D
se traslapan,
traslapan por ejemplo,
ejemplo cuando son
especies moleculares mltiples, aun cuando se
trate de pprotenas p
purificadas.
Para el primer paso en una 2D-SDS-PAGE
se aplica una separacin por carga elctrica
(isoelectroenfoque) y una segunda separacin
por p
p peso molecular.
Esta poderosa tcnica se ha convertido en
un sinnimo de Protemica y el mejor mtodo
para la resolucin de mezclas complejas de
protenas.