Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Enzimologia
Enzimologia
NDICE
INTRODUCCIN A LA ENZIMOLOGA ..................................................................................................... 7
Notas histricas .................................................................................................................................. 8
El estudio de la Enzimologa ............................................................................................................. 11
Bibliografa general ........................................................................................................................... 12
CAPTULO 1: Las reacciones qumicas: criterios de espontaneidad y cintica ................................... 14
1.1 En qu circunstancias tiene lugar espontneamente una reaccin? ....................................... 15
1.2 La velocidad de las reacciones qumicas.................................................................................... 19
CAPITULO 2: Catlisis enzimtica: trminos, conceptos y caractersticas generales......................... 32
2.1 Conceptos y trminos ................................................................................................................ 33
2.2 Naturaleza qumica de las enzimas ........................................................................................... 39
2.3 La especificidad de las enzimas ................................................................................................ 41
2.4 Otros aspectos de la catlisis enzimtica .................................................................................. 45
2.5 Teoras sobre la accin enzimtica ............................................................................................. 45
CAPTULO 3: Clasificacin y nomenclatura de las enzimas. Reacciones enzimticas ........................ 48
3.1 Principios generales de clasificacin y nomenclatura de enzimas ............................................ 48
3.2 Reacciones enzimticas .............................................................................................................. 50
3.2.1 Grupo 1: Oxidorreductasas ................................................................................................. 50
3.2.2 Grupo 2: Transferasas ......................................................................................................... 55
3.2.3 Grupo 3: Hidrolasas ............................................................................................................. 59
3.2.4 Grupo 4: Liasas .................................................................................................................... 64
3.2.5 Grupo 5: Isomerasas.............................................................................................................. 1
3.2.6 Grupo 6: Ligasas o Sintetasas ................................................................................................ 3
CAPITULO 4: Coenzimas o cofactores .................................................................................................... 6
4.1 Introduccin.................................................................................................................................. 6
4.2 Coenzimas asociadas a procesos redox ....................................................................................... 8
4.2.1 Coenzimas piridnicas (NAD+, NADP+) ................................................................................... 8
4.2.2 Coenzimas flavnicas........................................................................................................... 12
4.2.3 Coenzimas hemnicas .......................................................................................................... 15
4.2.4 Quinonas ............................................................................................................................. 19
4.2.5 cido ascrbico (vitamina C) ............................................................................................... 20
4.2.6 Glutatin.............................................................................................................................. 21
4.2.7 Otras coenzimas redox ........................................................................................................ 23
4.3 Coenzimas asociados a otras reacciones (no redox) .................................................................. 24
4.3.1 Tiamina pirofosfato ............................................................................................................. 24
2
4.3.2 Piridoxal fosfato .................................................................................................................. 25
4.3.3 Coenzimas folnicas ............................................................................................................. 27
4.3.4 Coenzimas cobamdicas ...................................................................................................... 30
4.3.5 Biotina ................................................................................................................................. 33
4.3.6 S-adenosil metionina .......................................................................................................... 34
4.3.7 Pantetenas.......................................................................................................................... 35
4.3.8 Carnitina .............................................................................................................................. 37
4.3.9 3'-Fosfoadenosil 5'-fosfosulfato (PAPS)............................................................................. 38
4.3.10 Adenosina 5' trifosfato (ATP) ............................................................................................ 39
4.3.11 Otros nucletidos que operan como coenzimas............................................................... 40
CAPTULO 5: Cintica de las reacciones enzimticas ......................................................................... 41
5.1 Introduccin................................................................................................................................ 41
5.1.1 Inters de los estudios cinticos ......................................................................................... 41
5.1.2 Concepto de velocidad inicial ............................................................................................. 43
5.2 Efecto de la concentracin de enzima........................................................................................ 44
5.3 Efecto de la concentracin de substrato .................................................................................... 48
5.3.1 Estudio cintico de la interaccin enzima-substrato ......................................................... 49
5.3.2 Mecanismo de Michaelis y Menten ................................................................................... 51
5.3.3 Concepto de Km .................................................................................................................. 52
5.3.4 Concepto de Vmax ................................................................................................................ 55
5.3.5 Aproximacin de estado estacionario ................................................................................ 55
5.3.6 Eficiencia cataltica de las enzimas ...................................................................................... 57
5.3.7 Determinacin experimental de Km y Vmax...................................................................... 59
5.4 Efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimticas ................................................ 61
5.4.1. Bases moleculares .............................................................................................................. 61
5.4.2 Significado biolgico del efecto del pH ............................................................................... 65
5.5 Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimticas ..................................................... 66
5.5.1 Bases moleculares ............................................................................................................... 66
5.5.2 Significado biolgico del efecto de la temperatura ............................................................ 68
CAPTULO 6: Inhibicin enzimtica ...................................................................................................... 69
6.1 Concepto e importancia ............................................................................................................. 69
6.2 Tipos de inhibidores ................................................................................................................... 71
6.2.1 Inhibidores reversibles ........................................................................................................ 71
6.2.2 Inhibidores irreversibles ...................................................................................................... 72
6.3 Inhibicin competitiva ............................................................................................................... 73
6.3.1 Cintica de la inhibicin competitiva ................................................................................. 73
3
6.3.2 Diagnstico cintico de la inhibicin competitiva ............................................................... 75
6.3.3 Aspectos estructurales de la inhibicin competitiva.......................................................... 77
6.3.4 Anlogos de estado de transicin ....................................................................................... 80
6.3.5 Anticuerpos catalticos ........................................................................................................ 82
6.3.6 Importancia prctica de la inhibicin competitiva ............................................................. 83
6.4 Otras formas de inhibicin reversible ........................................................................................ 84
6.4.1 Inhibicin no competitiva.................................................................................................... 84
6.4.2 Inhibicin acompetitiva o anticompetitiva ......................................................................... 86
6.5 Inhibicin irreversible ................................................................................................................. 87
6.5.1 Generalidades ..................................................................................................................... 87
6.5.2 Reactivos de grupo -SH....................................................................................................... 88
