Está en la página 1de 13

Nuevo mtodo rpido para la

determinacin de histamina en
productos pesqueros

Elisa Jimnez

www.azti.es 11/24/2014 1
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
INTRODUCCIN

Histamina
Amina bigena formada postmortem en msculo de peces
Crecimiento bacterias generadoras de histidina decarboxilasa
Principalmente en escombridos (atunes) (mayor contenido His)
Indicador nivel descomposicin
Elevado nivel: causa de reacciones txicas (cefalea, hipertensin,
nausea, )

Imagen: www.rcgroups.com

www.azti.es 11/24/2014 2
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
INTRODUCCIN

Histamina
Medicin: Cromatografa Lquida con detector de fluorescencia
(LCFLD), previa derivatizacin

Regulacin:
Reglamento (CE) n 2073/2005, de la Comisin de 15 de noviembre de 2005,
relativo a los criterios microbiolgicos aplicables a los productos alimenticios

Limite mximo permitido

Productos de la pesca procedentes de especies de pescado


asociados a un alto contenido de histidina: 100 mg/Kg

Productos de la pesca sometidos a tratamiento de maduracin


enzimtica en salmuera, fabricados a partir de especies de
pescados asociados a un alto contenido de histidina: 200 mg/Kg
www.azti.es 11/24/2014 3
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
INTRODUCCIN

Aptmeros
Oligonucletidos de pequeo tamao capaces de
unirse especficamente a la molcula de inters frente
a la cual han sido previamente seleccionados
(Ellington y Szostak, 1990)
ARN o ADN Imagen: www.amsbio.com

Kd= M (molculas pequeas) (hasta nM en protenas)

Mtodo seleccin
SELEX Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment
(Tuerk C y Gold L. 1990)
Ellington AD & Szostak JW (1990). In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346:818-822.
Tuerk C & Gold L (1990). Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249:505510.

www.azti.es 11/24/2014 4
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
OBJETIVOS

Objetivos
Desarrollar un sistema de deteccin rpido de histamina

Sistema de reconocimiento biolgico basado en aptmeros

Testar los aptmeros seleccionados en sistema SPR (Surface


Plasmon Resonance)

Implementacin de aptmero en un sensor rpido (tiras de


reaccin, placas ELISA)

www.azti.es 11/24/2014 5 5
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
DESARROLLO

Seleccin de aptmeros
Aplicacin de protocolo FluMagSELEX para la seleccin de
aptmeros ptimos (Stoltenburg, 2005)

Seleccin a partir de una biblioteca de oligonucletidos (1015


molculas)

Aptmeros: parte variable central (60mer) flanqueados por dos


regiones comunes de anclaje de cebadores (18 mer)

Histamina pegada a esferas magnticas


Dynabeads M-270 Epoxy (Invitrogen)

Deteccin mediante fluorescencia


Imagen: Invitrogen Dynal

Stoltenburg R.; et al. (2005), Flu-Mag-SELEX as an advantageous method for DNA aptamer selection. Anal. Bioanal. Chem., 383, 83

www.azti.es 11/24/2014 6
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
DESARROLLO

Protocolo de seleccin
Sucesivos ciclos: n=15
1. Enfrentamiento biblioteca de aptmeros-histamina
2. Lavado de aptmeros no unidos
3. Elucin de aptmeros afines
4. Amplificacin por PCR de aptmeros con mayor afinidad
5. Separacin PAGE desnaturalizante
Cebadores longitud desigual
Marcaje fluorescente
6. Vuelta al paso 1
7. Seleccin negativa
Esferas no tapizadas con histamina
Imagen: Stoltenburg R.; et al. (2005), Flu-Mag-SELEX as an advantageous
method for DNA aptamer selection. Anal. Bioanal. Chem., 383, 83

www.azti.es 11/24/2014 7
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
RESULTADOS

Identificacin de aptmeros
Clonacin de aptmeros
pMOS Blue Vector (Amersham)

Secuenciacin de clones positivos pMOS Blue Blunt-Ended Cloning Kit.GE Healthcare

Anlisis de secuencias: bsqueda de motivos comunes


Software Clustal W
Seleccin de dos posibles aptmeros afines a histamina
Anlisis de estructura secundaria
Software Mfold

www.azti.es 11/24/2014 8
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
RESULTADOS

Anlisis de afinidad
Test afinidad aptmero-histamina en sistema de fluorescencia
ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)

Aptmero marcado con FAM


Incremento concentracin histamina > incremento fluorescencia = AFINIDAD

Concentracin (g/mL) UF Unidades

Unidades de Fluorescencia (UF)


Fluorescencia
0.1000 3,965,115.00
0.0500 2,447,103.50
0.0200 1,070,333.50
0.0130 781,517.50
0.0100 462,513.00
0.0050 256,044.00
0.0020 44,121.00

Concentracin de Histamina (g/mlL)

www.azti.es 11/24/2014 9
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
RESULTADOS

Aplicacin a sensor SPR


Sistema de Resonancia de Plasmones Superficiales SPR BIACORE X
Determinacin de constante de disociacin de la interaccin
Chip CM5: superficie de oro, matriz dextrano-carboximetilada
Reconocimiento aptmero-histamina > seal detectable
Seal mnima: Histamina bajo peso molecular

Cooper MA (2002). Optical biosensors in drug discovery.


Nature Reviews Drug Discovery 1:515-528.
www.azti.es 11/24/2014 10
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
RESULTADOS

Optimizacin
Conjugacin Histamina+BSA (Bovine Serum Albumin)

Biofuncionalizacin del chip con BSA


Activacin de grupos carboxlicos de BSA con EDC:NHS

Optimizacin de variables cinticas: flujo, volumen de


inyeccin...

Imagen Biacore X. www.biacore.com Imagen Estructura BSA. Autor: K.A.Majorek,P.J.Porebski,M.Chruszcz,S.C. Almo,W. Minor,
New York Structural Genomics Research Consortium (NYSGRC)

www.azti.es 11/24/2014 11
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
ACTIVIDADES FUTURAS

Futuros pasos
Incorporacin de aptmeros a tiras de flujo laminar

Deteccin mediante nanopartculas de oro: en tira o en solucin

Funcionalizacin de chip SPR cubierto con estreptavidina con


aptmero marcado con biotina

Imagen: Liu J (2006). A Simple and Sensitive Dipstick Test in Serum Based on Lateral Flow Separation of Aptamer-Linked Nanostructures. Angew. Chem. Int. Ed. 45:7955-7959.

www.azti.es 11/24/2014 12
www.azti.es | www.alimentatec.com | www.itsasnet.com
T. +34 94 657 40 00

Txatxarramendi ugartea z/g Herrera Kaia, Portualdea z/g Astondo Bidea, Edificio 609
48395 Sukarrieta, Bizkaia 20110 Pasaia, Gipuzkoa Parque Tecnolgico de Bizkaia
48160 Derio, Bizkaia

13