AISLAMIENTO DE LEVADURAS

1.-GENERALIDADES

1.1.-Introduccion.-

Atravez de este trabajo informamos sobre el aislamiento de cepas puras de

levaduras ya que en Bolivia en nuestro medio no existe algún expendio donde
fabriquen o que vendan levaduras, no existe comercialización de levaduras
para la fabricación de bebidas.

En el presente trabajo de investigación se tiene una propuesta donde se

propone el aislamiento de levaduras puras procedentes de un mosto de uva y
cascaras de limón atravez de procesos morfológicos donde creamos un banco
de levaduras puras con cepas totalmente identificables a su vez se utilizó agar
malta porque está destinado para trabajar con levaduras.

Las levaduras que habitan en los frutos, gracias a los múltiples mecanismos de
adaptación que han desarrollado frente a condiciones adversas, pueden ser
utilizadas en varios campos industriales y biotecnológicos

1.2.-Antecedentes.-

12.1.- Aislamiento, selección e identificación de

levaduras Saccharomyces spp. Nativas de viñedos en Querétaro, México.

Querétaro es el segundo estado productor de vinos en México, pero la

comercialización es difícil por la falta de calidad y tipicidad. Una alternativa es
tener levaduras nativas seleccionadas para aumentar el potencial de los
mostos y dar originalidad a los vinos. El objetivo del presente estudio fue el
aislamiento, selección con base en su potencial enológico e identificación de
levaduras Saccharomyes nativas de viñedos queretanos. Las cepas fueron
aisladas en 2012 en el laboratorio de fermentaciones y fisiología de frutos de la
Universidad Autónoma de Querétaro, México, durante la fermentación
espontánea de mostos de uvas maduras recolectadas aleatoriamente dentro de
tres viñedos queretanos, diferenciando las Saccharomyces en medio lisina. Los
vinos producidos con estas levaduras fueron secos (<3.8 g glucosa L -1), con
acidez total de 6.5 a 8.4 g L-1 ácido tartárico, acidez volátil de 0.13 a 0.26 g L-
1
ácido acético, y pH de 3.56 a 3.74, sin diferencias entre levaduras (Tukey, p
>0.05). La nativa N05 y K1 (testigo) obtuvieron los mayores grados alcohólicos
(15.2 y 14.9 %), eficiencia de conversión (16.31 y 16.67 g glucosa °alcohólico -
1
), y eficiencia fermentativa (90.8 y 89.1 %). La cepa SR26 contrastó con OB10
en la velocidad de fermentación (19.2 vs. 18.6 g CO 2 48 h-1) y SR19 y SR26
obtuvieron las menores producciones de SO2 (25.6 y 36.8 mg L-1). El presente
estudio reveló el potencial de levaduras nativas del estado de Querétaro para
utilizar en la producción de vinos regionales.
1.2.2.- Aislamiento, selección e identificación de levaduras
Saccharomyces cerevisiae nativas de Alboraya para la producción de
cerveza.

En los últimos años el mercado de la cerveza está experimentando nuevas

tendencias de consumo. El consumidor demanda una mayor variedad de
cervezas en cuanto a sabor y aroma. En la fabricación de cerveza es esencial
la levadura empleada, puesto que, es la responsable de la mayor parte de los
compuestos aromáticos presentes una vez finalizada la fermentación del
mosto. Por esto, tratamos de aislar e identificar levaduras nativas del municipio
de Alboraya, concretamente Saccharomyces cerevisiae, la más conocida en la
elaboración de cerveza. Esto nos permitiría obtener un perfil aromático
particular para producir cerveza. Para ello, se realizó un muestreo en el campo,
más tarde, se aislaron las diferentes cepas y se seleccionaron mediante el
fenotipo: ensayos de crecimiento en medio líquido y en placa, en medios
restrictivos y no restrictivos para la especie en cuestión. Posteriormente, se
procedió a la caracterización molecular de aquellas cepas putativas mediante
análisis filogenéticos y de “Restriction fragment length polymorphism” (RFLP)
de secuencias de regiones ribosómicas generadas por “Polymerase chain
reaction” (PCR). Mediante esta metodología identificamos S. cerevisiae
asociada a suelos de higuera.

1.2.3.- Evaluación de la persistencia de levaduras Saccharomyces en

viñedos de la zona alta del Río Mendoza”

La elaboración de vino constituye por excelencia dos actividades de amplia

tradición y gran impacto económico en Mendoza. Dos aspectos fundamentales
para potenciar el desarrollo de dichas actividades son el agregado de valor a la
producción de vinos y la diversificación a nivel vitivinícola. Ambas perspectivas
pueden abordarse desde una estrategia microbiológica, considerando que las
levaduras presentes en el mosto son las principales responsables de la
fermentación alcohólica del vino. En todas las regiones vitivinícolas del mundo
se colectan, estudian, conservan y aprovechan las levaduras asociadas al
ecosistema del viñedo. El conocimiento y la comprensión de los fenómenos
que determinan la presencia de distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae
en los viñedos de una región vitícola, ha sido posible gracias al uso de técnicas
específicas de biología molecular, y constituye una herramienta imprescindible
para el abordaje de los desafíos actuales que plantea la producción de vinos a
nivel mundial. La Zona Alta del Río Mendoza constituye la principal región
vitícola donde se cultiva la variedad Malbec, vino emblemático de Argentina. En
el presente estudio se propuso abordar la evaluación de la persistencia de S.
cerevisiae en un viñedo de variedad Malbec de esta región, a fin de estudiar
sus reservorios a lo largo del ciclo fenológico de la vid y contribuir a mantener
la biodiversidad propia de esta región. Para ello, se evaluaron las poblaciones
S. cerevisiae presentes en uvas, suelo, corteza, yemas, hojas y flores en
diferentes etapas desde cosecha hasta la floración. Se pudo verificar la
presencia de diferentes cepas de S. cerevisiae en el ecosistema del viñedo que
presentaron un carácter dinámico en el período evaluado. La información
generada integrará la colección de recursos genéticos que reflejan la
biodiversidad de nuestra región y que permitirá abordar a futuro el desarrollo de
inóculos que contribuyan a la diversificación de vinos argentinos.

1.3.-Justificacion.-
Atravez de este trabajo se logró generar un banco de cepas puras para la
comercialización de cerveza y vino ya que en Bolivia no existe lugares donde
se pueda comercializar levaduras, a partir de este problema se trató de aislar
levaduras con el objetivo de tener sepas puras y tener más conocimiento de los
distintos procedimientos que conlleva esta investigación.

1.4. Objetivos.-

1.4.1 Objetivo general

Aislar cepas puras con el objetivo de producir un banco de levaduras, donde se

prepara un mosto de uva con cascaras de limón y con la elaboración de agar
malta con el objetivo de aislar sepas puras de levaduras para el beneficio de la
elaboración de bebidas.

1.4.2 Objetivos específicos

 Preparación del mosto

 Preparación de medios de cultivo agar malta
 Aislamiento levaduras desde la flora epifitica
 Purificación de levaduras
 mantenimiento y conservación de las sepas

Objetivos específicos Acciones

O.E1.-Preparar el mosto
1. Estrujar la uva
2. Filtrar con una tela o media
naylon
3. Dejar hervir por unos 2-3
minutos hasta que llegue a 80
°C
4. Dejar que enfríe el mosto
estéril
5. Una vez frío añadimos pedazos
de cáscara de limón y
manzana
6. Taparlo con algodón
7. Dejarlo por dos días
O.E.2.-Preparar medio de cultivo agar 1. Verter la malta en el vaso
malta precipitado
2. Con la varilla mover hasta que
baje la espuma
3. Una vez que la malta este sin
espuma poner a la hornilla
4. Dejar hervir unos 10 minutos
5. Poner 20 ml de agar a cada
caja Petri
6. Envolver cada caja con papel
madera
7. Poner en el autoclave y dejar
que enfrié cuando salga
8. Poner en la parte baja del
refrigerador hasta sembrar

O.E.3.-Aislamiento levaduras 1. Elegimos 25 colonias

2. Preparamos el mosto para
viales
3. Colocamos las colonias en los
viales

O.E4.- purificación de levaduras 1. Preparamos las placas para

observar en el microscopio
2. Observamos e identificamos
las levaduras
3. Realizamos las resiembras
4. Separamos las levaduras puras

O.E.5.-conservacion de las sepas La conservación de hace en el

pico de flauta:
 Poner 1 ml de agua hervida fría
en un tubo
 Tomar la cepa de levadura
pura con la ayuda del asa de
argolla estéril
 Depositarlo en el tubo con el
agua hervida fría y mezclar
muy bien
 Tomar un tubo con agar
desinfectar el algodón al abrir
 Con ayuda de la pipeta
depositar una gota en el fondo
del tubo y con ayuda del asa
estéril de forma descendente
en zigzag subir hasta la parte
 superior
 Una vez sembrado volvemos a
desinfectar el algodón y
tapamos el tubo
 Desinfectar nuevamente el asa
al finalizar realizar el sembrado

2.-MARCO TEORICO.-

2.1.- ¿Qué es la levadura?

