Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
5980 1397es PDF
5980 1397es PDF
espectroscopa
UV-visible moderna
Conceptos bsicos
Tony Owen
Copyright Agilent Technologies 2000
Todos los derechos reservados. Esta prohibida la
reproduccin, adaptacin o traduccin, sin el
permiso previo y por escrito, excepto aquello
permitido por la ley de Derechos de Autor.
Impreso en Alemania 06/00
Nmero de publicacin 5980-1397ES
Prlogo
iii
iv
Contenidos
captulo 1 Principios y aplicaciones de
espectroscopa UV-visible
Principios bsicos................................................................................................ 2
El espectro electromagntico.................................................................... 2
Longitud de onda y frecuencia .................................................................. 3
Origen de los espectros UV-visible ........................................................... 3
Transmitancia y absorbancia..................................................................... 6
Derivadas de espectros .............................................................................. 6
Obtener las derivadas de los espectros ........................................... 8
Aplicaciones ........................................................................................ 9
Seal/ruido .......................................................................................... 9
Consideraciones instrumentales .................................................... 10
Anlisis cualitativo ............................................................................................ 10
Identificacin:
espectros y estructura .............................................................................. 10
Confirmacin de la identidad .................................................................. 11
Color ........................................................................................................... 13
Otra informacin cualitativa.................................................................... 14
Temperatura de fusin de las protenas y los cidos nuclicos . 14
Actividad enzimtica ........................................................................ 15
Consideraciones instrumentales ............................................................. 16
Anlisis cuantitativo.......................................................................................... 16
Ley de Beer ................................................................................................ 16
Requisitos de la muestra.................................................................. 20
Anlisis multicomponente ....................................................................... 21
Principio de aditividad ..................................................................... 21
Mtodo de ecuaciones simultneas simples ................................. 21
Mtodo de mnimos cuadrados....................................................... 24
Otros mtodos................................................................................... 26
Requisitos de la muestra.................................................................. 27
Requisitos instrumentales........................................................................ 27
Cuantificacin indirecta ................................................................................... 28
Derivatizacin qumica............................................................................. 28
Valoraciones espectrofotomtricas ........................................................ 28
Ensayos cinticos enzimticos................................................................ 28
captulo 2 Instrumentacin
Diseo instrumental .......................................................................................... 32
Componentes............................................................................................. 32
Fuentes .............................................................................................. 33
v
Contenidos
vi
Contenidos
Isoabsorbancia.................................................................................. 72
Anlisis multicomponente............................................................... 72
Modelar el fondo............................................................................... 73
Referencia interna ............................................................................ 74
Correccin de tres puntos ............................................................... 74
Espectroscopa derivada ................................................................. 75
Problemas fotoqumicos ................................................................................... 79
Fluorescencia ............................................................................................ 79
Descomposicin de la muestra........................................................................ 80
vii
Contenidos
apndice C Referencias
indice
viii
captulo 1
captulo 1 Principios y
aplicaciones de
espectroscopa
UV-visible
1
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
espectroscopa UV-visible.
Principios bsicos
Frecuencia [Hz]
Rayos gamma
Microondas
Ultravioleta
Televisin
Infrarrojo
Rayos X
visible
Rdar
Radio
NMR
2
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
E = h
= c
3
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
transicin
transicin
Figura 2
Transiciones electrnicas en el formaldehdo
4
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Figura 3
Transiciones electrnicas y espectros de los tomos
5
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
transicin electrnica
Figura 4
Transiciones electrnicas y espectros UV-visible en molculas
T = I I o o % T = ( I I o ) 100
La absorbancia se define:
A = log T
Para la mayora de las aplicaciones se utilizan valores de
absorbancia, ya que la relacin entre sta y tanto la
concentracin como el paso ptico es, normalmente, lineal.
6
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Orden cero: A = f( )
dA
Primer orden: ------- = f ( )
d
2
A-
d--------
Segundo orden:
2
= f ( )
d
La Figura 5 de la pgina siguiente muestra los efectos de la
derivacin en una banda gaussiana simple. Las derivadas de
los espectros son siempre ms complejos que el espectro de
orden cero.
