UNIVERSIDAD NACIONAL DE

SAN ANTONIO ABAD DEL

CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
REA BIOLOGA Y GENTICA

GUA DE PRCTICAS

Fuente: http://www.embrios.org/images/celulacolor.jpg
Autoras:

Blga. Mercedes Maritza Quispe

Flrez
Blga. Griselda Muiz Duran

ASIGNATURA:
BIOLOGA CELULAR Y
MOLECULAR
 CUSCO PER
2015-II
PRCTICA N 1
BIOSEGURIDAD EN LABORATORIOS DE BIOLOGA
CELULAR Y MOLECULAR

INTRODUCCIN.-
La Bioseguridad, como disciplina naci durante la dcada del 70,
en respuesta operativa hacia los riesgos potenciales de los agentes
biolgicos modificados por Ingeniera Molecular. A partir de los
trabajos de P. Berg (1974) se cre el Comit Asesor de DNA
recombinante. En 1983 la Organizacin Mundial de la Salud
(OMS) edita el Manual de Bioseguridad en el laboratorio que pasa
a ser la publicacin internacional de referencia.
El Ministerio de Salud (MINSA) del Per a travs del Instituto
Nacional de Salud (INS) tambin cuenta con un Manual de
Normas de Bioseguridad Norma Tcnica N 18, 1996.
El concepto de bioseguridad esta referido a todas las estrategias
que involucran medidas de PREVENCIN Y CONTROL que se
adoptan dentro del laboratorio para evitar incidentes: por
infeccin al personal, por contaminacin a la muestra biolgica, a
los instrumentos, a los equipos o al ambiente de trabajo.
Se refiere al conjunto de actitudes y procedimientos orientados a
impedir la contaminacin por agentes biolgicos, fsicos o
qumicos, tomando en cuenta las medidas preventivas destinadas a
proteger la salud y la seguridad del personal que trabaja en el
laboratorio.
El objetivo fundamental de la Bioseguridad es el de PREVENIR
para evitar prdidas y gastos posteriores por no tomar las medidas
correctas de seguridad.
El costo de no tomar medidas de bioseguridad puede ser muy alto
y llevar a:
- Prdida de la salud del personal, gastos personales de
tratamiento, hospitalizacin y recuperacin, de seguros de vida,
de demandas judiciales, de desprestigio institucional.
- Riesgo potencial de infectar o contaminar a personas sanas y a
las muestras biolgicas.
- Prdida de la calidad de la muestra biolgica, del anlisis, del
resultado y por ende del prestigio de la institucin.

Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:

a) Universalidad: Las medidas deben involucrar a todos los
pacientes de todos los servicios, independientemente de conocer
o no su serologa. Todo el personal debe seguir las precauciones

MMQF/GMD 2
 estndares rutinariamente para prevenir la exposicin de la piel
y de las membranas mucosas, en todas las situaciones que
puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el
contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal del
paciente. Estas precauciones, deben ser aplicadas para TODAS
las personas, independientemente de presentar o no patologas.
b) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposicin
directa a sangre y otros fluidos orgnicos potencialmente
contaminantes, mediante la utilizacin de materiales adecuados
que se interpongan al contacto de los mismos. La utilizacin de
barreras como guantes, mandil entre otros no evitan los
accidentes de exposicin a estos fluidos, pero disminuyen las
consecuencias de dicho accidente.
c) Medios de Eliminacin de material contaminado: Comprende el
conjunto de dispositivos y procedimientos adecuados a travs de
los cuales los materiales utilizados en la atencin de pacientes,
son depositados y eliminados sin riesgo.
OBJETIVOS.-

Entender el concepto de Bioseguridad

Establecer el nivel de bioseguridad que se tiene en los

laboratorios de Biologa Celular y Molecular

Conocer la clasificacin de los residuos slidos

intrahospitalarios

Aplicar las normas bsicas de Bioseguridad y disponer

adecuadamente los residuos slidos

MATERIALES.-

Reactivos a utilizar en las prcticas con diferentes etiquetados

de seguridad.
Grficos con diferentes smbolos y pictogramas de seguridad.

PROCEDIMIENTO.-

a)Establecer el Nivel de Bioseguridad que tienen los

Laboratorios de Biologa celular y molecular de acuerdo a
la siguiente clasificacin.

TIPOS DE LABORATORIO CON RELACIN AL NIVEL DE

RIESGO

MMQF/GMD 3
 Los laboratorios se clasifican de acuerdo al nivel de riesgo,
diseo y barreras de contencin que requiere, los cuales se
dividen en cuatro niveles:

LABORATORIOS CON NIVEL DE BIOSEGURIDAD I

Es un laboratorio bsico que permite el trabajo con agentes de

bajo riesgo, que no causan enfermedad en l humano y de
mnimo riesgo potencial para el personal de laboratorio y la
comunidad, el laboratorio no esta separado del edificio y el
trabajo se realiza en mesas de laboratorio. Son los que se
encuentran en los Centros de Salud, Hospitales de nivel local,
Laboratorios de diagnstico, Universidades y Centros de
Enseanza.

Ejemplos de patgenos que requieren Bioseguridad nivel I:

Bacillus subtillis, Escherichia coli, Plasmodium, Protozoarios y
Helmintos intestinales.

LABORATORIOS CON NIVEL DE BIOSEGURIDAD II

Es un laboratorio bsico que cuenta con cmaras de

bioseguridad y otros dispositivos apropiados de proteccin
personal o de contencin fsica para proteger al operador.
Cuenta con reas de trnsito limitado. Se puede trabajar con
agentes de riesgo de clase II y de clase III los cuales constituyen
un moderado peligro potencial para el personal y la comunidad.
Es utilizado en Institutos de Investigacin, Hospitales regionales
y los Laboratorios de Salud Pblica. Se aconseja la inmunizacin
o el tratamiento antibitico, segn sea el caso.

Ejemplos: Virus sarampin, Salmonellae, Toxoplasma spp.,

Bacillus anthracis, virus del dengue.

LABORATORIOS CON NIVEL DE BIOSEGURIDAD III

Es el laboratorio de contencin que cuenta con reas de acceso

restringido y barreras de contencin que protegen al operador.
Esta destinado para trabajar con agentes de clase III, los cuales
pueden causar enfermedades serias o potencialmente letales
como resultado de la exposicin por va inhalatoria o contacto
con la piel.

Ejemplos: Histoplasma capsulatum, virus de Hepatitis B, C, D,

virus de la fiebre amarilla, HIV.

LABORATORIOS CON NIVEL DE BIOSEGURIDAD IV

MMQF/GMD 4
 Es el laboratorio de contencin mxima, cuenta con recintos
separados, aislados y con sistemas de apoyos exclusivos. Sirve
para trabajar con agentes de clase IV que son agentes
peligrosos y exticos, los cuales poseen un alto riesgo individual
de infecciones transmitidas por aerosoles y enfermedades que
atentan contra la vida.

Ejemplos: Virus bola, Hanta, Marburg, Lassa, Machupo.

b)Conoce la clasificacin de residuos slidos hospitalarios:

Los residuos slidos hospitalarios se clasifican en tres

categoras:

Clase A: Residuo Biocontaminado, Clase B: Residuo Especial y

Clase C: Residuo Comn.

Clase A: Residuo Biocontaminado

Tipo A.1: Atencin al Paciente

Residuos slidos contaminados con secreciones, excreciones y
dems lquidos orgnicos provenientes de la atencin de
pacientes, incluye restos de alimentos.

Tipo A.2: Material Biolgico

Cultivos, inculos, mezcla de microorganismos y medio de
cultivo inoculado proveniente del laboratorio clnico o de
investigacin, vacuna vencida o inutilizada, filtro de gases
aspiradores de reas contaminadas por agentes infecciosos y
cualquier residuo contaminado por estos materiales.
Tipo A.3: Bolsas conteniendo sangre humana y
hemoderivados.
Constituye este grupo las bolsas conteniendo sangre humana
de pacientes, bolsas de sangre vacas; bolsas de sangre con
plazo de utilizacin vencida o serologa vencida; (muestras de
sangre para anlisis; suero, plasma y; otros subproductos).
Bolsas conteniendo cualquier otro hemoderivado.
Tipo A.4: Residuos Quirrgicos y Antomo Patolgicos
Compuesto por tejidos, rganos, piezas anatmicas, y residuos
slidos contaminados con sangre y otros lquidos orgnicos
resultantes de ciruga.

Tipo A.5: Punzo cortantes

Compuestos por elementos punzo cortantes que estuvieron en
contacto con agentes infecciosos, incluyen agujas
hipodrmicas, pipetas, bisturs, placas de cultivo, agujas de
sutura, catteres con aguja, pipetas rotas y otros objetos de
vidrio y corto punzantes desechados.

MMQF/GMD 5
 Tipo A.6: Animales contaminados
Se incluyen aqu los cadveres o partes de animales
inoculados, expuesto a microorganismos patgenos, as como
sus lechos o material utilizado, provenientes de los
laboratorios de investigacin mdica o veterinaria.

Clase B: Residuos Especiales

Tipo B.1: Residuos Qumicos Peligrosos

Recipientes o materiales contaminados por sustancias o
productos qumicos con caractersticas txicas, corrosivas,
inflamables, explosivos, reactivas, genotxicos o mutagnicos,
tales como quimioteraputicos; productos qumicos no
utilizados; plaguicidas fuera de especificacin; solventes;
cido crmico (usado en limpieza de vidrios de laboratorio);
mercurio de termmetros; soluciones para revelado de
radiografas; aceites lubricantes usados, etc.

Tipo B.2: Residuos Farmacuticos

Compuesto por medicamentos vencidos; contaminados,
desactualizados; no utilizados, etc.

Tipo B.3: Residuos radioactivos

Compuesto por materiales radioactivos o contaminados con

radionclidos con baja actividad, provenientes de laboratorios
de investigacin qumica y biologa; de laboratorios de anlisis
clnicos y servicios de medicina nuclear. Estos materiales son
normalmente slidos o pueden ser materiales contaminados
por lquidos radioactivos (jeringas, papel absorbente, frascos
lquidos derramados, orina, heces, etc.)

Clase C: Residuo comn

Compuesto por todos los residuos que no se encuentren en

ninguna de las categoras anteriores y que, por su semejanza con
los residuos domsticos, pueden ser considerados como tales. En
esta categora se incluyen, por ejemplo, residuos generados en
administracin, proveniente de la limpieza de jardines y patios,
cocina, entre otros, caracterizado por papeles, cartones, cajas,
plsticos, restos de preparacin de alimentos, etc.

Dentro del las llamadas precauciones estndares, denominadas

precauciones universales (PU) se encuentra el lavado de manos el
cual se debe realzar con jabn desinfectante antes y despus del
procesamientos del las muestras y antes de salir del laboratorio.

La tcnica de lavarse las manos tiene la siguiente secuencia:

1. Subirse las mangas hasta el codo

MMQF/GMD 6
2. Retirar alhajas y reloj
3. Mojarse las manos con agua corriente
4. Aplicar 60 segundos de jabn lquido
5. Friccionar las superficies de la palma de las manos y puo durante 10
a 15 segundos.
6. Enjuagar en agua corriente de arrastre
7. Secar con papel toalla

DISTRIBUCIN DE LOS MICROORGANISMOS POR GRUPOS

DE RIESGO

Esta lista no es limitativa, cada agente puede presentar riesgos mayores

o menores dependiendo de varios factores como la cantidad de agente
que se est manipulando, el tipo de muestra, es importante estar
siempre atentos y prevenir cualquier accidente.

CLASE I
Acanthamoeba
Bacillus subtilis
Bacillus cereus
Naegleria
Plasmodium
Otras bacterias que no pertenecen a las clases
Protozoarios y helmintos intestinales.
CLASE II
Acinetobacter
Aeromonas
Bordetella
Bartonella
Blastomyces
Clostridium
Corynobacterium
Entamoeba hystoltica
Escherichia coli enteropatgenas
Leishmania
Listeria monocytogena
Mycoplasma
Plesiomonas
Pseudomonas
Staphylococcus
Treponema pallidum
Vibrio
Calinomatobacterium
Campylobacter
Haemophylus
Legionella
Leptospira
Neiseria
Salmonella typhi
Salmonella paratyphi A y otras
Shigella
Streptococcus
Yersinia
Virus de la Hepatitis B

MMQF/GMD 7
CLASE III
Brucella
Coccidiodes immitis
Histoplasma capsulatum
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium bovis
Mycoplasma mycoides
Paracoccidiodes brasiliensis
Pasteurella multocida
Trypanosoma cruzi
Yersinia pestis
Virus de la inmunodeficiencia humana
CLASE IV
Virus de la fiebre hemorrgica de Marburg
Ebola
Hanta virus
RESULTADOS.-

1. Qu nivel de bioseguridad tiene un laboratorio de enseanza de

prcticas de Biologa Celular y Molecular? Fundamente su respuesta.
2. Con qu nivel de bioseguridad cuentan los laboratorios de Biologa
Celular y Molecular? Fundamente su respuesta.

3. Cules son los elementos bsicos de proteccin obligatorios que se

deben tener en cuenta en los cuatro tipos de laboratorios clasificados
de acuerdo al nivel de bioseguridad?

4. Cules son los criterios que se toma en cuenta para clasificar a los
laboratorios de acuerdo al nivel de bioseguridad y en nuestro pas que
institucin se encarga de ello?

CONCLUSIONES.-
Mencione las conclusiones finales del desarrollo de la prctica.
CUESTIONARIO.-

1. Qu tipos de residuos hospitalarios se genera en un laboratorio

clnico de hospital? Enliste todos los posibles residuos y
clasifquelo de acuerdo a la categora y subcategoria a la que
pertenece.
2. Dibuje cuatro seales de bioseguridad que debe existir en
laboratorios de Biologa Molecular y mencione las acciones o
cuidados a tener en cuenta.
3. De qu maneras cree usted que podemos fortalecer el tema de
bioseguridad y despertar la responsabilidad en los alumnos para
poner en prctica la correcta eliminacin de residuos
producidos en los laboratorios de trabajo.
4. Qu tipos de residuos hospitalarios se genera en el servicio de
Farmacia de un hospital? Enliste todos los posibles residuos y
clasifquelo de acuerdo a la categora y subcategora a la que
pertenece.

MMQF/GMD 8
REFERENCIAS
1. Lozada, I. 2004. Manual de Prcticas de Inmunologa I. Universidad Peruana
Cayetano Heredia. Per.
2. Per. Ministerio de Salud. 2004. Norma Tcnica: Procedimientos para el
manejo de residuos slidos hospitalarios. R.M. N 217 2004
3. Per. Ministerio de Salud-Pronahebas. 2004. Norma Tcnica: Manual de
bioseguridad. Sistema de gestin de la calidad del Pronahebas. NT015-
MINSA/DGSP V.01
4. Rivera, Ch.; Vidal, M. y Chvarry, E. 2005. Manual de Prcticas de Biologa I.
Universidad Peruana Cayetano Heredia. Per.

