Instrucciones de uso

Histamina ELISA

REF KAPL10-1000

Histamina - ELISA
1. Uso y principio de la prueba

Inmunoensayo enzimtico para la determinacin cuantitativa de histamina en plasma y orina.

En combinacin con el kit complementario (REF BA E-1100), el ensayo se realiza para la liberacin de histamina en sangre
heparinizada.
En primer lugar la Histamina es acilada cuantitativamente. El kit competitivo de ELISA utiliza el formato de placa de microtitulacin. El
antgeno se une a la fase slida de la placa de microtitulacin. Los estndares, los controles, las muestras aciladas y los analitos
ligados a la fase slida compiten por un nmero fijo de lugares de unin al antisuero. Una vez el sistema est en equilibrio, los
complejos sin antgeno y sin antgeno- antisuero son eliminados mediante el lavado. El anticuerpo unido a la fase slida es detectado
por un conjugado IgG-peroxidasa anti-conejo usando TMB como sustrato. La reaccin es controlada a 450 nm.
La cuantificacin de muestras desconocidas se logra mediante la comparacin de su absorbancia con una curva de referencia
preparada con concentraciones estndar conocidas.

2. Almacenamiento y estabilidad
Almacene los reactivos a 2-8 C hasta la fecha de vencimiento. No utilice los componentes ms all de la fecha de indicada en las
etiquetas del kit. No mezcle varios lotes de ningn componente del equipo dentro de un mismo ensayo.

3. Contenido del kit

BA 3050 Tampn de ajuste 1 x 4 mL Listo para su uso

BA 3024 Placa de reaccin 1 x 96 pocillos Listo para su uso
BA 10-0025 Solucin de lavado 1 x 20 ml Concentrado. Diluir el contenido con agua
concentrada destilada para un volumen final de 500 mL
BA 10-0055 Sustrato 1 x 11 ml listos para su uso, con solucin de
tetrametilbenzidina (TMB)
BA 10-0080 Solucin de parada 1 x 11 ml listo para su uso, con 0,25 MH 2 SO 4
BA 10-0090 Papel aluminio 1 x 4 mL Listo para su uso
BA 10-1001 Estndar A 1 x 4 mL listo para su uso
BA 10-1002 Estndar B 1 x 4 mL listo para su uso
BA 10-1003 Estndar C 1 x 4 mL listo para su uso
BA 10-1004 Estndar D 1 x 4 mL listo para su uso
BA 10-1005 Estndar E 1 x 4 mL listo para su uso
BA 10-1006 Estndar F 1 x 4 mL listo para su uso
BA 10-1010 Antisuero de histamina 1 x 11 mL Proveniente de cabra, listo para su uso, de color
azul, con tapa azul.
BA 10-1012 Reactivo de acilacin 3 x 0.5 mL Liofilizado
BA 10-1028 Reactivo de igualacin 1 x 3 mL Liofilizado
BA 10-1031 Tiras de mircoplaca para 1 x 96 pocillos 12 tiras, 8 pocillos cada una, separadas, pre-
Histamina recubiertas
BA 10-1040 Conjugado enzimtico 1 x 11 ml listo para su uso, conjugado IgG anti-cabra con
peroxidasa
BA 10-1051 Control 1 1 x 4 ml listo para su uso
BA 10-1052 Control 2 1 x 4 ml listo para su uso
BA 10-1075 Diluyente de Acilacin 1 x 2 ml listo para su uso

4. Materiales adicionales y equipos requeridos pero no incluidos en el kit

- Micropipetas calibradas de precisin variable (ej.: 10-100 L / 100 - 1.000 L)
- Dispositivo para lavado de placas de microtitulacin
- Lector Elisa con posibilidad de lectura de absorbancia a 450 nm y 620 nm o 650 nm
- Agitador (con capacidad de agitacin de 3mm; aproximadamente 600 rpm)
- Material absorbente (toallas de papel)
- Agua destilada,
- Mezclador Vortex,

5. Toma y almacenamiento de muestras

Plasma

Se debe usar plasma (EDTA, heparina). Las muestras hemoltica y especialmente lipmicas no debe utilizarse con este ensayo.
Almacenamiento: hasta 6 horas a 2 - 8 C, para perodos ms largos (hasta 6 meses) a - 20 C.
Se debe evitar ciclos repetidos de congelacin y descongelacin.