La primera derivada es la velocidad de cambio de la
absorbancia frente a la longitud de onda. Empieza y termina
en cero, pasando por cero a la misma longitud de onda que
la max de la banda de absorbancia. Esta derivada tiene una
banda positiva y una negativa con un mximo y un mnimo a
las mismas longitudes de onda que las de los puntos de
inflexin de la banda de absorbancia. Este funcin bipolar
es caracterstica de todas las derivadas de orden impar.
La caracterstica ms significativa de la derivada de
segundo orden es una banda negativa con un mnimo a la
misma longitud de onda que la del mximo de la banda de
orden cero. Esta derivada tambin muestra dos bandas
satlite positivas, a cada lado de la banda principal. La
cuarta derivada muestra una banda positiva con un mximo
a la misma longitud de onda que el mximo de la banda de
orden cero. Las derivadas de orden par muestran una banda
negativa o positiva, con mnimos o mximos a la misma
longitud de onda que la max de la banda de absorbancia.
7
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Absorbancia Absorbancia
1 derivada 2 derivada
3 derivada 4 derivada
Figura 5
Derivadas de los espectros de una banda gaussiana de absorbancia
8
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
9
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Anlisis cualitativo
10
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
11
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Absorbancia
4 derivada
Figura 6
Mejora de la resolucin
12
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Figura 7
Transmisin y color
Figura 8
Absorbancia y colores complementarios
13
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
14
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
15
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Anlisis
cuantitativo
Ley de Beer Si 100 fotones de luz entran en una cubeta y slo 50 salen
por el otro lado, la transmitancia es 0.5, o del 50 %. Si estos
50 fotones atraviesan, entonces, una cubeta idntica, slo
saldrn 25, etc. La Figura 9 muestra la representacin de la
transmitancia frente a la concentracin.
16
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Transmisin
Paso ptico
Figura 9
Transmitancia y concentracin: la ley de Bouguer-Lambert
17
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Transmisin
Paso ptico
Figura 10
Transmitancia y paso ptico: ley de Beer
18
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Absorbancia [UA]
Concentracin
Figura 11
La ley de BeerBouguer-Lambert
19
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Orden cero: A = bc
dA d
Primera derivada: ------- = ------ bc
d d
n n
A-
d-------- d
n derivada: = -------- bc
d d
20
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
A ( x + y ) = A x + A y = e x bc x + e y bc y
21
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
A ( x + y ) = A x + A y = e x bc x + e y bc y
22
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Absorbancia [UA]
23
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
x 1 0.9 - 10 % 0 - 100 %
y 1 1.1 + 10 % 1.98 + 98 %
24
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Real Medido
Absorbancia [UA]
25
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Sulfhemoglobina
Oxihemoglobina
Carboxihemoglobina
Absorbancia [UA]
Figura 15
Espectros de absorcin de derivados de hemoglobina
26
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
27
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Cuantificacin
indirecta
28
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
29
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
30
captulo 2
captulo 2 Instrumentacin
31
Instrumentacin
Diseo instrumental
32
Instrumentacin
33
Instrumentacin
Dispositivos de dispersin
(b) Red de difraccin Cuando la luz solar incide sobre un prisma, se genera un
arcoiris. Este principio se utiliza en los espectrofotmetros.
Los prismas son simples y baratos, pero la dispersin
resultante es angularmente no lineal (Figura 19a). Adems,
el ngulo de dispersin depende de la temperatura.
