DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE CIDO ASCRBICO

EN UCHUVA (Physalis peruviana L.), POR CROMATOGRAFA

LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (CLAR)

ASCORBIC ACID DETERMINATION IN GOOSEBERRY

(Physalis peruviana L.), FOR HIGH-PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

TANIA M. GUTIRREZ1, OLGA L. HOYOS2 Y MARTHA I. PEZ3

PALABRAS CLAVE: RESUMEN

cido ascrbico, cromatografa l-
quida de alta resolucin, uchuva,
estandarizacin y extraccin.
KEY WORDS:
Ascorbic acid, high-performance
liquid chromatography, gooseberry,
standardization and extraction
____________
El cido ascrbico (AA) es una vitamina esencial en la dieta humana, y su
determinacin por tcnicas sensibles y rpidas, es importante para evaluar su
estabilidad en diferentes alimentos. Actualmente la bsqueda de fuentes na-
turales de AA, reviste gran inters por las caractersticas antioxidantes de la
vitamina; la uchuva (Physalis peruviana L.), fruto silvestre de los Andes
suramericanos, registra contenidos de 20 a 32 mg de AA por cada 100 g de
pulpa, siendo as, un cultivo promisorio para incluir en los registros de las
fuentes comunes de esta vitamina. El objetivo principal de este estudio, fue
encontrar las condiciones ptimas para la extraccin, identificacin y
cuantificacin por cromatografa lquida de alta resolucin (CLAR) del AA
presente en la uchuva (Physalis peruviana L.); para ello se analizaron diferen-
tes metodologas reportadas para el proceso de extraccin. Por el mtodo del
cido fosfrico se encontraron porcentajes de recuperacin entre el 92,36 y
100,4 %; las condiciones de operacin ms adecuadas para la cuantificacin
del AA por CLAR, fueron, fase mvil: NaH2PO4 al 1 % pH = 2,7; fase estacio-
naria: Hypersil C18 ODS 5 m x 4,0 mm x 250 mm; longitud de mxima
absorcin: 265 nm y un flujo: 0,9 mL/min. La metodologa de cuantificacin
present linealidad, precisin, exactitud y sensibilidad a un nivel de confianza
del 95%. El contenido de AA determinado para la uchuva fue de 0,3320 mg ( s 0,0262)/
g de muestra, la estandarizacin del mtodo de cuantificacin del AA por CLAR
ofrece la oportunidad de realizar posteriores investigaciones acerca de la estabilidad
de la vitamina en la uchuva.

Recibido para evaluacin: Diciembre 5 de 2006. Aprobado para publicacin: Febrero 5 de 2007

1 Magster en Ciencias Qumica, Universidad del Valle, Departamento de Qumica, Grupo de Investigacin en Contaminantes Ambientales
y Plaguicidas
2 Doctora en Ciencias Qumica, Universidad del Cauca, Departamento de Qumica, Grupo de investigacin en Qumica de Productos
Naturales
3 Doctora en Ciencias Qumica, Universidad del Valle, Departamento de Qumica, Grupo de investigacin en Contaminantes Ambientales y
Plaguicidas

Correspondencia: Tania Gutirrez: e_mail: tgutierrez@unicauca.edu.co

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Vol 5 No.1 Marzo 2007 71

ABSTRACT

The ascorbic acid (AA) it is an essential vitamin in the human diet, and their determination for sensitive and quick
technical, it is important to evaluate their stability in different foods. At the moment the search of natural sources of
AA, had great interest for the antioxidants characteristics of the vitamin; the gooseberry (Physalis peruviana L.),
tropical fruit of the South American Andes, registers contents from 20 to 32 mg of AA for each 100 g of pulp, being
this way, a promissory cultivation to include in the registrations of the sources common of this vitamin. The main
objective of this study, was to find the optimize conditions for the extraction, identification and quantification by
high-performance liquid chromatography (HPLC) of the present AA in the gooseberry (Physalis peruviana L.); for
they were analyzed it different reported methodologies, for the extraction process. The phosphoric acid method, of
they were recovery percentages between the 92,36 and 100,4 %; the most appropriate operation conditions for the
quantification of AA for HPLC, were: Mobile phase: NaH2PO4 to 1 % pH = 2,7; Stationary phase: Hypersil C18 ODS 5
m x 4,0 mm x 250 mm; Maximum absorption wavelength of: 265 nm and a Flow: 0,9 mL/min. The quantification
methodology presented linealidad, precision, accuracy and sensibility at a level of trust of 95 %. The content of
certain AA for the gooseberry was of 0,3320 mg ( 0,0262)/g sample, the standardization of the method of
quantification of the AA for HPLC offers the opportunity to carry out later investigations about the stability of the
vitamin in the gosseberry.

