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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Facultad de Farmacia y Bioqumica

Escuela Profesional de Farmacia y Bioqumica

SEMINARIO
Departamento Acadmico de Bioqumica

Lisozima

Asignatura: Bioqumica 1

Docente: Dra. Gloria Gordillo

Dra. Amparo Zavaleta

Integrantes:

ACUA LEIVA RODRIGO

MOSTACERO ARANGO LUCERO

Lima
Per
2017
LISOZIMA 1
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LISOZIMA

ESTRUCTURA PRIMARIA

La secuencia de aminocidos en una cadena proteica recibe el nombre de estructura primaria

es la secuencia lineal de residuos de aminocidos en la cadena polipeptdica estando implcito
en esta estructura el enlace peptdico que se forma entre cada uno de los aminocidos en una
secuencia especifica. Esta secuencia esta codificada mediante molculas de ADN, las cuales
determinan su tercera dimensin, la forma que adopta esta protena en su estado nativo; as
como su funcin1. Para el caso de la lisozima su masa molecular es 14.307 Da y compuesta
por una secuencia de 129 residuos aminoacdicos.2

Fig 1. Estructura primaria de la lisozima de CH,se muestran en color violeta los residuos del aminocido que recubre el bolsillo d

ESTRUCTURA SECUNDARIA

La estructura de la lisozima se compone de dos dominios o lbulos, el dominio con los

residuos (1-40 y 90-129) y el dominio (41-89), unidos por una larga -hlice donde se
encuentra el sitio activo. La regin alfa se compone de cinco segmentos helicoidales que son:
hlice A (4-15), hlice B (24-36), hlice C (88-99), hlice D (108-115) y hlice 310 (120-125). La
regin beta laminar con tres cadenas: lmina- (41-60), hlice central 310 (79-84) y un largo
bucle (61-78) (Mine y col., 2004). En la regin alfa tiene dos puentes disulfuro (Cys 6-Cys 127
y Cys 30Cys 115), en el dominio beta posee otro (Cys 64-Cys 80) y el cuarto puente (Cys 76-
Cys 94) se encuentra entre los dos dominios. Estos cuatro puentes disulfuro confieren a la
lisozima una elevada estabilidad trmica (Matsumura y col., 1989). Como es de esperar, la
mayo-ra de las cadenas laterales no polares estn en el interior de la molcula, fuera del
contacto con el solvente acuoso. Adems es una protena estable en soluciones cidas
(Lesnierowski y col., 2007)3.

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Fig 2. Diagrama de cintas de la lisozima, en la izquierda vemos las hlices se muestran como cintas enrrolladas; la

ESTRUCTURA TERCIARIA

La estructura terciaria de la molcula enzimtica presenta un centro activo al que se une el

sustrato. El centro activo constituye un bolsillo de la molcula proteica al que el sustrato est
tan perfectamente adaptado que puede unirse reversiblemente a los aminocidos de la pared
del bolsillo. Estos enlaces son a menudo valencias secundarias, por ejemplo, interacciones
hidrfobas o puente de hidrogeno. Sin embargo, tambin pueden producirse enlaces inicos
entre grupos ionizados de la molcula de sustrato y grupos ionizados de los aminocidos del
bolsillo. 4

El centro activo es una hendidura tridimensional formada por grupos que provienen de
diferentes partes de la secuencia de aminocidos; incluso, residuos muy alejados en la
secuencia de aminocidos pueden interaccionar ms fuertemente que los residuos adyacentes.
En la lisozima, una enzima que degrada las paredes celulares de algunas bacterias, los grupos
importantes en el centro activo son los aportados por los residuos 35, 52, 62, 63, 101 y 108 de
su secuencia lineal de 129 aminocidos.5