Por esto, la mayora de los espectrofotmetros modernos
contienen redes hologrficas en lugar de prismas. Estos
1er orden
2 orden dispositivos son de cristal, en los que se realizan hendiduras
muy estrechas. Tradicionalmente esto se realizaba mecni-
Figura 19 camente, pero actualmente se utiliza un proceso ptico
Dispositivos de dispersin hologrfico. Las dimensiones de las hendiduras son del
mismo orden que las longitudes de onda de la luz que se va
34
Instrumentacin
35
Instrumentacin
capa p Regin
intrnseca
capa n
Bloque de oro
Figura 21
El detector de fotodiodos
36
Instrumentacin
Luz
Fotodiodo
Condensador
Registro
de cambio
Interruptor
transistor
Lnea de vdeo
Ciclo de lectura
Figura 22
Diagrama esquemtico de una matriz de fotodiodos
37
Instrumentacin
38
Instrumentacin
Muestra
Monocromador
Detector
Rendija de salida
Dispositivo de
dispersin
Fuente Rendija de
entrada
Figura 23
Esquema de un espectrofotmetro convencional
39
Instrumentacin
Matriz
de diodos
Policromador
Muestra Dispositivo de
dispersin
Fuente Rendija de
entrada
Figura 24
Esquema de un espectrofotmetro de diodos
40
Instrumentacin
41
Instrumentacin
Obturador
Lente
Lmpara
de
Muestra wolframio
Lente Lmpara
Rendija de deuterio
Red
Matriz de
1024 diodos
Figura 25
Diagrama ptico del espectrofotmetro de diodos Agilent 8453
42
Instrumentacin
Monocromador
Rendija
de salida Referencia
Dispositivo
de dispersin
Rendija de Chpper
Fuente entrada Detector
Muestra
Figura 26
Sistema ptico de un espectrofotmetro de doble haz
43
Instrumentacin
Lmpara visible
Espejos de
Celda de esquina de
Lmpara UV referencia la cubeta
Elipse de
Espejo de la fuente
la fuente
Espejo superior
Elipse del director del haz
UV espectrgrafo
Celda de
muestra
Visible
Espejos
esquina
Red Rendija del
de cubeta
espectrgrafo y Espejo inferior
hologrfica
matrices del detector director del haz
Figura 27
Sistema ptico del espectrofotmetro de diodos HP 8450A
Diseo con divisin de haz El espectrofotmetro con divisin de haz (Figura 28) simula
el espectrofotmetro de doble haz pero utiliza un divisor en
lugar de un chpper para dirigir la luz por los pasos de
blanco y muestra, simultneamente, hasta dos detectores
idnticos pero separados. Esta configuracin permite medir
el blanco y la muestra al mismo tiempo. Aunque el diseo
de divisin de haz es mecnicamente ms simple que el
instrumento real de doble haz y requiere menos elementos
pticos, el uso de dos detectores independientes introduce
otra posible fuente de deriva.
44
Instrumentacin
Monocromador
Rendija de
salida
Dispositivo Referencia Detector
de dispersin
Rendija
Fuente de entrada
Muestra Detector
Figura 28
Sistema ptico de un espectrofotmetro con divisin de haz
45
Instrumentacin
46
Instrumentacin
Seal de
Intensidad salida del detector
Figura 29
Definicin de resolucin
0.5 I
SBW Longitud de
onda
Figura 30
Anchura de banda espectral
instrumental
47
Instrumentacin
Longitud de
NBW
onda
Figura 31
Anchura de banda espectral natural
Figura 32
Efecto de variar la SBW sobre la
forma de la banda medida
48
Instrumentacin
Espectro
original evaluacin y almacenamiento, tambin afecta a la
resolucin (en un espectrofotmetro de diodos, la
digitalizacin ocurre en la propia matriz). La Figura 33
muestra este efecto. Si el intervalo de muestreo es grande
Proceso de relativamente a la SBW, la resolucin del instrumento se
muestreo degradar. Un intervalo de muestreo ms pequeo mejora
la resolucin pero resulta en ficheros espectrales mucho
Absorbancia
Espectro
ms grandes, que pueden ser difciles de manejar. En la
digitalizado
prctica, es mejor fijar el intervalo de muestreo a un valor
igual o ms pequeo que la SBW.
Cuando se consideran requisitos instrumentales, es
Longitud de onda importante determinar cul es la resolucin necesaria.
