3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 15

3. MATERIALES. DILUYENTES. MEDIOS DE CULTIVO

3.1 MATERIAL Y EQUIPAMIENTO BSICO

A. Material de vidrio o de plstico esterilizable. Tubos de ensayo de diferentes

medidas, placas de Petri, pipetas graduadas, asa de Digralsky, matraces, erlenmeyers,
probetas, botellas con tapn de rosca, portaobjetos, portaobjetos socavados,
cubreobjetos.
B. Material diverso. Asas de Kolle, gradillas, cestillos metlicos, mecheros Bunsen,
trpodes, termmetros, algodn, papel de embalaje, indicadores de pH, etc.

Fig. 3.1
C. Aparatos
I. Balanzas: Granatario, de precisin y analticas.
II. Microscopio. Microscopio ptico con objetivo de inmersin
III. Estufa de incubacin
IV. Centrifuga
V. Autoclave
VI. Espectrofotmetro
VII. pHchmetro
VIII.Agitadores
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3.2 CONDICIONES DE CRECIMIENTO

Para un buen crecimiento microbiano se tienen que cumplir una serie de requerimientos
fisicos y qumicos:
a. Requerimientos Fsicos: Temperatura, pH, presin osmtica.
b. Requerimientos qumicos: Agua, fuentes de carbono y nitrgeno, sustancias
minerales, oxgeno y factores orgnicos de crecimiento.

3.3 DILUYENTES
Las muestras problemas presentan a menudo una concentracin de bacterias excesiva, que
precisa de diluciones previas, para realizar siembras que permitan lecturas dentro de la
normativa (30-300 colonias/placa petri).

La caracterstica principal de un buen diluyente es que no produzca modificaciones

cualitativas ni cuantitativas en la flora existente, es decir, que mantenga lo ms fielmente
posible la flora de la muestra, sin suprimirla ni favorecer su desarrollo.

Los diluyentes requieren por ello cumplir con determinadas exigencias de los
microorganismos, en cuanto a: pH, Isotonicidad

Diluyentes En Microbiologa se utilizan varios diluyentes, habitualmente los siguientes:

Agua de triptona (Tryptone Water: TW)

Soluciones salinas

Las soluciones salinas no son medios de cultivo ya que no permiten el crecimiento de los
microorganismos. Mantienen los microorganismos en suspensin sin que disminuya su
viabilidad, debido a que son isotnicosi y tienen niveles de pH adecuados.

Para su preparacin se disuelven las sales en agua destilada y se ajusta el pH con cido
clorhdrico 0,1 N o hidrxido de sodio 0,1 N. La solucin as preparada se distribuye en
recipientes adecuados y se esteriliza en autoclave.

a) Solucin de Ringer 3
b) Solucin salina (SS)
c) Tampn fosfato (PBS)

Presin osmtica

Si ponemos en contacto a travs de una membrana semipermeable (pergamino o cermica

porosa impregnada de ferrocianuro de cobre), dos disoluciones con diferente concentracin
de soluto, el flujo de disolvente es mayor desde la disolucin ms diluida hacia la disolucin
ms concentrada. (debido al impedimento producido por las molculas de soluto)

Se denomina osmosis al paso de disolvente a travs de una membrana semipermeable.

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Llamamos presin osmtica a la presin hidrosttica que es capaz de impedir el flujo neto
de disolvente hacia la disolucin a travs de la membrana semipermeable.
n
Ley de Van't Hoff:  = M$R $T = V $R $T

Osmosis inversa , fenmeno que se obtiene

ejerciendo sobre la disolucin concentrada una
presin superior a la presin osmtica
(desalinizacin de agua, concentracin de zumos
de frutas).

Osmol Presin osmtica de un mol de soluto no

disociado disuelto en 1 litro de agua a 22,4 at. de
presin y 0 C.