Se llama levadura al organismo vivo, generalmente un hongo, que produce

enzimas, los cuales provocan cambios bioquímicos importantes en productos
orgánicos naturales: fermentación. Son capaces de transformar los azúcares
en alcohol y CO2. Se multiplican por gemación o estrangulamiento cada 3
horas.

Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscópicos

unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la
fermentación de hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias.

Aunque en algunos textos de botánica se considera que las levaduras

"verdaderas" pertenecen sólo a la clase Ascomycota, desde una perspectiva
microbiológica se ha denominado levadura a todos los hongos con predominio
de una fase unicelular en su ciclo de vida, incluyendo a los hongos
basidiomicetes.

A veces suelen estar unidos entre sí formando cadenas. Producen enzimas

capaces de descomponer diversos sustratos, principalmente los azúcares.

Una de las levaduras más conocidas es la especie (Saccharomyces

cerevisiae). Esta levadura tiene la facultad de crecer en forma anaerobia
realizando fermentación alcohólica. Por esta razón se emplea en muchos
procesos de fermentación industrial, de forma similar a la levadura química, por
ejemplo en la producción de cerveza, vino, hidromiel, pan, producción de
antibióticos, etc...

Las levaduras se reproducen asexualmente por gemación o brotación y

sexualmente mediante ascosporas o basidioesporas. Durante la reproducción
asexual, una nueva yema surge de la levadura padre cuando se dan las
condiciones adecuadas, tras lo cual la yema se separa del padre al alcanzar un
tamaño adulto.

En condiciones de escasez de nutrientes las levaduras que son capaces de

reproducirse sexualmente formarán ascosporas. Las levaduras que no son
capaces de recorrer el ciclo sexual completo se clasifican dentro del género
Candida.

Se llama levadura o fermento a un conjunto diverso de hongos, por lo general

microscópicos y unicelulares, capaces de iniciar los procesos de
descomposición (fermentación) de distintas sustancias orgánicas,
particularmente los azúcares y los carbohidratos, obteniendo como
subproducto otras sustancias específicas (como alcoholes).

Las levaduras son de diverso tipo y existen en diversos hábitats,

reproduciéndose tanto sexual (mediante esporas) como asexualmente (por
gemación o brotación). En un medio nutricionalmente favorable, se produce
una nueva camada de ellas en tan sólo 90 minutos, ya que son organismos
simples y eficaces.

La fermentación es el proceso que este tipo de hongos lleva a cabo para

obtener energía, y por lo general puede ser de dos tipos distintos, de acuerdo
al subproducto obtenido:

2.1.1.- Fermentación alcohólica. Se trata de un proceso de descomposición

anaeróbico (en ausencia de oxígeno) que convierte carbohidratos glúcidos
(glucosa, sacarosa, fructosa, etc.) en alcohol (etanol), junto con dióxido de
carbono (CO2) y dos moléculas de ATP (Adenosíntrifosfato), según la siguiente
ecuación química:

C6H12O6 + 2Pi + 2 ADP + 2 NAD → 2CH3-CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + 2 NAD

2.1.2. Fermentación láctica. Este tipo de fermentación es llevado a cabo por

algunos organismos (protozoos) y tejidos animales, también en ausencia de
oxígeno (a veces como proceso de obtención de energía de emergencia en el
tejido muscular) y se produce la descomposición de la glucosa (glucólisis) y
reducción del piruvato, obteniendo así menor cantidad de energía
y subproduciendo lactato, como sustancia de desecho. Todo se da mediante
las siguientes fórmulas químicas:

C6H12O6 + 2Pi + 2 ADP + 2 NAD → 2 C3H4O3 (piruvato) + 2 ATP + 2NADH

+ 2H+ + 2H2O

2 C3H4O3 + 2NADH + 2H+ → 2 C3H6O3 (lactato) + 2NAD

La levadura se alimenta de proteínas, sales minerales y principalmente

sacarosa y maltosa, este último azúcar contenido naturalmente en la harina. A
los azucares los descompone transformándolos en alcohol, anhídrido carbónico
(co2) “gas” y otras sustancias que hacen a los sabores y aromas. A este
proceso se lo denomina fermentación y se facilita por la acción de las enzimas
que poseen las levaduras. Cuanto más fuerte y sana sean las levaduras
mayores será su capacidad enzimática. Como todo ser vivo, necesita
temperaturas óptimas para su desarrollo y reproducción, siendo el rango
óptimo de 28ºC a 35ºC grados. Se conserva en la heladera a 5ºC, durante
 aproximadamente 7 días, mientras que si la sometemos a más de 40ºC se
alterará y pasando los 58ºC morirá.

2.2.- Composición de la levadura fresca

Agua 70,0%
Materias nitrogenadas 13,5%
Materias celulósicas 1,5%
Azúcar 12,0%
Materias minerales 2,0%
Vitaminas B,PP,E

2.3.- características de una buena levadura

Medios
apreciación
Cualidades Defectos

color debe ser crema claro o no debe ser nunca rojizo

blanco

olor debe ser inodora no debe desprender olor

desagradable o acético

gusto debe tener sabor no debe tener demasiado gusto ni de

agradable ácido

textura consistencia firme no debe ser en ningún caso blanda ni

plástica pegajosa

utilización debe diluirse sin formar debe desmigarse fácilmente entre los
grumos dedos sin pegarse

2.4.-Caracteristicas generales.-

Las levaduras se clasifican en base a sus caracteres morfológicos, aunque

para algunos microbiólogos, sus propiedades fisiológicas tienen mayor
importancia.

La mayoría de las levaduras son hongos unicelulares sencillos microscópicos,

la mayoría se reproducen asexualmente por gemación, y otras especies lo
hacen por fisión múltiple. Las levaduras que pueden reproducirse sexualmente
se conocen como “verdaderas”, este proceso implica la formación de
ascosporas, sirviendo la propia levadura como asca, de aquí que ellas se
clasifican como Ascomicetos; por el contrario las “falsas” que no producen
ascosporas, pertenecen a los hongos imperfectos.

2.5.-.-Características morfológicas.-

Los caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su

observación microscópica. Además, los criterios morfológicos se basan en el
modo de reproducción vegetativa de la morfología celular, de la formación
de Pseudomicelio y de Micelio. La forma de la levadura puede ser desde
esférica a ovoide, en forma de limón, piriforme, cilíndrica, triangular, e incluso
alargada formando un verdadero micelio o un falso micelio.

También se diferencian en cuanto a su tamaño, miden de 1-10 um ancho por 2-

3 um de longitud. Son partes observables de su estructura, la pared celular, el
citoplasma, las vacuolas, los glóbulos de grasa, y los gránulos, los cuales
pueden ser metacromáticos, de albúmina o de almidón. Para poder observar el
núcleo es preciso utilizar tinciones especiales.

La estructura celular es de tipo eucariótico, pero sin sistema fotosintético. La

pared rígida, se caracteriza por la presencia, en su composición, de dos
polisacáridos: manano y glucano. Algunas levaduras producen una cápsula
constituida por fosfomanos. El núcleo está rodeado de una membrana que
persiste durante la división celular. El número de cromosomas es variable de
unas a otras. Las levaduras en ningún caso son móviles. 