6.5.3 Metales pesados................................................................................................................. 91
6.5.4 Inhibidores que combinan con cationes esenciales ............................................................ 91
6.5.5 Reactivos especficos de grupo y marcadores de afinidad ................................................. 91
6.6 Substratos suicidas ..................................................................................................................... 93
6.6.1 Modo de accin de los antibiticos -lactmicos ............................................................... 94
6.6.2 Resistencia a los antibiticos -lactmicos: la -lactamasa ............................................... 96
6.6.3 Otros inhibidores suicidas ................................................................................................... 98
CAPTULO 7: El Centro Activo enzimtico. Mecanismos de la accin enzimtica ............................. 99
7.1 El centro activo ........................................................................................................................... 99
7.1.1 Concepto ............................................................................................................................. 99
7.1.2 Pruebas experimentales de la existencia del centro activo .............................................. 100
7.1.3 Nmero de centros activos ............................................................................................... 102
7.1.4 Aminocidos y grupos qumicos implicados en el centro activo....................................... 103
7.2 Mecanismos de la accin enzimtica ....................................................................................... 107
7.3.1 Efectos de proximidad y orientacin................................................................................. 108
7.3.2 Catlisis cido-base ........................................................................................................... 109
7.3.3 Grupos nuclefilos y electrfilos ....................................................................................... 112
7.3.4 Formacin de intermediarios covalentes con la enzima................................................... 112
7.3.5 Efectos mecanocunticos .................................................................................................. 113
7.4 Estudio del centro activo de la quimotripsina .......................................................................... 114
CAPITULO 8: Regulacin de la actividad enzimtica, 1 ..................................................................... 119
8.1 Generalidades ........................................................................................................................... 119
8.1.1 Tipos de regulacin enzimtica ......................................................................................... 120
8.2 Control por retroalimentacin negativa .................................................................................. 123
8.2.1 Retroalimentacin negativa en sistemas enzimticos ...................................................... 124
4
8.2.2 Caractersticas generales del control enzimtico por retroalimentacin negativa .......... 127
8.3 Alosterismo ............................................................................................................................... 129
8.3.1 Definicin .......................................................................................................................... 129
8.3.2 Pruebas experimentales .................................................................................................... 132
8.3.3 Alosterismo y cooperatividad ........................................................................................... 132
8.3.4 Interpretacin cuantitativa del alosterismo...................................................................... 136
8.3.5 La aspartato transcarbamilasa .......................................................................................... 138
8.3.6 La hemoglobina ................................................................................................................. 143
CAPTULO 9: Regulacin de la actividad enzimtica, 2. Modificacin covalente de las enzimas.
Activaciones proteolticas .................................................................................................................. 149
9.1 Introduccin.............................................................................................................................. 149
9.1.1 Modificacin covalente: su importancia biolgica............................................................ 149
9.1.2 Formas de modificacin covalente ................................................................................... 152
9.1.3 Concepto de segundo mensajero...................................................................................... 153
9.2 Regulacin de la glucgeno fosforilasa .................................................................................... 156
9.2.1 Reaccin catalizada y formas moleculares de la glucgeno fosforilasa............................ 156
9.2.2 Cascada de activacin en la glucgeno fosforilasa ........................................................... 158
9.2.3 Mecanismos moleculares en el sistema de la glucgeno fosforilasa ................................ 161
9.2.4 Otras actividades ligadas al sistema de la glucgeno fosforilasa...................................... 170
9.3 Otros sistemas de fosforilacin de protenas ........................................................................... 173
9.3.1 Protein kinasas A ............................................................................................................... 173
9.3.2 Protein kinasas G ............................................................................................................... 174
9.3.3 Protein kinasas C ............................................................................................................... 174
9.3.4 Protein kinasas dependientes de calcio-calmodulina ....................................................... 174
9.3.5 Protein tirosin kinasas ....................................................................................................... 176
9.4 Otras formas de modificacin covalente .................................................................................. 177
9.4.1 ADP-ribosilacin ................................................................................................................ 177
9.4.2 Adenilacin y Uridilacin ................................................................................................... 178
9.5 Activaciones proteolticas: Zimgenos digestivos ........................................................................ 181
9.5.1 Pepsina .............................................................................................................................. 182
9.5.2 Tripsina .............................................................................................................................. 182
9.5.3 Quimotripsina.................................................................................................................... 183
9.6 Activaciones proteolticas: Coagulacin de la sangre............................................................... 183
9.6.1 El proceso de coagulacin: generalidades ........................................................................ 184
9.6.2 Polimerizacin del fibringeno ......................................................................................... 185
9.6.3 Formacin de trombina ..................................................................................................... 188
5
9.6.4 Formacin del complejo protrombinasa ........................................................................... 189
CAPTULO 10: Enzimas en Medicina .................................................................................................. 193
10.1 Las enzimas en el diagnstico clnico ..................................................................................... 193
10.1.1 Procedencia de las enzimas sricas................................................................................. 194
10.1.2 Alteraciones en la concentracin enzimtica en suero .................................................. 194
10.1.3 Estudio de las principales enzimas con inters diagnstico ........................................... 196
10.2 Enzimas en Teraputica .......................................................................................................... 201
10.2.1 Teraputicas sustitutivas................................................................................................. 202
10.2.2 Enzimas en Ciruga .......................................................................................................... 203
10.2.3 Trastornos de la circulacin ............................................................................................ 204
10.2.4 Trastornos de la coagulacin sangunea ......................................................................... 204
10.2.5 Enzimas en teraputica antineoplsica ........................................................................... 205
10.2.6 Otros usos teraputicos de enzimas ............................................................................... 205
6
INTRODUCCIN A LA ENZIMOLOGA
Si algo distingue realmente a la Bioqumica del resto de las disciplinas qumicas, es el papel
central que en los seres vivos desempean las enzimas. Y si algn elemento distintivo hay en
la Bioqumica frente a las ciencias biolgicas es que las enzimas nos brindan un modelo
interpretativo de uso general para todas ellas sin excepcin en trminos de la teora
atmico-molecular. El estudio de las biomolculas no es en s mismo ms que una serie de
captulos de la Qumica Orgnica, por ms que se utilicen tcnicas poco convencionales
desde el punto de vista de esta ciencia. Lo realmente nico en la qumica biolgica es esa
impresionante cantidad de catalizadores especficos encargados cada uno de un
determinado proceso dentro de los muchos miles de reacciones qumicas posibles en lo
organismos. Cmo son las enzimas? Cmo funcionan? Cmo se forman? La respuesta a
estas preguntas, entendidas en su ms amplio significado, nos brindara la explicacin a
todos los fenmenos que asociamos a la vida: la posibilidad de un metabolismo; de su
regulacin, y por tanto de su integracin a un nivel fisiolgico; igualmente, de su biosntesis
y todos los fenmenos genticos a ella asociados; y por ltimo, de las complicadas pautas
evolutivas y adaptativas de los organismos vivientes.