La caracterstica ms llamativa de la molcula de la lisozima es una hendidura prominente, el

sitio de fijacin del sustrato, que atraviesa una cara de la molcula. El sitio cataltico de la
lisozima se encuentra divido en seis zonas: A, B, C, D, E y F que a su vez se unen a seis
azcares. En el sitio cataltico se encuentran dos aminocidos que son necesarios para que
ocurra la catlisis que son (Glu 35 y Asp 52) siendo estos los grupos funcionales en el centro
de reaccin de la lisozima que tienen propiedades catalticas requeridas, estos residuos son
invariables en la familia de la lisozima.3

Identificacin de los residuos catalticos

Los grupos importantes para la catlisis de la lisozima se identificaron en forma experimental

mediante la mutagnesis dirigida por el sitio ( seccin 5-5G) y el uso de reactivos especficos
de grupo:

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Glu 35: la mutagnesis de Glu 35 a Gln genera una protena sin actividad cataltica detectable
(< 0.1 % de tipo salvaje), si bien tiene todo solo una disminucin de aproximadamente 1,5
veces la afinidad por el sustrato. Por consiguiente Glu 35 debe ser esencial para la actividad
cataltica de la lisozima.

Asp 52: la mutagnesis de Asp 52 a Asn, que tiene una polaridad comparable a la del Asp pero
carece de su carga negativa, rinde una enzima que no tiene ms del 5 % de la actividad
cataltica de la lisozima del tipo salvaje, aun cuando esta mutacin causa un aumento de
aproximadamente 2 veces en la afinidad de la enzima por el sustrato. Por consiguiente Asp 52
es importante para la actividad cataltica.

Falta de compromiso de otros residuos de aminocidos.

Los otros grupos carboxilo de la lisozima adems de los de Glu 35 y Asp 52 no participan en el
proceso cataltico, como se demostr mediante la reaccin de la lisozima con reactivos
especficos para carboxilo en presencia de sustrato. Este tratamiento rinde una enzima con
actividad casi completa en la que todos los grupos carboxilo menos los de Glu 35 y Asp 52 son
derivados. Otros reactivos especficos de grupos que modifican por ejemplo, residuos de His,
Lys, Met o Tyr solo inducen rupturas no importantes en la estructura de la protena y causan un
cambio pequeo en la eficacia cataltica de la lisozima. 6

Fig 3. Modelo espacial compacto de la lisozima. Ntese lo fuertemente empaquetados que estn los tomos, con muy poco espacio sin rellenar.

FUNCIONES BIOLGICAS

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Hidrolizar enlaces (1-4)

La lisozima es de la clase de enzimas que destruye las paredes celulares de ciertas bacterias
Gram-positivas por ruptura del enlace (1-4) entre el cido N-acetil-murmico (NAM) y N-
acetilglucosamina del peptido-glicano (NAG)], debilitando as la pared celular.

El resultado es la penetracin de agua en la clula que se hincha y acaba por estallar, un

fenmeno denominado lisis.

Fig 4. Formacin de protoplastos en una solucin diluida, la rotura de la pared libera al protoplasto que inmediatamente se lisa p

Actividad antibacteriana de la forma dimrica.

La desnaturalizacin por calor da lugar a una estructura dimrica que conserva dos puentes
disulfuro que siguen reteniendo su actividad ltica frente a las pare-des bacterianas. Esta forma
dimrica tambin llega a formarse durante el almacenamiento de los huevos (Back, 1984).
Estas formas oligomricas de la lisozima de huevo han sido descritas en diferentes trabajos.
Estos dmeros se obtuvieron mediante diferentes mtodos desde desnaturalizacin trmica en
diferentes soluciones, tratamiento con agentes reductores, agentes de unin qumica,
ultrafiltracin, calentamiento con vaco, radiacin, etc., (Ibrahim, 1996 a, b; Lesnierowski y col.,
2004). En algunos de los trabajos se le atribuyen actividades biolgicas a estas formas
dimricas de la lisozima, como por ejemplo actividad antibacteriana frente a bacterias Gram-
negativas y positivas, virus y hongos. Nika Health Products Inc (Patente N US00546649A) ha
desarrollado un sistema de preparacin de un producto puro de dmero de