Orina
Se deben utilizar muestras de orina tomadas de manera espontnea o de 24 horas, recolectadas en un frasco con contenido de 10-
15 mL de 6 M HCL
Almacenamiento: hasta 6 horas a 2 - 8 C, para perodos ms largos (hasta 6 meses) a -20 C
 Se deben evitar los ciclos repetidos de congelacin y descongelacin.
Evite la exposicin directa a la luz solar.

Sangre
La histamina liberada se analizada con sangre heparinizada. Para ms informacin ver instrucciones de uso (REF BA BA10-1100).

6. Procedimiento de la prueba
Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de su uso.
Se recomiendan realizar mediciones en duplicado.

6.1 Preparacin de los reactivos

Tampn de lavado
Diluya los 20 ml de tampn de lavado concentrado con agua destilada hasta obtener un volumen final de 1000 ml. Almacene el
Tampn de lavado concentrado a una temperatura de 2-8 C. Vida til: Consulte la fecha de vencimiento indicada en el kit.

Reactivo de igualacin
Reconstituya el contenido del vial con 3 ml de agua destilada. El reactivo de igualacin reconstituido no usado de manera inmediata
debe ser congelado a -20C (en partes alcuotas) y solamente puede ser descongelado una vez.
Vida til: por favor, consulte la fecha de caducidad indicada en el kit.

Reactivo de acilacin
Reconstituya cada vial con 0,5 ml de diluyente de acilacin.

El reactivo de acilacin debe prepararse justo antes del ensayo (no ms de 1 hora antes).

Si hay ms de 0,5 mL es necesario combinar los contenidos de 2 3 viales y mezclar bien.

6.2 Preparacin y acilacin de las muestras

1. Pipetee 25 L de estndares, 25 L de controles, y 25 L de muestras de plasma o 10 L de muestra de orina en los

respectivos pocillos de la placa de reaccin.

2. Aada 25 L de tampn de ajuste a todos los pocillos.

3. Aada 25 L de reactivo de igualacin (vea 6.1) a todos los pocillos.

4. Aada 10 L de reactivo de acilacin (vea 6.1) a todos los pocillos.

5. Incube durante 1 hora a temperatura ambiente (20-25 C) en un agitador (aprox. 600 rpm).

6. Aada 200 L de agua destilada a todos los pocillos.

7. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25 C) en un agitador (aprox. 600 rpm).

Tome 20 L de los estndares, contrles y muetras preparados para la prueba Histamine ELISA

6.3 Histamina ELISA

1. Pipetee 20 L de los estndares, controles y muestras acilados en los pocillos correspondientes de las Tiras de
microtitulacin para histamina.
2. Pipetee 100 L del Antisuero de histamina en todos los pocillos.
3. Agite las Tiras de Microtitulacin para Histamina brevemente con la mano y cbralas con lmina adhesivo.
Incube durante 15 - 20 horas a 2 - 8 C.
4. Retire la lmina adhesiva. Deseche o aspire el contenido de los pocillos y lave por completo cada pocillo 4 veces con 300 L de
Tampn de lavado. Seque agitando la placa en posicin invertida sobre material absorbente.
5. Pipetee 100 L de Conjugado enzimtico en todos los pocillos.
6. Cubra la placa con lmina adhesiva e incube durante 1 hora a temperatura ambiente (20-25 C) en un agitador (aprox. 600
rpm).
7. Retire la lmina adhesiva. Deseche o aspire el contenido de los pocillos y lave por completo cada pocillo 4 veces con 300 L de
Tampn de lavado. Seque agitando la placa en posicin invertida sobre material absorbente.
 8. Pipetee 100 L del sustrato en cada pocillo e incubar durante 20-30 minutos a temperatura ambiente (20-25 C) en un agitador
(aprox. 600 rpm. Evite la exposicin directa a la luz del sol.

9. Aada 100 L de la solucin de parada a cada pocillo y agite la placa de microtitulacin para garantizar una distribucin
homognea de la solucin.