INTRODUCCIN dacin trmica en jugos y frutas naturales, bajo diferen-

El cido ascrbico (AA) es un nutrimento esencial para
los humanos. Una baja ingesta causa una enfermedad,
por deficiencia, conocida como escorbuto. Este cido
esta presente en forma natural en muchas frutas y verdu-
ras, adems, estos alimentos son ricos en vitaminas
antioxidantes, compuestos fenlicos y carotenos [1, 2].
tes condiciones de tratamiento; por ejemplo, la oxida-
cin del AA al cido dehidroascrbico y dicetogulnico,
hace que se pierda la actividad vitamnica, razn por la
cual, el seguimiento de la variacin en la concentracin
del AA en alimentos, es relevante para establecer los
mecanismos que afectan su estabilidad y por tanto in-
fluyen en el tiempo de vida til de los mismos.

La Food and Drug Administration (FDA, Direccin de
Alimentos y Medicamentos), clasifica el cido ascrbico
sinttico como un aditivo alimenticio "generalmente re-
conocido como seguro". Se adiciona a una amplia va-
riedad de alimentos, tanto por razones nutricionales
como tcnicas.
Entre las funciones del AA, estn la fijacin del oxge-
no: Cuando los alimentos se embotellan o se enlatan
estos contienen oxgeno, que podra reaccionar con
varias molculas del alimento, provocando rancidez,
prdida de color, entre otras caractersticas. Al agregar
AA, este fija o elimina el oxgeno, como se observa en la
figura 1.
Adems la fijacin de radicales libres y control del
pardeamiento, [3 ], hacen que esta vitamina sea uno de
los aditivos ms empleados en la industrial de los ali-
mentos.
El AA, es conocido como una vitamina termolbil; va-
rios autores, [4, 5] han estudiado la cintica de degra-
La uchuva es una fr uta tpica de los Andes
Suramericanos, per tenece a la familia de las
solanceas y el gnero Physalis; cuenta con ms de
ochenta variedades que se encuentran en estado sil-
vestre. La uchuva es la especie ms conocida de este
gnero y se caracteriza por tener un fruto azucarado y
con buenos contenidos de vitaminas A y C (AA 20
mg/100 g de fruta), adems de hierro y fsforo. Su
jugo, presenta valores de pH entre 3,6 a 4,1; ste
parmetro favorece la estabilidad del AA en la fruta,
frente a procesos de oxidacin, tratamientos trmi-
cos, exposicin a la radiacin, etc.
La determinacin de AA por diferentes tcnicas analti-
cas, ha sido ampliamente estudiada, teniendo en cuenta
las propiedades fisicoqumicas de la molcula. (6,7)
Torregrosa (8,9) cuantifica el AA en jugos de naranja y
zanahoria por tcnicas polarogrficas, dadas las carac-
tersticas redox del analito; empleando la gota de mer-
curio como electrodo de trabajo, pulso diferencial con
velocidad de barrido de 10 mV/s y cuantificacin por
adicin estndar.