2.5.1.-Estructura de las levaduras

La levadura es un hongo unicelular, microscópico de forma redonda u ovalada,

denominado técnicamente: Saccharomyces cervisiae.
La estructura de este hongo se compone de la siguiente manera:
 Pared celular: permite el paso de aire, líquidos y alimentos.
 Protoplasma: es el cuerpo propiamente dicho, contiene grasas,
proteínas e hidratos de carbono con sus sales y vitaminas.
 Núcleo: al dividirse da lugar a la fermentación de nuevas células.
 Vacuola: Cavidad con sustancias útiles para la célula.
En condiciones normales, se produce emitiendo un “brote” llamado yema
que va creciendo hasta formar una nueva célula, cada célula se
reproduce a sí misma en 2 horas

2.6.- Propiedades fisiológicas.-

Las distintas especies de levaduras pueden ser muy diferentes en cuanto a su

fisiología, la mayoría necesitan más humedad para crecer y desarrollarse. El
intervalo de temperatura de crecimiento de las levaduras es en general,
parecido al de los hongos, con una temperatura óptima en torno a los 25 a
30ºC y una temperatura máxima en torno a los 35 a 47ºC.
Una reacción ácida del medio, próxima a un pH de 4 a 4.5, estimula el
crecimiento de la mayoría de las levaduras, mientras que en medios básicos,
no crecen bien a no ser que se hayan adaptado a los mismos, crecen mejor en
aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de crecer,
aunque lentamente, en anaerobiosis.

En general, los azúcares son la fuente energética más apropiada para las
levaduras, aunque en las oxidativas, por ejemplo, las formadoras de película
oxidan los ácidos orgánicos y el alcohol, y también contribuyen en la
producción de los sabores o “bouquet” de los vinos.

2.7.-Conservación de la levadura

Las son importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos

de carbono, produciendo distintas sustancias. Son abundantes en la
naturaleza, y se encuentran en el suelo y sobre las plantas. La mayoría de las
levaduras que se cultivan pertenecen al género Saccharomyces. La levadura
es un organismo vivo y que es preciso tener cuidado para que conserve sus
cualidades. Sufre tanto con el frío como con el calor. Por debajo de 3°C se
aletarga y por encima de 50ºC muere. Es pues recomendable guardar la
levadura en refrigerador a una temperatura ideal entre 4 y 6°C. A esta
temperatura la levadura se conservará muchas semanas, aunque se aconseja
utilizarla durante los diez días siguientes a su adquisición. Es también
importante saber que la levadura se debilita en contacto con agentes
microbianos (mohos...) y que el cloruro de sodio es letal para la levadura. No
debe ponerse jamás sal sobre la levadura. 
2.8.-Reproduccion.-

La mayoría de las levaduras se reproducen por gemación multicelular o por

gemación polar, que es el mecanismo en el cual una porción del protoplasma
sobresale de la pared de la célula y forma una protuberancia, la cual aumenta
de tamaño y se desprende como una nueva célula de levadura.

En las levaduras que forman película, la yema crece a partir de una

prolongación tubuliforme de la célula madre. El material nuclear replicado se
reparte entre la célula madre y la célula hija.
La reproducción sexual de las levaduras verdaderas (Ascomycotina) da lugar a
la producción de ascosporas, desempeñando la función de asca, la propia
célula de la levadura. En la mayoría de las especies de levaduras verdaderas,
la formación de ascosporas tiene lugar tras la conjugación de dos células,
aunque algunas pueden producir ascosporas sin que exista conjugación previa,
teniendo lugar después la conjugación de las ascosporas.
Tanto el número y el aspecto de esporas por asca, son típicos de cada especie
de levadura, y se pueden diferenciar por su color, rugosidad o lisura de su
pared y por su forma (redondeada, ovalada, arriñonada, falciforme, forma de
saturno o de sombrero, hemisférica, angular). Las células de algunas levaduras
se transforman en clamidosporas mediante la formación de una gruesa pared
alrededor de la célula, tal como ocurre, por ejemplo, en las especies de los
géneros Candida, Rhodotorula y Cryptococcus

2.9.- Características del cultivo

En la mayoría de los casos, el crecimiento en masa de las levaduras no resulta

apropiado para su identificación. En los cultivos con agar, es difícil diferenciar
las colonias de levaduras de las colonias bacterianas, por lo que la observación
microscópica es la única forma segura que existe para poderlas diferenciar.

La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas,

y es posible que tengan aspecto harinoso. La mayoría de las colonias son
blanquecinas, algunas tienen un color crema o rosado. Algunas colonias
cambian poco de aspecto cuando envejecen, otras se secan y se vuelven
rugosas.

Las levaduras son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es

a la vez de ambos tipos. En la superficie de un líquido, las levaduras oxidativas
pueden crecer en forma de película, de velo, o de espuma, y por ello se
denominan levaduras formadoras de película. Las levaduras fermentativas
suelen crecer en toda la masa del líquido y producen dióxido de carbono

2.10.-Clasificacion e identificación.-

La clasificación de las levaduras es compleja, no obstante el desarrollo de

nuevas técnicas basadas en Biología Molecular, ha permitido separar o
reagrupar las especies. Las levaduras pertenecen al Reino Fungi y dentro de él
a la división Eumicota que agrupa a los hongos verdaderos.

En esta división, las levaduras se incluyen en 2 de las 5 subdivisiones de los

Eumicetos, la Ascomycotina representada por las levaduras capaces de
producir ascosporas, llamadas por ello esporógenas, y la Deuteromycotina
representadas por las levaduras incapaces de formar esporas llamadas no
esporógenas. Los géneros de las levaduras esporógenas englobados todos
ellos en la familia Saccharomycetaceae, se distribuyen en 3 subfamilias. Los
géneros de las levaduras no esporógenas constituyen la familia
Cryptococcaceae. Además las levaduras pueden ser clasificadas por debajo de
los taxones género y especie, en subespecies y variedades, que a menudo
adquieren rango de especie tras nuevas revisiones taxonómicas, o varias
especies son unificadas en una sola como subespecies de la misma, con lo
que la clasificación se complica aún más y se incrementa el número de
sinonimias. Los principales criterios utilizados para la clasificación e
identificación de las levaduras son los siguientes:
1.- Producción de ascosporas.
2.- Aspecto de las células vegetativas: forma, tamaño, color, inclusiones.
3.- Forma de reproducción asexual.
4.- Producción de micelio.
5.- Forma de película en medio líquido.
6.- Color de la colonia.
8.- Propiedades fisiológicas: producción de ácido, actividad ureásica.
9.- Caracterización bioquímica - Fermentación de glucosa, galactosa, sacarosa,
maltosa, lactosa y rafinosa.

2.11.- Selección de levaduras.-

El estudio de la dinámica, cuantificación y composición de la microbiota

responsable de las fermentaciones espontáneas, ha mostrado diferencias tanto
cualitativas como cuantitativas, en las levaduras aisladas en una misma zona
vitivinícola e incluso dentro de los depósitos de una misma bodega. Las causas
de esta variabilidad pueden ser: cambios en las técnicas de
aislamiento, cambios en las condiciones climáticas, etc. Por tanto, la necesidad
de asegurar la fermentación alcohólica, así como la tipicidad y reproducibilidad
de los vinos, requiere cada vez más, el uso de cultivos iniciadores. Las
levaduras seleccionadas se han utilizado con excelentes resultados en muchos
países, obteniéndose productos finales de calidad más uniforme que los que se
producían con las fermentaciones espontáneas. Este último punto es el que
genera el debate acerca de la utilización o no de inóculos, ya que garantizan
repetitividad a expensas de perder algo de complejidad en el producto. A pesar
de que existen levaduras comerciales para realizar las fermentaciones, es más
efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona donde
se van a utilizar, lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya
que se cree que las levaduras que se encuentran en una microzona son:
específicas del área, totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la
zona y a la materia prima, es decir al mosto a fermentar, son responsables al
menos parcialmente, de las características únicas de los productos obtenidos.