7
"Ingeniera Gentica", y que nos recuerde los viejos laboratorios donde se haca Bioqumica
clsica all por los aos 50 y 60. Por ello trato de reivindicar la importancia de la misma. Si la
Biotecnologa no es otra cosa que introducir en gran escala a las enzimas en el proceso
productivo y econmico, la Ingeniera Gentica actual no es concebible sin la ayuda de una
serie muy concreta de enzimas; y adems, sus ltimas aspiraciones son enteramente
enzimticas: la introduccin de nuevos procesos metablicos all donde normalmente no
los hay. La Gentica Molecular se ocupa de los planos del edificio viviente; la Enzimologa,
del estudio del propio edificio funcionando.
El propsito del autor de este libro es presentar una visin actualizada de las
enzimas, pero a un nivel de estudiante de Grado, y especficamente, en el rea de Ciencias
de la Salud. Para el especialista hay numerosas y magnficas monografas, aparte de series
peridicas e innumerables artculos de investigacin y de divulgacin que tratan con
enzimas directa o indirectamente. A tal fin se da una cierta extensin a captulos como la
cintica enzimtica, que en los textos consagrados de Bioqumica ocupan un espacio a
nuestro juicio harto reducido, pero sin llegar por ello a extremos monogrficos o
especializados. El autor pretende demostrar que la metodologa del estudio de las enzimas,
tanto en lo puramente tcnico como en lo ms conceptual y abstracto, es la indicada para el
abordaje de la gran mayora de los problemas, puros o aplicados, que nos plantea el estudio
de los seres vivientes.
Notas histricas
1. Los orgenes
8
Alimentando a aves con tubos metlicos rellenos de distintas materias alimenticias estudi
las transformaciones de stas a lo largo del tubo digestivo y pudo comprobar que exista
realmente una transformacin qumica de los alimentos durante la digestin. Lazzaro
Spallanzani (1729-1799) ampli estos estudios dejando fuera de duda el hecho de la
transformacin qumica de los alimentos durante el proceso digestivo. Si consideramos que
por aquel entonces su contemporneo Antoine de Lavoisier (1743-1794) reduca a
trminos qumicos el proceso respiratorio, que Karl Wilhelm Scheele (1742-1786)
comenzaba el estudio de los "productos naturales" y que unos pocos aos ms tarde (1804)
John Dalton (1766-1844) resucitaba en trminos cientficos el primitivo atomismo de
Demcrito, bien podemos sugerir que estaba teniendo lugar una verdadera revolucin
qumica al mismo tiempo que la Revolucin Francesa. En cuanto al proceso digestivo, en
1836, Schwann y Eberle describieron un principio en el jugo gstrico capaz de degradar
protenas, al que denominaron "pepsina".
"...Tenemos amplias razones para suponer que en las plantas y en los animales
vivientes tienen lugar miles de procesos catalticos entre los tejidos y los fluidos, y
que de ellos resulta la formacin de gran nmero de distintos compuestos, para
cuyo origen a partir de la sangre o de los jugos vegetales no podemos asignar hoy
da una causa conocida" (1836)
2. La fermentacin alcohlica
9
Conocido desde tiempo inmemorial, este proceso empez a recibir atencin cientfica a
finales del siglo XVIII. En 1779 la Academia de Ciencias de Francia estableci un premio
consistente en una libra de oro para el trabajo que arrojara luz sobre el hasta entonces
misterioso proceso qumico. Aunque este premio fue retirado en 1793, no hay duda que
contribuy decisivamente a nuestro actual conocimiento no slo de las fermentaciones,
sino de la Enzimologa en general.
Justus von Liebig (1803-1873), junto con F.Whler (el autor de la sntesis de urea)
consideraban la levadura como una sustancia qumica "inestable" que al comunicar su
inestabilidad al azcar lo degradaba a alcohol. Esto entraba en contradiccin con el punto
de vista sostenido por Schwann, Ktzing y Cagniard-Latour, es decir, la naturaleza celular de
la levadura. Por tanto se plante la cuestin de si las fermentaciones dependan de la
propia calidad "viviente" de la clula o bien se trataba de un componente "inanimado" de la
misma. Liebig defenda esta ltima postura, mientras que Schwann sostena la primera.
10
"...Los fermentos no son, como crea Liebig, sustancias inestables que transmiten a
materiales normalmente no reactivos su vibracin qumica, sino que son sustancias
qumicas, relacionadas con las protenas y que como todas las dems sustancias
poseen una estructura qumica definida...La hiptesis propuesta por Schwann y
Pasteur de que la fermentacin ha de ser considerada como expresin de la
actividad vital de los organismos inferiores no es satisfactoria... Los fermentos son la
causa de los procesos qumicos vitales no slo en los organismos inferiores, sino
tambin en los superiores".
En 1897 E. Bchner (1860-1917) dio con la clave final al preparar un extracto acelular de
levadura capaz de fermentar azcar, lo que ech por tierra la teora celular de la
fermentacin (y todo el vitalismo que implicaba); la totalidad del proceso fermentativo
poda ser llevada a cabo por enzimas individuales en el sentido de los definidos por Khne
(es decir, los "no organizados").
Y por fin, Arthur Harden (1865-1940) utiliz el sistema de Bchner mediante una
metodologa que pas a ser clsica en todos los estudios metablicos: calentamiento,
dilisis, inhibidores, etc. de forma que unos aos ms tarde Meyerhof pudo enumerar una
a una todas las enzimas y reacciones de la fermentacin alcohlica.