Figura 33 Como se trat en el captulo 1 Principios y aplicaciones de
Efecto del muestreo digital espectroscopa UV-visible, las bandas de absorcin en la
regin UV-visible son ms bien anchas, particularmente
para muestras en disolucin. Para aproximadamente el 99 %
de las medidas de rutina, una SBW de 2 nm es ms que
adecuada para obtener medidas exactas de absorbancia, de
bandas con una NBW de 20 nm o mayor.
Si un instrumento con una SBW de 2 nm se utiliza para
medir muestras con una NBW ms estrecha de 20 nm (por
ejemplo, benceno), resultar en un error en las medidas de
absorbancia absoluta. Este error aumenta al disminuir la
NBW (ver Figura 32). Para medidas absolutas de
absorbancia, es necesario un instrumento con una SBW
ms estrecha. Sin embargo, la mayora de las medidas
UV-visible se utilizan para cuantificacin, lo que
normalmente requiere slo medidas relativas (por ejemplo,
la absorbancia de una concentracin desconocida relativa a
la absorbancia de un patrn). Una calibracin realizada
utilizando patrones, que encierran la concentracin de la
muestra desconocida, dar lugar a resultados cuantitativos
exactos incluso para bandas muy estrechas.
49
Instrumentacin
Error = 0.0 UA
Absorbancia [UA]
50
Instrumentacin
T = ( I + Is ) ( Io + Is )
51
Instrumentacin
Figura 35
Efecto de la luz dispersa sobre la absorbancia medida de la muestra
52
Instrumentacin
Rango dinmico lineal Una especificacin citada con frecuencia y, a menudo, mal
entendida, es el rango del instrumento. En la mayora de los
casos, ste es simplemente el rango numrico que un
instrumento puede mostrar. Una especificacin ms til es
el rango dinmico lineal que especifica para una desviacin
aceptable de la linealidad (en porcentaje de absorbancia),
los valores mnimo y mximo de absorbancia.
Pueden calcularse los errores potenciales a diferentes
absorbancias, a partir de la luz dispersa y el ruido.
( A t Am )100 At
At = log ( I I o )
Am = log [ ( I + I s ) ( I o + I s ) ]
donde Io es la intensidad de luz incidente, I es la intensidad
de luz transmitida y Is es la intensidad de luz dispersa. La
Figura 35 muestra el error debido slo a la luz dispersa.
y A m = A t + T 100 A pn + A en
o Am = T 100 A pn A en
53
Instrumentacin
Absorbancia [UA]
Figura 36
Error de absorbancia terica frente a absorbancia
54
Instrumentacin
Error
Absorbancia [UA]
Figura 37
Efecto de la deriva sobre los valores de absorbancia medida
55
Instrumentacin
56
captulo 3
captulo 3 Tratamiento y
medida de
muestra
57
Tratamiento y medida de muestra
Muestras lquidas
58
Tratamiento y medida de muestra
Slice
fundida
Transmitancia [%]
Cuarzo
fundido
Plstico Vidrio
acrlico
Vidrio
ptico
Figura 38
Caractersticas de transmisin ptica de los materiales de cubetas
Tipos de cubeta Existe una amplia gama de cubetas pero aqu slo se
describen las ms importantes. La cubeta ms utilizada es la
rectangular abierta (Figura 39a). Estas cubetas pueden
tener pasos pticos de 1 a 100 mm, pero el ms popular es
10 mm. Casi todas las cubetas rectangulares tienen una
59
Tratamiento y medida de muestra
Fuentes de error
60
Tratamiento y medida de muestra
Cuidado de las cubetas Las cubetas deben manejarse cuidadosamente para evitar
araarlas. Debe evitarse tocar las superficies pticas con
los dedos, ya que la grasa de las huellas dactilares puede
absorber significativamente. Si las superficies pticas de la
cubeta estn ligeramente sucias, pueden limpiarse con un
pauelo de papel fotogrfico. Si la cubeta est muy
contaminada, puede limpiarse con un detergente sulfnico
suave o con un lquido especial de limpieza. En casos
extremos, puede utilizarse un tratamiento con cido
clorhdrico o ntrico.