Las características propias de la zona pueden ser por tanto, un aspecto

interesante a la hora de seleccionar una levadura, aunque hay muchos otros
que también se tienen que tomar en cuenta. La importancia de estos
parámetros puede ser relativa, dependiendo del producto para el cual quieren
ser utilizados. La selección de la cepa adecuada para cada tipo de
fermentación es una estrategia muy importante para garantizar por un lado una
fermentación correcta, así como para mejorar las características del producto
final, ya que las levaduras pueden producir compuestos que den un toque de
distinción al producto obtenido, tales como el glicerol, ésteres, alcoholes
superiores.

2.12.-Como aislar y almacenar levaduras con placas de agar.-

Cuando se realiza esta captura, muchas veces se obtienen varias cepas que
pueden ser usadas directamente en cerveza, pero a través del tiempo y su
reutilización es muy difícil lograr resultados consistentes, ya que unas cepas
van a replicarse más que otras en cada lote.

Para lograr resultados consistentes, y en general para determinar las

características de cada cepa y seleccionar las que mejor se desempeñen y
 provean los resultados más satisfactorios, es necesario aislarlas en un proceso
dispendioso e iterativo con placas de agar.

El agar (o agar-agar) es una especie de gelatina derivada de algas, que cuando

se mezcla con mosto en una placa petri facilita la separación de colonias de
levadura, especialmente cuando ésta se captura de forma empírica, sin equipo
ni cuarto esterilizado.

La separación de cepas puras de levadura permite tener más control sobre

estos microbios, y así tener más consistencia en diferentes lotes de cerveza
fermentados con la misma cepa.

Las levaduras asentadas en cervezas comerciales acondicionadas en botella

también pueden capturarse con este método.

Lo primero que se debe hacer es preparar con anticipación una placa de agar

2.12.1Preparación de placas agar

Ingredientes:

 Placas petri.
 300 ml de mosto con densidad de 1.040 sg o menor.
 5 gramos de polvo agar-agar.
 Una pizca de nutriente de levadura.

2.12.2.-Instrucciones para preparar la placa de agar

1. Caliente el mosto en una olla pequeña y mezcle el agar cuando esté a

punto de hervir.
2. Hierva el mosto, ya que el agar no se mezclará bien con el mosto si no
se hierve.
3. Deje enfriar por varios minutos hasta que la temperatura alcance los
37ºC – aproximadamente 5-10 minutos. Revise bien la olla y asegúrese de que
la mezcla esté líquida antes de agregarla a la placa petri.
4. Desinfecte las placas petri. Vierta una capa pequeña del líquido en las
placas petri y póngalas en un espacio cerrado, donde no hayan corrientes de
aire. Es importante dejar enfriar el líquido antes de cubrir las placas petri para
prevenir condensación en las tapas y así reducir el riesgo de moho.
5. El líquido debe tornarse en gelatina al enfriarse. Si esto no ocurre, hierva
de nuevo el líquido con un poco más de agar.
6. Cierre las placas petri y cubra sus bordes con plástico para envolver
alimentos, para prevenir que entre contaminación y evitar que se seque su
contenido si no se usan en los días siguientes.
7. Deje las placas al revés por un par de días en un lugar oscuro y tibio
para incubarlas. Esto permitirá determinar cuáles placas se contaminaron con
moho u otros bichos indeseados, y así no utilizarlas.
8. Guarde las placas no contaminadas en una bolsa resellable y
refrigérelas si no las va a utilizar inmediatamente.

Luego de tener placas agar, el paso siguiente es introducir la levadura en las

placas e incubarlas para luego separarlas.

IMPORTANTE: Asegúrese de desinfectar debidamente todo el equipo y sus

manos en los pasos siguientes para lograr obtener una cepa pura y evitar
contaminación.

2.12.3.-Instrucciones para separar la levadura

1. Encienda una hornilla o quemador e intente trabajar cerca a la hornilla

para así evitar contaminación durante todo el proceso.
2. Remueva el plástico de la placa agar.
3. Como las placas agar se almacenaron boca abajo, habrá condensación
de agua en la tapa. Mantenga la placa boca abajo, remueva la tapa y
gírela rápidamente para deshacerse del agua, ya que se debe evitar que
esa agua caiga en el agar con mosto. Vuelva a tapar la placa mientras
está boca abajo.
4. Desdoble el clip hasta la mitad, de tal forma que se pueda usar parte del
alambre para pasar pequeñas cantidades de levadura en la placa agar.
5. Esterilice el extremo del clip con el cual se va a trabajar usando una
llama – ya sea el quemador o un fósforo – hasta que el alambre esté
rojo. Asegúrese de dejarlo enfriar por aproximadamente 30 segundos
antes de usarlo en los siguientes pasos para evitar matar la levadura.
6. Si la levadura se obtuvo en el starter, utilice una pipeta desinfectada
para obtener una muestra del fondo del starter. Si la levadura se obtuvo
en el tubo de ensayo, sacúdalo para distribuir la levadura. Sumerja la
punta del alambre (clip) en el líquido con la levadura (pipeta o tubo de
ensayo), sólo necesita una pequeña cantidad, suficiente para mojar la
punta del alambre. Aunque parezca muy poco, se obtendrán suficientes
microbios para su incubación en las placas agar.
7. Remueva la tapa de la placa agar. Forme algunas líneas
cuidadosamente en las placas agar con la punta del alambre
conteniendo la muestra de microbios.
8. Desinfecte la punta del alambre para eliminar cualquier microbio y evitar
agregar más a la placa agar en los siguientes pasos, ya que si se agrega
mucha levadura habrán muchos microbios incubados y será difícil
separar la levadura al final de la incubación.
9. Recorra de nuevo las líneas formadas anteriormente con el alambre
desinfectado para disminuir la cantidad de microbios en las primeras
líneas, y forme nuevas líneas cruzando las anteriores – como iniciando
el dibujo de un diamante.
 10. Desinfecte el alambre de nuevo y recorra las líneas iniciales y siga
dibujando el diamante asegurándose de cruzar las líneas anteriores.
11. Voltee la placa y póngala sobre la tapa. Colóquela en un lugar oscuro y
tibio para incubar, lo cual tomará entre pocos días o hasta dos semanas
dependiendo de la cantidad de células obtenidas y la temperatura de
incubación.
12. Si se utilizó una cepa pura para practicar, se verán grandes cantidades
de colonias de levaduras redondas y blancas. Las primeras líneas que
se hicieron en la placa agar tendrán más concentración de levadura, y
las siguientes líneas serán menos densas hasta encontrar colonias
individuales en el interior de la placa.
13. En el caso de la levadura salvaje, se verán inicialmente diversos tipos de
microbios incluyendo moho. Es importante revisar constantemente la
placa agar antes de que microbios no deseados se tomen toda la placa y
no permitan separa la levadura salvaje capturada.
14. Para aislar las diferentes cepas de levadura, se debe repetir el proceso,
obteniendo muestras de levadura de las placas petri no contaminadas y
agregándolas a nuevas placas petri como se indican en este
procedimiento. Después de varias interacciones se comenzarán a notar
colonias de levadura creciendo separadamente, con diferentes texturas
y colores, lo que permitirá finalmente aislarlas satisfactoriamente.
15. Luego de haber aislado colonias individuales de levadura, seleccione
una colonia con el alambre desinfectado y agréguela en un tubo de
ensayo o pequeño recipiente con 10 ml de mosto de baja densidad
previamente hervido para alimentar y propagar la colonia.
16. Luego de este proceso, se puede seguir propagando la levadura de 10
ml a 100 ml a 1 litro y así tener suficiente levadura para utilizar en un lote
de prueba y apreciar sus características.