El estudio de la Enzimologa
- En primer lugar, se repasan algunas nociones de qumicofsica que son necesarias para la
comprensin, siquiera superficial, de las reacciones qumicas. Los conceptos importantes
que se abordan son: la energa libre, la velocidad y el orden cintico de las reacciones y el
fenmeno de catlisis tratado de una manera general.
11
cataltica. Se discuten por ltimo las principales teoras sobre la accin enzimtica.
- Los dos captulos siguientes se refieren a la cintica de las reacciones enzimticas y a sus
inhibidores, respectivamente (caps. 5 y 6). Veremos cmo el estudio cintico nos ayuda a
comprender los mecanismos bsicos de reaccin y nos permite en muchas circunstancias
un estudio de los pasos individuales. La inhibicin, que se estudia inicialmente bajo un
punto de vista cintico, se termina discutiendo en trminos ms estructurales, indicando su
importancia prctica, y muy particularmente como paradigma de la teraputica
farmacolgica.
Bibliografa general
Libros y artculos
12
Fersht, A.R. Enzyme Structure and Metabolism, 2 ed. W.H.Freeman and Co. New York 1984
Koshland, D.E.Jr. Evolution of catalytic function Cold Spring Harbor Symposia on Quantiative
Biology, vol. LII, 1-7, 1987
Matthews
Monod, J., Wyman, J., Changeux, J-P. On the nature of allosteric transitions: a plausible
model J.Mol.Biol. 12, 88-118, 1965
Nelson, D.L. & Cox, M.M. Lehninger. Principios de Bioqumica Omega, 2001
Price, N.C. & Stevens, L. Fundamentals of Enzymology Oxford University Press, Oxford 1987
Segel, I.H. Enzyme Kinetics. Behavior and Analysis of rapid equilibrium and steady-state
systems John Wiley and Sons, New York, 1975
Stryer
Pginas web
http://www.expasy.ch/enzyme/
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
http://en.wikipedia.org/wiki/Enzymes
http://en.wikipedia.org/wiki/Coenzyme
http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_kinetics
http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_inhibitor
13
CAPTULO 1: Las reacciones qumicas: criterios de espontaneidad y
cintica
14
acelera la consecucin del equilibrio. Se conocen, como es lgico, muchas otras reacciones
catalizadas fuera del mundo viviente, pero a lo largo de ste y los prximos captulos
trataremos de ver por qu la catlisis biolgica es tan importante en el contexto de un curso
de Bioqumica. Antes de entrar en esta materia especfica, es preciso que consideremos
brevemente algunas generalidades sobre las reacciones qumicas, particularmente su
posibilidad y su velocidad.
Somos conscientes de que en muchas reacciones qumicas hay intercambio de calor. Cuando
un sistema se transforma a presin y temperatura constantes, el calor desprendido o
absorbido en el proceso recibe el nombre de entalpa (y se representa por H). Como los
procesos biolgicos tienen lugar por lo general en estas condiciones, en lo sucesivo
utilizaremos calor y entalpa prcticamente como sinnimos. Asimismo, hemos de sealar una
importante convencin respecto a las variaciones de entalpa en una transformacin: el
incremento en entalpa se considera positivo cuando el sistema absorbe calor a partir del
entorno; en caso contrario, el incremento se considera negativo. Por ejemplo, si se nos dice
que una reaccin cursa con un incremento de entalpa de -100 kJ (kilojoules), ello significa que
la tranformacin desprende esa energa en forma de calor desde el sistema al entorno. El caso
contrario (absorcin de calor por el sistema desde el entorno) se representa como variacin
positiva de entalpa.
15
reacciones en las que se desprende calor. As, definiramos como espontneas las reacciones
exotrmicas (reacciones que desprenden calor, con incremento negativo de entalpa) y como
no espontneas las reacciones endotrmicas (esto es, que absorben calor, con incremento
positivo de entalpa).
Es fcil refutar esta hiptesis, pues bastan unas pocas observaciones para comprobar que
existen procesos endotrmicos y que son sin embargo espontneos. Por ejemplo, la entrada
en solucin de sales como el cloruro amnico es un proceso perfectamente espontneo, y sin
embargo cursa con absorcin de calor, como podemos comprobar al tacto por el enfriamiento
del recipiente que contiene la solucin. Por tanto, no es factible un criterio sobre
espontaneidad de las reacciones qumicas basado nicamente en la entalpa.
Fijmonos en el ejemplo que refutaba la hiptesis anterior. La disolucin de una sal amnica
en agua es un proceso endotrmico y sin embargo, espontneo. El fenmeno de disolucin de
la sal implica el paso de un sistema altamente ordenado, cual es el caso de un slido cristalino,
al desorden propio de una solucin, similar al que existe en el estado gaseoso. Toda vez que el
desorden de un sistema es medido por una magnitud termodinmica de estado, la entropa,
que se representa con el smbolo S, y que el Segundo Principio establece el aumento global
de la entropa en cualquier transformacin que sufra un sistema aislado, podramos pensar
que un criterio vlido para dictaminar la espontaneidad de las reacciones sera el siguiente:
Son espontneas las transformaciones de un sistema que cursen con un incremento de
entropa (y que por tanto van a favor de la flecha del tiempo). Debemos hacer notar que en
este caso definimos como positivas las variaciones en las que aumenta la entropa del sistema.
Tampoco es vlido este segundo criterio. Por ejemplo, la congelacin del agua a 0C y presin
atmosfrica es un fenmeno totalmente espontneo y cursa con una importante disminucin
entrpica, la propia de pasar del relativamente desordenado estado lquido al orden propio de
los slidos cristalinos. Igualmente, la desnaturalizacin de una protena cursa con un fuerte
incremento de entropa en el sistema, ya que la estructura nativa de aqulla representa un
sistema muy ordenado, y sin embargo, las protenas no se desnaturalizan espontneamente.