El estado de la concentracin salina del medio respecto a las clulas puede ser de tres tipos:

1. Isotnico, si las concentraciones del medio y las clulas son iguales. En microb. se
suele trabajar en condiciones de isotona (300 milismoles j d 10-20 % sacarosa).
2. Hipertnico, si la concentracin del medio es mayor que la de las clulas. Los
halfilos (Staphylococcus) permiten concentraciones muy altas de NaCl. En general
los salazones son un buen mtodo de conservacin.
3. Hipotnico el medio presentan menor presin osmtica que las clulas. La bacterias
que pueden vivir en medios hipotnicos (acuosos), se debe a la pared rgida que
permite que el agua no penetre la bacteria.

En el mundo de las procariotas, seres ligados por completo al medio acutico, las barreras
que aslan en cierto modo a la delgada membrana celular son:

La pared celular no es rgida (baln de ftbol). Como una pelota inchada, el

protoplasto totalmente lleno confiere rigidez a la clula. La pared celular es permeable
a sales y sustancias de bajo peso molecular.

La cpsula (en ocasiones)

La membrana citoplasmtica es semipermeable y osmticamente activa: controla la entrada y

salida de sustancias disueltas, as como la eliminacin de residuos.

Si hacemos aumentar la presin osmtica exterior (medio hipertnico aadiendo + azcar o

urea), se extrae agua de la clula y el protoplasto se encoje (plasmlisis). La clula puede
modificarse de forma irreversible.

Si el medio es hipotnico, la clula recibe agua del medio y se incha (turgencia). La clula
puede reventar.

Seres unicelulares, como los protozoos ciliados y otros muchos, presentan un conjunto de
vacuolas dilatables, que actan regulando el nivel de agua en el citoplasma.
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Estos fenmenos osmticos explican muchas propiedades de los seres vivos:

Las races absorben agua cuando las soluciones del suelo son hipotnicas respecto del
citoplasma de las clulas de la planta. En caso contrario, el agua sale de la planta y
esta acaba secndose.

El crecimiento rpido de las plantas se debe en gran medida a la turgencia que
provoca en sus clulas la entrada de agua del suelo.

Las inyecciones intravenosas han de tener la misma concentracin salina que el
plasma sanguneo, pues si fueran ms diluidas, podra provocarse la rotura de las
clulas sanguneas.

La mayora de las bacterias no necesitan regular su osmolaridad interna con precisin porque
estn protegidas por una pared celular capaz de resistir una considerable presin osmtica
interna.

Las bacterias mantienen siempre su osmolaridad muy por encima de la del medio. Si la
presin osmtica interna desciende por debajo de la externa, el agua sale de la clula y el
volumen del citoplasma disminuye, dandose la membrana. En las bacterias Gram positivas
esto provoca que la membrana celular se separe de la pared, se dice que la clula se ha
plasmolizado.

Las bacterias varan ampliamente en sus requerimientos osmticos. Algunas crecen en

disoluciones muy diluidas y otras en disoluciones de elevada osmolaridad que reciben el
nombre de osmfilos.

La mayor parte de los ambientes naturales con elevada osmolaridad contienen concentraciones altas
de sales, especialmente cloruro sdico. Los microorganismos que crecen en este tipo de ambiente se
llaman halfilos.

Las bacterias se pueden dividir en 4 amplias categoras con respecto a su tolerancia a la sal:

1. no halfilos
2. organismos marinos
3. halfilos moderados
4. halfilos extremos

Algunos halfilos, por ejemplo, Pedioccocus halophilus, pueden tolerar concentraciones elevadas de
sal en el medio de crecimiento, pero tambin pueden crecer en medios sin NaCl.

Otras bacterias, entre las que se incluyen las marinas y algunos halfilos moderados, as como los
halfilos extremos, requieren NaCl para el crecimiento.

pH del medio

Los iones OH- y H3O+ son los ms mviles de todos, por lo que pequeas variaciones
en su concentracin tienen grandes consecuencias.

