UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS AGRONOMICAS

CICLO BASICO
BIOQUMICA

BIOSNTESIS
DE LAS
MOLECULAS
DE LA VIDA

ALEJANDRO RIQUELME

2001

SINTESIS O DUPLICACIN DEL ADN

 2

Molcula de la vida.

El ADN es la molcula de la herencia en todos los organismos vivos

(procariontes y eucariontes). Sin embargo, en el caso de los virus, el
material gentico puede ser ADN o ARN.

Todos los ADN estn formados por dos muy largas cadenas
helicoidales de bases nitrogenadas, que son:

A : adenina
Purinas
G : guanina
T : timina
C : citosina Pirimidinas

Estas bases se encuentran enrolladas a lo largo de un eje comn.

Las dos hebras de la doble hlice estn dispuestas en direcciones
opuestas, es decir, mientras una tiene direccin 5 3 la otra
tiene direccin 3 5.

Ejemplo de una molcula de ADN: 5 ACTCGGAATGC 3

3 TGAGCCTTACG 5

Las dos cadenas permanecen juntas por enlaces de hidrgeno entre

los pares de bases:

- Adenina siempre se aparea con Timina (unidas por dos

enlaces de hidrgeno)
- Guanina est siempre apareada con Citosina (unidas por
tres enlaces de hidrgeno).

De esto se desprende que una de las hebras de la molcula de ADN

es la complementaria de la otra.

Toda la informacin gentica o de la herencia es codificada por una

secuencia precisa de bases a lo largo de la hebra de ADN.

La mayora de las molculas de ADN tienen la caracterstica de ser

circulares.

Adems el eje de la doble hlice de un ADN circular puede girar en

s mismo, formndose una superhlice. Esta estructura recibe el
 3

nombre de ADN sobreenrrollado, que es una forma ms compacta

que una molcula relajada (sin giro sobre su propio eje).

ADN relajado ADN sobrenrollado

Durante el proceso de duplicacin de la molcula de ADN, lo primero

que debe ocurrir es el desenrollamiento del ADN sobrenrollado y
luego las dos hebras del ADN son separadas para que se pueda
sintetizar una nueva molcula de ADN. Cada hebra padre acta
como patrn para la formacin de la nueva hebra complementaria.

Experimento para probar que el ADN es el material gentico.

Meselson y Stahl, en 1958, comprobaron que la duplicacin del

ADN es semi-conservativa, esto quiere decir, que cada molcula hija
recibe una de las hebras del ADN padre.

Los investigadores crecieron bacterias en un medio que contena

N-15 (nitrgeno 15; un istopo de nitrgeno) y luego las bacterias
fueron transferidas a un medio con N-14 (nitrgeno 14; el istopo
normal de nitrgeno), despus ellos analizaron el ADN extrado en
cada generacin obtenida (es decir, extrajeron el ADN despus de
los ciclo reproductivo). Los resultados indicaron que el ADN de las
bacterias crecidas con N-15 estaban marcadas con N-15. En la
generacin siguiente, despus de ser transferidas al medio que
contena N-14, ellos obtuvieron un ADN hbrido, marcado tanto con
N-14 como con N-15. Y en la siguiente generacin encontraron una
mezcla de dos tipos de ADN; una molcula de ADN marcada con N-
14 y la otra molcula correspondi a un ADN hbrido (mezcla de N-
14 y N-15)

Si tenemos que N-15 = y N-14 =

 4

Generaciones

0 1 2

+ + + +


doble hebra de ADN 2 ADN marcado con 2 ADN marcados con N-14 y N-15
marcada con N-15 N-14 y N-15 2 ADN con N-14

Figura 1. Esquema del experimento de Meselson y Stahl

demostrando que la duplicacin es semi-conservativa.

Requerimientos para la duplicacin del ADN.

En todos los organismos los requerimientos generales para la

sntesis de ADN son los mismos:

- una hebra de ADN como molde, en otras palabras una

seccin de ADN que ser copiado.

- la enzima encargada de copiar el ADN, llamada ADN

polimerasa.

El proceso de sntesis puede ser resumido como sigue:

Mg+2
d (NMP)n + d NTP d (NMP)n+1 + PPi

ADN polimerasa
 5

donde d NTP es el deoxirribonuclesido trifosfato y d (NMP)n se

refiere a un polmero de n deoxirribonucleotidos. El pirofosfato (PPi)
generado por la reaccin anterior es hidrolizado a fosfato inorgnico
conduciendo la reaccin hacia la derecha ( PPi 2Pi) .

Enzimas que participan en la duplicacin.

En procariontes.-
La duplicacin es un proceso complejo en la que participan muchas
protenas. En bacterias, como E.coli, existen 3 polimerasas
(Tabla I) y una ADN ligasa.

- ADN polimerasa I.

Es una de las enzimas que es capaz de catalizar la sntesis

de ADN.
Posee una sola cadena polipetdica de 109 kDa.
Contiene un tomo de zinc como cofactor.
Esta enzima sintetiza en la direccin 5-->3 ( ver fig. 2).

Todas las ADN polimerasas poseen una actividad exonucleasa;

esto corresponde a la actividad de hidrolizar el ADN de hebra simple,
removiendo deoxirribonucleotidos terminales desde el extremo 3
(actividad exonucleasa 3 5) o desde el extremo 5 (actividad
exonucleasa 5 3).

- ADN polimerasa II

Esta enzima sintetiza ADN en forma similar a la ADN polimerasa I,

pero no tiene actividad exonucleasa 5 3.

-ADN polimerasa III

La enzima esta compuesta por lo menos por 10 subunidades. Todas

las subunidades son requeridas para que la enzima exprese su
actividad total. Esta enzima es la responsable de la sntesis de
ADN en E.coli.
 6

Tabla I. ADN polimerasas de E. coli.