72
Figura 1. Reaccin del cido ascrbico con el oxgeno (3).
2+

&+
2+
2 2
+ +
2
+2 2+
El uso de la espectroscopa Ultravioleta-Visible (UV-Vis),
para la determinacin del AA, es ampliamente utilizada
en investigaciones con alimentos, [10,11], pues este
cido presenta transiciones electrnicas fuertes en la
regin UV, facilitando su identificacin y cuantificacin
por esta tcnica.
Sin embargo, la cromatografa lquida de alta resolu-
cin (CLAR), garantizan lmites de deteccin y
cuantificacin ms bajos, que facilita adems la elimi-
nacin de los efectos causados por la matriz
(interferencias en otras mtodos de anlisis); esta tcni-
ca se utilizan como herramienta esencial en los estudios
cinticos detallados [12,13,14 ].
El objetivo de este estudio fue realizar la optimizacin
del mtodo de extraccin, identificacin y cuantificacin
del AA en la uchuva (Physalis peruviana L.), por CLAR;
teniendo en cuenta que la informacin sobre la estabili-
dad de esta vitamina en la uchuva es incipiente.
La tcnica cromatogrfica fue utilizada posteriormente
para evaluar la cintica de degradacin trmica y lumnica
del AA en la uchuva [15].
METODOLOGA
Reactivos. Los reactivos empleados para el desarrollo
experimental fueron todos grado analtico. Las solucio-
nes patrn de AA se prepararon con: L-ascrbico 99,9
%, Aldrich Chemical Co, Inc; dichas soluciones se pre-
pararon con cido fosfrico 0,05 N en agua deionizada:
cido fosfrico, Merck, 85 %. Se trabaj con cido
sulfrico: Iso Merck, 95 - 97 %, Fosfato monobsico de
potasio: Mallinckrodt, 99,5 %, para la extraccin de la
vitamina en la fruta.
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2+
&+
2+
2 2
+ 2
2 2
Las fases mviles empleadas para optimizar la elucin
del AA en el cromatgrafo de lquidos fueron: Fosfato
de sodio monobsico: Mallinckrodt, 99,2 %, Metanol
HPLC: Fischer, Chem Alert, 99,9 % y Acetonitrilo HPLC:
Fischer, Chem Alert, 99,9 %. Todas las soluciones se
prepararon con agua deionizada (sistema EQ-millipore),
cuya conductividad registr valores entre 0,5 a 0,8 S.
La muestra de uchuva para los anlisis, fue recolectada
en el cabildo El Cacique ubicado a 3128 m.s.n.m, el
cual pertenece al resguardo indgena de Guambia en
Silvia, departamento del Cauca (Colombia). El cultivo
estaba constituido por 500 plantas de uchuva distribui-
das aleatoriamente entre cultivos de maz, de las cuales
se seleccionaron 50 plantas de un lote de 6 x 13,5 m, de
7 meses de edad, para el estudio.
Teniendo en cuenta la distribucin aleatoria de las plan-
tas, se realiz un barrido entre filas, tomando en prome-
dio seis uchuvas por planta, para obtener al final del
recorrido una muestra compuesta. Las uchuvas reco-
lectadas con cliz de color amarillo se cortaron con tije-
ras, realizando corte transversal del pednculo; una vez
obtenida la muestra compuesta, sta se almacen en
una nevera de icopor de dos pisos, para evitar que las
300 uchuvas presentaran algn tipo de dao mecnico.
Instrumentacin: Cromatografa Lquida de Alta Re-
solucin, (CLAR). Para la adecuacin del mtodo de
identificacin y cuantificacin de AA en uchuva, se uti-
liz un Cromatgrafo de Lquidos HP 1100 series -
desgasificador G1322A, bomba cuaternaria G1311A,
detector UV-Vis G1314A, columna Hypersil ODS C18 -5
m x 4,0 mm x 250 mm.
Los equipos requeridos para el proceso de extraccin
fueron: Planchas Corning PC 420, Centrifuga Sorvall
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T6000B, Liofilizador Labconco Freeze dryer 4,5
micrones Hg, pH-Meter 744 Metrohm, Balanza Analtica
Precisa XT 220 A (0,001g), Licuadora Ozterizer con as-
pas de acrlico. Las muestras de uchuva y las solucio-
nes patrn fueron almacenas en una Incubadora
Precision 815 a 4,0 s 0,1 C.
Extraccin del cido Ascrbico en Uchuva (Physalis
peruviana L.). En la optimizacin del procedimiento de
extraccin del AA de la fruta (se trabaj con todo el fruto
comestible, sin cliz), se evaluaron tres metodologas