16
que se define por la siguiente ecuacin en procesos isotrmicos a presin constante:
[1]
G = H - TS
en la que vemos que entran como variables la entalpa H, la entropa S y la temperatura
absoluta T. La energa libre de Gibbs representa la cantidad mxima de trabajo til que puede
obtenerse en una transformacin a presin constante, y constituye un criterio vlido para
predecir la espontaneidad de las reacciones qumicas. As, un incremento negativo en energa
libre (es decir, cuando el sistema desprende energa libre hacia el entorno) significa que la
transformacin puede tener lugar espontneamente. Una variacin positiva tiene lugar
cuando el sistema absorbe energa, y tales transformaciones no pueden tener lugar
espontneamente. La magnitud G tiene una gran importancia en todo tipo de clculos
qumicos, y por tanto en los biolgicos.
1.1.3.1 Normalmente se dispone de tablas en las que se especifican las energas libres
standard de formacin de compuestos. Esta magnitud es el incremento en energa libre que
tiene lugar en la reaccin de formacin del compuesto a partir de sus elementos en estado
standard (se toma como cero la energa libre de formacin standard de un elemento en su
estado ms estable). Estas energas libres de formacin se refieren a estados standard, es
decir, concentracin unidad, 298 K (25 C), 1 atm de presin, etc. A partir de las energas de
formacin de los reactivos y productos podemos calcular muy fcilmente la energa libre
standard de una reaccin dada. Esta energa libre standard se representa por el smbolo G0.
________________________________________
Solucin: Al ser la energa libre una funcin termodinmica de estado, su variacin depende
nicamente de los estados inicial y final de la reaccin, sin importar el camino seguido. Por
tanto, las energas libres se suman o restan de la misma forma que en ecuaciones
termoqumicas. A partir de la relacin
G0 = G0 (productos) - G0 (reactivos)
________________________________________
1.1.3.2 Para unas condiciones dadas, diferentes de las standard, podemos calcular el
incremento en energa libre de una reaccin concreta A B mediante la relacin
[2]
[ B]
G G0' RT ln
[ A]
1.1.3.3 De la relacin anterior podemos obtener otra muy interesante, mediante la cual se
calcula la constante de equilibrio de una reaccin a partir de la energa libre standard, o
viceversa. En el equilibrio, G = 0, y por tanto,
[3]
G0 = -RT ln(Keq)
[4]
C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O G0 = -2858 kJ/mol
Segn las consideraciones anteriores, esta reaccin cursar espontneamente puesto que
transcurre con un fuerte incremento negativo en energa libre. Sin embargo, todos somos
conscientes de que la glucosa en presencia de oxgeno (por ejemplo, dentro de un frasco) es
perfectamente estable y no arde "espontneamente". Esto no est en contradiccin con todo
lo que acabamos de exponer, ya que la energa libre standard nos informa acerca de la
posibilidad de una reaccin, pero no nos da ninguna informacin acerca de la dimensin
tiempo de los fenmenos. Para tener una idea de la velocidad con que transcurre una
reaccin, no nos queda hoy por hoy ms remedio que ir al laboratorio y estudiarla
experimentalmente. Quiz los progresos en qumica cuntica y las actuales facilidades de
clculo nos permitan algn da hacer predicciones tericas de la velocidad; entre tanto, slo las
determinaciones empricas nos valen para algo, como veremos a continuacin.
La velocidad de una reaccin qumica depende de varios factores cuyo efecto podemos medir
experimentalmente en el laboratorio. De estos factores tienen especial significacin para
nosotros la concentracin de reactivos, la temperatura y la presencia o ausencia de
catalizadores.
19
1.2.1 Velocidad y concentracin: orden de reaccin y molecularidad
[5]
C12H22O11 (sacarosa) + H2O C6H12O6 (glucosa) + C6H12O6 (fructosa)
Olvidndonos por el momento de que el agua es un reactivo en esta reaccin, los resultados
que obtuvo eran compatibles con la siguiente ley: La velocidad de la reaccin es
directamente proporcional a la concentracin de sacarosa. Es decir,
[6]
-d[A]/dt = d[B]/dt = d[C]/dt = k[A]
[7]
aA + bB cC + dD
[8]
v = -d[A]/dt = -d[B]/dt = d[C]/dt = d[D]/dt = k[A]x[B]y
Es importante sealar que el orden de reaccin es una magnitud experimental, es decir, que
20
la obtenemos a partir de mediciones en el laboratorio. En este sentido, debemos tener
presente que son posibles rdenes de reaccin no enteros; por ejemplo, en la reaccin de
descomposicin del acetaldehido
[9]
CH3-CHO CH4 + CO
la experimentacin nos dice que tiene un orden de 3/2 con respecto al acetaldehido, a pesar
de que la observacin de la ecuacin estequiomtrica nos hara pensar en un primer orden
para esta reaccin.
Volvamos a la ecuacin [7]. En ella se deca que la velocidad puede ser igual a k[A]x[B]y, y
por tanto el orden de reaccin global igual a (x+y). Es importante insistir en el hecho de que
el orden de reaccin no es necesariamente igual a la suma de los coeficientes
estequiomtricos, ya que el orden de reaccin depende del mecanismo de la misma, y no
de su estequiometra global. Supongamos una reaccin en la que dos molculas de A
reaccionen con una de B para dar el producto C:
[10]
2A + B C
Para esta reaccin son posibles varios mecanismos. Por ejemplo: en un caso podemos
suponer que las tres molculas colisionan simultneamente para producir C. En ese caso la
reaccin sera de orden 3. Ahora bien, si la reaccin transcurre de manera que en primer
lugar reacciona una molcula de A con una de B para dar un intermediario X y ste
posteriormente reacciona con una nueva molcula de A para dar el producto C, el orden ya
no sera de 3, sino que estara comprendido entre 2 y 3. Y de esta misma manera podemos
pensar en muchos otros mecanismos para esta reaccin, cada uno de los cuales nos dara un
orden distinto. De hecho, rdenes de reaccin de 3 son muy raros en la prctica; y
superiores a 3 son realmente excepcionales.
21
sucesivas de molecularidad 2 cada una.
[11]
-d[A]/dt = k[A]
[12]
At = A0exp(-kt)
[13]
ln At = ln A0 - kt
[14]
t1/2 = ln2/k
________________________________________
Ejemplos:
22
presente lo est en forma L-, y que el D-aspartato se forma por racemizacin del ismero
L- despus de la muerte, siendo ste un proceso de primer orden, conocida dicha relacin
en la muestra se puede calcular el perodo aproximado de muerte de la muestra biolgica.