2.14.- Utilidad de las levaduras.-

Las utilidades industriales más importantes de la levadura son la producción de
cerveza, pan, vino y kumis, gracias a su capacidad de generar dióxido de
carbono y etanol durante el proceso de fermentación. Básicamente este
proceso se lleva a cabo cuando esta levadura se encuentra en un medio muy
rico en azúcares (como la D-glucosa). En condiciones de escasez de
nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metabólicas que le permiten obtener
un mayor rendimiento energético, y por tanto no realiza la fermentación.
Desde el punto de vista científico, este microorganismo se ha empleado como
modelo simple de la célula eucariota. Esto se debe a una serie de ventajas
como su facilidad de cultivo y su velocidad de división celular
(aproximadamente dos horas).
Las propiedades fisiológicas de la levadura han llevado su uso al campo de
la biotecnología. La fermentación de azúcares (carbohidratos) por la levadura
es la aplicación más grande y antigua de esta tecnología. Se utilizan muchos
tipos de levaduras para hacer muchos alimentos: la levadura de panadería en
la producción de pan, levadura de cerveza en la fermentación de la cerveza y la
levadura en la fermentación del vino y para la producción de xilitol. La
llamada levadura del arroz rojo es en realidad un moho, el Monascus
purpureus. Las levaduras incluyen algunos de los organismos más
ampliamente usados como modelo para la genética y la biología celular.
2.15.- ¿Que es la fermentación?

Se llama fermentación a un proceso de oxidación incompleta, que no requiere

de oxígeno para tener lugar, y que arroja una sustancia orgánica como
resultado. Es un proceso de tipo catabólico, es decir, de transformación
de moléculas complejas a moléculas sencillas y generación de energía
química en forma de ATP(Adenosín Trifosfato).

La fermentación consiste en un proceso de glucólisis (ruptura de la molécula de

glucosa) que produce piruvato (ácido pirúvico) y que al carecer de oxígeno
como receptor de los electrones sobrantes del NADH
(nicotin adenin dincleótido) producido, emplea para ello una sustancia orgánica
que deberá reducirse para así re oxidar el NADH a NAD+, obteniendo
finalmente un derivado del sustrato inicial que se oxida. Dependiendo de dicha
sustancia final, habrá diversos tipos de fermentación.

Este proceso fue descubierto por el químico francés Louis Pasteur, quien la

calificó como “La vida sin aire” , ya que puede ser llevado a cabo en ausencia
de oxígeno por microorganismos como las bacterias, levaduras, o algunos
metazoos y protistas. En este proceso, entonces, no intervienen ni
las mitocondrias ni las estructuras vinculadas al proceso de respiración celular.

En comparación con la respiración aerobia, la fermentación no es un método

de obtención de energía muy eficaz: se producen sólo 2 moléculas de ATP por
molécula de glucosa consumida, mientras que al respirar se obtienen de 36 a
38.

Sin embargo, es llevada a cabo por diversas células de nuestro cuerpo para

paliar los instantes de ausencia de oxígeno, como ocurre en las células
musculares que fermentan glucosa cuando el insumo de oxígeno no es
suficiente para continuar respirando.

La fermentación es un proceso que degrada moléculas para transformarlas en

otras moléculas más simples. En el proceso de fermentación se producen unos
desechos:

 Alcohol.- (por eso se dice que la fermentación de la levadura es

alcohólica). Este alcohol (concretamente etanol) se evapora durante el
horneado.
 Dióxido de carbono o CO2.- gas que “infla” la masa, en forma de
burbujas. También el CO2 se elimina en el horneado.
 Y también produce calor (si se fijan, una masa de pan al fermentar
genera un calor propio).

Este proceso en el que se genera CO2, alcohol y calor es lo que

llamamos fermentación
2.15.1.-Tipos de fermentación

De acuerdo a la sustancia obtenida al final del proceso de fermentación,

podemos clasificarlo en:

 2.15.1.1.-Fermentación alcohólica. Llevada a cabo por las levaduras

principalmente, produce a partir de ciertos azúcares una cantidad de
alcohol etanol, dióxido de carbono y ATP. Este es el proceso empleado
para producir las bebidas alcohólicas.
 2.15.1.2.-Fermentación acética. Propia de las bacterias del
género Acetobacter, transforma el alcohol etílico en ácido acético, o sea,
el alcohol en vinagre. Es, no obstante, un proceso aeróbico, por lo que
puede darse en los vinos expuestos al aire.
 2.15.1.3.-Fermentación láctica. Consiste en una oxidación parcial de la
glucosa, llevada a cabo por bacterias lácticas o por las células
musculares animales (cuando se quedan sin oxígeno para respirar).
Este proceso genera ATP pero se produce ácido láctico, lo cual produce
al acumularse, la sensación dolorosa de fatiga muscular.
 2.15.1.4.-Fermentación butírica. Descubierta por Pasteur, consiste en
la conversión de las glucosas en ácido butírico y gas, esto último le
confiere un olor típicamente desagradable. Es llevada a cabo
característicamente por las bacterias del género Clostridium y requiere
de presencia de lactosa.
 2.15.1.5.-Fermentación butanodiólica. Se trata de una variante de la
fermentación láctica, llevada a cabo por entero bacterias que liberan
dióxido de carbono y generan butanodiol, un alcohol incoloro y viscoso.
 2.15.1.6.-Fermentación propiónica. En este proceso intervienen
el ácido acético, dióxido de carbono y ácido succínico, y se obtiene de
todos ellos ácido propiónico, una sustancia corrosiva con olor acre.

2.15.2.- Usos de la fermentación

Numerosas industrias humanas sacan provecho a la fermentación para obtener

determinadas sustancias. Por ejemplo, en las industrias alimenticias del queso,
se llevan a cabo procesos de fermentación propiónica, o en la preservación de
muchos tipos de comestibles se acude a la presencia del ácido láctico, que
actúa como preservante, debido a la fermentación láctica.

Algo similar ocurre con la industria alcohólica, tanto de vinos, cervezas u otro
tipo de licores, que requieren de un proceso de elaboración en el que interviene
la fermentación alcohólica. Por el contrario, si algunos licores como el vino se
dejan destapados mucho rato, el oxígeno añadido iniciará la
fermentación acética y la bebida empezará a avinagrarse.

2.15.3.- Condiciones necesarias para que se produzca la fermentación

Las levaduras necesitan unas determinadas condiciones de alimento, humedad
y temperatura para poder vivir y desarrollarse y así dar lugar a la fermentación
de la masa:
  Sin humedad no pueden activarse, ya que la levadura necesita que su
alimento esté disuelto en agua para poderlo asimilar.
 Su alimento base son los azúcares (lo que “más le gusta” es la glucosa,
es el azúcar que puede utilizar), también necesita algo de nitrógeno (que
toma de las proteínas) y algunos minerales.  Utilizan los azúcares de los
alimentos que fermentan, transformándolos.
 En cuanto a la temperatura: por debajo de 26º no actúan (o con
dificultad) y por encima de 35º se debilitan demasiado. A 60º mueren.
Para fermentar la masa de pan se considera ideal 32-35º.  Es la razón
por la que la panificadora en un ambiente fresco no funciona bien.

2.16.- ¿Que es esterilización?

Se denomina esterilización al proceso por el cual se obtiene un producto libre

de microorganismos viables. El proceso de esterilización debe ser diseñado,
validado y llevado a cabo para asegurar que es capaz de eliminar la carga
microbiana del producto o un microorganismo más resistente.
Dado que la esterilidad no se puede demostrar de manera absoluta, sin causar
la destrucción completa de todas las unidades del lote de producto terminado;
se define la esterilidad en términos probabilísticos, en donde la probabilidad de
que una unidad de producto esté contaminada es aceptablemente remota. Se
considera que un producto crítico es estéril, cuando la probabilidad de que un
microorganismo esté presente en forma activa o latente es igual o menor de 1
en 1.000.000.
Los agentes que matan microorganismos son denominados microbicidas o
más comúnmente denominados “germicidas”. Si el agente específicamente
destruye bacterias, es llamado bactericida; si mata hongos es denominado
fungicida. Tras una exposición del objeto esterilizado al aire o a sus
alrededores, éste se habrá contaminado de nuevo con microorganismos.
Los métodos térmicos de esterilización son comúnmente los más utilizados
para eliminar los microorganismos, incluyendo las formas más resistentes
como lo son las endoesporas.
2.16.1.- Métodos de esterilización.-
Existen varios métodos de esterilización:

 2.16.1.1.-Métodos físicos
Los métodos físicos son aquellos que no involucran el empleo de sustancias
letales para los microorganismos, sino procedimientos físicos como
la radiación ionizante, el calor o la filtración de soluciones con membranas
que impiden el paso de microorganismos, incluyendo virus. El método más
usado en esta categoría es el calor que mata microorganismos por la
desnaturalización de las enzimas; el cambio resultante en la forma
tridimensional de las proteínas las inactiva. La resistencia al calor varía
entre los diferentes microorganismos; esta diferencia puede ser expresada
como el punto térmico de muerte (PTM) el cual se define como la
temperatura más baja a la cual todos los microorganismos en una
suspensión líquida serán eliminados en 10 minutos.
 Otro factor que debe ser considerado en una esterilización es el tiempo
requerido. Este puede expresarse como el tiempo de muerte térmica (TMT),
el cual es el tiempo mínimo para que toda bacteria en un cultivo líquido en
particular sea exterminada a una temperatura determinada.
Ambos PTM y TMT son guías útiles que indican la severidad del tratamiento
requerido para matar a una población de bacterias dada. El tiempo de
reducción decimal (TRD, o valor D) es el tercer concepto relacionado con la
resistencia bacteriana al calor. TRD es el tiempo, en minutos, en el cual el
90 % de una población bacteriana a cierta temperatura será eliminada los
tratamientos, térmicos en resumen, son métodos para conservar los
alimentos.

o Calor húmedo (en autoclave de vapor)

o Calor seco (en horno de esterilización)
 Flama directa
o Incineración
o Aire caliente
o Pasteurización
o Ebullición
o Vapor
o Tindalización
o Radiación
 Radiación ionizante
 Radiación no ionizante: (ej:Radiación infrarroja y Radiación
ultravioleta)
 2.16.1.2.-Métodos químicos
Los métodos químicos de esterilización son aquellos que involucran el
empleo de sustancias letales para los microorganismos, tales como el óxido
de etileno y el peróxido de hidrógeno. El uso de este método es muy
limitado para la Industria Alimentaria pero muy utilizado en otras industrias
como la farmacéutica.

o Alcoholes
 Etanol
 Alcohol isopropílico
o Aldehídos
 Formol
 Glutaraldehído
o Fenoles
 Fenol (Ácido carbólico)
 Xilenol
o Óxido de etileno
o Peróxido de hidrógeno
2.16.1.3.- métodos térmicos
Los métodos térmicos suelen englobar todos los procedimientos que tienen
entre sus fines la destrucción de los microorganismos por el calor. Los métodos
son tanto la pasteurización como la esterilización, cuya finalidad principal es la
destrucción microbiana, como al escaldado y a la cocción, procesos en los que
también se consigue una cierta reducción de la flora microbiana, pero que sus
objetivos principales son la variación de las propiedades físicas.
2.16.2.- Aplicaciones
En investigación de laboratorios científicos es empleado principalmente para
eliminar microorganismos de los elementos de trabajo, evitando así la
contaminación de la muestra, recipientes y material de trabajo.
En la industria alimentaria se emplea para aumentar la vida útil de los
alimentos. Los alimentos esterilizados más comunes son los enlatados.
En los hospitales es empleado principalmente para eliminar agentes patógenos
de los instrumentos quirúrgicos reutilizables.
Los fabricantes de productos sanitarios esterilizan los productos para poder
utilizarlo con asepsia en un procedimiento quirúrgico o de laboratorio por los
profesionales sanitarios.
En el tratamiento de residuos peligrosos hospitalarios, se utiliza la esterilización
de alta eficiencia, con el fin de eliminar todos los microorganismos patógenos y
así disminuir los riesgos de infección asociados.
2.17.- ¿Que es mosto?

El mosto es el zumo de la uva que contiene diversos elementos de la uva como

pueden ser la piel, las semillas, etc. Se considera una de las primeras etapas
de la elaboración del vino. De allí la idea generalizada de pensar que el mosto
es el desecho de la uva. En otras palabras podemos decir que es jugo de uva
concentrado.

Existen diversas calidades de mosto, por el contrario tiene que tener ciertas
condiciones de calidad para ser aceptado para la venta. Mientras mejor
conserve el aroma a vino y su color intacto mejor calidad.

El mosto de uva se utiliza en infinidad de bebidas como la

en sidras comerciales, en zumos de melocotón, o zumos de piña, que muchas
veces el porcentaje de zumo de uva es muy alto.
También usamos el mosto de uva concentrado para hacer vinos dulces, o
mejorar la cantidad de azúcar en mostos de otros vinos para aumentar el grado
alcohólico de esos vinos, ya que a mayor contenido de azúcar mayor grado
alcohólico.

Existen 3 tipos de mosto. El mosto simple, el mosto concentrado y el mosto

sulfitado
El simple es lo que queda de la prensada de la uva en fresco y aún no
comienza el proceso de fermentación.
El concentrado es el mosto que comienza a deshidratarse.
Y el sulfitado es el mosto fresco que se lo conserva así mediante el agregado
de anhídrido sulfuroso o de metabisulfito de potasio.
2.18.- ¿Que son los microorganismos?

Son seres vivos pequeños que no pueden ser observados a simple vista y por
ello se utilizan equipos especializados como los microscopios, típicamente son
organismos unicelulares, son considerados esenciales para la vida debido a su
amplia diversidad y distribución en el planeta. Algunos de los organismos más
estudiados pertenecen a grupos biológicos como lo son los protozoarios, algas,
hongos y bacterias. Desde el descubrimiento de los primeros seres
microscópicos se han realizado diferentes clasificaciones de acuerdo al tema
de estudio, por ejemplo, dividirlos en dos grandes grupos: benéficos y no
benéficos según el impacto que causan en otros seres vivos o el ambiente. En
las bacterias podemos encontrar grupos benéficos como la bacteria Clostridium
Lochheadii o Cilliobacterium cellulosolvens que habita en el estómago de las
vacas (rumen) que les da la capacidad de digerir cierto tipo de alimento (pasto).
Por otra parte podemos encontrar bacterias como Salmonella typhimurium que
cuando se encuentran en grandes cantidades en el estómago puede causar
enfermedades intestinales.

Ejemplos de algunos microorganismos utilizados en industria.

Cerveza: Saccharomyces cerevisiae y Shizosaccharomyces pombe

Insulina: Escherichia coli

Neomicina: Streptomyces fradiae

Pan: Saccharomyces cerevisiae

Penicilina: Penicillium chrysogenum

Queso : Lactobacillus lactis ssp., Streptococcus thermophilus y Penicillium

roquefortii

Vino: Acetobacter Yakult Lactobacillus casei

Yogurt: Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii ssp.

Bulgaricus

Los microorganismos tienen una serie de características en común:

 Su tamaño es tan reducido que son imperceptibles a simple vista.

 Sus reacciones metabólicas son muy veloces.
 La relación que mantienen con el medio es intensa.
 Necesitan agua para metabolizar.
 Desarrollan mecanismos de dispersión y de resistencia.
 Tienen la capacidad de alterar el medio en el cual se encuentran.
 Se reproducen a una gran velocidad.
 Su actividad es indispensable para la vida en el planeta.
  Forman parte de los ciclos biogeoquímicos que se llevan adelante en
la naturaleza.
 Son muy livianos, por lo que se transportan en el aire.

2.18.1.-Tipos de microorganismos

Dentro de la naturaleza se pueden identificar diferentes tipos de

microorganismos. Algunos de ellos son los siguientes:

 Virus: Son los microbios más básicos y solamente se los puede percibir

con microscopios electrónicos. Para reproducirse, deben infectar a otros
organismos unicelulares, a los que les inoculan su contenido genético
(solo pueden reproducirse en una célula huésped).
 Algas cianofíceas: Se trata de bacterias de gran tamaño y se
caracterizan por hacer fotosíntesis de manera muy similar a las plantas,
es decir, oxigénica (desprenden oxígeno).
 Hongos: Así como la levadura, muchos de los organismos que integran
el Reino Fungi son microscópicos.
 Protistas: Se trata de microbios unicelulares eucariotas de gran
volumen. Por lo general, se desarrollan en ambientes acuáticos, que
pueden ser de agua dulce o salada, o en lugares muy húmedos. Aunque
algunas variedades desarrollan vidas parasitarias, por lo general, estos
organismos depredan a otros microorganismos a la hora de alimentarse.
 Arqueas y bacterias: Se trata de dos tipos de organismos procariotas y
unicelulares, y son los microbios más simples. Conforman el grupo de
microbios con mayor presencia en la Tierra, se alimentan del hábitat en
el que se encuentran y su reproducción es a partir de la división de su
material genética.