Base
Polimerasa Mr (kDa) Molculas sintetizada Direccin
por clula por a) polimer.
segundo b) exonucl.

I 109 400 16-20 a) 5 3

b) 3 5
y 5 3

II 120 17-100 2-5 a) 5 3

b) 3 5

III 180 10 250-1000 a) 5 3

b) 3 5
y 5 3

Origen de duplicacin.

La sntesis del cromosoma de E.coli siempre comienza en el mismo

punto, llamado sitio ori C, una regin de 245 pares de bases.

oriC

Enzimas que participan en la sntesis de ADN en Eucariontes.

 7

Por otro lado, existen cinco polimerasas en eucariontes son

conocidas como alfa , beta , gamma , delta y psilon. Todos ellas
tienen mecanismos de accin similares a las enzimas en
procariontes (E.coli).
- Las ADN polimerasas alfa y delta son las encargadas de la
duplicacin del ADN cromosomal.
- La ADN polimerasa beta consistente de una sola cadena
polipeptdica es la responsable de la reparacin del ADN.
- La ADN polimerasa gamma se encuentra en mitocondrias y
es responsable de la duplicacin del ADN mitocondrial.
- La ADN polimerasa psilon, enzima recientemente
descubierta y su actividad es similar a la polimerasa delta.

Proceso General de Sntesis de ADN (Fig. 2).

Las hebras de ADN son antiparalelas y la cadena del ADN que va

en direccin 3 5 es copiada directamente por la enzima ADN
polimerasa III. La hebra hija sintetizada (5 3) es llamada HEBRA
PRINCIPAL o ADELANTADA.

La otra hebra del ADN padre que tiene la direccin opuesta, 5 3,

no puede ser copiada directamente, debido que no es sustrato para
la enzima y solamente puede ser sintetizada hasta que una parte
del ADN se ha desdoblado. La hebra hija resultante se llama HEBRA
RETRASADA y es sintetizada en forma discontinua.

Esta sntesis discontinua resulta de la formacin de cortas secciones

de ADN de aproximadamente 1000 a 2000 nucletidos que reciben
el nombre de FRAGMENTOS DE OKASAKI. Estas secciones son
unidas por la accin de la enzima ADN ligasa produciendo una
hebra de ADN continua, que algunas veces se conoce como ADN+.

ADN girasa (reduce los giros)

Proteinas SSB (cubren ADN de
una hebra)
Helicasas
(desdobla ADN) Primosoma (hace el primer)
 8

Holopolimerasa III
Primer (agrega dNTPs)

Topoisomerasa
(relaja tensin) El primer es
removido y
llenado el
espacio
Hebra Hebra
Adelantada Retrasada Pol I

Ligasa

Figura 2. Proceso de sntesis de ADN.

Previo a la sntesis.

Previo al proceso de sntesis del ADN propiamente tal, el ADN

padre de doble hebra debe desenrollarse, para lo cual se requiere la
accin de la protena REP o HELICASA que necesita energa
proveniente del ATP. Adems en este proceso de desenrollamiento
participa la enzima ADN girasa, que acta dando giros negativos al
ADN padre cuando este se encuentra sobre enrollado.

Etapa inicial de la sntesis.

Para comenzar la sntesis de ADN se requiere la presencia de

doble hebra como patrn-cebador. La segunda hebra corresponde
a una hebra de ARN, llamada PRIMER o PARTIDOR y es
sintetizada por una enzima llamada PRIMASA. La forma activa de
esta enzima requiere una serie de protenas. Entre estas protenas
se encuentra la PROTEINA N o dnaB, que selecciona el sitio en
que la primasa actuar. El complejo formado entre la primasa y las
protenas auxiliares recibe el nombre de PRIMOSOMA.

Regla para la Sntesis.

La regla principal para la actividad de la ADN polimerasa es que

cataliza la formacin de un enlace fosfodiester solamente si la base
entrante es complementaria al nucletido de la hebra padre. En otras
 9

palabras las ADN polimerasas son enzimas dirigidas por la hebra

patrn o padre.

Como mencionamos anteriormente las ADN polimerasas I. II y III

poseen la actividad exonucleasa que permite aumentar la fidelidad
de la duplicacin o replicacin del ADN, removiendo los nucletidos
que fueron puestos erradamente.

Proceso de Sntesis en procariontes

Una vez desenrollado la doble hebra de ADN, la enzima primasa

coloca el ARN partidor y de ah comienza la sntesis de la hebra
hija por la accin de la enzima ADN polimerasa III. Recordemos que
esta enzima es la responsable de la duplicacin, mientras que la
ADN polimerasa I acta como enzima auxiliar sacando la hebra de
ARN partidor y luego sintetizando el trozo faltante, adems ella
tambin participa en la reparacin del ADN.

Durante el proceso de duplicacin del ADN circular (E.coli) se

produce una estructura caracterstica, formada por dos horquillas (o
frentes) de duplicacin.
Direccin de la
replicacin

La velocidad de sntesis en E.coli , es de 800 bases por segundo.

Otras protenas del proceso de sntesis.

A continuacin describiremos otras protenas que participan en el

proceso de duplicacin del ADN:

- HELICASA: son enzimas requeridas para desdoblar y abrir

la molcula de ADN padre debido que esto no ocurre
espontneamente. Las helicasas requieren ATP como
cofactor.
 10

Dos diferentes helicasas han sido descritas, una de ellas se

mueve en direccin 3 5 del ADN padre y recibe el
nombre de REP o HELICASA II o COPOL III ( subunidad
beta de la ADN polimerasa III) y las otras se mueve en
direccin 5 3, llamadas HELICASA I y III.