10. Realice la lectura de absorbancia de la solucin en los pocillos dentro de un tiempo de 10 minutos, utilizando un lector de
microplacas programado a 450 nm con una longitud de onda de referencia entre 620 nm y 650 nm.

7. Clculo de resultados

Concentracin de los estndares

Estndar A B C D E F
Histamina (ng / mL = g/L) 0 0.3 1 3 10 30
Histamina (nmol/L) 0 2.7 9 27 90 270
Conversin Histamina (ng / ml) x 9 = Histamina (nmol / L)

La curva de calibracin se obtiene trazando las lecturas de absorbancia (clculo de la absorbancia media) de los estndares (lineal, eje-Y)
contra las concentraciones estndar correspondientes (logartmica, eje x).

Utilice una regresin no lineal para el ajuste de la curva (ej.: Trazado de lnea de curra, parmetro 4, akima).

Muestras de plasma y controles:

Las concentraciones de las muestras de plasma y los controles se pueden leer directamente de la curva estndar.

Muestras de orina
Las concentraciones de lectura de la histamina en la orina deben ser multiplicadas por 2,5
Calcule la excrecin de 24 horas para cada muestra de orina: ug / 24h = ug / L x L / 24h

7.1 Control de calidad

Se recomienda el uso de muestras de control de acuerdo a las regulaciones estatales y federales. Utilice controles en los niveles
normales y patolgicos. El kit control u otros controles comerciales deben estar dentro de los lmites de confianza establecidos. Los
lmites de confianza de los controles del kit se encuentran indicados en el informe de control de calidad.

7.2 Calibracin
La unin de los antisueros, los conjugados de enzima y la actividad de la enzima utilizada dependen de la temperatura, los valores de
extincin podran variar si no se utiliza un termostato. A mayor temperatura, mayor son los valores de extincin. Los valores de
extincin tambin dependen de los tiempos de incubacin. La temperatura ptima durante el inmunoensayo enzimtico se encuentra
entre 20-25 C.

En caso de desbordamiento, realiza la lectura de absorbancia de la solucin en los pocillos durante un tiempo de
de 10 minutos, utilizando un lector de microplacas programado a 405 nm

7.3 Curvas tpicas de calibracin

Ejemplo. No utilice para realizar clculos

8. Caractersticas del ensayo

Valores de referencia Histamina

esperados Plasma Orina
24 h Espontnea
< 1 ng/mL < 45 g/d < 45 g/g creatinina
Sensibilidad analtica Histamina
(Lmite de deteccin) Sensitividad de plasma 23 ng / ml
Sensitividad de Orina 0.25 ng / ml
Sustancia Reactividad cruzada (%)

Histamina
Especificidad Histamina 100
analtica
3-metil- Histamina 0.1
(Reactividad
cruzada) Tiramina 0.01
L-Fenilalanina < 0.01
L-Histidina < 0.01
L- Tirosina < 0.01
Triptamina < 0.01
Acido 5-Hidroxi-Indole-acetico < 0.01
Serotonina < 0.01
Precisin
Intra-ensayo Muestra Rango CV (%) Inter-ensayo Muestra Rango CV (%)
(ng / ml) (ng / ml)
1 8.7 0.6 7.4 Muestras 1 0.6 0.1 12
Histamina en Orina 2 30.1 2.2 7.3 control de 2 4.6 0.3 6.3
histamina
1 2.03 0.6 8
Histamina en Plasma
2 6.74 0.37 5.6

Rango Dilucin en serie Media (%)

hasta
Linealidad Histamina Orina 4.33 - 70 ng/mL 1:16 90 - 124
Plasma 0.74 8.48 ng/mL 1:16 85 -106
Media Rango % de recuperacin
Recuperacin Histamina Orina 112 108-123 despus de la
adicin
Plasma 103 92 120
Comparacin de los Histamina Orina ELISA = 0.9 This ELISA 3.1 r = 0.99, n = 29
mtodos
Plasma ELISA = This ELISA 0.4 r = 0.99; n = 47
frente a ELISA*
* ELISA Immunotech
9. Indicaciones para la manipulacin de la prueba