Las lesiones que aparecen a valores de pH desfavorables no se deben directamente a
la accin de los iones hidroxilo/hidronio, sino a que una concentracin elevada de
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estos desplaza el equilibrio de los cidos o bases dbiles presentes en la disolucin en

favor de las formas no disociadas, las molculas de cidos y bases (sin carga)
penetran con mucha mayor facilidad en las clulas que los productos de su
disociacin. El succianato dibsico, el cido ctrico tribsico, penetran tanto ms
rpidamente en la clula, cuanto ms bajo sea el valor del pH del medio.

a. neutrfilos la mayora de m.o. se desarrollan ptimamente a pH 7.

b. alcalfilos, algunas bacterias prefieren un medio ligeramente alcalino (nitrificantes,
rizobios, actinomicetos o bacterias degradadoras de la urea como el Proteus pH 8),
Vibrio Cholerae se desarrolla bien a pH 9.
c. acidfilos
1. pocas son cidotolerantes (lactobacillus, acetobacter,...)
2. acidfilas: Thiobacillus

Los Hongos preferentemente a pH 5,0.

Medios tamponados
Es fcil en un medio de cultivo que puedan aparecer variaciones de pH como consecuencia
de los metabolitos que se producen en la degradacin de los nutrientes por parte de las
bacterias. Es tpico en la fermentacin glucdica que se produzca acidificacin del medio, o
que se alcalinize el medio al utilizar la bacteria sales de amonio, como fuente de energa, en
la degradacin proteica.

El mantenimiento de un determinado valor de pH durante el crecimiento tiene gran

importancia para los mo. que producen cidos pero no los toleran (Lactobacilos,
Enterobacterias, muchas Pseudomonas).

a. Fosfatos inorgnicos tienen leve efecto tampn a pH >7,2

b. Carbonato de calcio en caso de produccin ms fuerte de cidos
c. Carbonato de sodio si no se quieren componentes insolubles

Los fosfatos son ampliamente utilizados para la preparacin de medios porque son los nicos
agentes orgnicos que tienen accin amortiguadora en la escala fisiolgicamente importante
en torno a la neutralidad y porque son relativamente atxicos para los microorganismos.
Adems, proporcionan una fuente de fsforo, un elemento esencial para el crecimiento.

A concentraciones elevadas el fsforo se hace inhibidor, de tal manera que la cantidad de

fosfato de amortiguacin que puede ser utilizada en un medio est limitada por la tolerancia
del organismo en particular que se va a cultivar. Generalmente, pueden ser tolerados por las
bacterias y los hongos unos 5 g de fosfatos de potasio por litro de medio.
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Temperatura

1. . Cada bacteria tiene una zona de crecimiento determinada por temperaturas mxima y
mnima. Segn sea el valor de la temperatura ptima se clasifican en:
a. psicrfilas o crifilas afinidad por el fro 5-25 C . Son organismos entre los
que predominan algunas bacterias marinas (bacterias luminiscentes) ; tienen su
tasa ptima de crecimiento por debajo de los 20 C.
b. mesfilas crecen bien a la temperatura corporal de los mamferos (20-42 C)
c. termfilas afinidad por el calor (40-70C Bacillus stearothermophlus,
Thermoactinomyces vulgaris; Se denominan organismos termfilos extremos
a aquellos que tienen su ptimo de crecimiento por encima de los 65C
(Thermus aquaticus, Sulfolobus); algunos de ellos pueden crecer a
temperaturas por encima de los 70C (varias especies del gnero Bacillus y
Clostridium) o incluso por encima de los 80C (Sulfolobus acidocaldarius) o
incluso a 105C (Pyrodictium occultum, una bacteria reductora de sulfato
anaerbica estricta).

3.4 MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Han de tener fuentes de carbono, oxgeno, hidrgeno, nitrgeno, azufre,
fsforo y en menor cantidad otros elementos, tales como hierro, magnesio, etc.

Los medios de cultivo slidos no slo sirven de fuente de nutrientes, sino tambin como
soporte fsico para las bacterias, de tal forma que crezcan formando colonias y sean visibles a
simple vista.