(c) La inactivacin de enzimas por agentes fsicos o qumicos es muy a menudo un proceso
de primer orden. As, en algunos procesos patolgicos, como el infarto de miocardio, la
destruccin de las clulas hace que se vierta su contenido a la circulacin sangunea. Entre
los componentes celulares vertidos a la sangre se encuentran muchas enzimas; alguna de
ellas, como la creatin kinasa, nos sirven para diagnosticar la presencia de un infarto.
Teniendo en cuenta que a lo largo del tiempo la actividad enzimtica en la sangre va
disminuyendo segn un proceso de primer orden, a partir de mediciones seriadas del
enzima podemos calcular la cantidad inicial vertida a la sangre, y de esta manera podemos
tener una idea de la extensin y gravedad del infarto.
(d) La inactivacin por calor de algunas enzimas, como la fosfatasa alcalina, sigue un proceso
de primer orden. Esta enzima se emplea como indicador de enfermedades seas o del rbol
biliar, entre otras; y las enzimas de distintas procedencias se pueden distinguir por su
estabilidad trmica. As, el semiperodo de inactivacin de la fosfatasa alcalina de origen
seo a 56 C es de dos minutos, mientras que el de la de procedencia heptica es de 7
minutos.
________________________________________
23
En 1889, Arrhenius propuso que la dependencia de la constante de velocidad k en funcin
de la temperatura viene dada por la expresin
[15]
k = A exp(-Ea/RT)
[16]
ln k = -Ea/RT + ln A
La ecuacin de Arrhenius nos indica que las molculas reactivas deben alcanzar una energa
crtica Ea antes de que puedan reaccionar. La figura 1.2, por su parte, nos muestra
grficamente el concepto de energa de activacin como la barrera que debe superarse para
alcanzar el complejo activo, de energa mxima, y a partir de l, caer del lado de los
productos. Por otra parte, en esta grfica se ve que el intercambio global de energa, E no
depende del camino que siga la reaccin, sino nicamente de los estados inicial y final.
La ecuacin [16] nos demuestra que la constante de velocidad se hace mayor a medida que
disminuye la energa de activacin. Como veremos, la accin de los catalizadores es
precisamente sta: Disminuir la energa de activacin gracias a situar los reactivos en un
entorno fsicoqumico ms favorable a su interaccin.
_______________________________________
1.2.3 Catlisis
Esto quiere decir que aun cuando participan en la reaccin, los catalizadores no sufren
cambio alguno por efecto de la misma, o si lo sufren, en el transcurso de la reaccin vuelven
a su estado original; de esta forma, en la ecuacin estequiomtrica global apareceran
iguales tanto en el trmino de la derecha como en el de la izquierda, por lo que pueden ser
eliminados de la misma.
[17]
A+XB+X
con los pertinentes pasos intermedios, si los hubiere; por ejemplo,
[18]
A + X AY BX B + X
Por esta razn, las reacciones catalizadas siempre pueden representarse como un proceso
cclico (figura 1.3). Este hecho tiene particular importancia en el metabolismo, en el que las
vas cclicas (como el ciclo de Krebs, por ejemplo), se comportan catalticamente.
26
1.2.3.2 Los catalizadores no alteran la posicin de equilibrio de la reaccin
Por otra parte, dado que un catalizador no modifica la posicin de equilibrio de una
reaccin, pero altera su velocidad, debemos concluir que los catalizadores alteran tanto la
reaccin directa como la inversa, y en la misma medida.
[19]
kd
A B
ki
27
en la que kd es la constante de velocidad directa y ki la inversa. En este caso, Keq = ki/kd; si
Keq no se modifica por la accin del catalizador, pero aumenta kd, tiene necesariamente que
aumentar ki.
Segn la teora de las colisiones, para que se produzca una reaccin entre tomos o
molculas, stas deben primero colisionar entre s. De esta forma se explica que a una
mayor concentracin de reactivo se acelere la reaccin. Ahora bien, no todas las colisiones
son eficaces; para que lo sean se necesita que las molculas reaccionantes posean una
cierta energa cintica y adems, que las molculas entren en colisin con la orientacin
precisa.
Los catalizadores permiten un nivel energtico ms bajo, bien sea por introducir un nuevo
agente en la reaccin que posteriormente se regenera (por ejemplo, en la catlisis especfica
cido-base), o bien por permitir el encuentro de las molculas en la orientacin adecuada
(caso de la catlisis heterognea). En todo caso, la accin del catalizador se traduce en una
disminucin de la energa de activacin, haciendo ms grande el factor de Boltzmann, y por
tanto, aumentando el nmero de molculas con capacidad de reaccionar en unas
condiciones dadas (figura 1.4)
28
________________________________________
[20]
N2 + 3H2 2NH3 G0 = -91.83 kJ/mol
A pesar del valor negativo de G0, que nos indica que el equilibrio favorecer la formacin
de amonaco, la reaccin es extraordinariamente lenta, y para que se lleve a cabo se
necesitan temperaturas de 450 C y presiones que van de 200 a 1000 atmsferas. El
amonaco as obtenido se utiliza ampliamente en la fabricacin de fertilizantes, explosivos,
fibras sintticas, etc., de tal manera que la cantidad total de amonaco producido por la
industria qumica viene a ser de unas 5107 Tm/ao.
Los seres vivos, en concreto las llamadas bacterias fijadoras de nitrgeno, realizan un
proceso que globalmente es anlogo al de Haber, fijando el nitrgeno atmosfrico a
compuestos amnicos como los aminocidos, pero en una magnitud global mucho mayor;
por esta va se incorporan aproximadamente 1.75108 Tm/ao. Lo realmente notable es que
este proceso tiene lugar a presin atmosfrica y a la temperatura del suelo, que es donde
residen las bacterias capaces de realizar esta funcin (gneros Rhizobium, Azotobacter,
Clostridium, etc.). Estas cifras nos dan idea de la extremada eficiencia de los catalizadores
29
biolgicos, capaces de reducir la energa de activacin hasta hacer posible un proceso a
temperatura y presin ambientales que de otra forma (e incluso en presencia de
catalizadores metlicos) requiere unas condiciones mucho ms extremas, y por tanto,
consumidoras de energa.