diferentes; el procedimiento de Johnston propone la
maceracin y posterior liofilizacin, adems de la ex-
traccin con una solucin tampn de acetato de sodio,
filtracin e inyeccin, por triplicado, al cromatgrafo de
lquidos [16]. El segundo y tercer mtodo consisti en
la extraccin con Agua-cido sulfrico y con cido fos-
frico 0,05 N respectivamente, [17]; se realiz una ex-
traccin slido-lquido por espacio de 30 minutos, al
trmino de los cuales se centrifug a 6000 r.p.m por 20
min, posteriormente se realiz la separacin de la fase
acuosa; se filtr, se afor e inyect, por triplicado al
cromatgrafo de lquidos.
Para los anlisis se trabaj con un tamao de muestra
de 25,5020 g de fruta; con la tcnica de extraccin ade-
cuada se optimiz el volumen del solvente extractor, entre
60 y 120 mL.
Cuantificacin de cido Ascrbico por CLAR. Con
una solucin patrn de AA de 50 mg/L en cido fosf-
rico 0,05 N y teniendo en cuentas los diferentes repor-
tes, (16,18,19), acerca de las condiciones para la
cuantificacin de AA en jugos y frutas, se optimiz la
fase mvil y la longitud de onda del detector (barrido
entre 200 a 320 nm), para obtener la mayor sensibilidad
y resolucin en la seal cromatogrfica. Para ello se
realizaron ensayos con las siguientes fases mviles:
- KH2PO4 2 %, pH = 2,3
- Acetonitrilo-Agua, (70:30)
- NaH2PO4 1 %, pH = 2,7
- Metanol-Solucin reguladora de: KH2PO4
0,03 M, pH = 2,7, (99:1)
- Agua-Metanol-Acetonitrilo (74,4: 25,0: 0,6)
Se realizaron ensayos de curva de adicin estndar y
curva de calibracin con patrones de AA entre 1,0 a
25,0 mg/L en cido fosfrico 0,05 N, para determinar el
efecto matriz en el mtodo de cuantificacin.
73
Rango de Linealidad: Se evalo la linealidad de la curva
de cuantificacin con las soluciones patrn de AA, entre
1,0 y 25, 0 mg/L, con un criterio de linealidad de R 
0.990, R2 0.980 y Coeficiente de variacin CV 5,00
%. Cada patrn se inyect por triplicado y se relacion el
rea del pico cromatogrfico vs. concentracin del AA.
Precisin: La precisin hace referencia a la reprodu-
cibilidad y repetibilidad de un conjunto de medidas reali-
zadas con el mismo mtodo de cuantificacin [20].
Repetibilidad: Con una solucin de 10,0 mg/L de AA y
teniendo en cuenta que el analito es una vitamina sensi-
ble a la degradacin por cambios de temperatura y radia-
cin, se prepar cada da un patrn fresco, el cual se
someti al anlisis en las mismas condiciones de opera-
cin (Siempre el mismo operador, equipo, laboratorio y
en pequeos intervalos de tiempo). El criterio establecido
de repetibilidad fue un CV 5,00 %.
Reproducibilidad: La concordancia entre dos resultados
individuales obtenidos con el mismo mtodo sobre una
solucin patrn de AA de 10,0 mg/L fue sometida al en-
sayo, pero en condiciones diferentes (Operadores, equi-
pos, laboratorios y/o pocas diferentes), [21].
Sensibilidad: Para el parmetro de sensibilidad se evalo
el lmite de deteccin y de cuantificacin. Experimental-
mente, se utilizaron los lmites de confidencia de la regre-
sin, empleando cinco soluciones patrn de AA de 0,1;
0,2; 0,3; 0,5 y 1,0 mg/L.
Exactitud: Una solucin patrn de 10,0 mg/L de AA certifi-
cada se tom como referencia para determinar la exactitud
del mtodo de cuantificacin, realizando inyecciones por
triplicado de dicho patrn en el cromatgrafo de lquidos.
Estabilidad de las soluciones patrn de cido
Ascrbico. Teniendo en cuenta que el AA se degrada
fcilmente por diversos factores, fue necesario estable-
cer el tiempo y la temperatura en la cual se conserva la
mayor cantidad de analito en su forma activa. Para ello, se
midieron tres soluciones de referencia de 25,0 mg/L de
AA a las 3, 6 y 9 horas despus de su preparacin,
almacenndolas en matraces protegidos de la luz. Ade-
ms se evalo el efecto de cinco temperaturas de almace-
namiento (4, 10, 20, 30 y 40 C), con soluciones patrn
de AA de 20,8 mg/L; se tomaron muestras cada tres ho-
ras y se inyectaron al cromatgrafo de lquidos.