- PROTEINAS QUE SE UNEN A HEBRA SIMPLE (SSB):

Las hebras simples de ADN generadas por las helicasas
son mantenidas separadas por la unin de las protenas
SSB a la hebra de ADN. (ver figura 3 y Tabla II)

- ADN LIGASA es una enzima que cataliza la formacin de

enlaces fosfodiester entre polinucletidos preformados. La
ADN ligasa esta involucrada en la sntesis de ADN
discontinua, uniendo los fragmentos de OKASAKI una vez
que se ha reemplazado el partidor de RNA. Ellas tambin
estn involucradas en los mecanismos de reparacin del
ADN daado. Existe un solo tipo de ADN ligasa en
procariontes y dos en eucariontes; ambas funcionan en el
ncleo.

Tabla II. Principales protenas de la duplicacin de E.coli.

Protenas Funciones

Protena N o dnaB Capacita a la primasa para comenzar la

duplicacin
Primasa Sintetiza el ARN partidor.

Helicasas Desdobla la doble hlice.

Protenas SSB Estabiliza regiones de hebra simple.

ADN girasa Introduce giros a la superhlice.

 11

ADN polimerasa III Sintetiza el ADN.

ADN polimerasa I Saca la hebra partidora y completa los

espacios.
ADN topoisomerasa I Corta una hebra de ADN.

ADN topoisomerasa II Corta ambas hebras de ADN.

ADN ligasa Une los extremos de los polinucleotidos

preformados.

Duplicacin del ADN en Eucariontes.

El mecanismo de sntesis del ADN en eucariontes es probablemente

similar al proceso en procariontes.
La velocidad de las polimerasas en eucariontes es mucho menor
que en procariontes. Para compensar esto, las clulas eucarioticas
contienen ms de 20.000 molculas de enzimas. Adems, las
clulas eucarioticas tienen un gran nmero de horquillas de
duplicacin y fragmentos de Okasaki mas pequeos de 40 - 300
bases. De esta forma la velocidad de duplicacin del ADN es mayor
en eucariontes.

La ADN polimerasa delta es la encargada de sintetizar la hebra

principal o adelantada y la polimerasa alfa la hebra retrasada. El
ADN en eucariontes esta unido con histonas, por lo tanto la
duplicacin involucra dos pasos extras;
- Primero el ADN se debe disociar de las histonas para
comenzar la duplicacin.
- La sntesis de histonas tiene lugar al mismo tiempo que la
sntesis de ADN y las histonas se deben unir al nuevo ADN.

Algunos virus poseen otra forma de sintetizar ADN, debido que

tienen una enzima llamada TRANSCRIPTASA REVERSA capaz de
usar como hebra molde la molcula de ARN.
 12

5 3

3 Procariontes
3

3 5 3 5

Hebra Hebra
adelantada retrasada

Figura 3. Esquema que muestra el loop que se forma en la hebra

retrasada para que la ADN polimerasa III tenga la misma
posibilidad de actuar en ambas hebras.

5'
Primasa

Pol
3'

5'

Helicasa
 13

PCNA

Pol

Figura 4. Sntesis de ADN en eucariontes.

Mutaciones

Las mutaciones son causadas por cambios en la secuencia de

bases de ADN. Los principales tipos son sustitucin, supresin e
insercin. La sustitucin de un par de bases por otra es la ms
comn mutacin. Una transicin es el reemplazo de una purina
por otra purina ( lo mismo ocurre con las pirimidinas). Una
transversin es el reemplazo de una purina por una pirimidina o
viceversa.
Muchos potenciales cancergenos pueden ser detectados por su
accin mutagnica en bacteras.

Gen Salvaje 5'- CGACTGT-3'

3'- GCTGACA-5'

Transicin ( cambio del par A-T por G-C)

5'- CGGCTGT-3'
3'- GCCGACA-5'

Transversin (cambio del par A-T por T-A)

5'- CGTCTGT-3'
3'- GCAGACA-5'

Insercin (colocar un par extra ej: G-C)

5'- CGAGCTGT-3'
 14

3'- GCTCGACA-5'

Supresin (suprimir el par A-T)

5'- CGCTGT-3'
3'- GCGACA-5'

TRANSCRIPCIN DE ADN SINTESIS DE ARN

El flujo de la informacin gentica en las clulas normalmente es:

ADN ARN Protena

La sntesis de ARN usando un ADN patrn es llamada

transcripcin, mientras que la sntesis de protena a partir de un
ARN patrn es llamado traduccin.

Clases de ARN.

Existen tres clases de ARN:

- ARN mensajero (mARN)

- ARN de transferencia (tARN)
- ARN ribosomal (rARN)

En general, todos estos ARN son de hebra simple, pero el ARN de

transferencia y ARN ribosomal contienen extensas regiones de
doble hlice (la cadena de nucletidos se dobla formando una
horquilla o loop).

Los ARN ms pequeos son los tARNs, que contienen alrededor de

75 nucletidos, mientras que el ms grande esta entre los mARN,
que pueden tener ms de 5.000 nucletidos.

Enzima de la sntesis
 15

Todos los ARN celulares son sintetizados por la ARN polimerasa de

acuerdo a las instrucciones dadas por un ADN-patrn (o molde),
empleando ribonuclesido-5-trifosfatos como sustrato. La
direccin de la sntesis de ARN es 53, similar a la sntesis de
ADN.

La actividad de la ARN polimerasa es diferente a la actividad de la

ADN polimerasa porque no necesita una secuencia partidora o
primer y no posee una actividad nucleasa. Otra diferencia es que el
ADN patrn es totalmente conservado despus de la sntesis de
ARN.

La secuencia de ADN transcrito por la ARN polimerasa en ARN es

llamado UNIDAD DE TRANSCRIPCIN y el producto de la sntesis
(ARN) es el TRANSCRIPTO PRIMARIO.

