Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Tema 10 PDF
Tema 10 PDF
Tema 10
CaCO 3
eluato
a b c d
Figura 10.1. Separacin hipottica de tres componentes de una mezcla por cromatografa en columna.
volumen o tiempo
Figura 10.2. Cromatograma de la mezcla de tres componentes de la figura 10.1.
* Aunque es posible recoger distintas fracciones de fase mvil que sale de la columna y determinar en cada
una de ellas la concentracin de soluto, normalmente el efluente se monitoriza continuamente con un
detector que mide alguna propiedad fsica o qumica del soluto o de la fase mvil.
Introduccin a los Mtodos Cromatogrficos 4
1. Cuando se utiliza como fase mvil un fluido a presin y temperatura superiores a la crtica se tiene un tipo
de cromatografa denominada de fluido supercrtico.
2. Adems de los mecanismos mencionados existen otros tales como: fase enlazada, interaccin inica,
afinidad, quelacin.
3. El mecanismo es de adsorcin cuando la fase mvil en un lquido polar.
4. El mecanismo puede ser de reparto cuando la fase mvil es un lquido no polar
Columnas cromatogrficas
* Las siglas HPLC corresponden a las iniciales de la denominacin en ingls High Performance Liquid
Chromatography.
Introduccin a los Mtodos Cromatogrficos 6
pared de la columna
a b c
Figura 10.4. Columnas tubulares abiertas. a) de capa porosa. b) con pared recubierta. c) con soporte
recubierto.
Intercambio catinico:
Matriz-A M+ + X+ > Matriz-AX+ + M+
Intercambio aninico:
Matriz-A+M + Y > Matriz-A+Y +M
La fase mvil suele ser una solucin acuosa tamponada y la separacin se produce
por la competencia que se establece entre los iones de la fase mvil y los iones del
analito por los centros activos de la resina. Este tipo de cromatografa se utiliza
ampliamente en qumica inorgnica para la separacin de iones metlicos, as como en
sistemas biolgicos para la separacin de compuestos inicos solubles en agua.
interfase
soluto
.
centros
activos
a) adsorcin b) reparto
contrain
FUNDAMENTOS TEORICOS
AS
KA=
AM
KA > KB > KC
A B C
A BC A B C
RETENCION Y DISTRIBUCION
* En cromatografa de gases con detector de conductividad trmica suele inyectarse, junto con la muestra,
unos micro-litros de aire,.
Claudio Gonzlez Prez 11
tM: tiempo muerto (tiempo requerido para que una especie no retenida alcance el detector)
VM: volumen muerto (volumen de fase mvil que se requiere para eluir una especie no
retenida)
VR: volumen de retencin (volumen de fase mvil que se requiere para eluir un soluto de la
columna cromatogrfica)
h: altura de pico; w: anchura de pico; w1/2: anchura de pico a la semialtura
w0,1: anchura de pico a un dcimo de la altura.
* Interacciones electrostticas entre especies de carga opuesta, como las que tienen
lugar en separaciones por cromatografa inica.
* Interacciones por fuerzas de van der Waals del tipo dipolo-dipolo (orientacin) o del
tipo dipolo-dipolo inducido (induccin)
o lo que es lo mismo*,
' tR tM
k =
tM
* La ecuacin k' = m /m representa la relacin entre la probabilidad de que una molcula de soluto
s M
permanezca en la fase estacionaria y en la fase mvil y esta relacin de probabilidad es tambien igual a la
relacin entre el tiempo que en promedio una molcula de soluto permanece en la fase estacionaria y en la
fase mvil.
Claudio Gonzlez Prez 13
' t R t M VR VM
k = =
tM VM
Los factores de retencin grandes favorecen una buena separacin, pero tambin
incrementan el tiempo de elucin y el ancho de banda. Idealmente, las separaciones se
realizan en unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de
una mezcla oscilan entre 1 y 5.
VR = VM (1 + k')
VR = VM (1 + K VS/VM)
VR = VM + K VS
VR = VM + kA As
y, por otra parte, puede determinarse fcilmente de forma directa midiendo los
tiempos de retencin de las especies A y B sobre un cromatograma experimental, ya
que,
tR B tM
=
tR A tM
La observacin de los picos cromatogrficos muestra una gran semejanza con las
curvas de error normal o Gaussianas, lo cual puede explicarse de la forma siguiente:
durante el desplazamiento por el interior de una columna cromatogrfica, una
partcula individual de analito experimenta miles de transferencias entre las fases
mvil y estacionaria. El tiempo de residencia en una fase dada es muy irregular,
pudiendo ser muy pequeo en algunas etapas, y relativamente grande en otras. Por
ello, el tiempo de permanencia de la partcula en el interior de la columna tambin ser
irregular, ya que solamente se eluye cuando reside en la fase mvil; algunas partculas
se desplazarn rpidamente, debido a que permanecen ms tiempo en la fase mvil,
mientras que otras lo harn con mayor lentitud, como consecuencia de su mayor
permanencia accidental en la fase estacionaria.
w 1/2 =2.35
1/2 h
w=4
Volumen
Figura 10.9. Pico cromatogrfico ideal.
Claudio Gonzlez Prez 15
Por otra parte, la anchura de los picos est directamente relacionada con el
tiempo de residencia en la columna (inversamente proporcional a la velocidad de flujo
de la fase mvil), ya que a mayor tiempo, mayor dispersin, de forma que las especies
eluidas al final presentan picos ms anchos que las eluidas al comienzo, como se
muestra en la figura 10.2.