74
Estimacin del contenido de cido Ascrbico en
uchuva (Physalis peruviana L.). Una vez determina-
dos los parmetros de cuantificacin del AA, se prosi-
gui a determinar su contenido en la muestra (Uchuva).
Para ello se tom 12,7510 g (Por triplicado) de uchuva,
y se efecto el mtodo de extraccin correspondiente;
al final el sobrenadante se afor a 100 mL con cido
fosfrico 0,05 N, se filtr con membrana 0.45 m,
se realiz la dilucin correspondiente e inyect al
cromatgrafo de lquidos por triplicado.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Extraccin del cido Ascrbico en uchuva (Physalis
peruviana L.). El AA se clasifica como una vitamina
hidrosoluble, razn por la cual es abundante en frutas
cuyo contenido de agua es superior al 50 %; esta
vitamina se degrada muy fcilmente por cambios de
temperatura, incidencia de la radiacin y concentra-
cin de oxgeno. Su extraccin de fuentes naturales
debe realizarse en medio cido y con la mnima canti-
dad de radiacin.
Utilizando la metodologa indicada por Johnston,[16]
se obtuvo un porcentaje de extraccin del 94,13 % del
cido presente en la fruta. A pesar, que el porcentaje
de extraccin es superior al 85 %, el cromatograma de
la figura 2, indica la aparicin de un hombro en el pico
del AA, lo cual implica una degradacin del cido a
productos intermediarios.
Segn Biancs, [22] la degradacin del cido ascrbico
es grande cuando el contenido de agua decrece por
debajo del 30%.
En otras investigaciones [18] los extractos liofilizados
conservaron mejor el contenido vitamnico en los ali-
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una curva entre la concentracin de AA extrado y el
volumen de cido fosfrico al 0,05 N adicionado (en
mL).
Como puede observarse en la figura 3, a partir de 100
mL de solucin extractora, el contenido de AA comen-
z a permanecer constante para un tamao de muestra
de 25,5020 g; por tal razn, se utiliz la mitad de mues-
tra (12,751 g) y 50,0 mL de solucin extractora para
los anlisis.
Cuantificacin de cido Ascrbico por CLAR. De
acuerdo con la figura 4, la longitud de onda de mayor
sensibilidad. Para la deteccin del AA, fue la de 265
nm, con un rea total de 5218,8 mUA.
La fase mvil de NaH2PO4 al 1% y pH = 2,7 present
picos gaussianos con ancho de banda menor de 0,15
min., a comparacin con otras fases que favorecieron
los fenmenos dispersivo en la columna.
Figura 2. Cromatograma del AA extrado de la uchuva, segn el mtodo
de Johnston, (Inyeccin por triplicado).
 FLGR
 FL
1RUP


 
  

 
 

Figura 3. Extraccin de AA con diferentes volmenes de H3PO4 0,05
N, segn el mtodo de Osuna.


mentos, puesto que el agua es el principal vehculo de 

J
transporte de enzimas y dems sustancias que causan J

el deterioro. An no es claro el mecanismo de prdida P

 
$
del AA en frutas cuando el contenido de agua es mni- $

Q
mo. y
L
F
D 
WU

Con la metodologa de: 1. Agua- cido sulfrico y 2.