La ARN polimerasa de E. coli (procariontes) esta formada por sub-

unidades 2 y un peso molecular cercano al medio milln de
dalton (450 kDa).

El corazn de la enzima consiste de 2 (enzima ncleo).

La sub-unidad sigma ( ) aumenta la velocidad y especificidad de la
transcripcin, debido que ayuda a la ARN polimerasa a reconocer la
seal de inicio en el ADN-patrn. La sub-unidad sigma estara
reconociendo una regin particular del ADN, que se encuentra a 35
bases antes del sitio de inicio de la transcripcin. Esta regin del
ADN recibe el nombre de regin PROMOTORA y adems de esta
regin, en E. coli existe otra regin promotora a 10 bases antes del
inicio de la transcripcin y est regin del ADN esta relacionada con
el lugar donde se une la enzima ncleo.

Regin Promotora (E.coli)

-35 -10 +1
(ADN) ------- TTGACA ------- TATAAT ----------------------------
Inicio de la
transcripcin
El signo negativo indica que las bases se encuentran antes
del sitio de inicio de la transcripcin
 16

Proceso de sntesis

La unin de la ARN polimerasa a estas regiones promotoras

permiten un desenrollamiento local de 17 pares de bases de la
molcula de ADN - patrn (llamada burbuja de transcripcin). La
sntesis de ARN siempre comienzan con GTP ATP, es decir, con
una base purina. La sub-unidad sigma se disocia desde la
holoenzima cuando se han trascrito 12 bases. Esta subunidad una
vez suelta puede unirse a otra enzima ncleo, permitiendo el inicio
de una nueva sntesis.

ARN polimerasa
+ 1 punto de inicio

-35 -10
3 5
ADN
5 3

Enzima ncleo
Subunidad
(a) Sigma

+1 punto de inicio
-35 -10
5'
ppp

3'

(b)
 17

5'
p
p
ARN en p
crecimiento

ppp NTP

-35 -10

Subunidad sigma
disociada

(c)

Figura 5. Inicio y elongacin de la cadena de ARN (transcripcin).

(a) Unin de la holoenzima a la regin promotora (complejo cerrado)
(b) Separacin de la doble hebra (complejo abierto)
(c) Elongacin en direccin 5' 3' , a los 12 nucletidos transcritos
la subunidad sigma se disocia.

Las regiones promotoras afectan la frecuencia de inicio de la

transcripcin. Lo anterior es reflejado en los siguientes ejemplos:
en cada clula de E. coli contiene solamente 12 molculas de
represor lac y su gen es transcrito una vez cada 30 minutos. Por
otro lado, el gen de ARN ribosomal es transcrito una vez por
segundo aproximadamente.

Terminacin de la Transcripcin.
 18

La terminacin de la transcripcin es tan controlado como su

iniciacin. El ADN-patrn contiene seales de detencin para la
transcripcin. Existen dos mecanismos de terminacin en E. coli:
uno es dependiente de una protena auxiliar llamada factor rho y otro
independiente de este factor.

Terminacin independiente del factor rho. Esto es distinguido por

la presencia de una secuencia rica GC en el ADN seguido por cinco
o seis adeninas. EL ARN transcriptos lgicamente tambin posee
esta regin rica en GC, regin que es capaz de formar un loop o
estructura de horquilla como resultado de interaccin entre bases
complementarias. Adems seguido de esta regin rica en GC, en el
extremo 3 del ARN aparece una secuencia rica en uracilo. Se ha
observado que la unin Uracilo con Adenina de la hebra de ADN
molde es menos estable y as el ARN es capaz de disociarse ( ver
fig. 6 ). Por consiguiente el duplex ADN-ARN se suelta y se libera el
ARN sintetizado.
C
U C

U C
G -- C
A -- U
C -- G
C -- G
C -- G
C -- G
C -- G
C -- G
G --- C 3'
5' U - A - A - U - C - C - C - A - C - A - G A - U - U - U - U - OH

Figura 6. Estructura secundaria del ARN sintetizado (seal de

termino).

Terminacin dependiente del factor rho. Tambin requiere la

presencia de la estructura de horquilla (regin rica en GC). Sin
embargo, la secuencia rica en U est ausente. El factor rho, es una
protena compuesta por seis sub-unidades idnticas de 46 KDa y
tiene una alta afinidad por ARN de hebra simple. Cuando se une al
ARN, el factor rho hidroliza ATP y la energa liberada es capaz de
mover este complejo proteico (factor rho) a lo largo del ARN que se
esta sintetizando en direccin de la burbuja de transcripcin.
 19

Cuando llega a dicha burbuja, el factor rho disocia el hbrido ADN-

ARN por un mecanismo desconocido, liberando el ARN al
citoplasma (ver fig. 7).

ARN polimerasa

Factor rho

ADP + Pi
5' ATP + H2O

Figura 7. Terminacin dependiente de rho

La transcripcin puede ser bloqueada por inhibidores especficos,

llamados comnmente antibiticos. Por ejemplo, el antibitico
rifampicina inhibe la iniciacin de la sntesis de ARN, mientras que
la actinomicina D bloquea la elongacin del ARN.

Transcripcin en eucariotes

La maquinaria transcripcional de eucariontes es lejos ms complejo

que en procariontes. Una importante consideracin es que en
eucariontes superiores solamente una pequea proporcin del
genoma es expresada a ARN (cerca de 10% como mximo). Una
considerable proporcin del genoma de eucariontes existe
permanentemente como cromatina (ADN cromosomal) altamente
condensada y es transcripcionalmente inerte. Adicionalmente,
 20

hay protenas accesorias especficas llamadas FACTORES DE

TRANSCRIPCIN y son requeridos para una transcripcin eficiente
de todos los genes de eucariontes.