PRCTICA N 2
RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS Y MATERIALES DE USO
FRECUENTE EN EL LABORATORIO

INTRODUCCIN
La biologa estudia la vida y las leyes que la rigen, el hombre para
conocerse asimismo y al medio que lo rodea ha desarrollado
tcnicas en las cuales es indispensable el uso de materiales y
equipos que permiten reproducir de una manera experimental los
sistemas biolgicos.
En la presente prctica se dan a conocer los equipos y materiales
ms utilizados, sin los cuales no hubiera sido posible llegar a
identificar elementos orgnicos; conocer la morfologa, estructura
y fisiologa de la materia viva as como la estructura celular y los
componentes qumicos que lo conforman.

OBJETIVOS
Identificar los materiales y equipos de uso frecuente en el
laboratorio estableciendo las diferencias que existen entre
ellos.
Conocer la importancia y el uso que cada uno de los
materiales y equipos tiene en los procesos de investigacin.

MATERIALES
A. Ambiente del laboratorio
B. Carpeta de trabajo
C. Equipos e instrumentos
D. Materiales de vidrio y plstico

MMQF/GMD 9
PROCEDIMIENTO
- Identifique cada uno de los equipos y materiales de uso
frecuente en el laboratorio conociendo el manejo y funcin.
- Realice la grfica correspondiente para el desarrollo del
informe.

EQUIPOS DE LABORATORIO
Dentro de los equipos bsicos de un laboratorio de enseanza se
tiene los siguientes:

1. REFRIGERADORA.- Aparato importante en el laboratorio

de uso necesario para la conservacin y preservacin de
sustancias, cultivos, reactivos, soluciones, sueros, enzimas
perecederos.
2. AUTOCLAVE.- Se utiliza en laboratorios e industrias para
esterilizacin de lquidos (medios nutritivos), para
destruccin de grmenes patgenos. Provee un medio
prctico y eficaz de esterilizacin por cuanto destruye las
formas vegetativas como esporuladas en un tiempo
comprendido entre 15 a 30 minutos, la esterilizacin se lleva
a cabo por calor hmedo.
3. CENTRIFUGA.- Es un aparato que permite acelerar la
separacin de partculas slidas suspendidas en lquidos, la
velocidad a la que sedimentan las partculas dependen de:
Tamao de las partculas, su peso, la densidad de los lquidos
y su viscosidad, fuerza gravitacional.
4. BAO MARIA.- Se emplea para el calentamiento indirecto
de sustancias a temperaturas desde los 5C a 100C. El bao
Maria esta compuesto por un recipiente resistente al calor,
que contiene agua. Tambin est provista de un dispositivo
especial que puede sumergirse en ella para calentar medios
de cultivo u otras muestras. Se usa solo con agua destilada.
5. HORNO PASTEUR.- Es un aparato muy utilizado en la
esterilizacin de vapor seco: hay de diferentes formas y
capacidades, conformado de metal de triple pared, la
intermedia mas corta que las otras dos cajas paralelas quien
se comunica con la parte superior, las paredes estn
revestidas de amianto o fibra de vidrio para mantener el
calor generado. Se utiliza para esterilizacin de material de
vidrio y materiales metlicos por ejemplo equipo de
diseccin.
6. POTENCIOMETRO.- Es un aparato utilizado para medir pH
en soluciones buffer. Fluidos biolgicos, medios de cultivo
etc.
7. INCUBADORA.- Aparato que conserva la temperatura
constante, presenta un termmetro y un termostato con el
que se puede graduar la temperatura mantenindola
constante, sirve para mantener microorganismos viables en

MMQF/GMD 10
 medios de cultivo tales como bacterias, hongos y cualquier
estructura viva esto con temperatura por encima de la
ambiental.
8. BALANZAS.- Son instrumentos necesarios en los
laboratorios y sirven para medir el peso de sustancias,
reactivos a utilizar en la experimentacin. Existen balanzas
analticas y balanzas de precisin.
9. DESTILADOR.- Es un aparato que sirve para purificar el
agua, mediante la evaporacin de los lquidos por medio del
calor, y separar las partes ms voltiles. Al enfriarse stas
pueden volver nuevamente al estado lquido.

MATERIALES DE VIDRIO Y OTROS

El material de vidrio constituye la principal herramienta en el
laboratorio, su nmero y variedad es grande, segn el tipo de
prueba a realizarse. El material de vidrio para ser considerado
como material de calidad debe cumplir con ciertos requisitos o
condiciones bsicas: ser de buena calidad, neutro resistente a la
accin mecnica y a cambios de temperatura, transparentes, de
superficie lisa sin ralladura, entre las marcas que cumplen este
requisito tenemos: PIREX, VYCOR, KIMAX, GEN, GLASS, KINBLE,
etc.

1. TUBOS DE ENSAYO.- Son materiales de forma cilndrica de

diferentes dimetros y capacidades, se utilizan en infinidad
de experimentos.
2. PROBETAS.- Son cilndricos de vidrio graduados en forma
ascendente de capacidad y tamao variables, su base es
amplia y plana, en el extremo superior posee un pico para
verter con facilidad las soluciones. Sirven para medir los
lquidos y el volumen de los cuerpos.
3. BALN.- Son frascos de vidrio con el cuerpo esfrico, cuello
largo y angosto sin tapa, se utiliza para homogenizar
sustancias con facilidad por el cuello largo que posee.
4. MATRAZ O ERLENMEYER.- Es un frasco de vidrio que
tiene cuerpo trapezoidal, cuello corto y ancho, con diferentes
capacidades, se emplean para calentar lquidos cuando hay
peligro de prdida de vaporizacin o para titular en el
anlisis cuantitativo.
5. VASOS DE PRECIPITACIN O BEAKER.- Son recipientes
de vidrio que en la parte superior presenta un pico, son de
boca ancha, cuerpo cilndrico con base plana, algunos son
graduados y son de uso mltiple.
6. PLACAS PETRI O CAJAS PETRI.- Son cajas circulares con
la tapa de dimetro mayor que la que sirve de base, se utiliza
para realizar cultivos microbiolgicos sobre sustancias
slidas como gelatina y agar.
7. EMBUDOS.- Son objetos con la parte superior cnica y la
parte inferior tubular y cuyo extremo inferior termina en

MMQF/GMD 11
 bisel, se usa para cambiar las soluciones de un recipiente a
otro.
8. FRASCO GOTERO.- Son recipientes con un dispositivo
especial en el cuello y la tapa (esmerilada), se utiliza para
depositar sustancias qumicas o colorantes que sern
utilizados por goteo.
9. PIPETAS.- Son tubos cilndricos de vidrio que sirven para
medir los lquidos en pequeas cantidades. Se tiene los
siguientes tipos:
PIPETAS GRADUADAS.- Son tubos de dimetro uniforme en
toda su longitud, a lo largo de dicho tubo se encuentra una
escala dividida generalmente en milmetros, cuya
numeracin comienza en el extremo agudo y son de
diferentes capacidades.
PIPETAS PASTEUR.- Se usan para trasladar
microorganismos en cantidades muy pequeas de un cultivo
a otro.
10. MORTERO.- Material de porcelana, metal o de vidrio se usa
para triturar tejidos, realizar mezclas, constan de una vasija
o mortero y un mango o piln.
11. ESPATULA.-Sirven para traslado, remocin, cortes de
sustancias, son de diferentes formas en hoja de cuchillo, en
forma de cuchara plataforma en los dos extremos.
12. GRADILLAS.- Permite estabilidad a los tubos de ensayo,
evita accidentes, pueden ser de madera y metal de
diferentes capacidades.
13. MALLA METLICA CON ASBESTO.- Malla de alambre
galvanizado con amianto resistente a altas temperaturas, se
coloca sobre la hornilla para calentar sustancias.
14. MECHERO DE ALCOHOL.- Constituido por un recipiente
de vidrio de borocilicato una tapa de metal por donde se
introduce la mecha produce poca temperatura.
15. MECHERO BUNSEN.- Es uno de los instrumentos ms
tiles de laboratorio existen diferentes mecheros con o sin
regulacin de gas.
RESULTADOS

Realice los grficos correspondientes estableciendo diferencias y

similitudes en el uso de cada uno de los equipos y materiales de
laboratorio descritos.

CONCLUSIONES

Establezca las conclusiones finales del desarrollo de la prctica.

CUESTIONARIO
1. Qu entiende por bioseguridad, cules son las reglas de
seguridad a seguir en un laboratorio biolgico?

MMQF/GMD 12
2. Haga un comentario sobre la disposicin o ubicacin de los
aparatos, instrumentos reactivos y material de vidrio.
3. Qu diferencias existe entre una autoclave y un horno Pasteur
y que tipo de materiales se pueden esterilizar en cada uno de
ellos?
4. Qu materiales de vidrio utilizara para realizar mediciones
exactas de lquidos? Por qu?
5. Por qu es necesario saber la ubicacin de los equipos de
seguridad?

REFERENCIAS
1. Lozada, I. 2004. Manual de Prcticas de Inmunologa I. Universidad
Peruana Cayetano Heredia. Per.
2. Rivera, Ch.; Vidal, M. y Chvarry, E. 2005. Manual de Prcticas de
Biologa I. Universidad Peruana Cayetano Heredia. Per.

PRCTICA N 3
RECONOCIMIENTO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO
COMPUESTO
INTRODUCCIN.-
Un aparato fundamental para la investigacin ha sido el
microscopio, con base en la microscopia, se ha podido escudriar
en un mundo extremadamente pequeo. Los antecedentes de los
modernos microscopios datan de la Grecia clsica y los rabes,
quienes ya conocan los mecanismos de la ptica. Pero la aparicin
del microscopio compuesto se da en el Renacimiento y fue Galileo
Galilei quien acopl dos lentes en un tubo, mismo que fue
perfeccionado a fines del siglo XVI por los hermanos holandeses
Jans y Zaccharias Janssen. Es relevante el trabajo del astrnomo y
matemtico Robert Hooke sobre la observacin de la estructura
del corcho, a travs de un microscopio fabricado por el mismo. Por
ltimo est Antn Van Leeuwnhook, quien no tena preparacin
acadmica y se convirti en un experto tallador de lentes, fue tal
su grado de perfeccin, que pudo observar varios tipos de
microorganismos. Llam tanto la atencin que la Royal Society of
London (primera asociacin cientfica reconocida en el mundo)
mand algunos investigadores cientficos a corroborar sus notas,
que envi durante 20 aos. El nico defecto que tenan sus
microscopios era la aberracin cromtica, lo cual corrigi a fines
del siglo XIX el qumico alemn Ernst Abbe. A partir del
microscopio compuesto se han derivado otros como el
Estereoscopio o Microscopio de diseccin, Microscopio de
Fluorescencia, Microscopio Electrnico entre otros.
El microscopio compuesto comn est conformado por tres
sistemas:
- El sistema mecnico, est constituido por una serie de
piezas en las que van instaladas las lentes que permiten el
movimiento para el enfoque.

MMQF/GMD 13
 - El sistema ptico, comprende un conjunto de lentes
dispuestas de tal manera que produce el aumento de las
imgenes que se observan a travs de ellas.
- El sistema de iluminacin, comprende las partes del
microscopio que reflejan, transmiten y regulan la cantidad
de luz necesaria para efectuar la observacin a travs del
microscopio.
Todo microscopio tiene las siguientes caractersticas:
- Poder de resolucin: Es la capacidad de distinguir con nitidez
dos puntos situados muy prximos el uno del otro.
- Lmite de resolucin: Es la distancia mnima que debe existir
entre dos puntos para que puedan verse separados.
- Nmero de aumento: El nmero total de aumento conseguido
por un microscopio, es el resultado del producto del nmero de
aumento del ocular por el del objetivo.

PARTES DEL MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO

1. Ocular: Es un cilindro corto metlico compuesto por un
juego de lentes, el lente plano se encuentra cerca del ojo del
observador y el lente convexo est dirigido hacia el objeto.
En la parte superior de esta pieza indica el aumento que
puede ser de 5x, 10x, 15x y 20x.
2. Objetivos: Cilindros metlicos que van enroscados al
revolver del microscopio, igual que los oculares, llevan
juegos de lentes destinados a dar imagen real e invertida del
objeto. El aumento esta indicado al costado de cada uno de
los objetivos.
3. Diafragma: Esta pieza se encuentra acoplada a la parte
inferior del condensador y consta de una serie de laminillas
metlicas dispuestas concntricamente que mediante una
manecilla se mueven dando una abertura circular, regulando
as la cantidad de luz emitida por el espejo en el preparado
que se va a observar.
4. Condensador: Esta ubicado debajo de la platina, constituido
por un sistema de dos o ms lentes, su funcin es la de
concentrar la luz iluminando la muestra a observarse.
5. Espejo: Est ubicado debajo de la platina, presenta dos
caras; una plana para observar con luz natural, y otra
cncava para observar con luz artificial. Su funcin es la de
iluminar la muestra.
6. Tubo ptico: Es un cilindro metlico de aproximadamente o
a 10 cm. De longitud cuya funcin es la de sostener al ocular.
7. Revolver: Es una pieza giratoria de forma circular y est
ubicado en la parte inferior del tubo ptico y consta de 3 a 4
orificios para sostener a los objetivos y colocar el sistema en
posicin de trabajo.

MMQF/GMD 14
 8. Platina: Es una superficie metlica plana que posee un
orificio circular en su porcin central, la que permite el paso
de la luz. Su funcin es la de sostener las muestras que van a
ser observadas. Encima de la platina el charriot o un par de
pinzas que sirven para fijar la lmina con la muestra a
observar.
9. Tornillo Macromtrico: Se encuentra ubicado en la
columna del microscopio, su finalidad es la dar movimiento a
la platina para alejar o acercar la muestra para sus
observaciones, es de movimiento rpido.
10. Tornillo Micromtrico: Se encuentra ubicado en la
columna del microscopio, su funcin es afinar la imagen para
observar mejor y es de movimiento fino, en algunos
microscopios estos dos tornillos se encuentran juntos.
11. Columna o brazo: Es una pieza metlica que tiene por
finalidad sostener a los tornillos macro y micromtricos y
tambin sirve para transportar el aparato.
12. Pie o base: Es una pieza metlica con el peso
suficiente para sostener y dar estabilidad al aparato.

OBJETIVOS.-
Identificar cada una de las partes del Microscopio ptico
Compuesto y ubica dentro del sistema al cul corresponde.
Aprender a manejar y cuidar el Microscopio ptico Compuesto
Valorar la importancia de la Microscopa como herramienta de
apoyo a su formacin profesional.
MATERIALES.-
Microscopio ptico Compuesto
Lmina Porta Objetos
Lmina cubre Objetos
Agua destilada
Gotero
Recorte periodstico
PROCEDIMIENTO.-
- Identifique cada una de las partes del microscopio con mucho
cuidado.
- Prepare ahora su muestra:
a. Con las tijeras corte una letra a, la ms
pequea posible de un pedazo de peridico. Colocando la
letra en el centro de una lmina portaobjetos limpia. Use un
gotero para colocar una gota de agua sobre el pedazo de
peridico que se cort y colquela sobre la lmina.
b. Tome una lmina cubre objetos limpia, cudese
de cogerla por los bordes para evitar engrasarla. Apoye
primero un lado del cubreobjetos y lentamente baje el resto
sobre el pedazo de papel para evitar que queden burbujas
atrapadas entre el cubreobjetos y la lmina portaobjetos.