Q
H
F
cido fosfrico al 0,05 N, se obtuvieron porcentajes Q
R

de recuperacin del 85,05 y 92,36 - 100,4 %, respec- & 

tivamente. A la metodologa del cido fosfrico al 0,05        

N, se le optimiz la cantidad de solucin extractora 9ROXPHQP/+ 32 1

 
respecto a la cantidad de muestra; para ello, se realiz
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A continuacin se describen las condiciones ptimas La hiptesis nula es, que no existe correlacin entre y e
encontradas para la determinacin del AA por CLAR: x, si el valor calculado de W >W , se rechaza la hip-
H[S WDE
Figura 4. tesis nula, es decir, si existe una correlacin significati-
va. En este caso, R = 0,999, R2 = 0,998 y n = 18, as
- Fase mvil: NaH2PO4 al 1%, pH = 2,7
WWDEes igual a 89,35 que comparado con WWDE[2,12], es
- Fase estacionaria: Hypersil C18 ODS 5m x 4,0 mm
mayor; por lo tanto existe una correlacin significativa
x 250 mm
entre el rea de pico y la concentracin del analito.
- Longitud de mxima absorcin: 265 nm
- Flujo: 0,9 mL/min
En la Tabla 2 se utiliz el dato estadstico Sy/x para cal-
cular la desviacin estndar del intercepto y de la pen-
Rango de linealidad: Los valores entre las pendientes
diente [23].
de la curva de calibracin y adicin estndar no presen-
taron diferencias significativas a un nivel de confianza
Sensibilidad: La sensibilidad corresponde a la mnima
del 95 %, por lo tanto se cuantific por curva de calibra-
cantidad que puede producir un resultado significativo,
cin empleando el mtodo de mnimos cuadrados con
se encuentra definida por los lmites de deteccin y
los datos sin promediar.
cuantificacin. Lmite de deteccin (LD): Existen dife-
rentes conceptos acerca del LD, para un mtodo analti-
En la tabla 1, se hace evidente una buena relacin lineal;
co [24, 25, 26].
sin embargo el mejor indicador del modelo lineal no es
simplemente R.
Tabla 1. Datos cromatogrficos para diferentes concentraciones de
cido ascrbico (mg/L).
Una prueba estadstica de linealidad, consiste en calcu-
lar, el valor de t con n-2 grados de libertad (Ecuacin 1),
y comparar el resultado con el valor de t tabulado para el &RQFHQWUDFLyQ
<H[SH &9
nivel de confianza requerido, que en nuestro caso fue SSP
del 95 %.   
  
Ecuacin 1. Clculo de la t experimental para n-2 grados de libertad.
  
  
  
U (Q  )
 

W=   
( U )

  Ec. (1)
  
  
  
  
Figura 4. Cromatograma de una solucin patrn de cido ascrbico
a:___255,___265,___270 y___275 nm.   
  
 9:'$:DYHOHQJWK QP
  
  
  
P$8


  
  
   
3(1',(17(  

,17(5&(372  
5  
           PLQ
5  

 Facultad de Ciencias Agropecuarias
76 Vol 5 No.1 Marzo 2007

Empleando otra aproximacin, el LD para un analito es El valor determinado de LC fue de 0,3505 mg/L. De
aquella concentracin que proporciona una seal (y) acuerdo con este parmetro, es posible indicar que la
significativamente diferente a la seal de una muestra tcnica de cuantificacin por CLAR para el AA mediante
en "blanco" o "seal de fondo". curva de calibracin, present sensibilidad.

Los resultados obtenidos se evaluaron, calculando la
recta de regresin para definir la respuesta a concentra-
cin cero por extrapolacin al origen de la recta (b).
Posteriormente se determin Sbl que corresponde a la
desviacin estndar del intercepto. As, XLD es la con-
centracin mnima de analito que puede detectar el
espectrofotmetro UV-Vis a 265 nm, la cual se determi-
na por la ecuacin 2. [27].
Ecuacin 2. Determinacin de la mnima cantidad
detectable del cido ascrbico por CLAR.
Exactitud: En la tabla 3, se observan los porcentajes de
error relativo, en la determinacin de una solucin refe-
rencia de 10,0 mg/L de AA. El error es inferior al 3,0 %,
y de acuerdo con los parmetros anteriores, el mtodo
de cuantificacin por curva de calibracin para el AA,
present exactitud.
Precisin: En la tabla 4, puede observarse la repeti-
bilidad del mtodo de cuantificacin del AA, emplean-
do una solucin de referencia de 10,0 mg/L. Los valo-
res de CV indican que el mtodo de cuantificacin por
CLAR presenta repetibilidad.

