INMUNOLOGA APLICADA

Tema 14: Estudios funcionales de clulas fagocticas. Tcnicas de evaluacin de

la actividad del complemento y estudio de la serie mieloide

Ensayos para el estudio de la serie mieloide

Tcnicas analticas de aplicabilidad muy limitada (proporcionan informacin en

situaciones clnicas infrecuentes), utilizadas para el diagnstico de las
inmunodeficiencias primarias (ID 1) y otros procesos. Dentro de las ID 1, los defectos
de la serie mieloide constituyen la minora (aprox. el 6%), por ello en el contexto clnico
estas tcnicas se utiliza slo en aquellos casos con clnica muy sugerente o
antecedentes familiares.

Clnicamente se caracterizan por una frecuencia anormalmente elevada de

infecciones cutaneo-mucosas que curan mal. Suele haber antecedentes familiares.

Durante la respuesta inflamatoria normal, los leucocitos se marginan hacia la

pared del vaso, se adhieren al endotelio, son activados por factores liberados en los
tejidos y se extravasan siguiendo un gradiente de factores quimiotcticos (C5a,
kalikreina, etc...), hasta alcanzar el foco de lesin y ejercer su funcin (destruir
microorganismos...). A nivel de cualquiera de estas fases puede producirse un defecto
y el fracaso funcional de los PMN. Este dficit es congnito en las ID 1, pero puede
ser secundario a frmacos, agentes txicos...

INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS DE LA SERIE MIELOIDE

ENFERMEDAD TECNICAS DE SCREENING CONFIRMACIN
- Produccin de O.2
Enfermedad granulomatosa -TEST DE NBT (Reduccin de - Cyt C)
crnica (CGD) - Cyt b552
- Niveles de Oxidasa
Sndrome de Chediak- -QUIMIOTAXIS
Higashi (CHS) -MICROSCOPA
-CITOMETRA DE FLUJO
Deficiencia de molculas de -Quimiotaxis -Western blot
adhesin (LAD) -Fagocitosis -RFLP
-Act. Bactericida
Deficiencia de grnulos -Quimiotaxis -Microscopa electrnica
especficos -Lactoferrina en PMN

En general los ensayos ms utilizados son:

- Generacin de O2 (NBT...)
- Quimiotaxis
- Fagocitosis
- Actividad bactericida

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 ENSAYOS DE QUIMIOTAXIS

Se utiliza la cmara de Boyden; dos compartimentos separados por una

membrana con poros de 3 a 5 . En un compartimento se sitan las clulas y en el
otro un estmulo quimiotctico. Tras incubar se tie el filtro y se ve si las clulas lo han
atravesado.

Est alterado el CHS, LAD y deficiencia de grnulos especficos. Adems se

altera por ciertos medicamentos.

ENSAYOS DE FAGOCITOSIS

Varias partculas diana; naturales y sintticas.

Es necesario opsonizar la diana, as que tambin se ha utilizado para
determinar la capacidad opsonizante del suero (alterada en las deficiencias de
protenas del complemento).

ENSAYOS DE METABOLISMO OXIDATIVO

Son la prueba diagnstica caracterstica de una de la inmunodeficiencias

primarias ms frecuentes, la enfermedad granulomatosa crnica (CGD); el ms
frecuente de los dficits congnitos de la serie mieloide.

Bsicamente determina la integridad de la OXIDASA DE LOS FAGOCITOS

(Phox) que cataliza el primer paso en la generacin de radicales de oxgeno tras la
degranulacin del PMN.

Los ensayos clsicos de metabolismo oxidativo son de dos tipos:

- Quimioluminiscencia: el estallido respiratorio se acompaa de la emisin de

fotones. En estos ensayos se determina la emisin de fotones por PMN tras recibir
un estmulo. La luz se mide mediante un contador (de centelleo) utilizando
sustancias amplificadoras como lucigenina o luminol.