MMQF/GMD 15
- Coloque su muestra en la platina del microscopio. Cercirese
(mirando desde afuera y no por el lente ocular) de colocar la
letra a en su posicin normal de lectura. Ubique la letra a
debajo del lente objetivo, comenzando con el de menor aumento,
con la ayuda del vernier o carrito.
- Mire el microscopio por un costado y mueva la perilla
macromtrica de manera que acerque el lente objetivo lo ms
prximo a la lmina sin tocarla. Mire a travs del lente ocular y
mueva la perilla del ajuste macromtrico para alejar el lente
objetivo de la muestra hasta que enfoque (empiece a ver la
imagen). Para evitar el cansancio visual mantenga ambos ojos
abiertos mientras mira a travs del microscopio. Para evitar que
choque el lente objetivo con la lmina, nunca baje el lente
objetivo hacia la platina con la perilla del ajuste macromtrico
mientras observa a travs del ocular. Mueva la perilla del ajuste
micromtrico para lograr un enfoque ms fino.
- Puede mover el diafragma para ajustar la cantidad de luz de
manera que pueda ver el objeto claramente y con el contraste
adecuado. En su microscopio puede haber un pelo, colocado en el
ocular, que sirve de puntero para sealar detalles dentro de la
muestra.
- Una vez enfocada la letra a con el objetivo de menor aumento,
mueva la lmina con el vernier hacia la derecha, la izquierda,
arriba y abajo. Observe cuidadosamente el movimiento desde un
costado del microscopio y a travs del ocular.
En qu direccin se mueve la letra a cuando la lmina se
mueve hacia la derecha?
En qu direccin se mueve la letra a cuando la lmina se
mueve hacia la izquierda?
En qu direccin se mueve la letra a cuando la lmina se
mueve hacia arriba?
En qu direccin se mueve la letra a cuando la lmina se
mueve hacia abajo?
A qu conclusin se puede llegar con respecto a la imagen
que observa al microscopio ptico?
- Estando bien enfocada la letra a, mueva el revolver para
colocar el objetivo seco de mayor aumento. Mire a travs del
lente ocular y haga enfoque fino con la perilla del ajuste
micromtrico. Nunca use el ajuste grueso cuando utilice el lente
objetivo de mayor aumento. Si no puede enfocar, vuelva al lente
objetivo de menor aumento y enfoque nuevamente.
- Retire el montaje hmedo, lave el cubreobjetos y el portaobjetos,
squelos cuidadosamente con papel toalla.
- Coloque el revolver con el lente de menor aumento antes de
guardarlo.
RESULTADOS.-
Realice los grficos correspondientes a las observaciones
realizadas.
Coloque las partes del microscopio de acuerdo al sistema al que
pertenece en el siguiente cuadro.

MMQF/GMD 16
Sistema ptico Sistema Mecnico Sistema de
Iluminacin

CONCLUSIN.-
Establezca las conclusiones finales del desarrollo de la prctica.
CUESTIONARIO
1. Indique las diferencias entre un microscopio simple y uno
compuesto.
2. A qu se refieren los trminos seco dbil, seco fuerte e
inmersin?
3. Por qu es necesario reportar en la grfica de una observacin
al microscopio, el aumento total de la misma?
4. Cules son los pasos que se sigue para realizar el enfoque de
una muestra al microscopio ptico compuesto?
5. Mencione otros tipos de microscopios y describa dos de ellos.
6. Cules son las principales fuentes de luz que se utilizan en
microcopia?
7. Cules son las causas de error en el enfoque de una muestra al
microscopio?
REFERENCIAS
1. Chvarry, E., Rivera, M.; Vidal, M. 2005. Manual de Prcticas de
Biologa I. Universidad Peruana Cayetano Heredia. Per.
2. Quispe, G. 2005. Gua de Prcticas de Biologa General y
Especializada. Universidad Nacional de San Antonio Abad del
Cusco. Per.

MMQF/GMD 17
 PRACTICA N 4

ORGANIZACIN MOLECULAR DEL DNA: PROBLEMAS

INTRODUCCIN

El cido desoxiribonucleico (DNA), est formado por dos cadenas

de polinucletidos las cuales llevan la informacin gentica tanto
en los organismos procariticos como eucariticos. En 1953
Watson y Crick publicaron un modelo de la estructura
tridimensional del ADN y concluyeron que consista en dos
cadenas de polinucletidos enrollados alrededor del mismo eje con
sentido dextrgiro, formando una doble hlice con un dimetro de
2nm.

La estructura primaria del ADN est definida por la secuencia de

las bases en la cadena del polinucletido. Conocer esta secuencia
de bases implica poder descifrar la informacin gentica del DNA.

Las principales caractersticas de la molcula son:

La polaridad de estas dos cadenas es opuesta, es decir el

extremo 5 de una cadena coincide con el extremo 3de la
otra: son antiparalelas.
La estructura fosfato-pentosa conforma el exterior de la hlice, mientras que
las bases se sitan hacia el interior formando un ngulo recto con el eje de la
hlice. Esta disposicin permite que las bases de ambas cadenas queden
enfrentadas en el interior de la doble hlice.
Las dos hebras de la hlice se mantienen unidas de forma no
covalente por la formacin de puentes de hidrgeno entre
las bases complementarias: la adenina forma 2 puentes de
hidrgeno con la timina y la guanina forma tres con la
citosina. (Regla de Chargaff)
Esta estructura descrita por Watson y Crick es que adopta el
DNA en condiciones de humedad elevada (92% de humedad
relativa) y corresponde al B DNA sin embargo, el DNA

MMQF/GMD 18
 puede adoptar otras estructuras. A DNA: Es la estructura
que adopta cuando est menos hidratado (65-75% de
humedad relativa), Z DNA: Es una estructura que se
encuentra cuando alternan purinas y pirimidinas en la
secuencia.

OBJETIVOS

- Reconocer los componentes del DNA

- Armar una secuencia del DNA en la maqueta proporcionada
- Comprender la disposicin espacial del DNA
- Resolver problemas relacionados a la estructura del DNA

MATERIALES

- Modelo tridimensional del DNA

- Lminas de la estructura de las bases nitrogenadas.

PROCEDIMIENTO
- Utilizando el modelo del DNA y segn las indicaciones del
profesor proceder a identificar los componentes moleculares
del ADN

Fuente: http://www.unorte.edu.uy/agro/ACIDOSNUCLEICOS.doc

- Diferenciando la coloracin de las bases nitrogenadas

proceder a colocar los cabezales correspondientes a cada
base nitrogenada ya sea prica o pirimdica.

MMQF/GMD 19
 Fuente: http://www.unorte.edu.uy/agro/ACIDOSNUCLEICOS.doc

- Seguidamente proceder a armar una secuencia del modelo

del DNA teniendo presente la complementariedad de las
bases nitrogenadas y el enlace de estas mediante los puentes
de hidrgeno.
- Verificar en todo momento la direccionalidad de las cadenas
complementarias que esta armando 5 ____ 3

Fuente: http://www.anselm.edu/homepage/jpitocch/genbio/doublehelix.JPG

MMQF/GMD 20
 - Resuelva los problemas propuestos utilizando para ello los
siguientes datos:

DATOS:
- Distancia entre nucletidos adyacentes : 0.34nm = 3.4
A
- Peso molecular de un par de bases: 650 daltons
- 1da = 1.68 x 10-24 gr.
- 1 pg = 10-12 gr.
- 1 g = 10-6 gr.
- 1 ng = 10-9 gr.
- 1 nm = 10 A
- 1 nm = 10-9 m, 10-6 mm
- 1 m = 10-6 m
- 1m = 10-3 mm
- 1 mm = 103

REGLA DE APAREAMIENTO DE CHARGAFF

Las bases nitrogenadas se aparean de tal manera que el
nmero total de purinas es igual al nmero total de
pirimidinas. Sin embargo, la cantidad de A + T no es
necesariamente igual a la cantidad de C + G.

- Si una molcula de una doble hlice de DNA tiene un

contenido G + C del 56%, Cules son los porcentajes de las
cuatro bases (A, T, G y C) de esta molcula?
- Qu peso molecular promedio tiene una molcula de DNA
duplex de 350 pares de bases de longitud?
- Si el genoma nuclear tiene 3 X 109 pares de bases y el
genoma mitocondrial 16,5 kilobases y si por cada clula
humana existen 200 mitocondrias determinar Cul ser el
peso molecular del genoma total por clula?
- Suponga que Escherichia coli sintetiza DNA a una velocidad
de 100 000 bases por minuto y que tarda 40 minutos en
replicar su DNA.
a. Determinar el nmero de pares de bases en el cromosoma
completo de E. coli
b. Determinar la longitud fsica del cromosoma en mm
c. Nmero de vueltas
- Suponiendo que 1 de longitud de DNA duplex tiene el
peso molecular de 2 x 10 6 da.Cul sera la longitud en y
el nmero de vueltas de hlice de los DNA siguientes:
a. Polioma: 3.33 x 106 da
b. Fago T4: 1.33 x 108 da
c. Fago Lambda: 3.33 x 107 da
d. E. coli: 4.00 x 109da
- En un fago, cuyo material hereditario es DNA
monocatenario, se encuentran las siguientes proporciones
relativas de bases: A/T = 0.5, A/G = 0.25, G/C = 2

MMQF/GMD 21
 a. Calcular la proporcin relativa de bases pricas y
pirimidicas
b. Si esa cadena simple de DNA sirviese de molde en la
formacin de una nueva, Cules seran las relaciones A +
T/G + C y A + G/T + C de la nueva cadena sencilla?
- Si una partcula vrica contiene un DNA duplex formado por
200 000 pb
a. Determinar cuntos nucletidos posee
b. Nmero de vueltas de hlice completa
c. Nmero de tomos de fsforo
d. Longitud del ADN viral
- Las proporciones de bases en el material hereditario de
cuatro organismos diferentes son las siguientes:

ORGANISMO T C U A G
HOMBRE 31.0 18.4 ---- 31.5 19.1
E. COLI 24.6 25.5 ---- 24.3 25.6
VIRUS DE LA GRIPE ----- 24.5 32.5 23.0 20.0
REOVIRUS ------ 22.0 28.0 28.0 22.0

Qu deduce del cuadro?

- Calcular el peso molecular del DNA de doble cadena de un

virus cuya longitud es 0.51 m (650 D/pb, longitud nt. 0.34
nm)

CUESTIONARIO

1. En qu consisti los experimentos de Griffith, Avery-

MacLeod-McCarty, y Hershey-Chase, a qu conclusiones
llegaron y de que modo aportaron al avance de la Biologa
molecular?
2. Dibuje la estructura qumica de las bases nitrogenadas,
desoxinuclesidos, ribonuclesidos, desoxinucletidos y
ribonucletidos que constituyen los cidos nucleicos, coloque
los nombres de cada uno de ellos de acuerdo a la
nomenclatura qumica.

MMQF/GMD 22
 3. Describa y esquematice en que consiste las conformaciones
ADN-A, ADN B, ADN Z y ADN H, establezca las
diferencias entre cada una de ellas.
4. Cules son las posiciones en un anillo de purina que poseen
el potencial para formar enlaces de hidrgeno, pero que se
encuentran formndolos en los pares de bases de Watson y
Crick?
5. Calcular el peso expresado en gramos, de una molcula de
DNA de doble hebra que se extendiera desde la tierra a la
luna (aprox. 320.000 km). La doble hlice de DNA pesa
aproximadamente 1 x 10-8 gr. Por cada 1.000 pares de
nucletidos; cada par de bases se extiende 0.34 nm. Para
poder establecer interesantes comparaciones, el cuerpo
humano contiene aproximadamente 0.5 gr. De DNA.
6. Si el genoma humano haploide contiene 3 x 10 9 nucletidos y
la masa molecular promedio de un par de nucletidos es
660:
a. Cuntas copias del genoma humano estn presentes, en
promedio, en 1 g de DNA humano?
b. Cul es la masa molecular de una copia del genoma
humano? NAV = 6.023 x 1023
7. Un fago con DNA monocatenario tiene una razn de bases
A/T de 0.33, G/C = 2.0 y A + T/G + C = 1.33 Cul es la
razn A + G/T + C en esta molcula? Si esta molcula
monocatenaria forma un filamento complementario, Cules
son las cuatro razones en el nuevo filamento? Cules son
dichas proporciones en los dos filamentos juntos?

REFERENCIAS

1. Annimo. (n.d). cidos Nucleicos. Obtenido el 10 de julio del

2007, de
http://www.unorte.edu.uy/agro/ACIDOSNUCLEICOS.doc
2. Annimo. (n.d). Estructura y propiedades de los cidos nucleico.
Universidad de Jan, Dpto. Biologa Experimental, rea de
Gentica. Problemas de Gentica Curso 2005 2006.
3. Andrs, I. (n.d.). Problemas tema 10. Informacin Gentica.
Departamento de Biologa Molecular Facultad de Medicina.
Universidad de Cantabria.
4. Lehninger, A.; Nelson, D.; Cox, M. (2001). Principios de
Bioqumica. Espaa. Ediciones Omega
5. Mnsua, JL. (2003). Gentica. Problemas y Ejercicios resueltos.
Madrid. Pearson Prentice Hall
6. Muiz, G.; Quispe, G. (2002). Gua de Prcticas de Biologa
Molecular. Per
7. Weaver, R. (1999). Molecular Biology. Norte Amrica. McGraw-
Hill

MMQF/GMD 23
 PRCTICA N 05

SNTESIS DE PROTENAS MEDIANTE EL CDIGO

GENTICO: PROBLEMAS
INTRODUCCIN
La interpretacin de la sntesis proteica a travs del cdigo
gentico, comprende los mecanismos de transcripcin del DNA en
RNAm y la traduccin del RNAm en protenas, constituyendo el
dogma central de la biologa molecular.

