PROTOCOLO PARA COPROCULTIVO

OBJETIVO

Identificar las posibles especies patgenas de microorganismos presentes en las

vas gastrointestinales (Heces) a travs del coprocultivo y de sus reacciones
bioqumicas.

FUNDAMENTO

La porcin inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente
amplia. Los microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios
(Bacteroides, bcilos gram positivos, Estreptococos), microorganismos entricos
gran negativos y Enterococcus faecalis. Cualquier intento por aislar bacterias
patgenas de las heces implica la separacin de las especies patgenas,
usualmente a travs del empleo de medios selectivos diferenciales y de cultivos
enriquecidos. Las principales causas de trastornos gastrointestinales agudos
incluyen a los virus, las toxinas (de: Estafilococos, Vibriones, Escherichia coli ),
bacilos entricos gran negativos invasores, los fermentadores lentos de la lactosa,
la Shigella, la Salmonella y la Campilobacterias. La importancia relativa de estos
grupos tiene grandes discrepancias en las distintas partes del mundo.

Las heces y los raspados rectales son los especimenes de que se dispone con
mayor facilidad. Debe anotarse, en el examen macrocpico la presencia de
sangre, moco o helmintos en la inspeccin inicial. Se suspenden los especmenes
en un caldo selectivo como el Caldo de Tetrationato y se cultivan sobre medios
ordinarios as como en medios selectivos diferenciales, por ejemplo Agar EMB,
Agar McConkey, Agar S-S, para permitir la separacin de los bacilos gran
negativos que no fermentan la lactosa de otras bacterias entricas comunes.

Los frotis teidos pueden revelar una prevalencia de leucocitos y de ciertos

microorganismos anormales como Cndida o estafilococos, pero no pueden utilizarse
para diferenciar las bacterias entricas patgenas de las de la flora normal, por lo que
deben realizarse otro tipo de pruebas para discriminar los tipos de bacterias presentes
en la muestra como son las pruebas bioqumicas.

Importancia clnica

El mdico, frente a un paciente que acude por presentar un cuadro diarreico, debe
decidir cul es la posible etiologa y qu tipo de tratamiento debe dar, por lo que recurre
al laboratorio a fin de obtener un diagnstico microbiolgico que permita realizar un
abordaje racional de la enfermedad.

Afecciones gastrointestinales

La ingestin de patgenos causa muchas afecciones, que pueden quedar delimitadas al

tracto gastrointestinal o comenzar en el intestino para diseminarse despus hacia otras
partes del organismo. Los trminos utilizados ms comnmente para describir las
enfermedades del tracto gastrointestinal son:

Diarrea: eliminacin fecal anormal caracterizada por heces frecuentes y/o

liquidas, habitualmente se debe a enfermedad del intestino delgado, e implica un
aumento de la perdida de lquidos y electrolitos.

Disentera: Trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal asociado

frecuentemente a presencia de sangre y pus en las heces y acompaado por sntomas
de dolor, fiebre y calambres; de modo habitual se debe a enfermedad del intestino
grueso.
 AGENTES ETIOLOGICOS DE DIVERSOS SINDROMES DIARREICOS

SINDROMES CARACTERISTICAS AGENTES ETIOLOGICOS.

Diarrea aguda liquida Mecanismo no inflamatorio, Rotavirus
medido por enterotoxinas. Escherichia coli
enterotoxigenica (ETEC)
E. coli enteropatognica (EPEC)
Salmonella spp.
Cryptosporidium.
Vibrio cholerae.
Clostridium perfringens.
Bacillus cereus.
Staphylococcus aureus.
Vibrio parahemoyiticus.
Giardia lamlbia
Virus Norkwalk.
Adenovirus 40, 41.
Campylobacter jejuni.
Acampylobacter coli.

Diarrea con sangre Mecanismo inflamatorio Shigella spp.

por invasin del epitelio Entamoeba histolytica.
intestinal, denominado E. coli enterohemorragica
usualmente como (EHEC)
disentera. Tambin hay E. coli neteroinvasiva (EIEC)
presencia de moco y Campylobacter jejuni
leucocitos en las heces. Salmonella (S. enteritidis, S.
choleraesuis, S.
parathypi)
Vibrio parahemolyticus.
 Yersinia enterocolitica.
Trichinellaspiralis.
Schistosoma japonicum
Balantidium coli.
Clostridium difficile
Diarrea crnica/ Mal Interferencia del agente Giardia lamblia.
absorcin. infeccioso con la actividad Ascaris lumbricoides.
normal del tracto Necatos americanus
gastrointestinal, pero sin un Strongyloides stercoralis
dao aparente en Trichuris trichura.
pacientes no Cryptosporidium
inmunodeficientes. Isopora belli
Enterocytozoon bieneusi
Fiebre enterica. Mecanismo invasivo con Salmonella typhi
penetracin a travs de la Yersinia enterocolitica
mucosa intestinal y Campylobavter fetus subsp.
diseminacin hematgena Fetus
a todo el organismo. Salmonella paratyphi A y B
Salmonella choleraesuis.
Yersinia pseudotuberculosis
Gastritis o atrofia Colonizacin del epitelio Helicobacter Pylory
gstrica. gstrico con ulceracin.