Diferente al factor bacterial sigma (), los factores de transcripcin

no se unen a la polimerasa directamente. Ellos forman complejos
con la cromatina (ADN cromosomal) antes del inicio de la
transcripcin y acta como un regulador positivo de la transcripcin.

Enzimas de la trancripcin en eucariontes.

El ncleo de eucariontes contiene tres tipos de ARN polimerasas:

- ARN polimerasa I (localizada en el nuclolo) transcribe los genes

de ARN ribosomal. El transcrito primario producido corresponde a
un pre-rARN que posteriormente sufre algunas modificaciones para
transformarse en una rARN maduro.

-ARN polimerasa II (se encuentra en el nucleoplasma) transcribe

los genes que codifican para protena y el transcrito primario
corresponde a un ARN nuclear heterogneo (hnARN), que son los
precursores del ARN mensajeros citoplasmtico.

-ARN polimerasa III (nucleoplasmtica) transcribe el rARN 5S (ARN

ribosomico) y los tARNs (ARN de transferencia).

La reaccin catalizada por todas las polimerasas en eucariontes es

bioqumicamente la misma que la reaccin de las enzimas de E.
coli (procariontes).

Todas las polimerasas eucarionticas son grandes molculas con

masas que exceden los 500 kDa. Ellas contienen dos sub-
unidades con masas superiores a 100 kDa, cada una de las cuales
es una polimerasa especfica y adems poseen 12 sub-unidades
menores, algunas de las cuales son comunes a los tres tipos de
polimerasas. La precisa funcin de cada sub-unidad es an
desconocida.

Regin promotora para la actividad de ARN polimerasa I

 21

Para el caso particular de la ARN polimerasa I que sintetiza el ARN

ribosomal. En el gen (ADN) para el rARN presenta una regin
promotora de 150 pares de bases, ubicada en la posicin -142 y
+6.
Sin embargo, existen copias imperfectas del largo total del promotor
en posiciones -1200 y -2300 pares desde el sitio de inicio de la
transcripcin y entre estas regiones hay mltiples copias de 60 81
pares de bases de la regin promotora ( ver Fig. 8).

Las copias 60/81 estimulan la transcripcin del verdadero promotor y

puede estar involucrado en la unin de un factor presente en
cantidades limitadas. Las copias totales de los promotores pero
imperfectos son capaces de iniciar la sntesis de ARN, pero este
efecto termina antes de alcanzar la verdadera regin promotora.

Punto de inicio

repeticiones Promotor
gen Promotor de 60/81 bp del gen Gen
28S rARN espaciador 18S rARN

-4000 -2000 +1

Figura 8. Regin promotora del gen de rARN, con una regin

promotora verdadera ( ) y con copias imperfectas de ella ( . ).

Regin promotora para la ARN polimerasa II.

Los genes transcritos por la polimarasa II producen los ARN

mensajeros. Estos incluyen los genes que codifican a las protenas
que son expresadas constitutivamente (que siempre son
expresadas) en todos los tejidos y aquellos genes que solamente
son expresados en un tejido particular de un organismo multicelular
o que esta regulado por la presencia o ausencia de un sustrato
particular, hormona o estmulo ambiental.

Los promotores para la ARN polimerasa II estn localizados en el

lado 5 del sitio de inicio de la transcripcin.
 22

-80 -25 inicio

--CAAT----------GGGCCCGGG------GGGCCGGG---------TATA--------

Estas secuencias tienen la funcin de unir los factores de

transcripcin especficos en vez de dirigir los puntos de contacto con
la ARN polimerasa II, como ocurre en procariontes. Varios
promotores que estn relativamente cercanos al punto de inicio de la
transcripcin, son necesarios pero normalmente insuficientes para
que se realice una eficiente expresin de los genes por la enzima
ARN polimerasa II.

Adems existen otros tipos de secuencias en el ADN molde

llamadas ENHANCER que no tienen actividad promotora por si
mismas, pero que pueden estimular la transcripcin y pueden
actuar sobre considerables distancias de varios kilobases del sitio de
inicio de la transcripcin. Una caracterstica de los enhancer es que
realizan su accin independiente de la orientacin que ellos tengan
(Fig. 9)

-8,000 +1
Enhancer Promotor
Sitio de inicio

Figura 9. Esquema de la posicin del Enhancer con respecto al

promotor.

El transcrito primario de la ARN polimerasa II, son conocidas

colectivamente como ARNs nucleares heterogneos. Ellas pueden
llegar a ser grandes molculas (sobre 10 kilobases) debido que
contiene an los intrones (secuencia que no son traducidas a
 23

protena) en la secuencia de ARN, pero ellas no estarn presente en

el ARN maduro.

SINTESIS DE ARN MENSAJEROS

La sntesis de un mARN en eucariontes (ver fig. 10):

- (1) Comienza la transcripcin de un ADN cuando una ARN
polimerasa se encuentra a 20 o 30 nucletidos despus de la
secuencia TATA.
- (2) Cuando el transcrito ( ARN) ha alcanzado 30 nucletidos de
largo, en su extremo 5 es colocado una guanosina unido a un
grupo trifosfato que adems es metilado.
- (3) La ARN polimerasa se nueve a lo largo del ADN transcribiendo
tanto exones como intrones. Hasta que se transcribe la
secuencia AAUAAA, despus de cerca de 20 nuclotidos de
esta secuencia, el transcrito es cortado; la reaccin
probablemente involucra una pequea ribonucleoprotena
nuclear (snRNP) que contiene una molcula de ARN ( U1
ARN) rico en uracilo.
- (4) Una enzima adiciona una secuencia de 150 a 200 adeninas
en el extremo 3 de la hebra de ARN naciente.
- (5) El transcrito es procesado y son cortados los intrones,
probablemente con la ayuda de otras snRNPs; y nuevamente U1
ARN se une a una secuencia complementaria (que incluye GU)
en el comienzo del intron, tambin en este proceso participan
otras 6 molculas de ARN (denominadas U2,U3,...U7)
- (6) Los intrones son doblados y cortados
- (7) Los exones son unidos para formar finalmente el ARN
mensajero maduro

La mayora de los genes en eucariontes superiores son

discontnuos. Las secuencias que se codificaran en estos genes
(exones) son separadas por secuencias que no son traducidas
(intrones), que son removidos en la conversin del transcripto
primario a mARN maduro.