El DNA se encuentra en el ncleo celular y la sntesis de protenas

tiene lugar en el citoplasma, en el hialoplasma concretamente. Es
por esto que la informacin contenida en la estructura primaria
del DNA debe transcribirse a una molcula de RNA denominada
RNA mensajero (RNAm). Tambin se sintetizan en el ncleo el
RNAr y el RNAt necesarios para la sntesis proteica.
El RNAm tiene una estructura primaria complementaria de una de
las cadenas del DNA. Esta disposicin de las bases nitrogenadas
en el RNAm es la que codifica la secuencia de aminocidos de la
protena. Crick demostr que los aminocidos en las protenas van
a estar codificados por secuencias de tres bases nitrogenadas
consecutivas de las cadenas de RNAm, a partir de la secuencia de
iniciacin AUG, complementaria de la secuencia de iniciacin TAC
del DNA. Cada una de estas secuencias de tres bases se llama
tripletes o codones. Debe tenerse en cuenta que, al haber en las
protenas 20 aminocidos distintos, una o dos bases no seran
suficientes para codificarlos. Al tener los cidos nucleicos cuatro
bases diferentes A, G, C, y U, existirn 64 codones o
combinaciones de tres bases y como solamente hay 20
aminocidos distintos, se deduce que varios tripletes codificarn
un mismo aminocido. Este cdigo, que relaciona la secuencia de
bases del RNAm con la secuencia de aminocidos en las protenas,
recibe el nombre de cdigo gentico y el proceso es conocido como

MMQF/GMD 24
traduccin. Los codones que codifican para la seal de paro que se
encuentran en el DNA son ATT, ATC o ACT.
En el siguiente esquema se ejemplifica los procesos de
transcripcin y traduccin en forma resumida:

GENE:
GENE: GATAACGCG
CTCTTGCGC CADENA MOLDE

TRANSCRIPCIN
mRNA: AUGAGAACGCG

TRADUCCIN
PROTEINA: MetSerAsnAla
Esquema de Expresin de un Gen. Weaver, R. (19999)
OBJETIVOS
A travs del desarrollo de problemas:
- Conocer los mecanismos de
interpretacin de la sntesis de protenas a travs del cdigo
gentico.
- Comprender que el DNA es
la molcula que contiene la informacin hereditaria en forma de
clave o cdigo.
MATERIALES
- Tabla del Cdigo Gentico
- Cuaderno de apuntes

1* Segunda base 3*
Base U C A G Base
UUU UCU UAU UGU U
Phe Ser Tyr Cys
UUC UCC UAC UGC C
U
UUA UCA UAA UGA Stop A
Leu Ser Stop
UUG UCG UAG UGG Trp G
CUU CCU CAU CGU U
Leu Pro His Arg
CUC CCC CAC CGC C
C
CUA CCA CAA CGA A
Leu Pro Gln Arg
CUG CCG CAG CGG G

MMQF/GMD 25
 AUU ACU AAU AGU U
Ile Thr Asn Ser
AUC ACC AAC AGC C
A
AUA Ile ACA AAA AGA A
Thr Lys Arg
AUG Met ACG AAG AGG G
GUU GCU GAU GGU U
Val Ala Asp Gly
GUC GCC GAC GGC C
G
GUA GCA GAA GGA A
Val Ala Glu Gly
GUG GCG GAG GGG G
El tercer nucletido de cada codn es menos especfico que los
primeros. Los codones se leen en direccin 5- 3. Por ejemplo
UUA = pU pU pA = Leucina (Leu). El codon de iniciacn es el AUG.
Los tres codones de terminacin (finales) son: UAA, UAG y UGA.

Aminocido Abreviacin Aminocido Abreviacin

Alanina Ala Treonina Thr
Valina Val Cisteina Cys
Leucina Leu Tirosina Tyr
Isoleucina Ile Asparagina Asn
Prolina Pro Glutamina Gln
Fenilalanina Phe cido Asp
Triptofano Trp asprtico Glu
Metionina Met cido Lys
Glicina Gly glutmico Arg
Serina Ser Lisina His
Arginina
Histidina

PROCEDIMIENTO
Resolver los problemas planteados aplicando los conocimientos
tericos del tema, tener presente la nomenclatura internacional de
los aminocidos y nucletidos:

CODIGO DE LOS AMINOCIDOS

Cdigo (1 Cdigo (3 Aminocido
letra) letras)
A Ala Alanina
R Arg Arginina
N Asn Asparagina
D Asp Aspartato
C Cys Cistena
Q Gln Glutamina
E Glu cido
Glutmico

MMQF/GMD 26
 G Gly Glicina
H His Histidina
I Ile Isoleucina
L Leu Leucina
K Lys Lisina
M Met Metionina
F Phe Fenilalanina
P Pro Prolina
S Ser Serina
T Thr Treonina
W Trp Triptfano
Y Tyr Tirosina
V Val Valina

LETRAS MS COMUNES UTILIZADAS

EN LA SECUENCIAS DEL DNA
Cdigo (1 Nucletido Categora
letra)
A Adenina Purina
C Citosina Pirimidina
G Guanina Purina
T Timina Pirimidina
N Cualquier /
nucletido
R AG Purinas
Y CT Pirimidina
s
S CG Enlace
fuerte
- Cap (Forat o /
gap)

- Dada una hebra simple de DNA 3 TACCGAGTAC 5

construya la cadena de DNA complementaria y la cadena de
mRNA que se formara de esta banda.
- Un RNA mensajero tiene 336 nucletidos de longitud,
incluyendo los codones de iniciacin y de terminacin. Cul es
el nmero de aminocidos de la protena traducida a partir de
este mRNA?
- Se usa un mRNA sinttico de secuencia repetitiva 5-
CACACACACACACACAC.. en un sistema sintetizador de
protenas, en ausencia de clulas, semejante al usado por
Niremberg. Asumiendo que la sntesis de protenas puede
comenzar sin la necesidad de un codn de iniciacin, qu

MMQF/GMD 27
 producto o productos pueden esperarse tras la sntesis de
protenas?
a. Una
protena, compuesta por un solo tipo de aminocido
b. Tres protenas, cada una compuesta por un nico tipo de
aminocido diferente
c. Dos protenas, cada una con una secuencia alternada de
dos aminocidos diferentes
d. Una protena, con una secuencia de dos aminocidos
alternantes diferentes.
- Bajo condiciones donde la metionina debe ser el primer
aminocido, qu protena estar codificada por el siguiente
mRNA?

5 CCUCAUAUGCGCCAUUAUAAGUGACACACA-3
- Qu mRNA codifica el siguiente poliptido?

Met Arg Ser Leu Glu

- Un poliribonucletido sinttico se produce a partir de una

mezcla que contiene U y C con una proporcin de 5:1.
considerando que el poliribonucletido ha incorporado los
nucletidos al azar, deducir las frecuencias relativas en las que
puede esperarse que aparezcan los distintos tripletes.

- Se obtiene una muestra de DNA, se transcribe a su mRNA y se

purifica. Se separan entonces las dos hebras del DNA y se
analiza la composicin de bases de cada hebra del DNA y del
mRNA se obtienen los datos recogidos en la tabla de la derecha.
Qu hebra del DNA es la hebra transcrita, que sirve como
molde para la sntesis del mRNA?

a) A G C T U Hebra 1
b) Hebra 2
c) Hebra DNA 19. 26. 31. 23.
0 Ambas hebras 1 y 2
d) n1 1 0 0 9 Ninguna hebra
e) Hebra DNA 24. 30. 25. 19. La informacin es
0 insuficiente .
n2 2 8 7 3
19. 25. 30. 24.
mRNA 0
0 9 8 3

MMQF/GMD 28
- En la posicin 210 de la enzima silvestre triptofano sintetasa de
E. coli hay un residuo de glicina. Si el codn para la Glicina es
GGA cuntas sustituciones de una sola base produciran
sustitucin de aminocido en la posicin 210.
- La adicin de un solo nucleotide y la delecin de otro nucletido
a una distancia de unos 15 nucletidos del primero provoca el
cambio de la secuencia de una protena de:
Lys Ser Pro Ser Leu Asn Ala Ala Lys
A: Lys Val His His Leu Met Ala Ala - Lys
a) Cul es la secuencia del mRNA original y del Nuevo
mRNA?
b) Qu nucletido se ha aadido y cual se ha quitado?
- Una mutacin provoca la insercin de un par de nucletidos
extra en el DNA; cual de las consecuencias siguientes cabe
esperar:
a) que
no se produzca mutacin
b) una
protena con un aminocido cambiado
c) una
protena con tres aminocidos cambiados
d) una
protena con dos aminocidos cambiados
e) una protena en la que estn cambiados la mayora de
aminocidos a continuacin del punto de insercin.
- Las siguientes secuencias representan DNA provenientes de
una sola molcula:
Sec 1: CTTTTTTGCCAT
Sec 2: ACATCAATAACT
Sec 3: TACAAGGGTTCT
a) Determinar para cada secuencia el mRNA que se producir
durante la transcripcin.
b) Determinar la secuencia de aminocidos que se producirn
en cada caso.
c) Si se considera que las 3 secuencias provienen del mismo
gen cual representa la parte inicial, la del medio y la
terminal.
REFERENCIAS

1. Annimo. (n.d). Estructura y propiedades de los cidos

nucleico. Universidad de Jan, Dpto. Biologa Experimental, rea
de Gentica. Problemas de Gentica Curso 2005 2006.
2. Annimo. (n.d.). El Cdigo Gentico: Antecedentes y
propiedades generales del cdigo. Asignacin de codones a
aminocidos concretos. Modelos de representacin.
Caractersticas especficas. Obtenido 25 de enero de 2010 en
http://www2.uah.es/bioquimica/f-bmig/pregs/t13/inicio.htm
3. Lehninger, A.; Nelson, D.; Cox, M. (2001). Principios de
Bioqumica. Espaa. Ediciones Omega

MMQF/GMD 29
 PRCTICA N 6
ESTRUCTURA DE LA CLULA
INTRODUCCIN.-
La evolucin de la teora celular constituye uno de los pilares de la
biologa moderna; cuando Robert Hooke, en el ao de 1665, utiliz
por primera vez el trmino clula para describir las celdas que
observaba al cortar finamente un trozo de corcho, dio inicio a una
era de investigaciones que condujo al desarrollo de la teora
celular. Contribuyeron a recorrer este camino hombres como
Leeuwenhoek, Schleiden, Schwann y Virchow, cuyos conceptos
posteriormente se fusionaron a los resultados de otros
investigadores, como Darwin y Mendel.
En el desarrollo de la teora celular se distinguen tres perodos el
primero se centr en establecer la estructura de la clula y est
muy ligado a la invencin y desarrollo del microscopio; el segundo
se caracteriza por el mtodo de trabajo experimental y por la
tentativa de interpretar las estructuras celulares respecto de su
funcin, y el tercero se refiere a la descripcin de las funciones de
los elementos celulares, pero a nivel molecular, gracias al
desarrollo de la gentica y de la biologa molecular.
Todos los organismos estn formados por clulas siendo esta su
unidad fundamental, la cual puede ser procaritica o eucaritica;
es una unidad independiente y autosuficiente capaz de cumplir
funciones especficas. Las clulas procariticas se caracterizan por
no poseer una membrana nuclear y ciertos organelos
citoplasmticos a diferencia de ellas las clulas eucariticas
poseen un citoplasma en el cual se encuentran suspendidos
organelos apropiados para desarrollar funciones especficas,
poseen una membrana nuclear y por ende un ncleo bien definido
que contiene al material gentico.
Las tcnicas que se emplean para el estudio de las clulas son:
1. Estudio de la clula viviente
2. Estudio de la clula postmortem

1. ESTUDIO DE LA CLULA VIVIENTE

Entre los principales mtodos para estudiar la clula viviente
tenemos:
a) Examen Vital
b) Cultivos celulares o cultivos de tejidos
c) Microciruga

- EXAMEN VITAL.- Es un mtodo de estudio de la clula, el cual

se aplica directamente a la observacin de organismos vivos,
clulas libres, aisladas. Para la observacin de organismos vivos
se emplean: Microscopio ptico, microscopio de contraste de
fases, de interferencia. Para la observacin exitosa de los
organismos vivos, se requiere de la utilizacin de lquidos en el

MMQF/GMD 30
 que no varen el pH del medio en el que vivan los organismos a
estos lquidos se les denomina Medios Fisiolgicos o
indiferentes por que no ejercen ninguna accin modificadora
sobre los elementos del organismo y por lo general son
isotnicos con respecto al ser vivo. Estos lquidos de acuerdo a
su origen pueden ser Naturales o Artificiales.
Lquidos Naturales, provienen del hbitat del organismo, si
son seres de vida libre, del agua dulce o marina; si son parsitos
o saprfitos, del suero sanguneo, del lquido amnitico, del
humor acuoso, de la clara del huevo, etc., es decir si son lquidos
en los que estos organismos acostumbran vivir, asimismo se
debe tener en cuenta el pH del medio.
Lquidos Artificiales, imitan a los lquidos naturales, sin
modificar la vitalidad del organismo ni sus caractersticas.
Ejemplo: El suero Fisiolgico en base a cloruro de sodio que se
prepara a 0.8 a 0.9% para conservar tejidos de vertebrados
superiores y al 0.6% para vertebrados inferiores e
invertebrados, con excepcin de organismos marinos, en los que
se debe concentrar a la misma proporcin que el agua del mar.
Para el estudio microscpico prolongado se debe recurrir a
procedimientos que impidan que el lquido de montaje se
evapore, lo que causara la muerte del organismo; para evitar se
emplean cmaras hmedas, pequeas celdas en donde se
encierran los organismos con cmaras de uso regularizado son:
cmara hmeda de Ravier, Cmara de gota pendiente, Cmara
hmeda de Carpenter.
Para la observacin vital de un organismo se utiliza el mtodo de
coloracin vital.

COLORACIN VITAL: En 1881 Enrlich ide por primera vez

este mtodo empleando el azul de metileno, que le dio buenos
resultados. Posteriormente Michaelis logr la tincin vital de las
mitocondrias que result con xito.
Con este mtodo se hacen visibles ciertas estructuras, sin
causar alteracin o causando poca alteracin fsico-qumica del
protoplasma es decir, en cierta manera se deja intacta la
vitalidad celular. En general los colorantes son ms o menos
txicos, por lo cual se deben preparar a concentraciones muy
bajas. Entre los colorantes vitales tenemos: Rojo neutro, tinta
china, azul de metileno, rojo de congo, verde de jano, azul de
tripn, entre otros. En general estos colorantes no tien sino,
que solamente se acumulan en determinadas estructuras de la
clula.

MMQF/GMD 31
 La tcnica de coloracin puede ser VITAL, cuando el colorante
no provoca la muerte celular, se utilizan, por lo tanto, para teir
material vivo; y SUPRAVITAL cuando se aplican los colorantes
una vez que el material se ha fijado el material en este caso es
obtenido a travs de biopsias o procedimientos quirrgicos.
- CULTIVOS CELULARES O CULTIVOS DE TEJIDOS.- Es un
mtodo que permite la observacin de las clulas bajo
condiciones favorables y seguir el desarrollo de stas. El cultivo
de tejido fue ideado por Harkson y perfeccionando en 1912 por
Alexis Carrel, hizo crecer explantos de tejido embrionario
cardaco durante varias generaciones. El cultivo celular se
realiza en medios qumicos bien definidos.
Existen tres tipos principales de cultivo de tejidos: Cultivos
primarios, cultivos secundarios y cultivos de lneas establecidas.
Los cultivos primarios: Consisten en obtener muestras
directas de tejidos animales o vegetales (normales) en
condiciones de asepsia, los cuales se cortan en trozos y se tratan
con tripsina; luego se cultiva en cpsulas petri en medios de
cultivos apropiado.