Qu es coprocultivo?

El coprocultivo o cultivo de heces

Es un estudio cuyo propsito es buscar bacterias patgenas que causan afecciones

gastrointestinales.
Mecanismos que causan diarrea o disentera

La fisiopatologa de los sndromes diarreicos o disentricos afecta 3 mecanismos

diferentes:

1. Toxinas (Entero toxinas)

Algunas bateras como el Vibrio cholerae y ciertas cepas de Escherichia coli despus
de adherirse a las epiteliales mucosas del intestino delgado producen entero toxinas
que activan la adenilsiclasa (AMP cclico). El AMP cclico es un nucletido cclico
presente en las membranas celulares que amplifica la accin de las hormonas y otros
compuestos biolgicamente activos en diversas clulas blanco. La actividad por entero
toxinas del AMP cclico en las clulas epiteliales mucosas del intestino delgado causa
un bloqueo de la absorcin de sodio lo que lleva a una diarrea acuosa hipertnica
profusa. No existe inflamacin mucosa y no se observan leucocitos en la materia fecal.

2. Invasin

Causado por invasin bacteriana directa de la mucosa intestinal que produce

inflamacin y leucocitosis. Especies de Shigella algunas cepas de E. coli muchas cepas
no S. typhi de Salmonella, Campylobacter jejuni invaden directamente la mucosa y
submucosa por produccin de entero toxinas que poseen mecanismos diferentes a los
del V. cholerae. Se halla gran nmero de neutrofilos segmentados, mucina y algunas
veces sangre en la materia fecal.

3. Penetracin de la pared celular

Comprende la penetracin profunda de la pared intestinal por parte de los

microorganismos como Salmonella typhi , Yersina enferilitica y Campylobacter fetusi.
Habitualmente esto da como resultado una leve inflamacin mucosa intestinal. Sin
embargo un aspecto puede ser una intensa inflamacin necrotizante en ganglios
linfticos mesentricos regionales.
Sintomatologa de las enfermedades gastrointestinales

Algunos sntomas que los pacientes con enfermedades infecciosas a menudo

experimentan son:

Fiebre: Es el aumento temporal en la temperatura del cuerpo en respuesta a alguna

enfermedad o padecimiento.

Un nio tiene fiebre cuando su temperatura est en o por encima de 37.2 C.

Un adulto probablemente tiene fiebre cuando la temperatura est por encima de
37.2 - 37.5 C, dependiendo de la hora del da.

Deshidratacin: Significa que el cuerpo no tiene tanta agua y lquidos como debiera.

Boca pegajosa o reseca.

Letargo o coma (con deshidratacin severa)
Ausencia o disminucin del gasto urinario; la orina aparece de color amarillo
oscuro.
Ausencia de lgrimas.
Ojos hundidos.
Fontanelas hundidas (el punto blando en la parte superior de la cabeza) en el
beb

Se clasifica en leve, moderada o severa sobre la base del porcentaje de lquido corporal
que se ha perdido o que no se ha repuesto. La deshidratacin severa es una situacin
de emergencia potencialmente mortal.

Letargo: Es una sensacin de falta de energa, de agotamiento o de cansancio. Que se

caracteriza por un estado de somnolencia profunda y prolongada. Torpeza,
insensibilidad, enajenamiento del nimo relacionado a dicho estado como
comportamientos asociados ya que nuestro organismo relaja todo nuestro cuerpo.
Toma de muestra

Para efectuar un coprocultivo pueden utilizarse las siguientes muestras:

Heces frescas
Hisopo rectal

Indicaciones para el paciente:

No es necesario el ayuno.
No se requiere dieta especial.
No estar bajo tratamiento con antibiticos o tener ms de 72 hrs de haber concluido
el tratamiento. En caso de no ser posible ninguna de estas dos opciones,
eespecificar en la solicitud del estudio que antibitico se estn tomando y cuantos
das lleva hacindolo.

Indicaciones para la toma y condiciones de la muestra

La toma de muestra se deber realizar lo antes posible luego del comienzo de la

enfermedad (preferiblemente dentro de los cuatro primeros das).
La recoleccin se efecta en un recipiente de boca ancha estril y con tapa de
rosca.
Las muestras de consistencia formada debern ser de 4-6 gramos (tamao de
una nuez), en caso de ser liquidas entre 5 y 1O ml.
Debe evitarse la contaminacin con orina.
Si no se pueden enviar las muestras de manera inmediata se pueden refrigerar
sin exceder 4 hrs. ya que a medida que la muestra fecal se enfra, la cada de
pH llega a ser suficiente para inhibir el crecimiento de muchas especies Shigella
y algunas de Salmonella.
Las muestras deben examinarse y cultivarse lo antes posible despus de la
recoleccin, si el cultivo se hace dentro de las dos horas despus de tomada la
 muestra, no se requiere medio de transporte, pasado este periodo se recomienda
usar el medio de transporte Cary & Blair, caldo selenito o Tioglicolato.
En general no se recomienda el uso de hisopados rectales pero pueden ser
necesarios para obtener muestras fecales de neonatos o adultos mayores.
El hisopo rectal debe insertarse exactamente ms all del esfnter rectal,
evitando el contacto directo con materia fecal en el recto. Estos hisopados deben
inocularse de inmediato en medios de cultivo o colocarse en un sistema de
transporte adecuado para impedir el desecamiento.
En pacientes en edad peditrica que usan paales las muestras deben ser
tomadas preferentemente de sus glteos y no del paal seleccionando las partes
mucosas, purulentas y/o sanguinolentas y colocarlas en frasco estril.