En cuanto a la reproducibilidad del mtodo se emplearon

 6EO + E  tiempos diferentes de anlisis, (cada 15 das durante dos
; /' = Ec. (2)
P Q meses). La tabla 5, indica que existe reproducibilidad del
mtodo de cuantificacin de AA en el tiempo; hay que
El LD para la determinacin de AA fue de 0,241 mg/L, tener en cuenta que el patrn fue preparado inmediata-
(Otras tcnicas, como la espectrofotomtricas, manejan mente antes de realizar las medidas, puesto que su esta-
LD de 3,2 mg/L con niveles de azcares menores del bilidad para dos meses es mnima.
0,15 %). (11) Lmite de Cuantificacin (LC): El lmite
de cuantificacin o determinacin es considerado como Los valores de % CV son inferiores al 3%, indicando que
el lmite ms bajo para mediciones cuantitativas preci- el mtodo de cuantificacin es reproducible en el tiempo.
sas, y para el AA est dado por:
Estabilidad de las soluciones patrn de cido
Ecuacin 3. Determinacin de la mnima cantidad cuantificable del Ascrbico. El AA presenta inestabilidad en soluciones
cido ascrbico por CLAR. acuosas aisladas, por tal razn stas deben prepararse
inmediatamente antes de ser analizadas por CLAR; de
este modo se obtuvo que: partiendo de una concentra-
 6EO + E  cin inicial de 25,48 mg/L de AA, al cabo de tres horas
; /& = Ec. (3)
P Q
Tabla 3. Determinacin de la concentracin de una solucin referencia
de 10,0 mg/L de cido ascrbico por curva de calibracin.

Tabla 2. Factores estadsticos en la determinacin del error asociado a 'tDV    

la pendiente e intercepto de la ecuacin y = 27,4869.x -7,9002 para el
cido ascrbico.
5e3/,&$6 P8$ P8$ P8$ P8$
    
)DFWRUHVHVWDGtVWLFRV 9DORUHV     
6  \[      
6P      
6E      
WQ   3520(',2    
P   '(69,$&,1    
E   &9    
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Vol 5 No.1 Marzo 2007 77

de preparada la solucin (almacenada en incubadora En la figura 6, se observan dos cromatogramas del AA

a 4,0 0,1 C), se degrad, en promedio el 13 %.
Pasadas seis horas, se determin una prdida del 30%
y a las nueve horas restantes, del 44%; por tal razn se
efectuaron todos los anlisis, tanto de muestras de
uchuva como de patrones, antes de las tres horas de
iniciado el procedimiento.
La temperatura por su parte degrada el AA a su primer
extrado de la uchuva; la determinacin del cido se
realiz por triplicado en una muestra compuesta de
uchuva y su extracto se inyect en el cromatgrafo de
lquido. Las interferencias estn ausentes, pues el pico
presenta gaussianidad, con tiempo de retencin corto,
que favorece la rapidez en la medida.
Tabla 4. Repetibilidad de un patrn de 10,0 mg/L de cido ascrbico
medido en cuatro das consecutivos.

intermediario, el cido dehidroascrbico; as en la fi-

5e3/,&$6 PJ/ PJ/ PJ/
gura 5, se observa el comportamiento de las solucio-
nes patrn de AA (20,8 mg/L), a diferentes temperatu-    
ras de almacenamiento (Aisladas de radiacin).    
   