La diversidad metablica de los microorganismos es enorme; por ello, la variedad de medios

de cultivo es tambin grande, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para
todos ellos. En el anexo I se detalla la composicin de los medios de cultivo ms frecuentes.
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3.5 COMPONENTES BSICOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

Agar. El agar e utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de
cultivo. El componente dominante en el agar bacteriolgico es un polisacrido, al que
acompaan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de
agar al 1-2 % en agua lica hacia los 100 C y se gelifica alrededor de los 40 C,
dependiendo de su grado de pureza.
Extractos. Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o vegetales (p. ej.,
carne, hgado, cerebro, semillas) son extrados con agua y calor, y posteriormente
concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados
son frecuentemente empleados en la confeccin de medios de cultivo. Ejemplos:
extracto de carne, de levadura, de malta, etc.
Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y sales
minerales que se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o
vegetales (soja, carne, gelatina, casena, etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos
y aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales.
Fluidos corporales. Sangre completa, plasma, o suero sanguneo son frecuentemente
aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patgenos.
Carbohidratos. Llamados comnmente azcares, se utilizan para enriquecer medios,
para promover el crecimiento o la pigmentacin y para determinar si los organismos
pueden producir cido y gas a partir de ellos.
Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de
cultivo para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Los
microorganismos ms comunes son neutrfilos (el pH ptimo para su crecimiento est
prximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisdicos o bipotsicos, o sustancias
como las peptonas, previenen una desviacin de pH.
Indicadores de pH. Indicadores cido-base se aaden a menudo a los medios de
cultivo con objeto de detectar variaciones de pH.
Agentes reductores. Se aaden para crear condiciones que permitan el desarrollo de
grmenes anaerobios.
Agentes selectivos. La adicin de determinadas sustancias al medio de cultivo puede
convertirlo en selectivo. Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sdica,
antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan como agentes selectivos frente
a determinados microorganismos.
3.6 TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

A) SEGN SU UTILIZACIN

Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos.

Agar nutritivo, Agar PCA, Agar TSA, Medio CPS (almidn-peptona-casena)
Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado tipo de
microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.
Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos
determinado, inhibiendo el desarrollo de los dems. Entre los ms usados destacan los
medios que se emplean para el recuento de los organismos intestinales del grupo
coliforme (Agar Mc Conkey, Medio de Endo). Otros medios seleccionan
determinado tipo de patgenos (Agar Salmonella-Shigella), Caldo de Rothe para la
deteccin de estreptococos de origen fecal.
3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 22

Medios diferenciales. Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades que
un determinado tipo de microorganismo posee. Se utilizan para determinar las
propiedades fisiolgicas y bioqumicas de las bacterias. Son ejemplos el agar citrato
de Simmons para determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como nica
fuente de carbono.

B) SEGN SU ESTADO FSICO

Slidos:
Placa de Petri. Se ven perfectamente las colonias y se puede tomar una sola
colonia con mayor facilidad que en tubo. Sufre mayor desecacin y todo el
medio es aerobio.
Tubo con agar inclinado. Se siembra por picadura o estra, el fondo es
anaerbico y la superficie inclinada aerbica. Se contamina y deseca menos
que la placa de Petri.
Semislidos
Tubo con agar recto. Se utiliza para observar la motilidad tras la siembra por
picadura.
Lquidos
Tubo. Todo el medio es aerbico debido a las corrientes de conveccin.

3.7 PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La mayora de los medios de cultivo se comercializan en forma liofilizada que es preciso

rehidratar. En general, la preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar
la cantidad deseada del mismo y redisolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del
fabricante. Las sustancias termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los
componentes previamente esterilizados en autoclave.

Antes de su esterilizacin, los medios lquidos en caldo se distribuyen en los recipientes

adecuados (tubos o matraces); en ningn caso la altura del lquido en el recipiente debe
exceder un tercio del volumen total de este. Si es un medio slido, habitualmente se procede a
fundir el agar en un bao Mara antes de esterilizarlo.
Finalizada la esterilizacin en el autoclave:
Los medios lquidos se dejan enfriar a temperatura ambiente.
Los medios slidos contenidos en tubos deben inclinarse para solidificarse, adoptando
la forma de agar inclinado (pico de flauta o slant).
Las placas de Petri se preparan vertiendo el medio aun fundido y estril dentro de
ellas en un ambiente asptico (p.ej., en la proximidad de la llama de un mechero
Bunsen).
Caldos y medios slidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a temperatura
ambiente. No obstante, para reducir su deshidratacin es mejor conservarlo a 4 C,
en posicin invertida y envueltas en bolsas de plstico microporoso.
3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 23