_______________________________________
Se suele distinguir entre catlisis homognea, en la cual toda la reaccin tiene lugar en la
misma fase fsicoqumica, y catlisis heterognea, en la cual la reaccin ocurre en una
interfase (lquido-slido, gas-slido, gas-lquido), tambin llamada catlisis de superficie. La
catlisis homognea de mayor inters para nosotros es la que tiene lugar en solucin, y
particularmente la catlisis general cido-base o la catlisis especfica cido-base, que
estudiaremos con mayor detenimiento en un captulo posterior.
[21]
bP
1 bP
[22]
30
Vmax s
v
Km s
[23]
v s
Vmax Km s
[24]
bs
1 bs
31
CAPITULO 2: Catlisis enzimtica: trminos, conceptos y
caractersticas generales
Los seres vivientes se caracterizan por llevar a cabo varios miles de reacciones qumicas
diferentes, a cuyo conjunto damos el nombre de metabolismo. Estas reacciones no tienen
lugar aleatoriamente; en lneas generales, los fines que persiguen son los siguientes: (a)
proveer a la clula de energa en una forma directamente aprovechable; (b) sintetizar los
elementos plsticos necesarios en la estructura celular; (c) generar y procesar seales
informativas a efectos regulatorios y adaptativos; y (d) propagar y mantener la informacin
gentica propia de la especie. La mera enumeracin de estos fines nos da una idea de la
complejidad de los sistemas bioqumicos, y de las complicadas reagrupaciones moleculares
que tienen lugar en el metabolismo. Todas las reacciones que en un momento dado tienen
32
lugar en la clula cursan, como es lgico, en el sentido de un incremento negativo en
energa libre en la forma definida por la ecuacin 1.2 del captulo anterior. Ahora bien, la
gran mayora de ellas seran extremadamente lentas para el ritmo temporal propio de los
seres vivientes; por eso todas ellas, o al menos la gran mayora, son reacciones catalizadas, y
llamamos enzimas a estos catalizadores. Pero a diferencia de otros catalizadores que
emplea la Qumica, las enzimas tienen la particularidad de ser especficas para cada
reaccin. No sera rigurosamente exacto, pero tampoco muy alejado de la realidad, afirmar
que en el metabolismo hay tantas enzimas como reacciones; en otras palabras, cada
reaccin tiene su enzima especfica. Uno de los criterios exigidos cuando se propone
tericamente una va metablica estriba en el hallazgo de una enzima especfica para cada
uno de los pasos postulados.
2.1.1 Enzima
33
es una entidad bastante ms estable, y representa un mnimo local de energa potencial en
la coordenada de reaccin (figura 2.1), a diferencia del complejo activo, que es un mximo.
2.1.1 Substrato
Es la regin de la molcula de enzima que fija el substrato y contiene los grupos qumicos
que lo transforman. Ntese que el concepto de "centro activo" indica un carcter
heterogneo en la catlisis enzimtica, en el sentido de que el substrato es fijado a la
molcula de enzima en un sitio especfico. Como veremos, la razn molecular de la
especificidad radica en la configuracin tridimensional, altamente precisa, del centro activo.
En lneas generales, existe un solo centro activo por molcula de enzima o protmero (vase
ms adelante). Conviene pensar en el centro activo como realizando dos funciones: una, la
34
fijacin especfica del substrato; otra, su transformacin. En muchos casos estas funciones
no son estrictamente disociables; an as, nuestra idea de la catlisis enzimtica se ve
facilitada por esta distincin.
2.1.4 Protmero
Es ste un trmino introducido por Monod, Wyman y Changeux. Alude a que al poseer
estructura cuaternaria la mayor parte de las enzimas, a veces de una gran complejidad,
llamamos protmero a la mnima parte de la molcula capaz de exhibir actividad
enzimtica, o lo que es lo mismo, la parte de la molcula que configura un nico centro
activo. Protmero y subunidad son, en ocasiones, equivalentes: as, la
gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa de msculo de conejo posee cuatro subunidades
idnticas, todas ellas activas. Pero en otras ocasiones, como en la aspartato
transcarbamilasa, un protmero consta de ms de una subunidad; la enzima necesita dos
subunidades tipo C (la estructura cuaternaria es C6R6) para configurar un centro activo. Las
35
asociaciones de protmeros y subunidades tienen un importante papel en los fenmenos de
regulacin enzimtica.
Entendemos por actividad enzimtica la velocidad con que transcurre una reaccin
catalizada por una enzima. Ntese que exclumos cualquier otro significado que pueda
atribuirse al trmino "actividad"; una enzima muy activa, en el presente estudio, significa
que est catalizando muy rpidamente una reaccin. La velocidad de una reaccin
enzimtica es en todo momento directamente proporcional a la concentracin de enzima;
por tanto, la actividad es una medida de la concentracin de enzima.
El katal (kat) es la actividad enzimtica que transforma un mol de substrato por segundo, sin
referirse a ningn otro tipo de condicin. Puede observarse que el katal es una unidad
muchsimo ms grande que la UI (1 kat = 6.107 UI). Por esa razn se prefieren submltiplos
del mismo, como el kat o el nkat.
36
especfica. Es obvio que la actividad especfica a lo largo de una purificacin llega a un lmite
superior correspondiente a la actividad intrnseca de la enzima pura.
2.1.7 Inhibidor
2.1.8 Activador
2.1.9 Coenzima
37
Ya desde aqu es interesante sealar la relacin que existe entre los trminos de coenzima y
38
vitamina. Muchas coenzimas tienen estructuras qumicas complejas que no pueden ser
sintetizadas por nuestro organismo. Por lo general, no se trata de toda la molcula, sino tan
solo de una parte. Esta porcin no sintetizable debe necesariamente ingresar en el
organismo con la dieta, y por ello son factores obligatorios en la alimentacin: muchos de
ellos son lo que llamamos vitaminas. Ahora bien, conviene no confundir los trminos: ni
todas las coenzimas son vitaminas, ni todas las vitaminas forman parte de coenzimas, al
menos en el sentido restringido en el que han sido definidos aqu.