61
Tratamiento y medida de muestra
Longitud de onda
Disolvente Polaridad* de corte (nm)** Riesgos***
Efecto del disolvente, Varios factores, que incluyen el disolvente utilizado, junto
concentracin, pH y con la concentracin, pH y temperatura de la muestra,
temperatura pueden afectar a la posicin e intensidad de las bandas de
absorcin de las molculas. Estos parmetros deben
controlarse para asegurar mxima precisin y para poder
comparar espectros medidos bajo diferentes condiciones.
La polaridad de un disolvente puede modificar el entorno
electrnico de un cromforo absorbente. En general, la
magnitud de la variacin puede correlacionarse con la
62
Tratamiento y medida de muestra
63
Tratamiento y medida de muestra
64
Tratamiento y medida de muestra
Indice de refraccin
Figura 41
Efecto del ndice de refraccin
65
Tratamiento y medida de muestra
Area fotosensible
Detector Detector
Figura 42
Efecto de una geometra no plana de la muestra
66
Tratamiento y medida de muestra
Promedio de tiempo
1.6 seg
67
Tratamiento y medida de muestra
S/N
Seal
Ruido
Absorbancia
Absorbancia
Longitud de onda # de puntos
NBW Rango
ptimo
Figura 44
Efecto del promedio de longitud de onda sobre S/N
68
Tratamiento y medida de muestra
Figura 45
Cambio de longitud de onda para aumentar el rango dinmico
Interferencia
69
Tratamiento y medida de muestra
70
Tratamiento y medida de muestra
Absorbancia [UA]
dispersin Tyndall
dispersin Rayleigh
Figura 47
Espectros de dispersin
Tcnicas de correccin Pueden utilizarse varias tcnicas para eliminar o reducir los
errores de interferencia. En general, si el origen del error es
conocido y reproducible entre muestras, puede eliminarse.
Por el contrario, si el origen es desconocido y vara de
muestra a muestra, el error puede reducirse pero no
eliminarse. Las tcnicas de correccin siempre requieren
datos de al menos dos longitudes de onda. Las tcnicas ms
sofisticadas requieren datos multilongitud de onda o
espectrales.
71
Tratamiento y medida de muestra
Figura 48
Correccin de isoabsorbancia
72
Tratamiento y medida de muestra
Espectro
medido
Absorbancia [UA]
Espectro extrapolado
de dispersin
Figura 49
Modelo de fondo
73
Tratamiento y medida de muestra
Espectro a
Espectro b
Absorbancia [UA]
Figura 50
Referencia interna
74
Tratamiento y medida de muestra
Espectro
medido
Absorbancia [UA]
Figura 51
Correccin de tres puntos (Morton-Stubbs)
75
Tratamiento y medida de muestra
n 1
D -------n .
W
Por lo tanto, para dos bandas coincidentes de igual
intensidad pero diferente anchura en el orden cero, la
amplitud de la derivada n de la banda ms aguda (X) es
mayor que la de la banda ms ancha (Y), en un factor que
depende de la anchura de banda relativa y del orden de la
derivada:
n n
DX WY
--------- = ---------
-
n n
DY DX
La Figura 52 muestra el efecto de tomar las derivadas de
dos bandas con NBW de 160 y 40 nm, respectivamente. En
modo absorbancia, estas bandas tienen igual amplitud. En
la primera derivada, la banda ms estrecha tiene 4 veces
mayor amplitud y, en la segunda derivada tiene 16 veces
mayor amplitud. Esta propiedad mejora la exactitud de la
cuantificacion de cualquier componente de banda ancha.
Este ltimo puede ser un componente intereferente, como
se muestra en la Figura 52.