Examen macroscpico

Una vez llegadas las heces al laboratorio, es primordial efectuar un examen

macroscpico de las mismas, ya que esta puede proporcionarnos una orientacin. En
este se observa:

Consistencia (solidas, diarreicas, liquidas); este puede indicar los estados de

protozoarios presentes. Normalmente la deposicin debe de ser solida
Color; indica la abundancia y la calidad del flujo biliar. Normalmente y con dieta
mixta la deposicin es de color pardo o marrn, oscurecindose a medida que pasa
el tiempo expuesto al aire, las heces de las personas que sufren estreimiento son
ms oscuras y duras.
Presencia de sangre, pus, moco; puede envolver a todo o una parte del bolo fecal, o
bien, estar ntimamente mezclado con esta masa. La aparicin del moco suele ser
reconocible macroscpicamente.
Fragmentos de tejidos o restos alimenticios sin digerir
Olor
 REALIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA

ESCHERICHIA

E. coli es la especie de bacteria recuperada con mayor frecuencia en los laboratorios

clnicos y ha sido incriminada en enfermedades infecciosas que afectan casi cualquier
tejido y sistema orgnico humano.

Ciertas cepas de E. coli pueden producir enteritis o gastroenteritis por 6 mecanismos

distintos que conducen a 6 sndromes clnicos diferentes. Estas cepas incluyen

1. E. coli enterotoxigenica (ETEC),

2. E. coli enteropatogena (EPEC),
3. E. coli enteroinvasiva (EIEC),
4. E. coli enterohemorragica (EHEC),
5. E. coli enteroagregante(EAEC) y
6. E. coli difusamente adherente (DAEC).

Los aislados de EPEC, EAEC y DAEC, se caracterizan por sus distintos patrones de
adherencia a las clulas epiteliales in vitro.

Las cepas EPEC se unen a las clulas husped en un patrn denominado adherencia
local, en el cual se forman microcolonias sobre las superficies de las clulas.

Las cepas DAEC estn definidas por un patrn de adherencia difusa en el cual las
bacterias cubren difusamente la totalidad de la superficie celular.

En la mayora de los casos no es necesario identificar un patgeno especifico de E. coli

en un paciente particular. En casi todos los pacientes con gastroenteritis debido a E. coli
la diarrea se resuelve antes de buscar atencin mdica o luego del tratamiento con
antibiticos empricos administrados para otras diarreas bacterianas.

La Identificacin de especies patgenas de E. coli se realiza con antisueros.

 CARACTERSTICAS CLAVES DE E. COLI DIARREICOGNICA

Termino abreviatura Fenotipo patgeno Signos y sntomas

E. coli ETEC Elaboracin de Asociado con los sindromas
enterotoxigenica enterotoxinas clnicos diarrea del destete y
termolbiles y/o diarrea del viajero. Tienen
termoestables inicio brusco tpico, casi
secretoras que no siempre sin sangre, moco ni
daan el epitelio pus. La deshidratacin y
mucoso vmitos ocurren en algunos
casos.
e. coli EPEC Se adhieren a las Habitualmente ocurre en
enteropatgena clulas epiteliales lactantes, se caracteriza por
intestinales en fiebre, vmitos, diarrea acuosa
microcolonias con gran cantidad de moco y
localizadas que en algunas ocasiones se
producen lesiones observan leucocitos en las
histopatolgicas heces.
caractersticas
conocidas como
lesiones de fijacin y
desprendimiento
E. coli EIEC La mayora de las Se presenta principalmente
enteroinvasiva cepas son inmviles, como diarrea acuosa, se tiene
fermentadoras tardias necesidad imperiosa de
o no fermentadoras defecar, presencia de moco,
de la lactosa y sangre y muchos leucocitos en
anaerogenas. las heces.
E. coli EHEC Elaboracin de Diarrea sanguinolenta sin
enterohemorrgi toxinas shiga leucocitos, dolor abdominal
ca frecuente.
E.coli EAEC Se adhieren a las Diarrea con moco, fiebre leve y
enteroagregante clulas epiteliales y poco o nada de vomito.
producen una toxina
(EASTI)
E.coli DAEC Se adhieren a las Diarrea en la mayora de las
difusamente clulas epiteliales en veces sin presencia de sangre
adherente un patrn difuso ni leucocitos

Agar EMB [Eosina Azul de Metileno]

Fundamento

Por la combinacin de estos dos colorantes y los dos hidratos de carbono se pueden
distinguir algunos gneros.
Las bacterias lactosa-negativas y sacarosa negativas (Salmonella y Shigella) dan
colonias incoloras, mientras que las lactosa y/o sacarosa-positivas dan colonias
prpura-violeta negruzco con/sin un centro oscuro y quedan rodeadas de una zona
incolora.
Por el efecto de estos mismos colorantes tambin queda inhibido el crecimiento de la
microflora acompaante, sobre todo la Gram-positiva.