Los cultivos secundarios: Se obtiene a partir de la

tripsinizacin de un cultivo primario, luego se cultivan en
nuevas placas petri. Los cultivos de lneas establecidas resultan
ser de uso comn. Estos cultivos se han adaptado a un
crecimiento prolongado invitro, por una transformacin
cancerosa. Entre las ms conocidas tenemos las clulas HELA.
Los cultivos de clulas normales no llegan a sobrevivir mucho
tiempo, puesto que despus de varios subcultivos dejan de
dividirse y mueren. Los cultivos de lneas establecidas se
caracterizan por una proliferacin rpida, crecen en forma
apretada, requieren menor concentracin de suero sanguneo y
en general son clulas heteroploides, no obstante de estas
anomalas son tiles para el estudio del cncer.

Cultivos de lneas establecidas: o lneas puras al cultivar las

clulas se realiza en concentraciones bajas se producen colonias
que se adhieren en la placa petri; todas las clulas de esta
colonia provienen de una clula nica (madre) por lo que se
conoce como cepa pura.
- MICROCIRUGA.- Es otro mtodo de estudio de la clula que ha
coadyuvado al conocimiento de la clula viviente. Tambin se
denomina micro manipulacin.
La microciruga consiste en la introduccin de micro pipetas,
micro agujas, micro electrodos en las clulas y tejidos. La
introduccin de estos instrumentos se realiza bajo el campo del

MMQF/GMD 32
 microscopio mediante aparatos o aditivos especiales del
microscopio, que permiten el movimiento controlado de estos
instrumentos. Con este instrumental se puede efectuar:
La diseccin y extraccin de partes de una clula y tejidos.
La medida de variables elctricas
La inyeccin de sustancias
El injerto de partes de una clula a otra y sucesivamente.
As mismo se utilizan ases de lser para producir dao en
regiones localizadas de la clula.
2. ESTUDIO POSTMORTEM DE LA CLULA
FIJACIN.- La fijacin es un mtodo por el cual se llega a
preservar la morfologa y composicin qumica de la clula.
Consiste en provocar la muerte celular de tal manera que la
estructura que tena la clula viviente se conserve sin el
agregado de otros artificios. La mayor parte de los fijadores
actan especialmente sobre la parte proteica de la clula,
transformando el coloide protoplasmtico en geles insolubles o
irreversibles, es decir actan solidificando el protoplasma por
medio de la coagulacin o precipitacin. Los fijadores conservan
una clula preparndola para la inclusin, microtoma y
coloracin. La fijacin es una tcnica que permite analizar
despus de la muerte clulas y tejidos. Cuando se introduce un
trozo de tejido en un lquido fijador, la muerte celular no se
produce instantneamente, por lo que pueden producirse
alteraciones post mortem debido a la anoxia y a los cambios de
pH. El fijador en el tejido penetra por difusin, razn por la cual
las clulas perifricas se fijan ms rpido que las clulas
centrales.

OBJETIVOS.-
Reconocer y describe la estructura y caractersticas
morfolgicas de las clulas procariticas y eucariticas de
diferente origen.
Establecer las diferencias entre las clulas observadas.
Identificar con ayuda de las tcnicas de coloracin organelos
presentes en las clulas.

MATERIALES.-
Microscopio ptico Compuesto
Centrfuga
Mechero
Tubos de ensayo
Lmina portaobjetos y cubreobjetos
Asa de Kolle
Alcohol-Cloroformo
Azul de metileno

MMQF/GMD 33
 Yogurt
Solucin de violeta genciana o de violeta de metilo
Solucin de lugol
Alcohol al 95%
Solucin de Fucsina o safranina
Goteros
Alfiler
Palillo de dientes
Agua estancada
Agua destilada
Moho de pan o de fruta
Glicerina
Cebolla, tomate, papa,
Aguja o bistur
Alcohol 70
Algodn
Trozo de epidermis de pollo

PROCEDIMIENTO.-
OBSERVACIN DE BACILOS DE YOGURT
- Con una asa de kolle tomamos una pequea muestra de
yogurt
- Colocamos en un portaobjetos sobre una gota de agua y
hacemos la extensin.
- Secamos al aire o a la llama del mechero.
- Colocamos el portaobjetos sobre el soporte de unciones y
aadimos unas gotas de alcohol cloroformo de esta forma
fijamos la preparacin y elimina grasas.
- Vertemos el exceso y dejamos secar al aire.
- Teimos con azul de metileno durante 10 minutos,
- Lavamos y secamos al aire
- Llevamos al microscopio y observaremos con objetivos de
fuerte aumento, se observar el Lactobacillus como
pequeos bastoncillos teidos intensamente por el azul de
metileno.

OBSERVACIN DE LA PLACA BACTERIANA CON TINCIN

GRAM
- Raspar cuidadosamente con ayuda de un palillo de dientes
entre los dientes de la boca
- Colocar el material raspado sobre una lmina portaobjetos
- Sobre el frotis fijado vierta la solucin de violeta y deje en
reposo 1 minuto. Luego vierta la solucin.
- Trate el frotis con la solucin de lugol durante 3 minutos y
sin lavarlo con agua, se vierte luego la solucin. (El lugol
forma un complejo crista violeta-yodo).
- Decolore el frotis con alcohol al 95% durante 0.5 minutos
(30segundos) moviendo el portaobjetos hasta que
desaparezcan los chorros gris violceos del colorante.
Despus lave con agua.

MMQF/GMD 34
 - Sobre el frotis eche la Fucsina o la solucin de Safranina
para realizar la contratincin. Al cabo de 1 2 minutos se
vierte el colorante, el preparado se lava con agua, se seca
con papel toalla o filtro.
- Observe al microscopio la tincin utilizando el lente de
inmersin. Localice las bacterias y determine la forma que
tienen.

OBSERVACIN DE PROTOZOARIOS
- Colocar las muestras en los tubos de ensayo al mismo nivel y
centrifugar
- Realizar preparaciones en fresco a partir del concentrado
centrifugado, de las muestras de agua.
- En zona asptica, con una pipeta Pasteur transfiera una gota
de la muestra al centro del portaobjetos limpio y
desengrasado.
- Cubra la preparacin con la lmina cubreobjetos y coloque en
la platina del microscopio para la observacin.
- Observe la preparacin con objetivo de 40X y con baja
intensidad de luz
- Realice los esquemas correspondientes a las preparaciones
observadas

OBSERVACIN DE HONGOS Y LEVADURAS

- Colocar una gota de glicerina sobre un portaobjeto.
- Desprender con un alfiler o con la aguja o asa de kolle una
porcin de moho de pan o de fruta y ponerla en la gota de
glicerina.
- Cubrir la muestra con el cubre objeto.
- Observar la muestra con objetivo de 40X
- Realizar la grfica correspondiente.

OBSERVACIN DE CLULAS EPIDRMICAS DE CEBOLLA

- Con ayuda de un bistur colocar una porcin pequea de
catafila en una lmina portaobjetos.
- Aadir unas gotas de agua destilada
- Colocar la lmina cubreobjetos y observar al microscopio
- La observacin se har primero con el objetivo de menor
aumento, se examinar la preparacin entera, observando que
est formada por clulas alargadas que encierran el ncleo.
- Si no se observa el ncleo agregar lugol o azul de metileno.

OBSERVACIN DE CROMOPLASTOS
- Colocar una porcin de pulpa de tomate en la lmina portaobjetos sin
agua y proteger con un cubreobjetos, comprimiendo suavemente la
preparacin.

OBSERVACIN DE LEUCOPLASTOS

MMQF/GMD 35
- Raspar papa con ayuda de lanceta y colocar en el
portaobjetos, aadir agua y lugol, colocar cubreobjetos y
observar al microscopio.
- Los grnulos de almidn se tien de color azul-violeta
intenso por el yodo.

OBSERVACION DE CLULAS DEL EPITELIO BUCAL

- Introducir el mondadientes en la cavidad bucal
- Raspar suavemente el mondadientes la cara interna del carrillo
- Limpiar el producto obtenido con ayuda de un bistur y
depositarlo con una gotita de agua sobre la lmina portaobjetos
- Hacer una extensin frotando con la aguja sobre el
portaobjetos
- Calentar a la llama del mechero sin que llegue a quemar el
porta sobre el dorso de la mano
- Colocar el porta sobre el soporte de tincin encima de la
cubeta
- Agregar unas gotas de azul de metileno o de verde de metilo
actico, dejando actuar el colorante 2 3 minutos
- Verter el colorante sobrante y lavar la preparacin hasta que
no suelte color.
- Poner encima un cubre objetos, de forma que ste caiga como
se cierran las tapas de un libro, dejando caer suavemente el
cubre se evita todo riesgo de que queden burbujas de aire
entre el porta y el cubre.
- Observar al microscopio a aumentos dbiles localizando el rea
de la preparacin ms idnea.
- Deben desestimarse las zonas pocas o muy teidas.
- Enfocar clulas aisladas con mayor aumento.

OBSERVACIN DE CLULAS DE FROTIS SANGUNEO

- Limpiar el pulpejo del dedo con una gota de alcohol,
hacer una puncin para conseguir una gota de sangre
- Depositar la gota de sangre, en un lado y en el centro
de un porta objetos bien limpio
- Seguidamente, con el empleo de un portaobjetos de
borde esmerilado se hace un frotis o extensin de sangre, el
portaobjetos con el que se hace la extensin debe deslizarse
bien colocado y lo ms perfectamente aplicado en su borde
contra el otro porta sobre el que se hace la extensin. Slo
debe pasarse una vez, de forma continua e ininterrumpida.
- Es conveniente realizar dos o tres extensiones, con el
fin de seleccionar para la tincin la mejor lograda.
- Las extensiones o frotis deben secarse al aire lo ms
rpidamente posible.
- Depositar el portaobjetos con la extensin de sangre
encima del soporte de tinciones y ste sobre la cubeta.

MMQF/GMD 36
- Dejar caer sobre la extensin unas gotas de metanol y
esperar que el alcohol se evapore, con lo que la muestra estar
fijada.
- Colorear con colorante Wright durante 15 minutos
- Lavar la preparacin, hasta que arrastre todo el
colorante
- Hacer secar la muestra.
- Realizar la observacin al microscopio.

OBSERVACIN DE LA PIEL DE POLLO

- Tomar una muestra de telita de piel de pollo
- Colocarla en el porta objeto.
- Agregar una gota de agua y cubrirla con el cubre objeto.
- Colocar la muestra sujetndola con las pinzas de la platina del
microscopio, observar con el lente de 4X y luego con el de 10X.

RESULTADOS.-
- Realizar las grficas correspondientes a cada observacin.
- Establecer las diferencias y semejanzas que poseen las clulas
procariticas y eucariticas
- Establecer las diferencias y semejanzas que poseen las clulas
vegetales y animales
- Establezca y explique las diferencias encontradas entre las
clulas observadas (Forma, tamao, presencia o ausencia de
estructuras, ncleo, etc.)

CONCLUSIONES.-
Establezca las conclusiones finales de la prctica.
CUESTIONARIO.-
1. Qu tamao y qu formas pueden presentar las clulas?
2. Cuntos reinos existen y que tipos de clulas poseen?
3. Quin o quienes hicieron la clasificacin de los seres vivos y
que tomaron en cuenta para ello? Segn Wittaker como se
clasifican los seres vivos?
4. Qu color tienen las clulas y por qu?
5. Cmo actan los colorantes en las clulas?

REFERENCIAS.-
1. Annimo. (n.d.) Gua de Prcticas de Histologa Humana.
Facultad de Medicina Humana USMP. Lima. Obtenida el 17
de febrero de 2010 en
http://www.scribd.com/doc/14766272/Guia-practicas-
Histologia
2. Acurio, L. (1995). Gua de Prcticas de Biologa Celular.
UNSAAC. Cusco.
3. Celis, G. (2001). Gua de estudio Biologa Celular y
Molecular. Universidad de la Sabana.

MMQF/GMD 37
 4. Quispe, G. (2005) Gua de Prcticas de Biologa General y
Especializada. UNSAAC. Cusco

PRCTICA N 7
FRAGILIDAD OSMTICA DE LOS ERITROCITOS
INTRODUCCIN.-
Existen varios mtodos para medir la presin osmtica celular; la
mayor parte son fsicos algunos de estos mtodos son utilizando
tanto a la zanahoria como al celofn, por lo que es conveniente
comparar los anteriores modelos utilizando clulas vivas, como en
este caso sern glbulos rojos. La forma de disco bicncavo del
eritrocito normal, implica un exceso de extensin superficial con
relacin a su volumen, lo que le proporciona una gran capacidad
de deformabilidad. Como la membrana eritrocitaria es
semipermeable, cuando los eritrocitos son colocados en una
solucin hipotnica, el agua entra osmticamente haciendo que
aumente el volumen y adquiere la forma esfrica. Con ello, la
superficie disminuye respecto a su volumen dando a la clula
cierto grado de rigidez que interfiere con el paso de la misma a
travs de pequeas aberturas, por lo que fcilmente se rompe.
Otro fenmeno adicional es la salida de hemoglobina, que es
permitida por el estiramiento de la membrana eritrocitaria. En
esta prctica se harn una serie de diluciones de NaCl, de
concentracin progresiva, en las que los eritrocitos problema se
sometern a diferentes concentraciones y se valorar la

MMQF/GMD 38
concentracin de Nacl que produce la hemlisis en comparacin
con una sangre normal.
La prueba de fragilidad osmtica es una medida de la resistencia
del eritrocito, a la hemlisis por estrs osmtico, la cual depende
principalmente del volumen de la clula, del rea de su superficie
y de la funcin de su membrana. Los eritrocitos se incuban en
solucin hipotnica de NaCl, lor eritrocitos absorben agua en un
esfuerzo para conservar o para lograr el equilibrio osmtico y las
clulas se hinchan hasta que se forma un esferocito. La captacin
adicional del agua produce una membrana porosa que permite la
liberacin de hemoglobina (hemlisis). Las clulas normales
comienzan a hemolizar a concentraciones de NaCl cercanas a
0.50% y la hemlisis es completa a una concentracin
aproximadamente de 0.30% de NaCl. Debido a la disminucin en
la proporcin de superficie a volumen, los esferocitos son
incapaces de expandirse tanto como las clulas normales de forma
discoide. Se necesita absorber muy poco lquido antes que las
clulas se hemolicen. Los esferocitos tambin tienen un aumento
en la permeabilidad de la membrana la cual contribuye al aumento
de su fragilidad.

OBJETIVOS.-
Aprender a realizar la determinacin de la fragilidad osmtica
de los eritrocitos para demostrar el fenmeno de osmosis.