lisozima para usarlo en tratamientos virales y antibacterianos. Se sabe que el dmero de la

lisozima simula la sntesis de algunas interleucinas y de los interferones alfa y gamma. Adems
tambin modula la generacin de TNF alfa (factor de necrosis tumoral), previniendo los efectos
negativos por cantidades excesivas. El dmero de la lisozima induce la actividad de clulas
fagocticas y tambin previene la produccin de radicales libres. Se ha sugerido que la lisozima
en las clulas del sistema inmunolgico se encuentra en forma dimrica, parece ser que esta
estructura es menos txica que el monmero, y adems ejerce un efecto inmunomodulador. El
dmero de la lisozima es utilizado en veterinaria y medicina. 3

Sistema primario de la defensa: lactancia

Durante la lactacin, la lisozima protege a los bebs frente a infecciones respiratorias y

gastrointestinales. La exposicin a las bacterias en los neonatos ocurre en el tracto
gastrointestinal, la mucosa intestinal no con-tiene normalmente fagocitos o clulas
inmunolgica-mente maduras, por ello tiene que existir un sistema de defensa del organismo.
En el momento del desarrollo del sistema inmune, la leche materna aporta al neo-nato entre
0,3-0,5 g/L de lisozima proporcionando de esta manera una importante defensa frente a los

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microorganismos. Es sabido que la lisozima de la leche humana juega un papel importante en

el sistema inmune de los recin nacidos. Rosenthal y Lieberman (1931) fueron los primeros en
describir la importancia de la lisozima en la flora intestinal de los recin nacidos y lactantes.
Estos autores observaron que el tracto intestinal del recin nacido libre de bacterias en el
momento del nacimiento, era invadido, en un corto periodo de tiempo, por los microorganismos
del medio ambiente. Esta flora inicial desaparece al tercero o cuarto da en los lactantes
alimentados en forma natural y es reemplazada por una flora en la cual pre-domina el
Lactobacillus bifidus. En los nios alimenta-dos en forma artificial no sucede lo mismo,
desarrollndose una flora microbiana intestinal muy variada y sin predominio de ninguna
especie determinada.

Capacidad antignica de la lisozima

Los huevos de gallina se incluyen como uno de los grandes ocho alimentos ms alergnicos,
siendo el ovomucoide (OM) y la ovoalbmina (OVA) los ejem-plos ms tpicos de protenas de
huevo con potencial alergnico. Sin embargo, aunque no se haya estudiado en profundidad, la
lisozima (Gal d4, 14 KDa, 3,5%) es tambin uno de los principales alrgenos de clara de huevo
y se han descrito reacciones clnicas a la lisozi-ma y con frecuencia se han encontrado
anticuerpos IgE anti-lisozima en los pacientes alrgicos de huevo como marcadores de
sensibilizacin.3

Biofabricas de Lisozimas

Es bastante comn entre los seres vivos, pues se ha encontrado enel extracto de distintas plantas,
en tejidos y secreciones de animalessuperiores, donde al parecer sirven de proteccin contra la
invasin demicroorganismos. La actividad de la lisozima ha sido determinada en la clara de
huevoy en suero de adultos, nios, recin nacidos, y en el cordn umbilical; orina de adultosy
nios; fluidos cerebroespinal; jugo gstrico; bilis; saliva; lagrimas; leche materna,fluido
amnitico, esperma, transudados, pus y fluidos pleurales. Tambin la producenalgunas bacterias
(Staphilococcus aureus, Bacillus subtilis) durante la fase estacionaria del crecimiento e
interviene en los procesos de autlisis de estosorganismos. 7

Funciones biolgicas de la lisozima

La lisozima es una enzima presente en las lgrimas y la saliva en donde acta comouna barrera
frente a las infecciones. Tambin es muy abundante en la clara del huevo,de donde se extrae
para su uso industrial, en particular para el control de las bacteriaslcticas en los vinos.La
enzima lisozima es una hidrolasa que cumple funciones de proteccinantibacteriana en nuestro
organismo, ya que hidroliza el enlace glucosdico de lospolisacridos que forman las paredes
celulares de las bacterias.Es capaz de romper los polisacridos complejos que forman las
paredes de muchasbacterias (lisis).