Este medio se siembra en la superficie del medio. Incubar entre 35 y 37C de

18 a 24 horas.

En la siguiente imagen se muestra el desarrollo se Escherichia coli

(Colonias Prpura-violeta con brillo verde metlico)

 Agar MacConkey:

Por la presencia de las sales biliares y el cristal violeta se inhibe el crecimiento de las
bacterias Gram-positivas. Por la presencia de la lactosa, las bacterias capaces de
fermentarla acidifican el medio, cambiando el color del rojo neutro y formando colonias
rojas o rosadas, pudiendo presentar un halo turbio correspondiente al precipitado biliar.
Las bacterias lactosa-negativas dan colonias incoloras.

Para aislar las colonias Sembrar la muestra por estra en la superficie de la placa
preenriquecida en MacConkey, Caldo. Incubar a 35-37 C de 18 a 72 horas.

En la siguiente imagen se muestra el desarrollo de E. coli

[Color Rosa-rojo (precip. biliar)]

SHIGELLA

Caractersticas microbiolgicas. Taxonoma.

Shigella es un bacilo Gram negativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae,

que se encuentra estrechamente relacionada con el gnero Escherichia, por sus
propiedades bioqumicas, serolgicas y por similitudes genticas.

Se caracteriza por no fermentar la lactosa, ser inmvil, no produce lisina

decarboxilasa y raramente produce gas a partir de hidratos de carbono. Su
identificacin se basa en caractersticas bioqumicas y antignicas. En base a ello
se describen cuatro especies (cuadro 1), todas ellas pueden causar disentera,
aunque con diferente gravedad.

AGAR SS

Fundamento

Por la presencia de las sales biliares, verde brillante y citrato se consigue la

inhibicin de las bacterias Gram-positivas. Por el mismo citrato conjuntamente
con el tiosulfato se frena notablemente el desarrollo de Coliformes y Proteus que
podran acabar cubriendo todo el cultivo. Las bacterias que no fermentan la
lactosa dan colonias incoloras, mientras que las que la fermentan hacen virar el
rojo neutro por la produccin de cido y quedan claramente diferenciadas.
Tambin se diferencian los microorganismos productores de Hidrgeno Sulfuro
que da un precipitado negro de Hierro(II) Sulfuro, que se observa en el centro de
la colonia. La peptona y el extracto de carne son aportes nutritivos suficientes para
estas especies patgenas, aunque algunas Shigellas muy exigentes se
desarrollen lentamente.
Las colonias sospechosas de Shigella crecidas en AgarSalmonella-Shigella son
transparentes, translcidas u opacas y suelen ser lisas. En este medio las colonias
de otros microorganismos que fermentan la lactosa (coliformes) son colonias
rojizas y en muchos casos mucoides.

AGAR SULFITO BISMUTO

Fundamento

El Bismuto Sulfito y el Verde Brillante inhiben conjuntamente a las bacterias Gram-

positivas y Coliformes, no restringiendo en absoluto el crecimiento de las
Salmonellas. A su vez por la presencia de azufre en el medio, los
microorganismos capaces de producir Hidrgeno Sulfuro precipitan Hierro(II)
Sulfuro, que da lugar a tonalidades marrones ms o menos oscuras e incluso
negras. Tambin se puede reducir el bismuto a metal dando un brillo metlico
alrededor de las colonias correspondientes. Es recomendable hacer un
enriquecimiento previo en caldo.

Sembrar por estra el material objeto de estudio o el procedente del caldo de

enriquecimiento en este caso con caldo tetrationato. Incubar a 352C de 24 a 48
horas.

Shigella flexneri ATCC 12022 Crecimiento (Nulo-escaso) Color ( Marrn)

 SALMONELLA

Nos enfocaremos a la identificacin de Salmonella y Shigella en los siguientes medios:

Agar McDonnell
Agar SS
Agar Vede Brillante
Agar EMB

Estos dos ltimos enriquecidos con caldo tetrationato para favorecer su crecimiento...

Casi todas las especies de Salmonella crecen bien en presencia de sales biliares. Las
especies de Salmonella y Shigella son mucho menos inhibidas, entran en una fase de
crecimiento logartmico y son ms fciles de aislar en las muestras fecales

AGAR McCONKEY:

Sembrar la muestra por estra cruzada.

Incubar a 37 24 horas.

Este agar contiene cristal violeta y sales biliares como inhibidores de organismos Gram
positivos.