(1) ARN Polimerasa II

ADN
TATA
 24

(2)
TATA

+CH3
Transcrito primario
G -P-P-P
Enzima

(3)

CH3
AAUAAA
G -P-P-P

snRNP
A

U1 ARN
Enzima Poli (A)

(4)
 25

CH3
! AAUAAA
G - P-P-P AAAA...

(5)

snRNP

U1 ARN
CH3
! GU GU
G - P-P-P AAAA...

(6)

CH3
GU

GU

!
G - P-P-P AAAA...

(7)
GU
GU

CH3
!
G - P-P-P AAAA...

Figura 10. Transcripcin de un mARN en Eucariontes (las

explicaciones se encuentran en el texto).
 26

ARN Polimerasa III

Los genes transcritos por la ARN polimerasa III ( rARN 5S, tARN y
varios ARNs nucleares y citoplasmticos pequeos) usualmente
contiene menos de 300 nuclotidos. Genes de rARN 5S no
contienen intrones mientras que muchos genes de tARN poseen
pequeos intrones.

Regin Promotora para la accin ARN polimerasa III.

El control de transcripcin mejor estudiada es del gen rARN 5S, que

inesperadamente tiene una secuencia promotora dentro de su
secuencia transcrita. Se ha determinado que la regin interna
promotora esta entre las posiciones + 50 y + 84, que mostr ser
esencial para la transcripcin de los genes rARN 5S (fig. 11). En la
regulacin de las sntesis de rARN 5S existen factores llamados :
TFIIIA, TFIIIC, que son requeridos para una transcripcin eficiente.

Gen 5S rARN
Regin
Promotora

5' 3'

5S rARN

-80 -40 0 +40 +80 +100

Figura 11. Localizacin de la regin promotora del gen 5S rARN de

X. laevis.

Modificaciones Post Transcripcionales

Muchos ARNs son modificados qumicamente (Ej. metilados) y

escindidos o cortados despus de la transcripcin. Los mARNs son
 27

modificados por acoplamiento de una larga cadena de poli-A a su

extremo 3. Los rARNs se generan a partir de una larga cadena
precursora que finalmente es escindida para rendir los ARNs
maduros.

CDIGO GENTICO

La secuencia de bases de un gen es colineal con la secuencia

aminoacdica de su producto polipeptdico. El cdigo gentico es la
relacin entre la secuencia de bases en el ADN (o su ARN
transcrito) y la secuencia de aminocidos en una protena.

Los aminocidos son codificados por un grupo de tres bases

(llamadas codones) comenzando de un punto determinado (ver
fig. 12).

Se pueden definir cuatro caractersticas generales del cdigo

gentico:

1) El cdigo no requiere de puntuacin ni seal alguna para indicar

el final de un triplete y el comienzo del siguiente, es decir el
cdigo gentico no tiene comas. nicamente requiere de una
molcula de mARN que este ubicada correctamente para su
lectura (53) adems de contar con el codn de inicio, AUG
(en procariontes codifica la incorporacin de N-formilmetionina y
en eucariontes metionina).

2) 61 de 64 codones especifican algn aminocido en particular.

De esta forma, para la mayora de los aminocidos hay ms de
 28

un triplete (o codn). En otras palabras, el cdigo es

DEGENERADO. Codones que especifican el mismo aminocido
son llamados sinnimos. La mayora de los sinnimos difieren
solamente en la ltima base del triplete. Esto presenta una
ventaja, debido a que la mayora de las mutaciones conducen a
la formacin de tripletes sinnimos no provocando un cambio en
la secuencia peptdica.

3) La tercera base de los tripletes es menos especifica que las dos

primeras. La degeneracin implica solamente la tercera base en
la mayora de los casos (excepto para Arginina, Leucina y Serina).

4) 3 de los 64 tripletes no codifican para aminocido alguno y estos

son UAG, UAA y UGA llamados originalmente codones sin
sentido que constituyen las seales de termino de la sntesis de
la cadena polipeptdica.

SEGUNDA LETRA

U C A G

UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys

UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys
U
UUA Leu UCA Ser UAA Stop UGA Stop
PRIMERA LETRA

UUG Leu UCG Ser UAG Stop UGG Trp

CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg
CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg
C
CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg
CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg
AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser
AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser
A
AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg
AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg
GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly
GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly
G
GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly
GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly
 29

Figura 12. Cdigo gentico.

SNTESIS DE PROTENAS

La sntesis de protenas tienen lugar en la superficie de los

ribosomas. Dicha sntesis requiere que los aminocidos sean
activados en el citoplasma por la accin de aminoacil- tARN-
sintetasas, que catalizan la formacin de steres de aminocidos
de tARN homlogos (unin de un aminocido con su tRNA
respectivo) y en forma conjunta en el proceso de activacin se
hidroliza ATP produciendo AMP y pirofosfato. Las aminoacil-tARN-
sintetasas son altamente especficas tanto para el aminocido como
para su correspondiente tARN.