MATERIALES.-
Centrfuga
Gradilla
16 tubos de ensayo de 13 x 100 mm
Equipo de venopuncin
Papel parafilm
Pipetas graduadas de 5 ml
Pipeta graduada de 0.2 ml
Sangre obtenida con EDTA
Solucin salina al 1% tamponada pH 7.4

MMQF/GMD 39
PROCEDIMIENTO.-
- Se obtienen 5ml de sangre venosa y se mezclan perfectamente
- Se colocan 16 tubos de ensayo en una gradilla y se numeran de
izquierda a derecha
- Montar la prueba de la siguiente manera:

N de tubo Sol. Salina al Agua Concentraci

0.9% (ml) Destilada n de la
(ml) solucin (%)
1 4.2 0.8 0.76
2 4.0 1.0 0.72
3 3.8 1.2 0.68
4 3.6 1.4 0.64
5 3.3 1.7 0.60
6 3.1 1.9 0.56
7 2.8 2.2 0.52
8 2.6 2.4 0.48
9 2.4 2.6 0.44
10 2.2 2.8 0.40
11 2.0 3.0 0.36
12 1.8 3.8 0.32
13 1.6 3.4 0.28
14 1.3 3.7 0.24
15 1.1 3.9 0.20
16 0.9 4.1 0.16

- Mezclar el contenido de los tubos

- Agregar a cada tubo 0.2 ml de sangre, invertir cudadosamente
cada tubo con papel parafilm, para asegurar la mezcla.
- Las gradillas que contienen los tubos se dejan reposar a
temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Transcurrido el tiempo indicado se mezcla cuidadosamente su
contenido y se centrifugan los tubos a 2000 r.p.m durante 5
minutos.
- Examinar los tubos observando macroscpicamente en que
punto comienza la hemlisi y en que punto es completa. El
menor indicio de color rojo en el lquido sobrenadante indica el
inicio de la hemlisis de los glbulos menos resistentes; la
hemlisis completa queda indicada por una solucin rojo claro
y ausencia de eritrocitos residuales en el fondo del tubo o
enturbiamiento al agitar el tubo ligeramente.

RESULTADOS.-
- Realice los esquemas correspondientes

CONCLUSIONES.-
- Establezca las conclusiones de la prctica.

MMQF/GMD 40
CUESTIONARIO.-
1. Qu es fragilidad osmtica?
2. Qu es osmolaridad?
3. Qu importancia clnica tiene la fragilidad osmtica?

REFERENCIAS.-
1. Balcells, A. 1998. La ciencia y el laboratorio. Medicina.
Barcelona. Espaa. 18 Edicin, Editorial Masson-salvat
2. McKenzie, S. 2000. Hepatologa clnica2. Editorial El Manual
Moderno. Mxico
3. Lynch, M. 1992. Mtodos de laboratorio. Mxico
4. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico.

PRCTICA N 8
CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL DE ORGANELOS
CELULARES
INTRODUCCIN.-
Las clulas eucariontes tienen organelos celulares delimitados por
una sola membrana. Todos ellos pueden ser separados utilizando

MMQF/GMD 41
mtodos de centrifugacin diferencial y por gradientes de
densidad dentro de lo que se conoce como la tcnica de
FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR. Dado que la mayora de ellos
tienen diferente peso molecular, viscosidad o densidad.
La tcnica de Fraccionamiento Subcelular, permite obtener
componentes celulares asilados, en grandes cantidades y con alto
grado de pureza. Esta tcnica fue desarrollada entre otros por
Alberte Claude y Christian Duve entre 1940 y 1950, y consiste en
la separacin de los componentes de la clula en base a su tamao
y densidad.
El primer paso a seguir en un fraccionamiento subcelular es la
ruptura u homogenizacin de la muestra. Esto se logra a travs de
diferentes procedimientos como sonicacin (exposicin a sonidos
de alta frecuencia), shock osmtico, o simplemente moliendo las
clulas en homogenizadores mecnicos. En esta etapa se rompen
muchas de las membranas de la clula, incluyendo la membrana
plasmtica y el retculo endoplsmico, las que queda formando
pequeos fragmentos o vesculas que dan origen a la fraccin
microsomal. El resto de los componentes celulares (ncleo,
mitocondrias, cloroplastos, aparato de Golgi, lisosomas y
peroxisomas) permanecen intactos. Las partculas y vesculas as
obtenidas conservan la mayor parte de sus propiedades
bioqumicas originales y permiten el estudio de la funcin de cada
organelo celular por separado.
La suspensin de clulas rotas obtenidas anteriormente es llamada
lisado u homogenizado, y es la que se fracciona en la segunda
etapa del proceso. Se realiza a travs de una serie de etapas
sucesivas de centrifugacin en las que los componentes de las
clulas se separan en un campo gravitacional. Si dos componentes
de distinta masa e igual tamao y forma estn en un mismo medio,
el cuerpo de mayor masa sedimentar (se ir al fondo) a mayor
velocidad debido a su mayor peso. El peso es el producto de la
masa (m) y la fuerza de gravedad (g), por tanto la fuerza de
gravedad se incrementa, la velocidad de sedimentacin tambin
aumentar. Para aumentar el campo gravitacional se usan las
centrfugas. Estos instrumentos consisten rotores con cavidades
para los tubos, los que se hacen girar a diferentes velocidades, de
manera que a mayor velocidad el campo gravitacional obtenido es
mayor. Lo mismo ocurre a mayor distancia entre el tubo y el eje de
giro del rotor. En otras palabras, el campo gravitacional generado
depende directamente del radio de giro y de la velocidad de
rotacin. Al trmino de una centrifugacin se pueden distinguir en
el tubo dos fases. En el fondo del tubo se obtiene un sedimento o
pellet y sobre l una parte lquida llamada sobrenadante.

MMQF/GMD 42
 Figura N 1: FASES OBTENIDAS DESPUS DE LA
CENTRIFUGACIN

Generalmente, la primera etapa de separacin consiste en una

centrifugacin a baja velocidad a la cual sedimentan slo las
clulas que permanecen enteras y las partculas subcelulares ms
grandes, los ncleos. As, el primer pellet obtenido corresponde a
una fraccin enriquecida en ncleos y el sobrenadante contiene al
resto de los componentes celulares en suspensin. El
sobrenadante se somete a una segunda centrifugacin que se
realiza a velocidades intermedias, en la que sedimentan
mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas. El nuevo
sobrenadante se recentrifuga a alta velocidad obtenindose un
pellet enriquecido en membrana plasmtica y retculo
endoplsmico (fraccin microsomal). Una ltima centrifugacin del
sobrenadante anterior a velocidades aun mayores permite
sedimentar finalmente los ribosomas, dejando en el sobrenadante
solo la porcin soluble del citoplasma, el citosol.
Figura N 2: FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR TPICO A
TRAVS DE LA CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL

MMQF/GMD 43
Las fracciones que se obtienen por el procedimiento anterior son
fracciones enriquecidas, pero no totalmente puras de los
diferentes organelos. Existen otras modalidades de centrifugacin
en las que se utilizan medios de mayor densidad, que se obtienen
con soluciones de sacarosa, polmeros o protena. Permiten
realizar el proceso de separacin en gradientes de densidad,
obteniendo organelos con mayores grados de pureza.
Generalmente el proceso de fraccionamiento celular se evala
mediante el anlisis de la forma en que se distribuyen algunos
componentes celulares de localizacin subcelular conocida en las
diferentes fracciones obtenidas. Estas molculas son llamadas
marcadores de cada una de las fracciones. Por ejemplo, el DNA es
un marcador de la presencia de ncleos, las enzimas del ciclo de
krebs o de la cadena respiratoria son marcadores de mitocondrias,
y el proceso de fotosntesis indica la presencia de cloroplastos. De
este modo, el anlisis de la distribucin de los diferentes
marcadores en todas las fracciones subcelulares obtenidas permite
conocer la distribucin y pureza relativa de los distintos organelos
y el nivel de calidad de los componentes contaminantes de cada
fraccin.
La obtencin de organelos celulares aislados permite entonces
estudiar en forma relativamente especfica algunos procesos
celulares que ocurren en compartimentos particulares, aislndolos
de las reacciones que ocurren en otros organelos. Por ejemplo se
puede estudiar la sntesis de protenas en ribosomas aislados o
asociados a membranas, el transporte de sustancias a travs de la
membrana plasmtica, la fotosntesis en cloroplastos, el
procesamiento de glicoprotenas en el aparato de Golgi, etc.
OBJETIVOS.-

MMQF/GMD 44
 Conocer las tcnicas de homogeneizacin usadas en el
fraccionamiento subcelular
Comprender los fundamentos de la tcnica de centrifugacin
usada en el fraccionamiento subcelular.
Realizar el fraccionamiento celular e identificar en este
organelos de clulas vegetales o animales.

MATERIALES.-
Hgado Fresco
Hojas de Espinaca
Pinzas, tubos de centrfuga
Vasos de precipitacin
Embudos mechero
Porta objetos, gasa
Solucin de sacarosa a 0.25Molar
Cloruro de sodio
Colorantes: Acetato de orcena clorhdrica, hematoxilina
eosina
Centrfuga
Homogeneizador mortero (licuadora)
Refrigeradora
Solucin de sacarosa. solucin acuosa 0.5M
Solucin tampn fosfato potsico. Solucin 0.1m de KH2PO4, en
solucin de sacarosa ajustada a pH 7.4
Solucin de EDTA en solucin tampn de fosfato 10M, ajustada
a pH 7.4

PROCEDIMIENTO PARA OBSERVACIN DE FRACCIN

SUBCELULAR A PARTIR DE HIGADO
- El hgado de cuye, res o pollo se perfunde en una solucin salina
helada (refrigerada) por doce horas descartando previamente
fibras, grasa, membranas del tejido.
- Seguida por una solucin de sacarosa helada a 0.25 molar por
12 horas.
- Se homogeneiza en solucin de sacarosa 0.25 M, en un
homogeneizador, mortero o licuadora.
- Filtrar el homogenato a travs de capas de gasa, de esta manera
se descarta fibras.
- Centrifugar el homogenato en tubos de centrfuga a 1000 r.p.m.
durante 20 minutos, el sedimento contiene hepatocitos aislados
intactos, algunas clulas se observaran rotas.
- Recuperar el sobrenadante en tubos de centrfuga y realizar un
frotis del sedimento en portaobjetos, secar a la flama del
mechero, colorear con hematoxilina-eosina, observar al
microscopio.

MMQF/GMD 45
- El sobrenadante recuperado en el paso 6, someter a
centrifugacin a 3000 r.p.m durante 20 minutos, el sedimento
contiene ncleos.
- Mediante una bagueta realizar un frotis del sedimento en
portaobjetos, secar al mechero, colorear con hematoxilina
eosina, observar al microscopio.

PROCEDIMIENTO PARA OBSERVACIN DE FRACCIN

SUBCELULAR A PARTIR DE HOJAS DE ESPINACA
Todos los pasos de este trabajo se realizan de 4 a 5C o muy
prximos a esta temperatura, para tratar de reducir la actividad
enzimtica.
- Tomar las hojas de espinaca, lavarlas con agua fra de cao
dejndola secar al aire tan lentamente como sea posible.
- Pesar 125 gr. De espinaca, se homogeneiza en 250 ml de
solucin de EDTA 10M durante 30 segundos poniendo al
mximo el indicador de velocidad de rotacin del
homogeneizador.
- El homogeneizado verde obtenido se filtra a travs de varias
capas de gasa.
- El filtrado se centrifuga a baja velocidad durante 30 minutos a
200 x g.
- El sobrenadante se transvasa a otro tubo; a continuacin se
centrifuga durante 12 minutos a 600xg.
- El precipitado se resuspende en 40 ml de solucin de sacarosa
0.5 M y se centrifuga nuevamente a 600 x g durante 12 minutos.
- El sedimento est constituido por cloroplastos purificados.

RESULTADOS.-
- Realizar las grficas correspondientes
- De qu depende el comportamiento de una partcula
subcelular durante la centrifugacin diferencial.

CONCLUSIONES.-
- Establezca las conclusiones de la prctica

CUESTIONARIO.-
1. A qu se denomina centrifugacin isopcnica?
2. Qu componentes contendrn los grnulos de secrecin?
(ltima fraccin de algunos tejidos?
3. Represente con un diagrama los cloroplastos y muestre sus
detalles internos identificando sus estructuras.
4. Los cloroplastos tienen su propio DNA y RNA, que funcin
cumplen en stos?
5. Cul es la organizacin molecular de los tilacoides?

REFERENCIAS.-

MMQF/GMD 46
 1. Annimo. (n.d.) Gua de Prcticas de Histologa Humana.
Facultad de Medicina Humana USMP. Lima. Obtenida el 17
de febrero de 2010 en
http://www.scribd.com/doc/14766272/Guia-practicas-
Histologia
2. Acurio, L. (1995). Gua de Prcticas de Biologa Celular.
UNSAAC. Cusco.
3. Celis, G. (2001). Gua de estudio Biologa Celular y
Molecular. Universidad de la Sabana.
4. Quispe, G. (2005) Gua de Prcticas de Biologa General y
Especializada. UNSAAC. Cusco

PRCTICA N 9

MMQF/GMD 47
 CICLO CELULAR Y MITOSIS
INTRODUCCIN.-
Una clula correspondiente a un organismos animal o vegetal, sea
unicelular o pluricelular, tiene la propiedad fundamental, cual es,
de reproducirse, o multiplicarse a travs del ciclo de proliferacin
celular, es decir que la clula duplica sus estructuras
fundamentales, transmitir el DNA con los sistemas nuclear y
citoplasmtico precioso a las clulas hijas o descendientes. En este
proceso la clula tiene una doble funcin: copiarse a s misma, y
que su copia sea regulada es decir, diferenciada segn las
necesidades del organismo a la que pertenece.El ciclo celular
comprende dos periodos fundamentales: Interfase y Divisin. Esta
ltima, en organismos eucariticos, generalmente tiene lugar por
la mitosis o meiosis.
La Interfase es un periodo de mxima actividad biosinttica,
donde se produce el DNA, protenas bsicas-histonas, la mayor
parte de RNA, protenas no bsicas y nuevas membranas. La
mayora de las clulas permanecen, sin embargo, la mayor parte
de su vida en interfase, periodo por el cual se duplica su masa y se
auto replica el DNA, lo que conlleva la duplicacin del
complemento cromosmico.
El periodo de la divisin se puede dar a travs de la mitosis o
meiosis, donde la clula madre o clula germinal se dividir para
dar lugar a dos clulas hijas diploides (2n) o a 4 gametos haploides
(n) respectivamente.
El ciclo celular puede dividirse en 4 fases: Fase S (sntesis de
DNA), G1 (lapso entre la divisin celular y la fase S), G2 (lapso
entre la fase S y la divisin siguiente) y M (mitosis y citocinesis).
La interfase comprende G1, S, G2; se realizaron estudios con
istopos radioactivos as como la Timidina Tritiada TdR-H3 durante
la interfase, este hecho permiti determinar el periodo exacto en
que se produce la duplicacin de DNA, demostrndose que la
sntesis se lleva a cabo durante la parte limitada de la interfase
denominada periodo S o sinttico que a su vez esta presidido y
seguido por dos espacios que son los gaps o periodo de la
interfase G1 y G2 en los que evidentemente no hay sntesis de DNA,
por este hecho es que Howard y pelc dividieron el ciclo celular en
4 intervalos G1,S,G2 y Mitosis, en el periodo G 2 las clulas
contienen el doble (4C) de la cantidad de DNA presente en la
clula diploide original (2C).