La lisozima es de la clase de enzimas que destruye las paredes celulares de ciertas bacterias
Gram-positivas por ruptura del enlace (1-4) entre el cido N-acetilmurmico (NAM) y N-
acetilglucosamina del peptidoglicano (NAG) [Figura 2], debilitando as la pared celular. El
resultado es la penetracin de agua en la clula que se hincha y acaba por estallar, un fenmeno
denominado lisis [Figura 3].

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Fig 5.- Pared Celular de las bacteria Gram Positivas y Gram Negativas.

La lisozima es casi inactiva frente a microorganismos Gram-negativos por la dificultad de

acceder al peptidoglicano que se encuentra protegido por la membrana externa. Esta propiedad
de hidrolizar el peptidoglicano se conoce como actividad neuraminidasa o muramidasa [Figura
4 (Ibrahim y col., 2002)]. Tambin es importante destacar que en las bacterias Grampositivas el
peptidoglicano representa alrededor del 90 % de la pared celular, mientras que en las
Gramnegativas apenas abarca el 10 %.

Se ha sugerido que la lisozima en las clulas del sistema inmunolgico se encuentra en forma
dimrica, parece ser que esta estructura es menos txica que el monmero, y adems ejerce un
efecto inmunomodulador. El dmero de la lisozima es utilizado en veterinaria y medicina.

Durante la lactacin, la lisozima protege a los bebs frente a infecciones respiratorias y

gastrointestinales. La exposicin a las bacterias en los neonatos ocurre en el tracto
gastrointestinal, la mucosa intestinal no contiene normalmente fagocitos o clulas
inmunolgicamente maduras, por ello tiene que existir un sistema de defensa del organismo. En
el momento del desarrollo del sistema inmune, la leche materna aporta al neonato entre 0,3-0,5
g/L de lisozima proporcionando de esta manera una importante defensa frente a los
microorganismos.8

Peptidoglucano:

La estructura del peptidoglicano (tambin llamado murena) es ligeramente distinta en bacterias

Gram-positivas y Gram-negativas. En Gram-positivas forma una capa mucho ms gruesa que en
Gram-negativas. En ambos casos est formado por:

cadenas lineales de un polisacrido formado por residuos alternativos de N-

acetilglucosamina y N-acetilmurmico unidos mediante un enlace (B 1 ->4)
El N-acetilmurmico est unido a un tetrapptido (segmento de 4 aminocidos) que se
caracteriza por poseer D-aminocidos. La composicin del tetrapptido es ligeramente
distinta en Gram-positivas y Gram-negativas

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Los distintos tetrapptidos estn conectados entre s, bien a travs de puentes

de pentaglicina(pentapptido formado por 5 glicinas), como ocurre en las Gram-
positivas, bien directamente, como ocurre en las Gram-negativas.
De esta forma se genera una estructura rgida, con forma de jaula que rodea la totalidad de la
clula, y que hace del peptidoglicano una de las molculas de mayor tamao que se conocen.

Fig 6.- Peptido glicano de las bacterias.

ACTIVADORES.

Dentro de los activadores de la lisozima tenemos a:

Tabla 1. Activadores de la lisozima.

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INHIBIDORES:

Algunos inbidores de la lisozima son:

Tabla 2. Activadores de la lisozima.

MECANISMOS DE CATLISIS ENZIMTICA.