2.18.2.-Técnicas de aislamiento
 Se realiza un aislamiento de los microorganismos presentes en un cultivo
mixto en caldo ordinario, sobre agar nutritivo. Se siembran dos placas de
agar nutritivo, una mediante la técnica del agotamiento de asa y otra
mediante la de estrias escocesas.
Estas técnicas pretenden diluir la carga microbiana que se deposita sobre el
medio de cultivo de forma que, en los últimos trazos de la siembra, haya tan
pocas células que queden suficientemente separadas unas de otras y
puedan desarrollar colonias independientes, se realizan una serie de
diluciones seriadas a partir del cultivo mixto  Con esta técnica conseguimos
además de aislar colonias, obtener un recuento del número de bacterias
que tenemos en el cultivo. 

2.18.3.-Técnicas para el cultivo de microorganismos

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos
métodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es
posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de
microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de
microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente
determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos.
A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de
trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario
tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos
en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino
también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el
medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la
incubación condiciones tales como la temperatura, aireación,  la luminosidad.
La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los
microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de
cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y
control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de
microorganismo y propósito específico del estudio.

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo

de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La
población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo.
Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina
cultivo puro o axénico, cuando contiene más de una especie de
microorganismos se denomina cultivo mixto.

2.18.4.-Técnicas de siembra

2.18.4.1.-Método de siembra por estría en placa

 Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para
ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a
continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado
en una placa Petri. Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa,
cada vez se van depositando en la superficie del medio menos
microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde
se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma
técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso
varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se
incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas
experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles.
Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola
célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan
juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos
de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a
partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se
desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos.

2.18.4.2.-Métodos de vertido en placa y extensión en placa

 En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes

de su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene
tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa.
Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser
diluida 10 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por
mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas),
normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien.

Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión

bacteriana a 9 ml (de medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se
agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces
sea necesario. A continuación, se puede proceder de dos maneras diferentes.

 En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar
fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar
y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y
serán más grandes.
 En el segundo método extensión en placa, las muestras diluidas se siembran
directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de
un asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar,
dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las
placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el método de
siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en
las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el
método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el
proceso. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que
permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de
siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a
partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.

3.-MARCO PRACTICO - METODOLOGIA

3.1.-MATERIALES

 12 cajas Petri
 7 tubos de ensayo
 6 pipetas de 1 ml
 1 pipeta de 10 ml
 1 Erlenmeyer
 1 vaso precipitado
Nota: TODO MATERIAL DEBE ESTAR ESTERILIZADO ANTES DE USAR
CON UNA DILUCIÓN CON LAVANDINA 1:4

3.2.-PREPARACIÓN DEL 1ER MOSTO

3.2.1.-Materiales

 1 kg de uva morada
 1 estrujador
 1 vaso precipitado
 Tela, media naylon para filtrar
 1 Erlenmeyer
3.2.1.-Procedimiento

8. Estrujar la uva
9. Filtrar con una tela o media naylon
10. Dejar hervir por unos 2-3 minutos hasta que llegue a 80 °C
11. Dejar que enfríe el mosto estéril
12. Verter el líquido en el matraz
13. Una vez frío añadimos pedazos de cáscara de limón y manzana
14. Taparlo con algodón
15. Dejarlo por dos días
3.3.-PREPARACIÓN DEL AGAR

3.3.1Materiales

 1 lata de Malta
 Vaso precipitado
 Varilla
 Hornilla
 Pipeta de 10 ml
 12 cajas Petri
 Papel madera
 Agar bacto
3.3.2Procedimiento

1. Verter la malta en el vaso precipitado

2. Con la varilla mover hasta que baje la espuma
3. Una vez que la malta este sin espuma poner a la hornilla
4. Dejar que hierba unos 10 minutos
5. Poner 20 ml de agar a cada caja Petri
6. Envolver cada caja con papel madera
7. Poner en el autoclave y dejar que enfrié cuando salga
8. Poner en la parte baja del refrigerador hasta sembrar
3.4.-PRIMERA DILUCIÓN

3.4.1.-Materiales

 12 cajas Petri de agar

 5 tubos de ensayo
 6 pipetas de 1 ml
 1 pipeta de 10 ml
 Mosto
 Agua hervida fría o agua vital
 Asas de argolla
 Mechero
3.4.2.-Procedimiento
Día 1 y 2:

1. Día 1 y 2 aislamientos de tubos 1,2,3

2. poner 9 ml de agua hervida fría en los tubos
3. Poner en el primer tubo 1 ml del mosto
4. Sacar 1 ml del primer tubo al segundo tubo (cada tubo con su
pipeta )
5. Sacar 1 ml del segundo al tercero sucesivamente hasta el quinto tubo
6. Con la pipeta de 1 ml poner una gota en el caja Petri de agar
7. Con la asa de argolla extender y hacer el respectivo sembrado de los
tubos 1,2,3 siempre siembre con un mechero cerca
8. Una vez terminado el sembrado guardar en lugar seco y que no le de
el sol directamente

Día 3:
1. Día 3 aislamiento tubo 2,3,4
2. poner 9 ml de agua hervida fría en los tubos
3. Poner en el primer tubo 1 ml del mosto
4. Sacar 1 ml del primer tubo al segundo tubo (cada tubo con su
pipeta )
5. Sacar 1 ml del segundo al tercero sucesivamente hasta el quinto
tubo
6. Con la pipeta de 1 ml poner una gota en el caja de agar
7. Con la asa de argolla extender y hacer el respectivo sembrado de
los tubos 2,3,4 siempre siembre con un mechero cerca
8. Una vez terminado el sembrado guardar en lugar seco y que no le
dé el sol directamente
Día 4:
1. Día 4 aislamiento tubos 3,4,5
2. poner 9 ml de agua hervida fría en los tubos
3. Poner en el primer tubo 1 ml del mosto
4. Sacar 1 ml del primer tubo al segundo tubo (cada tubo con su
pipeta )
5. Sacar 1 ml del segundo al tercero sucesivamente hasta el quinto tubo
6. Con la pipeta de 1 ml poner una gota en el caja de agar
7. Con la asa de argolla extender y hacer el respectivo sembrado de los
tubos 3,4,5 siempre siembre con un mechero cerca
8. Una vez terminado el sembrado guardar en lugar seco y que no le de
el sol directamente
3.5.-OPCIÓN 1

3.5.1.-Materiales
  25 viales
 1 kg de uva negra
 Media naylon o tela para filtrar
 1 estrujador
 1 vaso precipitado
 1 pipeta de 10 ml
 Mechero
 Asa de argolla
 algodón
3.5.2.-Procedimiento

1. Estrujar la uva
2. Filtrar con una tela o media naylon
3. Dejar hervir por unos 2-3 minutos hasta que llegue a 80 °C
4. Dejar que enfríe el mosto estéril
5. Con la pipeta poner a los viales 6 ml de mosto
6. Con el asa y cerca al mechero tomar una parte de la cepa y poner a los
viales no dejar que nada se quede en el asa
7. Taparlo con algodón y ponerlas en un lugar seco y que no le de
directamente el sol
Nota: pasados los 10 días del aislamiento en los viales aumentar mosto estéril
a cada vial 1 ml y ver al microscopio e informar de cuantos viales tienen
levaduras y descartar las que tienen bacterias

3.6.-VISTA AL MICROSCOPIO

3.6.1.-Materiales

 Viales con mosto

 Asas de argolla
 Mechero
 Portas y cubres
3.6.2.-Procedimiento

1. Tomar cada vial moviendo con el asa estéril

2. Depositar una gota en el porta y cubrirlo
3. Observar en el microscopio e informar
4. Descartar las q tienen bacterias
3.7.-1RA RESEMBRADA