- Test de reduccin de NBT (Nitro azul de tetrazolio) y similares: determina la

reduccin de un colorante (marcador) acoplada a las reacciones redox del estallido
respiratorio. Son tcnicas con muchas ventajas: son sensibles, muy especficas
(aunque pueden ser anormales por frmacos como la D-penicilamina). Estas
tcnicas son capaces de detectar a las portadoras de la enfermedad (imagen de
quimerismo en los PMN), cuando el defecto es de herencia ligada al cromosoma X
ya que las clulas de las hembras inactivan aleatoriamente uno de sus dos
cromosomas X. As las clulas que utilizan el cromosoma portador del gen alterado
no reducirn NBT, mientras que las que utilizan el cromosoma con el gen normal s
lo harn.

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 Tcnicas para el estudio del sistema del complemento.

Existen dos grupos de tcnicas para el estudio del complemento:

TCNICAS DE DETERMINACIN DE LOS COMPONENTES INTACTOS

Se trata de inmunoensayos en los que se cuantifica la cantidad de cada protena

en el suero. Generalmente se determinan los niveles de C3 y C4. La disminucin de
sus niveles se asocia a fenmenos de activacin, ya que se consumen por proteolisis.
As podemos utilizar esta determinacin para comprobar si una enfermedad en la que
se activa complemento (por ejemplo en un lupus eritematoso activo) est en fase de
actividad o por el contrario est bien controlada clnicamente.

Tcnicamente se suelen emplear inmunoensayos de sensibilidad baja o

intermedia, como inmunodifusin radial o nefelometra, ya que los niveles plasmticos
de estas protenas se encuentran en el rango de los g/ml.

La determinacin de componentes intactos de complemento tiene problemas

por la gran variabilidad de niveles normales, debida a la existencia de frecuentes
genes no funcionales en la poblacin (como en el caso de C4 codificado por dos
genes diferentes). Por otro lado los niveles pueden mantenerse altos a causa de que
se trata de protenas de fase aguda; se producen en grandes cantidades cuando hay
inflamacin. A pesar de esto, esta determinacin es til en la monitorizacin de las
enfermedades reumticas, siempre que se hagan determinaciones peridicas que
permitan ver si hay descensos de los niveles (que indicaran reactivacin de la
enfermedad).

ENSAYOS FUNCIONALES

Generalmente se utilizan los ensayos de complemento hemoltico total (CH). Como

su nombre indica se trata de determinar la integridad funcional de todo el sistema; bien
la va clsica o la alterna. Dado que la activacin es secuencial si alguno de los
componentes est ausente encontraremos que sistema no funciona. Es por lo tanto
el mejor mtodo para el estudio de las deficiencias congnitas de componentes del
complemento.

El ensayo ms popular para el estudio de la va clsica es el CH50. Consiste en

enfrentar hemates de carnero recubiertos de anticuerpos especficos a distintas
cantidades del suero problema e incubarlo para que se produzca la lisis de los
hemates por la va clsica. El % de hemates lisados se determina con el
espectrofotmetro estimando la hemoglobina libre. El resultado se expresa en
Unidades CH50/ml de suero, calculando la cantidad de suero capaz de lisar el 50% de
los hemates.

Existe una versin para el estudio de la va alterna en la que se utilizan

hemates de conejo, en lugar de carnero, porque son muy sensibles a la lisis por el
complemento humano sin necesidad de anticuerpos, aparentemente a casusa de una
deficiencia de acido silico en sus glicoprotenas de membrana. Salvo por este detalle
el fundamento es similar al CH50 y aqu el ensayo se hace especfico de la va alterna
aadiendo EGTA, que es un quelante de calcio, junto con un exceso de magnesio. La
ausencia de calcio hace que el complejo C1 (qrs) se disocie, con lo que la va clsica
no se puede iniciar. El exceso de magnesio favorece el ensamblaje de la convertasa
de la va alterna C3bBb.