9.1 Fiabilidad de los resultados de las pruebas

Con el fin de asegurar una evaluacin fiable de los resultados de la prueba, esta debe llevarse a cabo de acuerdo con las
instrucciones y de conformidad con las normas y directrices vigentes (GLP, RILIBK, etc.). Se debe prestar especial atencin para
controlar las revisiones de precisin y correccin durante la prueba, los resultados de estos controles deben estar dentro del rango
normal. En caso de discrepancias significativas entre las caractersticas preestablecidas para esta prueba y los resultados reales,
pngase en contacto con el fabricante del kit de prueba para obtener instrucciones adicionales.
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de referencia. Los valores reportados en este instructivo de
prueba son solamente de carcter indicativo.
Los resultados obtenidos con este kit de prueba no deben ser tomados como la nica razn para ninguna consecuencia teraputica,
sino que se deben correlacionar con otras pruebas de diagnstico y observaciones clnicas.

9.2 Quejas
En caso de quejas por favor enve al fabricante un informe escrito que contenga todos los datos acerca de cmo se llev a cabo la
prueba, los resultados obtenidos y una copia de la impresin original de la prueba. Pngase en contacto con el fabricante para
obtener un formulario de reclamacin y enviarlo completamente diligenciado.

9.3 Garanta
Este kit de prueba se produjo de acuerdo a los ltimos avances en tecnologa y sometido a estrictos controles de control de calidad
externa e interna. Cualquier alteracin del equipo de prueba o del procedimiento de ensayo, as como el uso de reactivos de
diferentes cargos puede presentar una influencia negativa en los resultados del examen y por lo tanto no son cubiertos por la
garanta. El fabricante no se hace responsable por los daos ocasionados durante el transporte del kit.

9.4 Eliminacin
Las sustancias residuales y/o todos los productos qumicos, reactivos y soluciones listas para usar restantes, son residuos
especiales. Su disposicin est sujeta a leyes y reglamentos de la federacin y los pases. Las autoridades responsables o
compaas de eliminacin de residuos deben informar acerca del desecho de residuos especiales. La eliminacin del kit debe
hacerse de acuerdo con las normas oficiales nacionales. Las bases jurdicas para la eliminacin de residuos especiales son el ciclo
econmico y la ley de residuos.
Las hojas de datos de seguridad adecuadas de los productos individuales estn disponibles en la pgina principal. Las hojas de
datos de seguridad corresponden a la norma: ISO 11014-1.

9.5 Interferencias
No se deben mezclar los reactivos ni las soluciones de diferentes lotes. Considere diferentes condiciones de transporte y de
almacenamiento. El manejo inadecuado de las muestras o desviaciones en la reglamentacin pueden afectar los resultados. No
utilice los componentes del kit despus de la fecha de vencimiento. Evite la contaminacin microbiolgica de los reactivos y el agua
de lavado. Considere la posibilidad de periodos de incubacin y referencias de lavado.

9.6 Precauciones
Tenga en cuenta los perodos de incubacin y lavado. Nunca pipetee con la boca y evite el contacto de la piel con los reactivos y las
muestras. No fume, coma o beba en zonas donde se manipulen las muestras o los tubos del kit de prueba. Cuando se trabaje con los
componentes del kit o muestras, use siempre guantes de proteccin y lvese las manos completamente una vez haya terminado.
Evite rociar cualquier producto. Use ropa protectora y guantes desechables. Todos los pasos se deben llevar a cabo segn el
protocolo. Slo se obtienen resultados ptimos del ensayo al utilizar pipetas calibradas. La azida de sodio podra reaccionar con
tubos de plomo y cobre, y formar azidas metlicas altamente explosivas. Durante la limpieza, enjuague con abundante agua para
prevenir la formacin de las azidas metlicas.
Todos los reactivos de este kit el cual contiene suero humano/animal o plasma han sido analizados y presentan resultados negativos
de VIH I / II, HBsAg y HCV mediante procedimientos aprobados por FDA.
Sin embargo, todos los reactivos deben ser tratados como materiales biolgicos potencialmente peligrosos durante su uso y para su
eliminacin.

Para obtener documentacin actual, informacin sobre relevancia clnica o cualquier otra informacin por
favor contacte a su proveedor local.