76
Tratamiento y medida de muestra
Absorbancia
Primera derivada
Segunda derivada
Figura 52
Discriminacin de bandas anchas en espectroscopa derivada
77
Tratamiento y medida de muestra
Absorbancia
Espectro medido
Espectro actual
Primera derivada
Figura 53
Correccin de la dispersin por espectroscopa derivada
78
Tratamiento y medida de muestra
Problemas
fotoqumicos
Longitud de onda de
Espectro medido con
excitacin ptica convencional
Espectro medido con
ptica inversa
Absorbancia [UA]
Longitud de onda
de emisin
Figura 54
Efecto de la fluorescencia sobre el espectro medido de absorbancia
79
Tratamiento y medida de muestra
80
captulo 4
captulo 4 Desarrollo y
validacin del
mtodo
81
Desarrollo y validacin del mtodo
82
Desarrollo y validacin del mtodo
A = kc
83
Desarrollo y validacin del mtodo
Posibles curvas
ica ic a
t e
r de calibracin reales t er
ci
n in
br a Absorbancia medida ib rac
ali l
Absorbancia [UA]
a
e c de la muestra d ec
ad rva
Absorbancia medida
C urv Cu
del patrn
Posibles resultados
Concentracin conocida de cuantificacin
del patrn
Concentracin Concentracin
Figura 56
Errores potenciales resultantes de una calibracin inadecuada
84
Desarrollo y validacin del mtodo
Rango
ptimo
Figura 58
Seleccin de las longitudes de onda para la mejor linealidad
85
Desarrollo y validacin del mtodo
A = a + kc
2
A = kc + kc
y
2
A = a + kc + kc
86
Desarrollo y validacin del mtodo
87
Desarrollo y validacin del mtodo
Absorbancia [UA]
Concentracin
Figura 59
Seleccin de las longitudes de onda para la mejor exactitud
88
Desarrollo y validacin del mtodo
Nmero de medidas
Figura 60
Determinacin de la precisin de un anlisis
89
Desarrollo y validacin del mtodo
90
Desarrollo y validacin del mtodo
Absorbancia [UA]
Rango
% RSD
ptimo
Figura 61
Seleccin de las longitudes de onda de mejor sensibilidad
91
Desarrollo y validacin del mtodo
92
Desarrollo y validacin del mtodo
Absorbancia [UA]
Concentracin [mg/l]
Figura 62
Seleccin de la longitud de onda para la mejor selectividad
93
Desarrollo y validacin del mtodo
94
captulo 5
captulo 5 Operacin de
rutina
95
Operacin de rutina
Verificacin del En los ltimos aos, las normas de calidad indicadas por la
rendimiento del ISO 9000 (BS 5750), las Buenas Prcticas de Laboratorio
(GLP), las Buenas Practicas de Fabricacin (GMP) y el
instrumento United Kingdom National Measurement Accreditation
Service (NAMAS) han cobrado una gran importancia. Como
consecuencia, en la industria farmacutica, las recomen-
daciones contenidas en las farmacopeas tambin han
alcanzado mayor influencia. La verificacin del rendimiento
continuo y apropiado de los espectrofotmetros UV-visible,
es un elemento clave de estos requisitos de calidad.
96
Operacin de rutina
Patrn de absorbancia
Patrn de
Absorbancia [UA]
longitud de onda
Figura 63
Espectros ideales de patrones de absorbancia y longitud de onda
97
Operacin de rutina
98
Operacin de rutina
Transmitancia [%]
Figura 64
Espectro ideal de un filtro de luz dispersa
99
Operacin de rutina
LLanura de la lnea de base Medir el ruido a todas las longitudes de onda, normalmente,
no es practicable. Sin embargo, la llanura de la lnea de base
indica el ruido relativo a todas las longitudes de onda y
revela aquellas con problemas instrumentales resultantes
del cambio de filtro o fuente, por ejemplo.
La llanura de lnea de base se mide, normalmente, a
absorbancia cero.