MMQF/GMD 48
Periodo G1
G1 en mitosis es el periodo ms variable del ciclo celular en
relacin con la condicin fisiolgica, este puede dudar das, meses
o aos. Los tejidos que normalmente no se divide Ejlo: clulas
nerviosas, msculo esqueltico o que se dividen poco como los
linfocitos, se hallan en le periodo G1 y contienen 2C de DNA.
Cuando una clula en cultivo se suspende su multiplicacin por
ejemplo, por inhibicin de contacto; se detiene tambin en G1.
Cuando una clula se detiene en un punto especfico de G1,
entonces se dice que la clula se detiene en estado de G 0; en el
cual la clula se ha retirado del ciclo celular
Durante el ciclo celular ocurren procesos moleculares importante
en cada una de los periodos de la Interfase y Mitosis, entre ellos la
sntesis de ADN durante el periodo S, lo cual conlleva la
duplicacin de los crosomas, sntesis de protenas especficas las,
Ciclinas de G1, A y B que regulan el ciclo celular.

Periodo S- Replicacin de ADN

Durante el periodo S de Interfase se produce la sntesis de DNA,
que consiste en una consecuencia directa del modelo propuesto
por Wastson y Crick en 1,953, en la cual las dos cadenas de DNA
se desarrollan de la doble hlice a manera de una bifurcacin que
forma una y, con las cadenas progenitoras, y cada cadena paterna
u original acta como molde o patrn para la sntesis de una
nueva cadena hija complementaria al patrn, en esta se produce
dos molculas hijas idnticas con apareamiento especfico de
bases, A, T, G, C. La sntesis de DNA por ende la replicacin es
Semiconserva dora.
El DNA se sintetiza en presencia de tres enzimas denominadas
DNA polimerasas, que no solo actan en la replicacin de DNA
sino tambin en su reparicin, La sntesis de ADN es discontinua
en una de las cadenas, es decir se sintetiza en pequeos
fragmentos de Okazaki, debido a que las DNA polimerasas actan
solo en direccin 5 - 3. Los fragmentos de Okazaki se indican
con un RNA cebador o primer, el que es sintetizado por RNA
polimerasa, que luego ser degradado, llenaremos el hueco por
accin de DNA polimerasa, enseguida las muescas entre
fragmentos de Okazaki son unidas por medio de una DNA ligasa.
Durante la replicacin de DNA, contina la sntesis de RNA.
En los organismos eucariticos simultneamente ocurre la sntesis
de DNA, histonas dando lugar a la replicacin de los ncleosomas
hijos. La replicacin de DNA en organismos eucariticos presenta
muchos puntos de origen y terminales, mientras que en
organismos procariticos tiene un solo punto de origen y terminal.

MMQF/GMD 49
Periodo G2
En este periodo el material gentico es 4C, se produce sntesis de
protenas no bsicas que disparan la mitosis, sntesis de RNA.

MITOSIS O PERIODO DE DIVISIN DEL NCLEO

Se lleva a cabo inmediatamente despus de finalizar el periodo G 2
y se realiza en forma asincrnica, durante la mitosis la sntesis de
RNA se detiene en los cromosomas condensados; la velocidad de
sntesis proteica disminuye.
En general la sntesis de protenas empieza en la telofase y
contina hasta la profase temprana.
La descondensacin y condensacin de los cromosomas se
efectan en la interfase y Mitosis. La mitosis conserva el nmero
diplode de cromosomas 2n, a su vez presenta 4 fases o estadios:
Profase, Metafase, Anafase y Telofase.

Profase
Los cromosomas comienzan a visualizarse, mientras que los
nucleolos inician el proceso de desorganizacin. Los tenues
filamentos cromosmicos, anteriormente extendidos, se
desarrollan a manera de un resorte cilndrico y en espiral,
volvindose ms cortos y gruesos. En la proface tarda se aprecia
que, cada cromosoma est constituido por dos elementos
cilndricos longitudinales y paralelos denominados cromatides. La
envoltura nuclear empieza a desaparecer. Y al finalizar profase
desaparece totalmente.

Prometafase
Los cromosomas se encuentran en el citoplasma sin orden
aparente. Esta fase es de corta duracin.

Metafase
Se caracteriza por la aparicin del huso mittico. Esta estructura
consta de un conjunto de microtbulos que se extienden entre los
polos de la clula,. Los cromosomas alcanzan el plano ecuatorial,
donde se disponen radicalmente en la periferie del huso como si se
rechazaran los usos a los otros. En las clulas vegetales los
cromosomas se distribuyen irregularmente y ocupan toda la
superficie del plano ecuatorial del huso. Los cromosomas estn
vinculados con las fibras del huso por medio de los centrometros.

Anafase
Comienza en el momento en que las cromtides se separan una de
otra. Cada cromatide est unida a la fibra del huso a travs de su
centromero y se dirigen hacia los polos opuestos.

Telofase
El final de la emigracin polar de los cromosomas hijos indica el
comienzo de la fase. Los cromosomas empiezan a desarrollarse, los

MMQF/GMD 50
nuclelos estn en fase de reorganizacin y la envoltura nuclear se
forma paulatinamente alrededor de los cromosomas.
Simultneamente se produce la citocinesis.
En esta prctica se estudiara la mitosis y el ciclo de divisin
celular en las clulas meristemticas de la raz de Allium cepa
(cebolla). Este sistema es muy adecuado porque la poblacin
celular esta en equilibrio dinmico y los cromosomas son
relativamente grandes, con nmero deploide, 2n = 8 pares, es
decir 16 cromosomas.

OBJETIVOS.-
Analizar los diferentes estados de la mitosis (profase, metafase,
anafase y telofase)
Identificar las diferentes disposicioens y formas de los
cromosomas en cada fase.
MATERIALES.-

Bulbos De cebolla con races frescas.

Pinzas, lancetas, hojas de afeitar.
Tijeras.
Gotero o pipetas de pasteur.
Portaobjetos cubreobjetos.
Vidrio de reloj.
Mechero de alcohol.
Papel filtro.
Estiletes.
Lpices de punta.
Orcena asctica-clorhdrica 2%.
Microscopio ptico compuesto

PROCEDIMIENTO
CULTIVO DE RAICILLAS DE CEBOLLA
Los bulbos de cebollas deben ser pequeos por su mejor
manipulacin , se cultivan en frascos de vidrio de 250 ml. de
capacidad, estos frascos deben contener agua corriente, los bulbos
de pueden acomodar con palillos de diente de tal manera que la
corona del bulbo debe tocar la superficie del agua, es necesario
cambiar el agua cada ocho horas con el fin de que exista buena
oxigenacin o inclusive se puede conectar un aereador de acuario
a los frascos donde se encuentran los bulbos, al cabo de 3 a 4 das
se obtiene raicillas de 3 cm. de longitud, es el momento adecuado
para relaizar las preparaciones. Durante el cultivo de los bulbos
hay que tener en cuenta tres factores: temperatura constante,
aireacin y oscuridad.
PREPARACIN DE CROMOSOMAS EN MERISTEMOS
RADICULARES POR EL MTODO DE TJIO Y LEVAN
- Obtenidas las raicillas, se cortan con tijeras 2 cm. a medir desde
el pice o cono, colocar en el vidrio de reloj que contenga el
colorante Orcena actica.

MMQF/GMD 51
- Mediante una pinza tomar el vidrio de reloj, someter al
mechero, cortando la llama y controlando la temperatura en el
dorso de la mano, hasta que el colorante emita vapores blancos
sin llegar a la ebullicin, enseguida colocar sobre la mesa hasta
que enfre, nuevamente repetir el mismo proceso dos veces ms,
en la ultima ves se debe dejar enfriar totalmente por lo menos
20 minutos de tal manera que el colorante acte intensamente
sobre las clulas.
- Teidas las raicillas, se colocan en portaobjetos con una gota de
Orceina.
- Mediante la lanceta realizar el corte de pice o cono vegetativo
(2 a 3 mm) descartando el resto de la raz, quedando solo el
pice,
- Cubrir con un porta objeto, luego realizar golpeteos con un
lpiz de punta, empezando de la superficie hacia la parte central
del cubre objetos, estos golpeteos se efectan con el fin de que
las clulas se disocien.
- Proceder al Squash es decir al aplastamiento, colocando papel
filtro o absorbente entre el dedo pulgar y la preparacin,
presionar fuertemente en plano perpendicular de tal manera
que las clulas queden en un solo plano.
- Observar en el microscopio a inmersin, distinguir clulas en
Interfase y Mitosis (profase, Metafase anafase y telofase) .
RESULTADOS.-
- Realizar las grficas correspondientes
CONCLUSIONES.-
- Establezca las conclusiones de la prctica
CUESTIONARIO.-
1. En que periodo del ciclo celular se produce la sntesis de RNA?
2. En que ciclo celular se produce la replicacin de los
nucleosomas hijos y de DNA, grafique?
3. En que consiste la duplicacin semiconservadora de DNA,
explique?
4. Cul es la actividad de las DNA polimerasas, RNA polimerasa y
DNA ligasa durante la replicacin de DNA?

REFERENCIAS.-
1. Annimo. (n.d.) Gua de Prcticas de Histologa Humana.
Facultad de Medicina Humana USMP. Lima. Obtenida el 17 de
febrero de 2010 en http://www.scribd.com/doc/14766272/Guia-
practicas-Histologia
2. Acurio, L. (1995). Gua de Prcticas de Biologa Celular.
UNSAAC. Cusco.
3. Celis, G. (2001). Gua de estudio Biologa Celular y Molecular.
Universidad de la Sabana.
4. Quispe, G. (2005) Gua de Prcticas de Biologa General y
Especializada. UNSAAC. Cusco

MMQF/GMD 52
 PRCTICA N 10

AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE DNA

INTRODUCCIN
El DNA constituye el material gentico de toda clula viva. Es un
polmero largo de monmeros de desoxirribonucletidos (A, G, C,
T), cuyas diferentes combinaciones producen la diversidad
encontrada en todos los seres vivos. Su rol central en bioqumica
ha permitido el desarrollo de innumerables tcnicas para su
caracterizacin fsica, bioqumica y biolgica, siendo necesario
aislar el DNA para su posterior caracterizacin y manipulacin.
La extraccin de DNA de una bacteria es un proceso sencillo
debido a que el DNA no est encerrado por una envoltura nuclear,
como ocurre en las clulas eucariticas. A parte del DNA
genmico, las bacterias presentan tambin molculas de DNA
extracromosmico circulares, conocidos como plsmidos, cuyo
aislamiento y purificacin tiene mucha utilidad en el rea de la
biologa molecular, como por ejemplo:
- Para el clonamiento de genes de inters
- Construccin de libreras de DNA
- Construccin de nuevos plsmidos recombinantes
- Anlisis del peso molecular
- Anlisis electrofortico de la digestin con enzimas de
restriccin
- Anlisis de la secuencia de nucletidos
- Hibridacin
El procedimiento bsico para la extraccin de DNA es el mismo,
independientemente de la fuente, y consta de los siguientes pasos:
1. Coleccin de las clulas: Este paso es muy importante ya que
depender de la calidad de muestra con que se cuente el
resultado de la extraccin de DNA. El tratamiento para cada
tipo de clula es diferente y estar relacionado con el
organismo del cual proviene si es de origen procaritico o
eucaritico.
2. Ruptura de las clulas o lisis celular: Entre los mtodos ms
utilizados de lisis celular estn:
a. Detergentes: los detergentes aninicos se utilizan
bsicamente para extraer DNA de parsitos, clulas en
cultivo y tejido, siendo el Dodecil Sulfato de Sodio (SDS),
Nodidet P 40 (NP40) y sarkosil uno de los ms usados
para la ruptura celular.
b. Enzimas: Se utilizan especialmente para la extraccin de
DNA bacteriano, total o plasmdico, siendo la lisozima la
enzima de eleccin. La lisozima acta desestabilizando la
pared celular de bacterias Gram negativas, ya que rompe
las uniones glucosdicas entre los polisacridos N-

MMQF/GMD 53
 acetilglucosamina (NAG) y el cido N acetilmurmico
(NAM).
c. Agentes denaturantes: se utilizan para extraer DNA de
diferentes tipos celulares y tejidos, siendo el cloruro de
guanidina uno de los ms empleados.
3. Destruccin de DNAasas: algunos protocolos de extraccin
de DNA utilizan enzimas que degraden a las DNAasas para
que tengan un producto ms estable. Se lleva a cabo
mediante el uso de enzimas proteolticas tales como la
proteinasa K. Algunos protocolos de extraccin realizan la
lisis con detergentes como el SDS en presencia de la
proteinasa K en un solo paso. Adicionalmente, la digestin se
acompaa del uso de la sal disdica del cido etilen-diamino-
tetra-actico (EDTA) para inhibir la accin de las DNA asas.
Alternativamente, para organismos ricos en glicoprotenas,
como las micobacterias y tripanosomas, entre otros, luego de
la digestin se realiza un tratamiento con el detergente
catinico bromuro de hexadecil trimetil amonio (CETAB)
en presencia de NaCl 0.7M, con el fin de eliminar las
glicoprotenas y obtener un DNA ms puro.
4. Eliminacin de RNA: Se realiza mediante digestin del RNA
con RNA asas como la ribonucleasa A de pncreas bovino.
Este paso en algunos protocolos se lleva a cabo despus de
la extraccin del DNA.
5. Purificacin del DNA: En este paso se separa el DNA de
otros componentes celulares (protenas, lpidos,
carbohidratos, cidos nucleicos): Se lleva a cabo con
solventes orgnicos tales como el fenol y el cloroformo, los
cuales tiene la propiedad de desnaturar las protenas. El
fenol deber ser bidestilado, equilibrado y protegido contra la
oxidacin mediante la adicin de 8 hidroxiquinolina. Por su
parte, al cloroformo se le adiciona alcohol isoamlico en
proporcin 24:1 volumen a volumen (V/V) con el fin de
prevenir la produccin de espuma y facilitar la separacin de
las fases acuosas orgnicas. Estos solventes se utilizan en
una relacin de 1:1 (V/V) de la muestra que se pretende
limpiar, quedando las protenas desnaturadas en la interfase
y el DNA en la fase acuosa. Generalmente se recomienda
realizar una extraccin con fenol, seguida de una extraccin
con fenol cloroformo- alcohol isoamlico y finalmente, una
ltima extraccin con cloroformo alcohol isoamlico para
limpiar toda traza de fenol.
6. Precipitacin del DNA: Se logra mediante precipitacin con
etanol en presencia de cationes monovalentes a
concentraciones de 0.1 a 0.5 M. el etanol en la presencia de
estos cationes induce un cambio estructural en el DNA que
causa la agregacin y precipitacin del mismo.
Adicionalmente con este tratamiento se remueven los
residuos de fenol y cloroformo del paso anterior. Entre las

MMQF/GMD 54
 sales ms utilizadas se encuentran el acetato de sodio,
acetato de potasio, acetato de amonio y cloruro de litio.
7. Resuspensin del DNA: Se puede hacer con agua destilada
estril, agua bidestilada, buffer de resuspensin T.E. (Tris
EDTA)
8. Almacenamiento del DNA: Va a depender mucho de que fines
se tenga con el producto y sobre todo de cuanto tiempo
queremos guardarlo, las temperaturas de almacenamiento
son -4 C, - 20 C, -70 C y -192 C

OBJETIVOS
- Aislar y purificar DNA genmico vegetal
- Entender la funcin que cada reactivo tiene en el protocolo de
extraccin
MATERIALES REACTIVOS EQUIPOS
- Micropipetas
- Pipetas Bacteriolgicas
- Puntas de micropipeta
- Papel toalla
- Leja
- Tubos de microcentrifuga
(Eppendorf) de 1.5 ml
- Tubos de centrifugacin
(Falcon) de 50 ml
- Descartador de tips
- Tris HCl 1M pH 7.4
- EDTA 0.5 M
- NaCl 5 M
- SDS 10%
- Cloroformo
- Alcohol isoproplico
- Etanol absoluto
- Buffer T. E. (Tris HCl
50mM pH 8.0, EDTA 1mM)
- Buffer de Maceracin
- Bao Mara
- Centrifuga refrigerada
BUFFER DE MACERACIN (C.S.P. 50 ml)
1 M Tris HCl pH 7.4 10 ml
0.5 M EDTA 2.5 ml
10% SDS 2.5 ml
5 M NaCl 2.5 ml
Agua Bidestilada hasta completar 50 ml
PROCEDIMIENTO
- Colocar hojas de quinua (0.15 gr.) con 400 l de buffer de
maceracin en un tubo de microcentrfuga nuevo. Homogenizar
hasta que se muestre de color verde intenso.
- Sedimentar en la microcentrfuga a 14,400 r.p.m por 1 minuto.