Las colonias aisladas de bacterias que fermentan la lactosa son rosadas y pueden estar
rodeadas de una zona de precipitado de sales biliares el cual es debido a una cada en
el pH por la fermentacin de la Lactosa. Las colonias que no fermentan la lactosa (como
las de S. tipi, S. paratyphi y S. disentera) permanecen incoloras. (Lado derecho)

AGAR SS:

Medio altamente selectivo, la lactosa es el nico hidrato de carbono y el rojo neutro es

el indicador para la deteccin de acido.

Siembra por el mtodo de estra cruzada para obtener colonias aisladas.

Incubar las placas a 35-37 C durante 24 a 48 horas y examinar el crecimiento.

Las enteras bacterias pueden ser diferenciadas en base a su capacidad de fermentar la

lactosa. Las especies de Salmonella y Shigella son no fermentadoras de la lactosa y
forman colonias incoloras. Las especies de Salmonella que son productoras de
sulfuro de hidrgeno desarrollan colonias con centro obscuro.
 AGAR VERDE BRILLANTE:

Sembrar por el mtodo de estra cruzada.

Incubar las placas a 35C durante un lapso de 18 24 horas

En este medias las peptonas y el extracto de levadura proporcionan la fuente de

nitrgeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los carbohidratos
fermentables. El rojo de fenol es un indicador de las variaciones de pH y cambia el color
del medio a amarillo en presencia del cido derivado de la fermentacin de los
carbohidratos. El verde brillante acta como inhibidor de bacterias Gram positivas y de
la mayora de bacterias Gram negativas.

Las colonias tpicas de Salmonella aparecen como colonias de color rosa a blanco,
opacas rodeadas por el rojo brillante del medio. Los pocos microrganismos que
crecen en este medio que son fermentadores de lactosa o sacarosa, son fcilmente
identificables debido a la formacin de colonias amarillas- verdes rodeadas de una
intensa zona de color amarilla-verdosa.

Este medio no es adecuado para el aislamiento de S. Tipi ni de Shigella, sin embargo

algunas cepas de S. Tipi pueden desarrollar dando colonias rojas.

AGAR EMB:

Sembrar por el mtodo de estra cruzada.

Incubar las placas 35- 37C durante 18 a 24 horas.

El uso de la eosina y del azul de metileno permite la diferenciacin de las colonias

fermentadoras de lactosa.

Adems de diferenciar a Salmonella nos permitir identificar otros organismos lactosa

negativos de organismos doliformes.

Las peptonas proveen la fuente de nitrgeno, la eosina y el azul de metileno son

colorantes que se combinan para formar un precipitado a pH cido. Los colorantes
actan como inhibidores e indicadores. Los carbohidratos proporcionan la fuente de
energa, los fosfatos actan como buffer.

Las colonias de Salmonella y Shigella son translcidas, de color mbar o incoloras.

VIBRIO

Vibrio Cholerae

Es un bacilo Gram (-) curvo que posee un flagelo polar produce oxidasa y
fermenta glucosa.

Las cepas de esta bacteria a su vez se pueden clasificar de diversas maneras:

 Caractersticas de Vibrio cholerae
Mtodo de Asociados con No asociados con epidemias
clasificacin epidemias

Serogrupos 1 No 01 (serogrupos 02-0138)

Biotipos Clsico, El Tor Biotipos no aplicables a cepas no 01
Serotipos Inaba, ogawa,Hikojima Estos 3 serotipos no son aplicables a
cepas No 01
Toxina Producen la toxina del Habitualmente no producen la toxina de
Clera clera; a veces producen otras toxinas

Aislamiento en el Laboratorio Clinico

Ya que V. Cholerae necesita tener un medio especfico para poder crecer, es

necesario que antes de sembrar nuestros medios de cultivo se enriquezca nuestra
muestra.

Enriquecimiento de la muestra:

Agua peptonada Alcalina, pH 9.0, de 6-8 horas a 37 C

AGUA PEPTONADA ALCALINA

Uso: Para el enriquecimiento de Vibrio cholerae y otros Vibrios a partir de

diversas muestras.

Fundamento: El medio contiene peptona de gelatina, proporciona los nutrientes

para la supervivencia y crecimiento abundante. El cloruro de sodio mantiene el
equilibrio osmtico del medio. El pH elevado, favorece el desarrollo de
microorganismos que tienen la capacidad de crecer en este medio, inhibiendo a la
flora acompaante.

Sembrado:
 Medio de cultivo TCBS, mantener a 37C y revisar entre las 18-24 horas.
Seleccionar colonias de color amarillo para Vibrio Cholerae.

AGAR TCBS

Uso: Medio selectivo para el crecimiento de Vibrio cholerae, Vibrio

parahaemolitycus y otras especies patgenas a partir de diversas muestras.
Fundamento: El contenido de peptonas y extracto de levadura proporcionan al
medio la fuente de nutrientes necesarios para el desarrollo de los
microorganismos; el contenido de sales biliares y el colato de sodio inhiben el
desarrollo de Gram positivos sobre todo a los enterococos. La alta concentracin
de tiosulfato de sodio y citrato, as como el elevado pH, inhiben notablemente a las
enterobacterias. La sacarosa es el carbohidrato fermentable, utilizando como
indicador de la variacin de pH, el azul de bromotimol y el azul de timol, se
presenta un vire amarillo por la produccin de cido incluso en un medio altamente
alcalino como el Agar TCBS.