L
H=
N
Es necesario indicar que las columnas se comportan a menudo como si tuvieran
distintos nmeros de platos para distintos solutos en una mezcla.
CS .
CS CS
CM CM CM
Respuesta
Respuesta
Respuesta
a a b
b 10 % h
t t t
a b c
Teora cintica
B
H=A+ +Cu
u
donde u es la velocidad lineal media de la fase mvil (u=L/tM; L=longitud de la columna;
tM=tiempo muerto).
fase
mvil 2
a b
Figura 10.11. Trayectorias de la fase mvil.
A = dp
donde es una constante que depende de las dimensiones, geometra y uniformidad
del empaquetamiento de la columna, y dp es el dimetro medio de las partculas de la
fase estacionaria. Segn la expresin anterior, partculas pequeas y uniformemente
empaquetadas conducirn a columnas ms eficaces, si bien, ello implicar el empleo de
presiones altas. Por otra parte, el trmino A es cero para columnas tubulares abiertas,
debido a que la fase estacionaria en tales columnas se deposita directamente sobre la
pared de la columna.
perfil de
concentraciones
fase
mvil
a b
B = 2 DM
donde es un factor de impedimento que depende de las caractersticas del relleno de
la columna ( suele ser 0.7 para columnas con relleno y 1.0 para columnas tubulares
abiertas)
Fase
mvil
Equilibrio
Fase
estacionaria
Fase
mvil
No equilibrio
Fase
estacionaria
En cromatografa de gases, los efectos de la fase mvil, CM, son mucho menores
que los correspondientes de la fase estacionaria, CS, mientras que en HPLC, CM y CS
tienen valores comparables.
B
A+ +Cu
u
Cu
B/u
Las curvas de la ecuacin de van Deemter son similares para CG y para CL,
presentando, en todos los casos un valor mnimo de H para una determinada velocidad
de la fase mvil (condicin ptima). A velocidades inferiores a la ptima la difusin
longitudinal (B) origina un incremento en la altura de plato y un ensanchamiento de la
banda, mientras que a velocidades superiores, la resistencia a la transferencia de
masa (equilibrio lento) entre fases provoca que el soluto se extienda.
estacionaria, de forma que cualquier zona del sistema en la que estn presentes el
soluto y la fase mvil, pero no expuesta a la fase estacionaria contribuye a la difusin
del soluto y, en consecuencia, al ensanchamiento de las bandas cromatogrficas. Es
evidente, que debern usarse tubos estrechos para las conexiones entre el sistema de
inyeccin y la columna, y entre sta y el detector.
En cuanto a los detectores, su propio volumen podr actuar como una verdadera
cmara de mezcla. Debern disearse de forma que su volumen sea pequeo y de que
se mantenga un flujo laminar en su interior.
RESOLUCION Y SU OPTIMIZACION
2 t RB t RA
R=
wA wB
o. alternativamente,
2 t RB t RA
R=
1.699 w 1/2 A + w 1/2 B
Si R=1.5, los dos picos solo se superponen un 0.3 %, mientras que si R=1, la
superposicin es del orden del 2 %, que puede considerarse adecuada para muchos
anlisis.
'
1 1 k
R= N
4 '
1+k
donde k' es el valor medio de k'A y k'B. Esta expresin indica que la resolucin
depende de la eficacia global de la columna (N), de la capacidad de la fase estacionaria
para retener a los componentes () y de las caractersticas de retencin de cada
componente (k).
Cuando una muestra est constituida por un gran nmero de componentes, puede
ocurrir que se consigan las condiciones ptimas para la separacin de algunos , pero
ello vaya en detrimento de otros. En estos casos suele recurrirse a cambiar las
condiciones mientras se realiza la separacin, para lo cual, puede utilizarse la elucin
con gradiente (variacin gradual de la composicin de la fase mvil durante la elucin)
o la programacin de temperatura (variacin de la temperatura durante la elucin).
Introduccin a los Mtodos Cromatogrficos 26
En anlisis cualitativo sus aplicaciones son bastante limitadas, sobre todo cuando
se compara la informacin que proporciona un cromatograma con la que puede
obtenerse con otras tcnicas como espectroscopia infrarroja, de resonancia
magntica o de masas. De todas formas, la cromatografa es una herramienta
importante para reconocer la presencia o ausencia de componentes en mezclas que
contengan un nmero limitado de posibles especies de las que se conozca su identidad.
Por otra parte, en ocasiones interesa conocer si un determinado componente est
ausente en una muestra. En estos casos, muchas veces la cromatografa proporciona
una evidencia segura en este sentido, al no aparecer el pico, o la mancha,
correspondiente al patrn en las mismas condiciones de operacin.
Anlisis Cuantitativo
En cromatografa plana (papel y capa fina) el rea ocupada por las especies
separadas es el parmetro utilizable en anlisis cuantitativo.
* La altura de un pico cromatogrfico se obtiene uniendo las lneas base a cada lado del pico por una lnea
recta y midiendo la distancia perpendicular desde esta lnea al pico.
* En el caso de no disponer de estos equipos, un mtodo sencillo para picos simtricos consiste en
multiplicar la altura de pico por la anchura a la semi-altura. Otros mtodos implican el uso de planmetros o
incluso la determinacin gravimtrica, consistente en recortar el pico y determinar su peso relativo respecto
al peso de un rea conocida del papel de registro.
Claudio Gonzlez Prez 27
Muestra Muestra
(salida) (salida)
Eluyente Eluyente
Columna Columna
a) b)
Acorregida de x
% de x = . 100
Acorregidas