Las soluciones de AA a 4 y 10 C presentaron una    
cintica de orden cero, es decir, la rata de cambio es    
independiente de la concentracin; sin embargo, hay 3520(',2   
mayor preservacin de la muestra a 4 C, puesto que
'(69,$&,1   
se conserva el 95,0 % de la vitamina inicial al cabo de
9 horas de almacenamiento. &9   
(UURU   
A 10 C se conserva el 88,91 % del AA inicial almace-
nado por 9 horas. Este comportamiento est acorde Tabla 5. Reproducibilidad del mtodo de cuantificacin de un patrn de
con el modelo cintico aplicado a los valores obteni- 10,0 ppm de cido ascrbico medido cada 15 das por dos meses.
dos, donde las pendientes de las curvas indican un
aumento progresivo con la temperatura; esto se tradu- 5e3/,&$6 P8$ P8$ P8$ P8$
ce en el aumento de la constante de rapidez (k), que     
acelera el proceso degradativo del cido.     
    
Las temperaturas de 20, 30 y 40 C, catalizan la de- 3520(',2    
gradacin del patrn con valores de k de 7,04, 7,82 '(69,$&,1  [ ]
 
y 16,7 ppm.h-1 respectivamente; as, a 40 C el AA
&9    
decae completamente a un valor no registrado por el
mtodo de cuantificacin, a un tiempo de 6 horas;

Figura 5. Efecto de la temperatura sobre soluciones patrn de cido
obviamente el valor de k indica una velocidad de re- ascrbico a pH 3,5.
accin bastante alta comparada con otras temperatu-
ras [15].
100
Porcentaje de conservacin (%)

Estimacin de la concentracin de cido Ascrbico

en uchuva por CLAR. En la tabla 6 se indica el conte- 80
4 C

nido de AA en uchuva utilizando el mtodo del cido 60

10 C
20 C
fosfrico; en promedio, la muestra analizada present 30 C
0,332 mg (0,0262) de cido por gramo de muestra 40 40 C

comestible.
20

Acorde con datos nutricionales en variedades andinas

de Sur Amrica, cuyo contenido promedio es de 0,43 0
0 3 6 9
mg; la variedad es un factor relevante en la composi-
cin qumica de la fruta. [28]. 7LH PS R  K R U D V 
 Facultad de Ciencias Agropecuarias
78 Vol 5 No.1 Marzo 2007

Tabla 6. Cuantificacin de cido ascrbico en uchuva. fue de 0,332 mg (0,0262) por gramo de muestra; el
mtodo no present efectos de matriz dadas las condi-
/LPLWHVGH ciones de acidez que favorecen la estabilidad del cido
0XHVWUDV &RQFHQWUDFLyQ
FRQILDQ]D
GHXFKXYD PJJPXHVWUD en el fruto.

  
   AGRADECIMIENTOS
  
 Los autores agradecen a los grupos de investigacin de
Figura 6. Cromatogramas de dos muestras de uchuva, extradas por el
mtodo del cido fosfrico. Qumica de Productos Naturales del Departamento de
Qumica de la Universidad del Cauca y al grupo de Con-
taminantes Ambientales y Plaguicidas del Departamen-
9 :'$ :DY HOHQJWK QP 7$ 1,$ ?9 &)26)'

to de Qumica de la Universidad del Valle por la financia-

P$ 8








cin de esta investigacin.




FLGR$VFyUELFR








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CONCLUSIONES
Teniendo en cuenta los valores estadsticos obtenidos
para la estandarizacin de la tcnica cromatogrfica, po-
demos indicar que la cuantificacin del cido ascrbico,
utilizando el mtodo del cido fosfrico para su extrac-
cin y posterior determinacin por CLAR, bajo las condi-
ciones de Fase mvil: NaH2PO4 al 1%, pH = 2,7; Fase
estacionaria: Hypersil C18 ODS 5 m x 4,0 mm x 250 mm;
Longitud de mxima absorcin: 265 nm y Flujo: 0,9 mL/
min, es un mtodo sensible con lmite de deteccin de
0,241 mg/L y de cuantificacin de 0,3505 mg/L.
Adems de presentar, precisin y exactitud. Las solu-
ciones y las muestras deben analizarse antes de las tres
horas subsiguientes a su preparacin, las cuales deben
almacenarse a 4, 0 0,1 C. Esta metodologa es til
para trabajar con matrices complejas como los alimen-
tos, por su versatilidad y bajo costo. La concentracin
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