Vibrios no colericos:

o V. Parahemolyticus
o V. Mimicus
o V. Metschnikovil
o V. Hollisae
o V. Furnisae
o V. Fluviales

YERSINIA

La especie Yersinia corresponde a la familia Enterobacteriaceae, las bacterias se

ven pequeas y con forma cocobacilar.

Las colonias pueden ser pequeas y puntiformes en agar MacConkey, en

particular con ciertas cepas de Y. pestis y Y. pseudotuberculosis. Las colonias
tienden a ser puntiformes despus de 24 horas de incubacin en agar-sangre.

El crecimiento ptimo ocurre en temperaturas entre los 25 a 32 C. Esta familia de

bacterias son las responsables de gastroenteritis, diarrea y linfadenitis
mesentrica.

En la familia Yersinia se encuentran dos principales bacterias, la principal es la Y.

enterocolitica, y la segunda y no tan frecuente es la Y. pseudotuberculosis.

Y. enterocolitica:

Se siembra en MacConkey Agar.

Esta presenta sndromes caractersticos como la diarrea con sangre.

La mayora de las cepas de Y. enterocolitica creccen en agares entricos

selectivos y se presentan como pequeas colonias lactosa negativas en agar
McConkey y agar SS en 48 horas.

La Y. enterocolitica en particular puede recuperarse de muestras fecales que se

incuban a 25C. Ya que lo que se busca es obtener colonias aisladas, su mtodo
de siembra es por estra cruzada.
No se recomienda el uso de EMB porque Y. enterocoltica es sacarosa positiva y
aparase como un coliforme en este medio.

Y. enterocolitica en Agar MacConkey

CAMPILOBACTER

Morfologa y caractersticas fisiolgicas:

Se trata de bacterias gram negativas, pequeas (0.3-0.6 m de dimetro, 0.5-5 m

de ancho), no esporuladas, con una forma distintiva curva o en espiral, con
aspecto de vibrio, cuando se observan a partir de cultivos jvenes; con ms de 48
horas de incubacin o tras prolongada exposicin al aire adoptan una forma
cocoide.

Casi todas las especies son sensibles al oxgeno y slo pueden desarrollar en
condiciones de reduccin de oxgeno, habitualmente en atmsfera microaerfila(5-
10% de oxgeno).

Todas las especies son capaces de desarrollar a 37C, pero C.jejuni tiene una
temperatura ptima de crecimiento de 42C, por lo que es prctica habitual en el
laboratorio la incubacin a esta temperatura con el fin de facilitar el aislamiento
selectivo del principal patgeno humano del gnero.
Su velocidad de desarrollo es ms lenta que la de las bacterias de la flora normal
entrica, por lo que para su aislamiento a partir de materias fecales se requieren
medios de cultivo selectivos que inhiban esta flora.

Aislamiento e identificacin:

Para el aislamiento a partir de materias fecales, los medios de cultivo selectivos

ms comunes se basan en agar sangre y antibiticos; los ms usados son
Skirrow, Butzler y Campy-BAP.

Las colonias pueden apreciarse en las placas en 24-48 horas, aunque a veces
pueden ser necesarias 72-96 horas.

En este medio la bacteria Campylobacter jejuni crece presentando colonias grises

con posible propagacin.

Campylobacter jejuni en Medio Butzler

REALIZACIN DE PRUEBAS BIOQUMICAS

Prueba KIA

Sembramos en picadura dos tubos con el medio KIA e incubamos a 37C durante 18-24
horas. Observar. Con la prueba bioqumica del KIA hemos detectado la capacidad que
tienen las enterobactericeas para metabolizar o no la glucosa y/o lactosa, produccin
de gas y de cido sulfhdrico.

B-GALACTOSIDASA

Nos indica si la bacteria en su metabolismo fermenta la lactosa. Esta prueba la

realizaremos preparando una suspensin densa del microorganismo en un tubo
donde aadiremos una gota de tolueno y mezclaremos para despus aadir el disco de
ONPG. Incubaremos a 37C y leemos antes de 24h el resultado.

OXIDASA

Esta prueba nos indica si el microorganismo contiene la enzima citocromo oxidasa

descartando que fuera un microorganismo anaerobio estricto pudiendo ser aerobio o
anaerobio facultativo. Se procede a impregnar una tira reactiva con una muestra de la
colonia crecida en la placa de Agar Sangre y observar la reaccin que produce
cambiando de color.

CATALASA

Para esta prueba se toma una colonia del microorganismo joven y se coloca sobre un
portaobjetos donde aadiremos una gota de perxido de hidrgeno observando si
produce o no burbujas.

UREASA

Esta prueba se realiza sembrando el microorganismo en medio Christensen en tubo

inclinado por la superficie en zigzag. El resultado se observa despus de una
incubacin a 37C con un cambio de color del indicador.
IDENTIFICACION HASTA ESPECIE

La identificacin hasta especie se realiza a partir de pruebas bioqumicas.