100
Operacin de rutina
101
Operacin de rutina
Cristal de xido de Patrn de longitud de Picos a muchas longitudes de onda de La posicin de los picos vara de lote a lote
holmio onda 280 a 2000 nm
Cristal de xido de Patrn de longitud de Picos a muchas longitudes de onda de La posicin de los picos vara de lote a lote
didimio onda 400 a 1920 nm No hay picos por debajo de 400 nm
Granate de neodimio Patrn de longitud de Picos a muchas longitudes de onda de No hay picos por debajo de 350 nm
ytrio aluminio onda 350 a 1000 nm
Cristal de densidad Patrn fotomtrico Perfil de absorbancia muy llano en el No es adecuado para el rango UV
neutra rango visible de longitud de onda No es absolutamente estable; debe
recalibrarse regularmente
Metal sobre cuarzo Patrn fotomtrico Perfil de absorbancia muy llano en los Problemas frecuentes por error de
rangos UV y visible de longitud de onda interreflexin
Sensible a la temperatura
No es muy estable; debe recalibrarse
regularmente
102
Operacin de rutina
Oxido de holmio en cido Patrn de longitud de Picos a muchas longitudes de onda No hay picos utilizables por encima de
perclrico onda de 240 a 650 nm 650 nm
Oxido de samario en cido Patrn de longitud de Picos a muchas longitudes de onda No hay picos utilizables por encima de
perclrico onda de 300 a 500 nm 500 nm
Benceno (vapor) Patrn de longitud de Picos muy estrechos de 230 a 260 nm Rango muy limitado de longitud de
onda onda
Dicromato potsico en cido Patrn fotomtrico Picos anchos a 257 y 350 nm y valles No absorbancia en el rango visible
perclrico o sulfrico anchos a 235 y 313 nm Muy sensible al pH y, como agente
oxidante potente, puede ser inestable
Mezcla de sales de cobalto y Patrn fotomtrico Picos a 302, 395, 512 y 678 nm que Bandas ms bien estrechas, la exacti-
nquel cubren las regiones UV y visible tud de puede afectar a los resultados
Disolucin de nitrito sdico (50 g/l) Luz dispersa Cortes a 390 nm Ninguna
Usado para medir luz dispersa a
340 nm o inferior
103
Operacin de rutina
Disolucin de cloruro potsico Luz dispersa Cortes a 200 nm Como la medida se realiza en el lateral
(12 g/l) Usado para medir luz dispersa a de la pendiente de corte, los errores de
220 nm o inferior exactitud de pueden afectar a la
medida de luz dispersa
Tolueno en hexano Resolucin Fcil mtodo emprico usando pico Slo puede usarse para determinar la
(269 nm) y valle (266 nm) del resolucin en un punto del espectro.
espectro del tolueno Puede variar con
104
Operacin de rutina
Longitud de onda
(nm) A (1 por ciento, 1 cm) Tolerancia mxima
105
Operacin de rutina
106
Operacin de rutina
930 Filtros de cristal de densidad Este SRM es para la verificacin y calibracin de las escalas de transmitancia y absorbancia de
neutra espectrofotmetros de absorcin visible.
931 Disolucin de cobalto y nquel en Este SRM es para la verificacin y calibracin de las escalas de absorbancia de
mezcla de cido ntrico y espectrofotmetros de absorcin ultravioleta y visible con pasos de banda estrechos.
perclrico
935 Dicromato potsico slido para Este SRM es para la verificacin y calibracin de las escalas de absorbancia de
preparar la disolucin de test espectrofotmetros de absorcin ultravioleta.
2031 Metal sobre cuarzo Este SRM es para la verificacin y calibracin de las escalas de transmitancia y absorbancia de
espectrofotmetros de absorcin ultravioleta y visible.
2034 Disolucin de xido de holmio en Este SRM es para utilizar en la verificacin y calibracin de la escala de longitud de onda de
cido perclrico espectrofotmetros de absorcin ultravioleta y visible con anchuras de banda espectral
nominal que no exceden 3 nm.
2032 Ioduro potsico slido para Este SRM se utiliza en la valoracin de la energa radiante dispersa heterocrmica (luz dispersa)
preparar la disolucin de test en espectrofotmetros de absorcin ultravioleta.