Fig. 3.1

Caducidad. Los medios de cultivo preparados y almacenados adecuadamente, tienen por

regla general, las siguientes caducidades:

Placa Petri: 2,5 meses

Tubos: 6 meses
3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 24

PRACTICA 3.1 IDENTIFICACIN DE NUTRIENTES:

A) RECONOCIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO.

Los glcidos (Hidratos de carbono) se clasifican en tres grupos:

Monosacridos: Glucosa, Fructosa, Galactosa.

Disacridos: Maltosa, Sacarosa, Lactosa.
Polisacridos: Almidn, Celulosa

Monosacridos. Identificacin con Reactivo de Fehling.

El reactivo de Fehling est formado por dos soluciones:

A) solucin sulfato de cobre y
B) solucin de NaOH y tartrato de sodio y potasio

Al mezclar las dos disoluciones se forma hidrxido de cobre (II) de color azul intenso e
insoluble, que no precipita sin embargo ya que forma un ion complejo con la sal orgnica.
Al adicionar el licor de Fehling a un compuesto reductor (glucosa) el Cu2+ pasa a Cu+, que en
medio bsico da un precipitado de color pardo-rojizo.
Polisacridos. Identificacin con Lugol (reactivo especfico para almidn). El Lugol es una
solucin que da una coloracin azul violeta especfica con el almidn.

Procedimiento: Marcar cada par de tubos como "A - B".

2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolucin de glucosa

2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolucin de fructosa
tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolucin de maltosa
2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolucin de sacarosa
2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolucin de lactosa
2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolucin de almidn
Aadir a los tubos "B" 2 ml de reactivo de Fehling (recin preparado).
Observar resultados a los 2 min. y cada 5 min.durante la hora siguiente
Aadir a los tubos "A" unas gotas de disolucin de Lugol. Agitar.
Observar los cambios producidos y anotar los resultados.

Hidrlisis del almidn

La enzima amilasa, presente en la saliva, acta sobre el polisacrido almidn,
hidrolizando el enlace O-glicosdico, que se transforma en glucosa.

Procedimiento:
Poner en una gradilla cuatro tubos de ensayo numerados del 1 al 4.
Aadir en cada tubo 5 ml. de una solucin diluida de almidn.
A los tubos 3 y 4 aadir una pequea cantidad de saliva (aprox. 1 ml.).
Colocar los tubos 3 y 4 al bao mara ( aprox. a 37 C) durante 15 min.
Realizar la prueba de Fehling sobre los tubos 1 y 3
Realizar la prueba del Lugol sobre los tubos 2 y 4.
Observar los resultados y anotarlos en una tabla. Conclusiones
3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 25

Hidrlisis de la sacarosa
El cido clorhdrico permite romper el enlace o-glicosdico. La hidrlisis de la
sacarosa descompone el disacrido en los dos monosacridos glucosa y fructosa.

Procedimiento:
Poner en dos tubos de ensayo numerados 5 ml. de solucin de sacarosa
Aadir 10 gotas de HCl 10% en el tubo n 1. Calentar suavemente a la llama del
mechero durante un par de minutos. Dejar enfriar.
Realizar la Prueba de Fehling en ambos tubos calentandolos 5 min. al bao mara.
Observar los resultados y anotarlos en una tabla. Conclusiones

B) RECONOCIMIENTO DE LPIDOS.

Identificacin con Sudn III ( colorante especfico para grasas, que se manifiesta en la
aparicin de un color naranja caraterstico).