Para las bacterias que se encuentran en el coprocultivo normalmente estas

pruebas se realizan con los siguientes medios de cultivo:
TSI
LIA
MIO
Citrato de sodio
Urea
Agar Hierro de Kligler

(La lectura e interpretacin de las mismas se explican en los anexos

correspondientes.)

IDENTIFICACION FINAL

[La deteccin directa de antgenos de rotavirus en materia fecal es

particularmente til porque el virus no puede recuperarse en cultivo].

En un laboratorio diagnostico, la combinacin de la historia clnica y el efecto

citoptico (CPE) produce informacin suficiente para identificar algunos virus o
bacterias.

La identificacin completa de los aislamientos, incluyendo la serotipificacin,

requiere la caracterizacin inmunolgica de los antgenos virales o bacterianos.

El mtodo tradicional para preparar antisueros ha sido inyectar el antgeno en un

animal (cordero, conejo, caballo, cuyo, cabras, etc). El animal genera entonces
anticuerpos policlonales a una variedad de determinantes (eptopes) del
antgeno.

Aunque los eptopes con los que reaccionan los reactivos monoclonales estn
estrechamente definidos, puede haber reacciones cruzadas si el eptope es
compartido por otros antgenos. Si los reactivos monoclonales estn
estrechamente definidos, pueden no detectar todos los aislamientos.

La identificacin de un aislamiento viral o bacteriano desconocido se lleva a cabo

mediante el anlisis del grado en el cual los antisueros de reactividad conocida
previenen la infeccin viral o bacteriana de las clulas de cultivos celulares,
huevos o animales.
Para caracterizar un aislamiento viral o bacteriano se utiliza un suero de
referencia conocida.

Tipos de reacciones inmunolgicas:

PRIMARIAS: Interaccin directa entre antgeno y anticuerpo.

SECUNDARIAS: Hay reacciones observables, como precipitacin, aglutinacin o
fijacin del complemento.
TERCIARIAS: se refieren a ciertos efectos biolgicos como opsonizacion,
fagositosis y quimiotaxis.

Se dispone de varias tcnicas de laboratorio para medir cada uno de los 3 tipos
de interacciones inmunolgicas.

Los antisueros se inyectan a los animales para que estos se pongan en

contacto con las bacterias y se generen anticuerpos (especficos para las
bacterias que se inocularon en los animales). Posteriormente estos anticuerpos se
extraen de la sangre de los animales para ser utilizadas en la identificacin de
bacterias aisladas de muestras biologas. Cuando hay formacin de precipitados
da positivo a la bacteria en particular.

En el caso de E.coli hay 6 antisueros diferentes.

En el caso de Shigella son 4 (A,B,C y D).
Para Salmonella hay 6 (A, B, C1,C2,D y E).
Para Vibrio cholerae hay 1 (01)

ANTIBIOGRAMA

El antibiograma es aquel estudio que se le realiza a una cepa, siempre y cuando

sea identificada como patgena, para saber su sensibilidad a diversos
antibiticos, y as conocer con cual y que dosis se va a combatir a dicho
patgeno.

En coprocultivo ocuparemos el siguiente mtodo:

Mtodo de Bauer-Kirby

Consiste en realizar el antibiograma en una placa de medio Mueller Hinton, el cual

es un medio enriquecido, es decir en l crecen tanto Gram (-) como Gram(+)
donde por medio de estra masiva se sembrara la colonia o cepa a la cual se le
har el anlisis.
Una vez realizada la siembra se deja secar el medio e inmediatamente se colocan
sobre el medio, los Multidisco, los cuales son una serie de papeles filtro
impregnados con diferentes antibiticos.

Los medios se incuban a 37 C durante 24 horas de pues de ello es hora de leer

los resultados del antibiograma, lo cual se hace midiendo el dimetro del alo que
se forme alrededor de los papeles filtro con antibitico.

Dependiendo del tamao del alo se podr decir que la bacteria tal es resistente
para equis antibiticos.

Se hace el reporte correspondiente y se desechan los medios ocupados.

El antibiograma en coprocultivo, solo se realizara a los gneros de:

Escherichia
Salmonella
Shigella
Yersinia

RESULTADOS

EXAMEN MACROSCOPICO DIRECTO DE LA MUESTRA

Cantidad: 13.20
Color: marrn oscuro
Olor: fecaloideo
Consistencia: dura y consistente
Forma: cilndrica
Presencia de:
- moco: no
- sangre: no
- pus: no
- fragmento de carne: no
 - fragmento de fcula: si
- trozos de mucosa epitelial: no
- falsas membranas: no

OBSERVACIN MICROSCOPIO EN FRESCO Y CON LUGOL

En fresco: Morfolgicamente se observan microorganismos Bacilos.

Lugol: Se observa almidn tiido de un suave color lilceo. No se observan
parsitos.