3.7.1.-Materiales

 Asas de argolla
 Tubos de ensayo ensayo
 Pipetas de 1 ml
  Pipeta de 10 ml
 Agua hervida fría
 Mechero
 Cajas Petri de agar
 Viales con mosto
3.7.2.-Procedimiento

1. poner 9 ml de agua hervida fría en los tubos

2. Poner en el primer tubo 1 ml del mosto del vial
3. Sacar 1 ml del primer tubo al segundo tubo (cada tubo con su pipeta )
4. Sacar 1 ml del segundo al tercero sucesivamente hasta el quinto tubo
5. Con la pipeta de 1 ml del 4to o 5 to tubo poner una gota en la caja de
agar
6. Con la asa de argolla extender y hacer el respectivo sembrado siempre
siembre con un mechero cerca
7. Una vez terminado el sembrado guardar en lugar seco y que no le dé el
sol directamente.
Pasado los dos días comienzan a crecer las primeras cepas
4ta y 5ta dilusion:

1. Se hizo la 4ta o 5ta dilución para separar las levaduras puras de la

mezcla y así obtener levaduras puras
2. Se vio en algunas cajas el crecimiento de hongos inmediatamente
debemos extraerlas con la ayuda de un asa caliente retirando el hongo
por completo y depositando el hongo extraído en una solución de
lavandina 1:4 después de retirar el hongo esterilizar con el mechero el
asa
3. Una vez crecidas las cepas se observa en el microscopio
4. Colocar en el porta una gota de agua de dilución
5. Tomar una parte de la cepa con el asa de punta estéril y mesclar hasta
que la cepa se homogenice
6. Cubrirlo y ver en el microscopio
7. En esta primera resembrada no se encontró la presencia de levaduras
puras solo se pudo ver la presencia de levaduras de mezcla y por esa
razón se hará nuevamente el aislamiento de las levaduras hasta
encontrar levaduras puras
3.8.-SEGUNDO AISLAMIENTO

3.8.1Materiales

 33 viales
 1 kg de uva negra
 Media naylon o tela para filtrar
 1 estrujador
 1 vaso precipitado
  1 pipeta de 10 ml
 Mechero
 Asa de argolla
 algodón
3.8.2.-Procedimiento

1. Estrujar la uva
2. Filtrar con una tela o media naylon
3. Dejar hervir por unos 2-3 minutos hasta que llegue a 80 °C
4. Dejar que enfríe el mosto estéril
5. Con la pipeta poner a los viales 6 ml de mosto
6. Con el asa y cerca al mechero tomar una parte de la cepa y poner a los
viales no dejar que nada se quede en el asa
7. Taparlo con algodón y ponerlas en un lugar seco y que no le de
directamente el sol
8. Pasado los 7 días de aislamiento :

 Tomar cada vial moviendo con el asa estéril

 Depositar una gota en el porta y cubrirlo
 Observar en el microscopio e informar
 Descartar las q tienen bacterias
3.9.-3ER RESEMBRADO

3.9.1.-Materiales

 Asas de argolla
 Tubos de ensayo ensayo
 Pipetas de 1 ml
 Pipeta de 10 ml
 Agua hervida fría
 Mechero
 Cajas Petri de agar
 Viales con mosto
3.9.2.-Procedimiento

1. poner 9 ml de agua hervida fría en los tubos

2. Poner en el primer tubo 1 ml del mosto del vial
3. Sacar 1 ml del primer tubo al segundo tubo (cada tubo con su pipeta )
4. Sacar 1 ml del segundo al tercero sucesivamente hasta el quinto tubo
5. Con la pipeta de 1 ml del 4to o 5 to tubo poner una gota en la caja de
agar
6. Con la asa de argolla extender y hacer el respectivo sembrado siempre
siembre con un mechero cerca
7. Una vez terminado el sembrado guardar en lugar seco y que no le dé el
sol directamente
3.10.-SEMBRADO EN EL PICO DE FLAUTA

3.10.1.-Materiales

 Tubos de ensayo con agar

 Tubos de ensayo
 Cajas Petri con levaduras puras
 Pipeta de 1 ml
 Mechero
 Agua hervida fría
 Asa de argolla
3.10.2.-Procedimiento

 Poner 1 ml de agua hervida fría en un tubo

 Tomar la cepa de levadura pura con la ayuda del asa de argolla estéril
 Depositarlo en el tubo con el agua hervida fría y mezclar muy bien
 Tomar un tubo con agar desinfectar el algodón al abrir
 Con ayuda de la pipeta depositar una gota en el fondo del tubo y con
ayuda del asa estéril de forma descendente en zigzag subir hasta la
parte superior
 Una vez sembrado volvemos a desinfectar el algodón y tapamos el tubo
 Desinfectar nuevamente el asa al finalizar el sembrado
4.-RESULTADOS

 4.1.-Se preparó el mosto de uva añadiendo cascaras de limón y

manzana
 4.2.-Se preparó el medio de cultivo agar malta para 12 cajas petri
 4.3.-Se realizó el aislamiento de colonias puras de las levaduras
mediante diluciones y sembrados después se las separo en 33 viales
con otra preparación de mosto para un mejor aislamiento.
 4.4.-Se logró la purificación de las levaduras mediante la identificación y
observación al microscopio, así logramos separar las sepas puras.

De los 33 viales que observamos en el microscopio descartamos 20 viales

ya que esos contenían bacterias
De los 13 viales restantes 1 contenía levadura pura y las demás contenían
levaduras mezcla se volvió hacer resiembras de los vial.
Pasado los días comienzan a crecer las primeras cepas
  4.5.-Se logró la conservación y mantenimiento de las sepas puras de
levaduras en picos de flauta

A días después del sembrado se empiezan a notar las primeras cepas

No se encuentra la presencia de hongos
5.-CONCLUSIONES.-

 Se preparó el mosto de uva con cascaras de limón para generar la

producción de levaduras
 se preparó el medio de cultivo agar malta para aislar y obtener colonias
de levaduras.
 Se realizó el aislamiento de levaduras para descartar las bacterias y
hongos presentes y poder separar las levaduras de esa manera poder
identificarlas.
 Se realizó la purificación de levaduras mediante la observación
microscópica que permite una mejor identificación morfología y así poder
separar las levaduras que eran tipo mezcla de las puras
 Se logró la conservación y mantenimiento de las sepas totalmente
identificadas en pico de flauta para generar el banco de levaduras para
su comercialización.

6.- BIBLIOGRAFÍA.-

 https://concepto.de/levadura/
 https://es.wikipedia.org/wiki/Levadura
 https://es.scribd.com/doc/228962940/JUSTIFICACION-
CRECIMIENTO-BACTERIANO
 http://www.calidadmicrobiologica.com.co/microbiologia/analisis-
microbiologico-de-levaduras
 https://www.ecured.cu/Levadura
 https://www.cerveza-artesanal.co/como-aislar-levadura-salvaje/
 https://es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae
 https://es.wikipedia.org/wiki/Levadura
 https://concepto.de/fermentacion/
 https://es.wikipedia.org/wiki/Esterilizaci%C3%B3n_(microbiolog
%C3%ADa)
 https://es.wikipedia.org/wiki/Esterilizaci%C3%B3n_(microbiolog
%C3%ADa)#Métodos_de_esterilización
 https://quimicayalgomas.com/salud/metodos-de-esterilizacion/
 https://catatu.es/blog/que-es-el-mosto/
 https://lanocheenvino.com/2016/09/03/el-mosto-que-es-y-para-que-
sirve/
 http://conogasi.org/articulos/que-son-los-microorganismos/
 https://concepto.de/microorganismo/
 https://conalepfelixtovar.wordpress.com/2012/09/26/tecnicas-y-
metodos-de-aislamiento-y-seleccion-de-microorganismos/
 http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1405-
31952015000700005
 https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/109447/Ferrer%20-
%20Aislamiento%2C%20selecci%C3%B3n%20e%20identificaci
%C3%B3n%20de%20levaduras%20Saccharomyces%20cerevisiae
%20nativas%20de....pdf?sequence=1&isAllowed=y
 http://bdigital.uncu.edu.ar/objetos_digitales/6714/tesis-gonzalez-
magali.pdf