Procedimiento:
Numerar 10 tubos de ensayo
Aadir 2 ml de agua en los tubo n 1-2
Aadir 2 ml de disolucin de glucosa en el tubo n 3-4
Aadir 2 ml de aceites diversos en los tubos n 5-6, 7-8, 9-10.
Aadir 5 gotas de Sudan III en cada uno de los tubos impares. Observar la coloracin.
Aadir 5 gotas de tinta roja en cada uno de los tubos pares. Observar la coloracin.
Aadir 1 ml. de agua a los tubos de aceite, agitar fuertemente y dejar reposar.
Observar carcter hidrfilo/lipfilo del Sudn III.
Observar los resultados y anotarlos en una tabla. Conclusiones.

C) RECONOCIMIENTO DE PROTENAS.

Prueba del biuret .Reactivo especfico para protenas. Al mezclar una protena con un lcali
concentrado y algunas gotas de sulfato de cobre(II) diluido se produce un color violeta-
rosceo, debido al grupo - CONH- (enlace peptdico).

Prueba xantoproteica. Las protenas tienen en su estructura aminocidos aromticos que

tratados con HNO3, dan un compuesto de color amarillo (compuestos aromticos
nitrados) que al aadir un lcali da color anaranjado oscuro.

Procedimiento:
Numerar 4 tubos de ensayo y aadir:
Tubo n 1, 3 ml. d al 50% de clara de huevo y 10 gotas de cido ntrico concentrado.
Agitar para evitar la coagulacin de la parte superior.
Tubo n 2, 3 ml. de disolucin de clara de huevo. Aadir reactivo de Biuret: 2 ml.
disolucin A y 4-5 gotas solucin B.
Tubo n 3, 2 ml de solucin de sacarosa y 10 gotas de cido ntrico concentrado.
Tubo n 4, 2 ml de solucin de sacarosa Aadir reactivo de Biuret: 2 ml. disolucin A
y 4-5 gotas solucin B.
Calentar al bao mara 5 min. los tubos 1 y 3. Enfriar y alcalinizar el medio con gotas
de NaOH 20 % (controlar el pH con papel indicador).
Observar los resultados y anotarlos en una tabla. Conclusiones
3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 26

Reaccin de los aminocidos azufrados

Se separa mediante un lcali, el azufre presente en los aminocidos azufrados. El

acetato de plomo precipita el azufre en forma de sulfuro de plomo de color negro.

Procedimiento
Poner en el tubo de ensayo 3 cc. de clara de huevo.
Aadir 2 cc. de solucin de NaOH 20%.
Aadir 10 gotas de solucin de acetato de plomo al 5 %
Calentar el tubo hasta ebullicin

Coagulacin de protenas

Colocar en un tubo de ensayo una pequea cantidad de clara de huevo.

Aadir 5 gotas de cido actico y calentar el tubo a la llama del mechero
Observar los resultados

Residuos: Reactivo de Fehling Bidn D Aceite Bidn aceites

Lugol Fregadero Protenas Fregadero

PRCTICA 3.2 MODIFICACIN DE LAS CONDICIONES DE CRECIMIENTO

(Escherichia. coli, Staphylococcus epidermidis, Saccharomyces cerevisiae)

A) Efecto del pH sobre los microorganismos.

a) Preparar caldo TSB (artesano y sin tamponar) a pH1 4, 5, 7, 10. Distribuir y esterilizar:

- 3 tubos con 10 ml. caldo TSB a pH 4

- 3 tubos con 10 ml. caldo TSB a pH 5
- 3 tubos con 10 ml. caldo TSB (comercial) a pH 7
- 3 tubos con 10 ml. caldo TSB a pH 10
- 1 tubo control de TSB sin inocular

Sembrar con asa de Kolle de cada cultivo dispuesto al efecto. Incubar 48 h. a 37 C.

(Saccharomyces a 27 C). Recoger los datos (claro, algo turbio, turbio, muy turbio) en un
cuadrante. Enumerar las conclusiones que se deriven de los resultados obtenidos.

B) Efecto de la presin osmtica sobre los microorganismos

a. Preparar tubos inclinados con 10 ml. de agar TSA(mximo pico de flauta)

3 tubos de TSA

3 tubos de TSA con un 5% de NaCl.

3 tubos de TSA con un 10% de NaCl.

3 tubos de TSA con un 15% de NaCl.