EXAMEN MORFOLGICO DEL CRECIMIENTO DE LAS COLONIAS

CULTIVADAS MACROSCPICAMENTE Y AL MICROSCOPIO

1. Agar sangre: Colonias redondas, borde entero, circular, color blanquecino.

2. Christensen: Colonias redondas, circular, convexa.
3. Kia: Se observa produccin de cido en todo el tubo, burbujas, agrietamiento
e incluso desplazamiento del medio.
4. McConkey: Colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la
Lactosa y en caso de que fueran colonias sin color sera el caso contario.
5. Hecktoen: No creci nada en este medio en 24 horas puede ser debido a un
periodo de incubacin insuficiente o a la siembra con inoculo muy diluido.

TINCIONES

Con la tincin de Gram detectamos el tipo de bacteria que es, gracias a la

diferenciacin de su morfologa.

OBSERVACIN MORFOLGICA

AZUL DE METILENO

AGAR SANGRE : Se observan diferentes agrupaciones de cocos: cocos,

diplococos, ttrada, estreptococos, estafilococos.
 McCONKEY : Se observa agrupaciones de bacilos teidos de azul por el
azul de metileno.
CHRISTENSEIN: Se observan agrupaciones de cocobacilos teidos de
azul por el azul de metileno.

TINCION DE GRAM

CHRISTENSEIN: Se observan agrupaciones de cocobacilos Gram +.

McCONKEY : Se observan agrupaciones de bacilos Gram , algunos
presentan puntos de color azul en la zona terminal del bacilo. Esto puede
ser debido a que se estuvieran dividiendo por lo que al romperse la capa
externa de peptidoglicano se pudo teir con el colorante de violeta de
genciana. Tambin pueden ser restos de este mismo colorante al realizar la
tincin.
AGAR SANGRE : Se observan cocos gram negativos ( rosados) en su
mayora, pero tambin se pueden observan algunos color azul del colorante
violeta de genciana.

CUADROS DE RESULTADOS

MEDIO DE TINCION DE GRAM TINCION DE

MICROORGANISMO CULTIVO AZUL DE
METILENO
Escherichia coli Mac conkey Bacilos Gram - Bacilos
Peptostreptococcus Agar sangre Cocos, diplococos y Cocos, diplococos
estreptococos gram + y estreptococos
Peptococcus Agar sangre Cocos y racimos Cocos y racimos
Gram +
Streptococcus Agar sangre Coco Gram + cocos
faecalis
MICROORGANISMO PRUEBAS BIOQUIMICAS
B- OXIDASA KIA CATALASA UREASA
GALACTOSIDASA
Peptostreptococcus - -
Peptococcus - -
Streptococcus - -
faecalis
Escherichia coli + - A/ A, + -
G
 CONCLUSIN

Hemos llegado a la conclusin que en la muestra de heces no se ha encontrado

ningn microorganismo patgeno ya que por las pruebas realizadas hemos
deducido que los microorganismos existentes en la muestra son los habituales que
presenta la flora intestinal, como es Escherichia coli , ya que creci en el medio
McConkey con la morfologa caracterstica de la E. coli,( color rosado) basndonos
tambin en la tincin de Gram donde aparecen en forma de Bacilos Gram y que
da positivo en la prueba de la B-galactosidasa, adems de dar negativo en la
prueba de la oxidasa, lo que nos hace sospechar que es una enterobacteria dado
que estas siempre son oxidasa negativa.

Las especies de Peptostreptococcus son organismos comensales en humanos,

que viven predominantemente en la boca, la piel, el aparato digestivo y el excretor,
y componen una parte de la flora intestinal bacteriana. Sospechamos que est
presente en la muestra ya que creci como es normal en el Agar Sangre con
colonias blanquecinas y siendo una de las colonias que observamos con la tincin
de Gram tenan forma cocoide en cadenas cortas, en parejas o individualmente
siendo Gram +.

El Peptococcus, al igual que el peptostreptococcus crece de la misma manera en

agar sangre y al tomar una colonia diferente observamos que la distribucin
morfolgica era diferente ya que aparecan formando racimos o solos.
Y por ltimo creemos que tambin se encuentra entre los microorganismos
el Enterococcus faecalis, ya que tambin creci en el Agar Sangre y en la tincin
de gram fueron cocos gram positivos distribuidos en cadenas o pares.
 BIBLIOGRAFIA

http://www.ictsl.net/downloads/microbiologia.pdf

http://www.scielo.cl/pdf/rci/v21s1/art07.pdf

http://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20EOSINA%20Y%20AZUL%20DE%2
0METILENO.pdf

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003090.htm

http://www.umm.edu/esp_ency/article/000982.htm#ixzz1uEoVsQwc

http://www.carloshaya.net/laboratorio/media/tomademuestras.pdf

http://www.scielo.org.pe/pdf/rins/v28n1/a18v28n1.pdf

http://es.scribd.com/doc/6617222/Manual-de-Bacteriologia

http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap1.htm

http://www.chopo.com.mx/promociones/detalle/coprocultivo/distrito-federal

http://salud.ccm.net/faq/5994-para-que-sirve-el-coprocultivo-o-examen-
bacteriologico-de-las-heces