Aminoacido + ATP aminoacil AMP + PPi

Aminoacil- AMP + tARN aminoacil-tARN + AMP

Aminoacido + ATP + tARN aminoacil tARN + AMP + PPi

El aminocido se une al extremo 3 del tARN que posee la secuencia

CCA, mientras que el anticodn esta a 80 de distancia en el otro
extremo (ver fig. 13).
 30

Sitio de unin
al aminocido
3
A
C
5 C

Loop DHU Loop TC

anticodn

Figura 13. Estructura de hoja de trbol caracterstica de un tARN

El ARN mensajero reconoce el anticodn de un tARN en vez de

reconocer el aminocido. Un codn en mARN se aparea con el
anticodn en el tARN. Algunos tARNs reconocen ms de un codn
porque la tercera base que se aparea de un codn es menos
especifica que las otras dos ( ver cdigo gentico).

Los Ribosomas.

La sntesis de protena tiene lugar en los ribosomas, que estn

formados por una subunidad mayor y una menor, cada una de las
cuales estn compuestas de dos tercios de ARNs y un tercio de
protenas. En E. coli, por ejemplo, el ribosoma 70 S ( 2.500 kdal)
est formado por una sub-unidad de 30 S y una de 50 S. En
 31

cambio en eucariontes el ribosoma es de 80 S, formado por uno de

40 S y uno de 60 S.

- El coeficiente de sedimentacin de macromolculas biolgicas

son expresadas en unidades Svedberg (abreviada como S).
1 S = 10-13 seg.

Hay tres fases en la sntesis de protena: inicio, elongacin y

termino.

CADENA NASCIENTE

40 S

5'

STOP
3'
INICIO

INICIO
ELONGACION TERMINO
40 S 60 S
60S

40 S

60 S

Figura 14. Ciclo de la sntesis de protena.

Inicio.

En procariontes el ARN mensajero, la formilmetionina- tARN y la

sub-unidad ribosomal 30 S, forman el complejo iniciacin de la
sntesis (en cambio para eucariontes este complejo est formado por
mARN, metionina-tARN y la sub-unidad 40 S, ver fig. 14).
La seal de inicio en el mARN es AUG y esta precedida por una
secuencia rica en purina que puede aparearse con el rARN 16 S de
la sub-unidad 30 S del ribosoma. La subunidad mayor ribosomal de
50 S se une a este complejo para formar un complejo de iniciacin
de 70 S, (ver fig. 15) que esta listo para la siguiente fase
 32

(elongacin). En el proceso de iniciacin estn participando una

serie de factores protecos que son descritos en la Tabla IV.

mARN

fMet.tARNMet
30S
IF-1 IF-3 IF-1 IF-3
IF-2 GTP

IF-2GTPfMet-tARN Met GDP +Pi

IF1
IF2

50 S

30 S

Complejo de inicio 70 S

Figura 15. Fase de inicio de la sntesis de protena en baterias

(procariontes). 30S y 50 S son la subunidad menor y mayor del
ribosoma respectivamente. IF, son factores proteicos de inicio.

Elongacin.

El ciclo de elongacin consiste en (ver fig. 16) :

1) La unin de aminoacil-tARN (reconocimiento del codn).
2) Formacin del enlace peptdico.
3) Transposicin.
 33

Tambin durante la elongacin se requiere la presencia de factores

proteicos que son descritos en la Tabla V.

La direccin de lectura del mARN es de 5 3y el crecimiento de la

cadena polipeptidica es hecho desde el extremo amino al extremo
carboxilo.

Sitio E f-Met Arg

f- Met
Ingreso del
Sitio A aminoacil-
tARN al sitio A

Sitio P GTP GDP

+
Pi

AUG- CGA- GCU------------3 ----------------AUG.CGA -

Inicio de un
nuevo ciclo Formacin del
enlace peptdico
catalizado por la
f- Met Sitio A peptidil transferasa
| vaci f- Met
Arg |
| Arg
|

Translocacin

GDP GTP
+
-AUG-CGA-GCU------ Pi ----------------- AUG-CGA-GCU

Figura 16. Fase de elongacin de la cadena peptdica: unin del

aminoacil-tARN, formacin del enlace peptdico y translocacin.
 34

Termino.

La sntesis de protena es terminada por factores de liberacin, que

reconocen los codones de terminacin UAA, UGA y UAG
provocando la hidrlisis entre el polipeptido y el tARN (Tabla VI).

La energa requerida tanto en la formacin del complejo de

iniciacin son 70 S como en la unin del aminoacil- tARN al
ribosoma, y en la transposicin son obtenidos de la hidrlisis del
GTP ( ver Tabla VII ).

Varios pasos en la sntesis de protena son especficamente inhibida

por toxinas y antibiticos. Por ejemplo, puromicina inhibe la
sntesis de la cadena peptdica por su interaccin con el peptidil -
tARN en la ribosoma, formando peptidil- puromicina que libera el
complejo ribosomal ( ver Tabla VIII).

Por otro lado, los polirribosomas, tambin denominados

polisomas, consisten en molculas de mARN a las que estn
adheridos muchos ribosomas, cada uno de los cuales, leen el
mARN independientemente y construyen una cadena polipeptdica.
En las clulas eucariticas, la sntesis proteca puede tener lugares
en ribosomas libres, o bin, en los ribosomas unidos al retculo
endoplasmtico.

Tambin existe sntesis proteca en las mitocondrias y en los

cloroplastos, los cuales poseen mARNs, tARNs especficos,
aminoacil- tARN-sintetasas y ribosomas.

Anexo 1.
 35

TABLA IV. FACTORES DE INICIACIN DE PROCARIONTES Y

EUCARIONTES

FACTOR FACTOR FUNCIN

BACTERIAL EUCARIONTES

IF- 1 elF - 1 Los roles no estn claros

IF- 2 elF - 2 Une Met- tARN (o fMet - tARN ) a los
ribosomas en el complejo con GTP.