1 tubo control de TSA sin inocular
Esterilizar y sembrar en estra con asa de Kolle un inculo de cada una de los dos cultivos
puros dispuestos al efecto. Incubar 48 h. a 37 C (Saccharomyces a 27 C).
Recoger los datos (claro, algo turbio, turbio, muy turbio) en un cuadrante. Enumerar las
conclusiones que se deriven de los resultados obtenidos.

1
Para preparar los caldos a pH 4, 5, 10 utilizar disoluciones tampn 4, 5, 10 respectivamente.
3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 27

DILUCIONES

Diluir una solucin consiste en disminuir la concentracin de soluto de la misma aadiendo

disolvente (diluyente). Es necesario diluir las muestras para obtener concentraciones
adecuadas a las tcnicas de recuento de microorganismos.

Si tomamos 1 ml de una solucin (agua de pozo, carne en agua de peptona, NaOH 5%, etc...)
y le aadimos 4 ml de diluyente (agua destilada, solucin Ringer, agua de peptona, ...)
podemos decir que hemos realizado una dilucin:
1
5 (numerador = n partes solucin inicial, denominador = n partes solucin final)

1:4 (partes de solucin inicial: partes de diluyente)

1
al 20 % (partes de solucin inicial en 100 partes de solucin final. 5 $ 100 = 20%)

diluir la solucin 5 veces (n de veces que aumenta el volumen de la disolucin inicial.

1
Es el inverso del factor de dilucin 5 )

Diluciones.
1 1
Se cumple en diluciones sucesivas que: c2 = c1 d1 d 2 $ $ $ siendo:
c2 = concentracin final de la disolucin
1
c1 = concentracin inicial de la disolucin d= factores de dilucin

Preparacin de diluciones.
1
Para preparar una dilucin d por cada unidad de volumen de solucin inicial aadiremos (d-
1) unidades de volumen de diluyente. Ej. Para hacer una dilucin 1/5 de una solucin inicial,
deberemos aadir a cada ml de soluto 4 ml de diluyente

Diluciones decimales

1/10 (10-1) ----> 1 ml de solucin inicial/10 ml disolucin final.

Para diluciones decimales aadiremos 1 ml de soluto a 9 ml de diluyente (factor de dilucin
1/10).

Banco de diluciones

Es la preparacin de una serie de diluciones de una determinada sustancia a partir de una

solucin madre o solucin inicial. Las sucesivas diluciones tienen una concentracin cada
vez menor.
3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 28

Problema n 1: Explicar qu volmenes de diluyente se necesitaran para preparar las

siguientes diluciones (se parte de 10 ml. de disolucin inicial).

Diluir una solucin 1/4 Diluir al 5%

Diluir una solucin 1:4 Diluir una solucin 10 veces

Problema n 2: Calcular la concentracin de una dilucin obtenida a partir de una solucin

inicial al 10 % y que se ha diluido al 1/10.

Problema n3: Calcular la concentracin de una dilucin obtenida a partir de una solucin
inicial de glucosa 5 g/l y que se ha diluido primero al 1/10 y la solucin obtenida se vuelve a
diluir al 1/5. Cul ser el fctor de dilucin total?

Problema n 4: Cuntos ml de agua destilada hemos de aadir a 1 ml de una solucin inicial

para hacer una dilucin decimal (1/10). Y para una dilucin decimal de 10 ml .

Problema n 5: Si tenemos 0,3 ml de una solucin salina al 5% y aadimos 4,7 ml de agua

destilada, que concentracin tendr la solucin resultante.

Problema n 6. Partiendo de una solucin madre de NaCl de concentracin 9 g NaCl/l,

efectuar un banco de diluciones con 3 tubos que contiene cada uno de ellos 8 ml de agua
destilada y siendo los sucesivos factores de dilucin 1/5. Describe como realizaras la
operacin y cul sera la concentracin final en g/l, y el factor de dilucin total.

Problema n 7: Expresar de otra forma las siguientes diluciones:

diluir n veces % 1/d 1:x

50%
1/10
1:1
25%
1/5
diluir 4 veces