107
Operacin de rutina
Tabla 8 Parmetros de test y patrones usados por las principales agencias reguladoras
NIST
Tipo de test Patrn USP SRM EP ASTM
Vapor de benceno X
108
Operacin de rutina
109
Operacin de rutina
Absorbancia [UA]
Figura 65
Espectro de disolucin de perclorato de holmio
110
Operacin de rutina
SBW
451.30 451.30
111
Operacin de rutina
Absorbancia [UA]
Figura 66
Espectro del dicromato potsico
112
Operacin de rutina
Transmitancia [%]
Figura 68
Espectro de tolueno en hexano
113
Operacin de rutina
Relacin de la absorbancia a
269 nm a la absorbancia a
SBW (nm) 266 nm
0.25 2.30
0.50 2.20
1.00 2.00
2.00 1.40
3.00 1.10
4.00 1.00
114
Operacin de rutina
Idoneidad del La idoneidad del sistema est diseada para evaluar los
sistema componentes del sistema analtico, para verificar que el
rendimiento del sistema cumple los estndares requeridos
por el mtodo. La idoneidad del sistema no debe
confundirse con la validacin del mtodo. Mientras la
validacin se realiza una vez al finalizar el desarrollo del
mtodo, los tests de idoneidad del sistema se ejecutan
peridicamente para determinar si todo es adecuado y/o su
eficacia. Los requisitos de idoneidad del sistema estn bien
definidos para los sistemas cromatogrficos pero no para
los sistemas de espectroscopa UV-visible.
En la prctica, los analistas han desarrollado sus propias
estrategias para realizar los test de idoneidad del sistema en
instrumentos UV-visible. Dos ejemplos son:
A. Medir y calibrar utilizando un patrn de concentracin
igual al 100 % de la concentracin del componente
esperado. Entonces, medir y cuantificar el patrn diluido
por un factor de dos. Los resultados de ambas muestras
deben caer dentro de un porcentaje especificado de la
concentracin conocida. Volver a medir el patrn confirma
la exactitud de la medida inicial.
B. Primero medir el patrn y a continuacin, una serie de
diluciones del mismo y calcular el coeficiente de extincin
(absorbancia dividida por concentracin) para cada
concentracin. Los valores de los coeficientes de extincin
no deben variar ms de un porcentaje especificado.
115
Operacin de rutina
116
Operacin de rutina
Cafena
Absorbancia [UA]
Acido saliclico
117
Operacin de rutina
Correlacin = 0.999
Normalizado
Patrn
Desconocido
Desconocido
Correlacin = 0.056
Normalizado
Patrn
Figura 70
Grficos comparativos de espectros similares y distintos
118
Operacin de rutina
Estadsticas Una sola medida no tiene un alto grado de validez. Todas las
medidas incluyen cierta predisposicin y variacin aleatoria
debidas al ruido. Aunque esta predisposicin puede
detectarse utilizando tcnicas como las descritas
anteriormente, el ruido tambin puede dar lugar a errores
significativos. Siempre debe estimarse la precisin de los
resultados realizando mltiples medidas y calculando la
media y la desviacin estndar de sta. La desviacin
estndar es un indicador de la validez de una medida.
Controlar los cambios de la desviacin estndar con el
tiempo, puede ser til para diagnosticar muchos problemas
de medida.
119
Operacin de rutina
120
apndice A
apndice A Exactitud y
precisin
121
Exactitud y precisin
Figura 71
Ejemplo de precisin y exactitud
122
apndice B
apndice B Caractersticas
de los
espectrofotmetros
de diodos
123
Caractersticas de los espectrofotmetros de diodos
Figura 72
Espectros de la hidrlisis de sultona
124
Caractersticas de los espectrofotmetros de diodos
125
Caractersticas de los espectrofotmetros de diodos
126
Caractersticas de los espectrofotmetros de diodos
127
Caractersticas de los espectrofotmetros de diodos
128
Caractersticas de los espectrofotmetros de diodos
129
Caractersticas de los espectrofotmetros de diodos
130
apndice C
apndice C Referencias
131
Referencias
132
Referencias
133
Referencias
134
indice
indice
135
Indice
136
Indice
137
Indice
138
s1