IF- 3 elF -3 Impide la reasociacin de las sub-unidades

ribosomales.

elF -4A Un grupo de factores liberados respon-

elF -4B sables de la unin al extremo bloqueado
elF -4E del mARN y desdoblar alguna estructura
elF -4F secundaria para capacitar a los ribosomas
en el reconocimiento del codn de inicio.

elF -5 Libera elF-2 y elF-3 del ribosoma y

permite la unin de la sub-unidad 60 S

elF -6 Involucrada en la disociacin del ribosoma

en sus sub-unidades.

GEF (Factor de intercambio de la guanina:

recicla elF-2 mediado por intercambio de
GDP por ATP en un proceso anlogo que
para reciclar EF.Ts)

TABLA V. FACTORES DE ELONGACIN

 36

FACTOR FACTOR FUNCIN

BACTERIAL EUCARIOTICO

ED-Tu EF - 1 Unir aminoacil- tARN al sitio A del

(43 kDa) (53 kDa ) ribosoma como por ejemplo, complejo
(EF-1 GTP, aminoacil-tARN).

EF - Ts EF - 1 Reciclar EF -Tu o EF - 1 respectivamente

( 30 kDa) (50/38 kDa)

EF - G EF -2 Involucrado en los pasos de translocacin

de los ciclos de elongacin.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------

TABLA VI. FACTORES DE TERMINACIN (O LIBERACIN)

BACTERIA ( E. coli ) EUCARIOTES

RF -1 ( Para UAA o UAG) eRF ( con los tres

codones de termino)

RF-2 ( Para UAA o UGA )

RF-3 (estimula RF-1 y RF-2)

TABLA VII. REQUERIMIENTOS ENERGETICOS PARA LA TRADUCCION:

LA ORGANIZACION REQUIERE EL INGRESO DE ENERGIA LIBRE DESDE
LA HIDROLISIS DEL ATP O GTP
 37

PROCARIONTES EUCARIONTES

Aminoacilacin ATP AMP + PPi ATP AMP + PPi

del tARN (e.i. 2 enlaces de alta energa por aminocido)

Iniciacin GTP GDO + Pi, GTP GDP + Pi,

asociado con IF-2 asociado con elF-2

ATP ADP + Pi,

asociado con el extremo
de guanina y el
desdoblamiento del
mARN. (no esta claro
cuantos ATPs son
usados)

Elongacin GTP GDP + Pi, GTP GDP + Pi,

asociado con EF-Tu asociado con EF-1

GTP GDP + Pi, GTP GDP + Pi

asociado con EF-G asociado con EF-2

Terminacin Probablemente no GTP GDP + Pi

requiere energa

TABLA VIII. INHIBIDORES DE TRADUCCIN

INHIBIDOR SELECTIVIDAD ACCIN

--------------------------------------------------------------------------------------------------------
 38

Cloramfenicol Procariontes Elongacin: inhile

peptidil
transferasa.

Cicloheximida Eucariontes Elongacin: mecanismo

incierto.

Eritromicina Procariontes Elongacin: inhibe

transpeptidacin

cido Fusidico Ambos Elongacin: bloquea la

liberacin del complejo
EF-G o EF-2 GDP.

Kanamicina Ambos Elongacin:causa error en la

lectura.

Neomicina Ambos Iniciacin y elongacin:

causa error de lectura del
mARN.

Puromicina Ambos Elongacin: causa

prematura
terminacin.

Sparsamicina Ambos Elongacin: inhibe peptidil-

transferasa.

Spectinomicina Procariontes Elongacin: inhibe transpep-

tidacin.

Treptomicina Procariontes Elongacin: se une a la sub-

unidad 30 S e interfiere
con
la interaccin codn-antico-
dn causando error de
lectu-
del mARN.

Tetramicina Procariontes Elongacin: bloquea la

unin
de aa- tARN al sitio A.

Anexo 2.
EJERCICIOS
 39

1.- Escribir la secuencia complementaria en direccin 5 3

a) 5- GATCAA- 3
b) 3- ACTGGCCTAA -5
c) 5- ACCTAGGGTA -5
d) 3- CCTGGATTAAG -5

2.- Compare la ADN polimerasa I y la ARN polimerasa de E.coli en

cuanto a:

a) estructura de subunidades.
b) precursores activados
c) direccin de elongacin de la cadena
d) actividad exonucleasae) conservacin del
ADN molde
f) necesidad de una hebra particular.
d) energtica de la reaccin de elongacin

3.- Escribir las secuencias de los mARN sintetizados de los

siguientes ADNs

a) 3- ATTGCCATGCTA-5
b) 5- AGCTACTTAACG-3
c) 3-GGACCTACGTT.5

Adems indique cuales son los codones sin sentido presentes.

4.- Cuantos aminocidos pueden ser codificados de las siguiente

secuencia de mARN.

a) Asumiendo que comienza la lectura en el extremo 5

inmediatamente.
b) Comenzando en forma normal establecida por el cdigo gentico.

4. 1- 5- UUGCCUAUGGAUUGGAUG-3
4. 2- 3-AUGUAGGUAAAGGUAGGCC-5
4. 3- 3- AGCGCCAGUGACCAUGUA-5

5.- Que secuencia es formado por la adicin de un poli (UUAC) a

un sistema de sntesis de protenas.
 40

6.- El ARN transcrito de una regin del ADN del fago G4

conteniendo la siguiente secuencia ( este tipo de ADN tiene una
traduccin superpuesta)

5 - TCCTCATTT - 3

Esta regin codifica para diferentes protenas. cuales son sus

secuencias.