MMQF/GMD 55
- Agregar un volumen de cloroformo y mezclar por inversin.
Dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar
por 5 minutos en la microcentrfuga. Trasvasar el sobrenadante
a un tubo nuevo.
- Trasvasar 300 l del sobrenadante, y precipitar con 0.1
volmenes de NaCl 5M con uno de los siguientes alcoholes:
Alcohol isoproplico 1 volumen
Etanol Absoluto 2 volmenes
- Dejar reposar a temperatura ambiente por 5 minutos, luego
sedimentar en la microcentrifuga a velocidad mxima por 5
minutos.
- Dejar secando a temperatura ambiente. Resuspender en 100 l
de agua destilada o en buffer T.E. (Tris HCl 10 mM, EDTA 1
mM)
- El producto final es de 20 ng/ l de DNA aproximadamente.
RESULTADOS
- De acuerdo al procedimiento bsico de extraccin de DNA,
cules son los pasos que corresponden a cada uno de ellos y
cules los reactivos utilizados en el protocolo trabajado.
CONCLUSIONES
Menciones las conclusiones finales a las cules se llega mediante
el desarrollo de la presente prctica.

CUESTIONARIO.-

1. Cul es la funcin que cumple cada uno de los reactivos

utilizados en el desarrollo de la prctica?

REFERENCIAS

1. Barrantes, I.; Santa Cruz, C. (2002). Gua de Prcticas de

Biologa Molecular. Lima Per. Universidad Nacional
Federico Villarreal Facultad de Ciencias Naturales y
Matemticas Laboratorio de Bioqumica y Biologa
Molecular.
2. Sambrook, J. Fritsch, E. y Maniatis, T. (2001). Molecular
Cloning. A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold Spr. New York.
Cold Spr ing Harbor Laboratory Press.
PRCTICA N 11

APLICACIONES DE LA BIOINFORMTICA A LA BIOLOGA

MOLECULAR

INTRODUCCIN

Tradicionalmente, la investigacin en Biologa Molecular se ha

realizado en el laboratorio experimental, pero la inmensa cantidad
de datos generados en los ltimos aos con la conclusin del
Proyecto Genoma Humano y desarrollo subsiguiente de otros

MMQF/GMD 56
grandes proyectos de genotipado (HapMap Project, 1000 Genomes
Project) destinados a explorar la relacin entre variantes genticas
y la predisposicin a las enfermedades, diagnstico y respuesta a
los frmacos, requiere el desarrollo de herramientas
computacionales que permitan extraer toda la informacin
contenida en las bases de datos para generar nuevo conocimiento.
Segn la definicin del National Center for Biotechnology
Information (NCBI) la Bioinformtica es la disciplina cientfica que
combina biologa, computacin y tecnologas de la informacin. El
objetivo de esta disciplina es investigar y desarrollar herramientas
tiles para llegar a entender el flujo de informacin. Inicialmente,
la bioinformtica se ocupaba sobre todo de la creacin de bases de
datos de informacin biolgica, especialmente secuencias, y del
desarrollo de herramientas para la utilizacin y anlisis de los
datos contenidos en esas bases de datos. La Bioinformtica ha ido
evolucionando para ocuparse cada vez con mayor profundidad del
anlisis e interpretacin de los distintos tipos de datos (secuencias
de genomas, proteomas, dominios y estructuras de protenas, etc.).
Las bases de datos utilizadas en biologa molecular son archivos
de datos que provienen de diferentes reas almacenados de modo
eficaz y uniforme y de uso pblico para la comunidad cientfica.
Existen bases de datos primarias que contienen secuencias de
DNA y de protenas, estructuras de protenas y perfiles de
expresin de genes y protenas. Cada registro de estas bases de
datos contiene una secuencia y su correspondiente "anotacin"
(comentarios que incluyen informacin acerca de esa secuencia,
habitualmente hechos de modo manual por algn anotador).
Las bases de datos secundarias archivan los datos que son fruto
del anlisis de las bases de datos primarias, tales como familias de
protenas, motivos o dominios proteicos, familias de genes,
mutaciones, polimorfismos, implicacin en enfermedades, etc.
Existen cientos de bases de datos, por el tipo de informacin se
pueden distinguir: bibliogrficas, taxonmicas, de nucletidos,
genmicas, de protenas, de microarrays y otras.
En el desarrollo de la prctica nos centraremos en las bases de
datos bibliogrficas y de nucletidos.
OBJETIVOS

- Conocer las bases de datos biolgicas y la utilidad que tiene

cada una de ellas
- Utilizar las herramientas bioinformticas mediante el desarrollo
de ejemplos
- Realizar bsqueda de secuencias nucleotdicas de DNA
- Aprender a elaborar mapas de restriccin mediante la
utilizacin de software libres

MMQF/GMD 57
EQUIPOS
- Aula virtual con equipos de computo e instalacin a Internet.
-
PROCEDIMIENTO

BASES DE DATOS BIBLIOGRFICAS

En estas bases de datos se organiza los artculos publicados en

revistas de mbito cientfico. Dentro de ellas se tiene:
- Pubmed (NCBI) cuya pgina de acceso es la siguiente:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ o bien escribir en google la
palabra pubmed y hacer click en el primer link de contacto.

- La bsqueda bibliogrfica se puede hacer de varias maneras:

Por nombre y apellido del autor
Nombre de la publicacin en caso de conocerla
Gnero del organismo de inters
Especie del organismo de inters
- Mientras ms especfica sea la bsqueda ms directa ser la
obtencin del material bibliogrfico con el cual deseamos
contar:

Ejemplo: Bsqueda bibliogrfica de Solanum tuberosum

MMQF/GMD 58
- Esta bsqueda nos muestra 5294 resultados de los cuales se
encuentran libres 1472 publicaciones a las cuales podemos
acceder a todo el contenido del artculo.
- En caso de buscar en forma ms especfica Solanum
tuberosum proteasas por ejemplo se reducir el nmero de
artculos a los cuales podemos accesar.

MMQF/GMD 59
- Se reduce los artculos 186.
BASES DE DATOS DE NUCLETIDOS

Las bases de datos de secuencias de nucletidos son muy

importantes para la biologa. Para asegurar la disponibilidad de las
secuencias al pblico general, ninguna revista cientfica puede
publicar un artculo describiendo una secuencia de nucletidos o
proteica si no ha sido depositada en una de las 3 principales bases
de datos internacionales.
Existe una colaboracin internacional entre las 3 principales bases
de datos de nucletidos: EMBL-Bank en el EBI, DDBJ (DNA Data
Bank of Japan) en el CIB/NIG y GenBank en el NCBI. Estas bases
de datos intentan alojar todas las secuencias de nucletidos que
son de dominio pblico. Estn divididas en varias secciones que
reflejan grupos taxonmicos, adems de otros grupos tales como
secuencias EST (expressed sequence tag), patentes, secuencias
HTGs (high-through-put genomic sequences), etc. En estas bases
de datos prima la cantidad sobre la calidad, en el sentido de que
contienen todo lo que los investigadores depositan en ellas, y son
bastante heterogneas en cuanto al tipo de secuencias, su calidad,
su anotacin, etc. Por este motivo son tambin redundantes, ya
que la misma secuencia puede encontrarse repetida en distintos
registros procedentes de distintos autores. Estas bases de datos
son accesibles gratuitamente por Internet y se sincronizan entre
ellas cada 24 horas, por lo que contienen exactamente la misma
informacin.
Cada entrada en estas bases de datos es un registro que debe
tener un identificador nico, formado por letras y/o nmeros, que
se denomina "nmero de acceso" (accession number) y es estable
(nunca cambiar en sucesivas versiones de ese registro). Por
tanto, otro identificador indicar las sucesivas versiones de cada
acceso, por lo que es importante conocer ambos. En febrero de
1999, el consorcio GenBank/Embl/DDBJ acord un formato de
versin consistente en el nmero de acceso seguido de un punto y
un nmero. Adems, GenBank incluye el indicador "GI".

Bsquedas en EMBL: Constituye el

repositorio ms importante en Europa.
Las principales fuentes de secuencias
de DNA y RNA son reportadas por
investigadores individuales, proyectos
de secuenciacin de genomas y
aplicaciones patentadas:
http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html

MMQF/GMD 60
Bsquedas en GenBank: GenBank es la base de datos de
secuencias del NIH en EEUU, una coleccin anotada de todas las
secuencias de DNA disponibles pblicamente.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?
db=nuccore&itool=toolbar

DDBJ (Japn): http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-e.html

- La bsqueda de nucletidos en cualquiera de las bases de datos

biolgicos se hace por:
Nombre del organismo
Nombre del gen o de la protena
Nombre de la actividad o funcin del gen o de la protena
Nmero de acceso en caso de conocerlo

EJERCICIO PRCTICO N 1:

Realizar la bsqueda de secuencia de nucletidos para la glucosa

6 fosfato dehidrogenasa de Leishmania braziliensis en las tres
bases de datos biolgicas. Observar las semejanzas y diferencias
de cmo cada una de ellas presenta el resultado de la bsqueda.

BSQUEDA EN EL EMBL
- colocar la pgina de acceso, se mostrar lo siguiente
-

MMQF/GMD 61
- Estamos en la opcin nucletide as que lo nico que debemos
hacer es escribir el nombre de la enzima correctamente en
ingls. Glucose 6 Phosphate dehydrogenase Leishmania
braziliensis . El resultado es:

- Ingresar a uno de los accesos y observar detenidamente como

esta organizada la informacin que nos presenta.

MMQF/GMD 62
BSQUEDA EN EL GENBANK NCBI
- Ingresar a la pgina web:

MMQF/GMD 63
- Realizar la bsqueda de Glucose-6-Phosphate
dehydrogenase de Leishmania braziliensis, eligiendo la
opcin nucleotide tal como se observa en el esquema.

- Elegir el primer link de acceso

MMQF/GMD 64
- observar detenidamente el resultado obtenido

BSQUEDA EN EL DDBJ

MMQF/GMD 65
- Ingresar a la pgina web.

- Realizar la bsqueda de secuencia nucleotidica indicada, con el

nmero de acceso obtenido en el GenBank

MMQF/GMD 66
- El resultado es el siguiente:

MMQF/GMD 67
GENERACIN DE UN ARCHIVO FASTA
La manipulacin posterior de las secuencias por otros programas
en el ordenador local requiere frecuentemente que stas se
encuentren en un formato definido. El ms til es el formato
FASTA, que consiste en un archivo de texto con las secuencias
unas a continuacin de otras encabezadas por su nombre
precedido del signo >. Ejemplo:
>cry1Aa
agggatatagacagatagagacagataggcttcctcggagacagtgagacagagataga
cagaatatagagagagacagatagagacgagataagagagagagagagcagatagac
agaggatatagagacagaga
Este tipo de archivo puede crearse manualmente utilizando el bloc
de notas de windows o un procesador de texto (Con la opcin de
guardar en FORMATO TEXTO). Tambin se puede realizar
seleccionado las opciones Save with view FASTA Seq del EMBL
Display FASTA del NCBI

EJERCICIO PRCTICO N 2
Busca en GenBank la secuencia codificadora completa (cds)
nucleotdica del gen de la methylmalonic aciduria cblA type.
Cuntos registros encuentras con cada una de la siguientes
bsquedas: MMAA, human methylmalonic aciduria cblA type,
human AND methylmalonic aciduria cblA type, human
methylmalonic aciduria cblA type gene? Una vez que hayas
identificado la secuencia ms apropiada, anota su nmero de

MMQF/GMD 68
identificacin. Cul es el smbolo de este gen?, Cul es su
longitud?, qu funcin tiene la protena?, dnde se localiza?
GENERACIN DE MAPAS DE RESTRICCIN UTILIZANDO
SOFTWARE LIBRES
- Utilizar un programa libre para la generacin de mapas de
restriccin de una secuencia nucleotidica.
Ejemplo:

RESULTADOS

- Observar los resultados obtenidos en cada caso y realizar las

comparaciones necesarias.

CONCLUSIONES
- Mencione las conclusiones finales a las cuales se llega con el
desarrollo de la presente prctica.

CUESTIONARIO
1. Realizar la bsqueda de secuencia nucleotidica de los
siguientes genes:

Genes que codifican endotoxinas de Bacillus

thuringiensis:

MMQF/GMD 69
 a. Bsqueda de cry1Ab en bases protena/DNA/gen
(NCBI y EMBL)
b. Comparar resultados en formato FASTA

Gen que confiere resistencia al herbicida glifosato

a. Bsqueda del gen aroA de Agrobacterium
b. Bsqueda en bases protena/DNA, comparar resultados
c. Archivo en formato FASTA

Gen mitocondrial citocromo B de bovino

Nombre del gen: cytB
a. Resultados de la bsqueda: genomas mitocondriales,
completos, genes completos, secuencias parciales.
b. Base de datos de genomas mitocondriales/cloroplastos
(NCBI)
c. Archivo en formato FASTA

2. Generar el mapa de restriccin correspondiente a cada

secuencia nucleotica obtenida en la parte 1. utilizando al
menos dos programas diferentes que se encuentren
disponibles.

REFERENCIAS

1. Annimo. (n.d). Aplicacin de herramientas bioinformticas

en el estudio de las enfermedades genticas humanas.
Obtenido el 23 de enero de 2010 de
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/ldesviat/_private/C
URSO%20MITOLAB/GUION%20CURSO%20Eva-Lourdes.doc
2. Europa. Base de datos Biolgicos.
http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html
3. Estados Unidos. Base de datos Biolgicos.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?
db=nuccore&itool=toolbar
4. Japn. Base de Datos Biolgicos.
http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-e.html

MMQF/GMD 70