La lizosima es una hidrolasa que es producida por diversos organismos incluyendo las aves y
los mamferos y que es capz de degradar los enlaces glucosdicos del polmero de N-
acetilglucosamina-N-acetilmurmico, que constituye las paredes celulares de las bacterias
gramnegativas. Gracias a ello es un poderoso antibacteriano.

Como otras muchas enzimas extracelulares es monomrica y posee varios puentes disulfuro que
la convierten en una protena bastante estable, gracias a ello, ha sido fcil de purificar y se
cuenta con numerosos estudios de su mecanismo de catlisis, su cintica y sus propiedades
moleculares.

Las siguientes imgenes muestran la estructura tridimensional de esta protena resulta mediante
anlisis de los patrones de difraccin de Rayos X de los cristales de esta enzima, la que ha sido
estudiada pricipalmente purificada a partir de pollo y de humanos. El modelo de enzima
obtenido en presencia del sustrato posee slo cuatro residuos de N-acetil-quitosa, que en un
inhibidor de la enzima. Pero en la imagen, esta molcula fue reconstruda para completar 6
residuos que son los que se sabe interaccionan con la enzima (por estudios de unidn de
polmeros de n-acetil-glucosamina de diferentes longitudes). La conformacin de los dos
residuos aadidos es aproximada y fue calculada usando Modelado mediante Mecnica-
Molecualr con el campo de fuerzas OPLS.

Para apreciar lo siguiente presione el botn de modelo esquemtico: El bolsillo de unin de esta
protena es una "ranura" que se forma entre dos regiones de la protena que difcilmente podran
considerarse dominios independientes, pero que claramente forman una especie de con la
cubierta semiabierta, en el que el lomo del libro est formado por giros y un par de segmentos

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beta antiparalelos muy cortos, luego, la cubirta posee hojas beta antiparalelas que interactuan
con una pequea alfa hlice y un largo extremo carboxilo terminal con una estructura no clsica
y el bloque de hojas del libro est formado por hlices alfa y giros agrupados en dos motivos
hlice vuelta hlice que se abrazan a travs del cruce del extremo amino.

La siguiente parte se observa en la vista del "bolsillo de unin". La cavidad en forma de V se

encuentra tapizada por una combinacin de grupos polares y grupos apolares que complementa
las regiones polares y apolares del sustrato, que es un polmero de N-actil-Glucosamina. Aqu es
carbono es gris, el oxgeno es rojo y el nitrgeno es azul, por lo que podra reconocer las
regiones polares y apolares de la molcula. En el compleo lisozima NAG-6 se observa como la
conformacin de los residuos de azcar est altenada, de manera que las cadenas de cido
murmico (que deberan unirse al OH 3 de la azcar) quedara viendo hacia afuera de la
protena, es decir, participan poco en la interaccin protena-sustrato. 9

Fig 7.- Mecanismo de sustitucin nucleofilica 2.

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VALORES DE Km y Vmax DE LA LISOZIMA10

Los valores para Km y Vmax se encontraron por la ecuacin de Lineweaver-Burk , previamente

se construy la grfica donde se obtuvo la ecuacin de regresin lineal, ah se pueden obtener
los datos y reemplazar y obtener dichas constantes. La velocidad mxima que se obtuvo fue
Vmax=1.41x104 U/mg de protena y la constante de Michaelis-Menten fue
km=28.17ug/ml( ver Fig 8)

Fig 8: Calculo de las Vmax y km de la lisozima

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REFERENCIA BIBLIOGRAFAS

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2007
2. Sadava. La vida: ciencia de la biologa. Editorial Panamerica. Madrid. 2008
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Investigacin en Ciencias de la Alimentacin. 2013 Dic. Vol 14 N 4.
4. Bachman. Biologa para mdicos. Editorial Revert. Caracas. 1978.
5. Mark. Bioqumica sexta edicin. Editorial Revert. Barcelona. 2007.
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Mller-Esterl, W. Editorial Revert. Espaa. http://www.reverte.com/microsites/muller-
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