2.1.10 Isoenzima
Las grandes vas metablicas son comunes a todos los seres vivos, y se llevan a cabo gracias
a enzimas que catalizan la misma reaccin aunque tengan estructuras moleculares
diferentes. Pero este fenmeno no se da solamente entre diferentes especies, sino entre
diferentes rganos y tejidos del mismo individuo. As, por ejemplo, la hexokinasa (ATP:D-
hexosa fosfotransferasa), enzima que permite la entrada de glucosa en el metabolismo a
travs de su transformacin en glucosa-6-fosfato, presenta diferentes formas segn el
tejido de procedencia: hexokinasa cerebral, hexokinasa muscular, hexokinasa heptica, etc.,
cada una de ellas con diferente estructura molecular.
Sin embargo, dicho concepto ha prevalecido de tal manera que hoy nadie duda de la
naturaleza protenica de las enzimas. El fallo en le deteccin de protena era debido, como
se dijo, a la inadecuacin de los mtodos cuantitativos para detectar cantidades muy
pequeas de protena, junto con las impresionantes cifras de actividad molecular de
algunos enzimas. En cuanto a los grupos prostticos detectados en algunos enzimas, hoy da
sabemos que son efectivamente parte del centro activo enzimtico, pero su reactividad y su
39
funcin biolgica, en definitiva, se deben al entorno proteico de la apoenzima (Cuando una
enzima presenta un grupo prosttico, denominamos holoenzima a la enzima completa, y
apoenzima a la parte especficamente proteica de la misma).
Repasaremos a continuacin las principales lneas de evidencia que nos llevan a afirmar
categricamente la naturaleza proteica de las enzimas.
1. Una de las primeras observaciones a este respecto fue que la actividad enzimtica puede
ser eliminada de una preparacin mediante tratamiento de la misma con enzimas
proteolticas, como pepsina, tripsina o quimotripsina.
4. El peso molecular de las enzimas, en aquellos casos en que puede ser determinado, es
compatible con una estructura proteica.
40
determinar incluso la disposicin molecular de los grupos enzimticos en relacin a la
estructura molecular del substrato, comprobando la complementaridad estereoespecfica
entre unos y otros y el papel determinante de algunos residuos en la accin cataltica. Se
dispone hoy da de estudios similares con muchas otras enzimas; los avances en
cristalografa de rayos X han llegado al punto de que la autntica dificultad de los mismos
sea lograr la cocristalizacin de enzima y ligando (substrato o anlogo estructural del
mismo).
Por otra parte, las enzimas son capaces de llevar a cabo sntesis asimtrica, es decir, de
generar un solo enantimero a partir de un grupo simtrico. Por ejemplo, en la reduccin
del piruvato llevada a cabo por la lactato dehidrogenasa, encontramos que slo se produce
L-lactato (en el caso de la enzima de fuentes animales) o D-lactato (en la enzima procedente
de bacterias). Esta reaccin se presenta en la figura 2.4.
41
2.3.2 Proquiralidad
Las enzimas son capaces de diferenciar grupos iguales en molculas simtricas, lo cual es
imposible por medios qumicos convencionales. As, en la molcula de citrato, la enzima
aconitasa ataca al grupo -CH2-COOH que procede de oxalacetato, mientras que no acta
sobre el grupo idntico procedente de acetato (vase figura 2.6).
Ogston ha explicado el fenmeno de proquiralidad en el sentido expresado en la figura 2.7:
Cuando un carbono C est sustitudo por dos grupos x, un grupo y y un grupo z (es decir,
cuando su estructura puede representarse como Cx2yz), caben dos formas de interaccin
con el centro activo de la enzima en el caso en que sean necesarios tres de los cuatro grupos
para la fijacin. Slo una ser la forma correcta, y de ese modo la enzima reconocer como
distintos los dos grupos idnticos.
2.3.3 Especificidad relativa
Cuando la enzima cataliza una reaccin multisubstrato (lo cual es ms regla que excepcin
en Bioqumica), la especificidad suele ser absoluta hacia todos ellos. Esto ocurre
particularmente con las deshidrogenasas y las kinasas (bisubstrato) y las sintetasas
(trisubstrato). Como es lgico, existen tambin excepciones a esta regla. La alcohol
deshidrogenasa es completamente especfica hacia uno de sus substratos, la coenzima
NAD+, pero admite muchos tipos de alcohol como segundo substrato.
-GAATTC-
-CTTAAG-
Por otra parte, las aminoacil-tRNA sintetasas son capaces de reconocer una secuencia
especfica en el tRNA propio del aminocido que activan; esta secuencia se sabe que es
diferente del anticodon.
Por otra parte, las enzimas son catalizadores polivalentes en el sentido de que son muchos
los tipos de reacciones catalizadas por ellos, a pesar de que los mecanismos intrnsecos de la
catlisis enzimtica son relativamente pocos. Entre las reacciones catalizadas encontramos:
reacciones redox, transferencia de grupos, hidrlisis, deshidrataciones y decarboxilaciones,
fosforolisis, condensaciones aldlicas, reacciones de radicales libres, polimerizaciones,
etc.etc.
El carcter protenico de las enzimas lleva a pensar en una interaccin entre el substrato y
una porcin de la superficie de la protena enzimtica (el centro activo) para explicar la
accin de las enzimas. Por otra parte, el estudio cintico de las reacciones enzimticas nos
muestra (como veremos en captulos posteriores) que la accin procede a travs de la
formacin de un complejo enzima-substrato; para una reaccin monosubstrato,
E + S ES E + P
Pero por otra parte, la especificidad de las reacciones enzimticas nos indica que la
interaccin enzima-substrato est mediada a travs de una disposicin altamente precisa de
los grupos qumicos de la enzima, de forma que slo pueden entrar al centro activo las
molculas que encajen perfectamente en los mismos. De esta forma, una pequea variacin
en la estructura molecular del substrato podra impedir su fijacin al centro activo.
Estas ideas fueron adelantadas por Emil Fischer en 1894, cuando propuso su conocida
analoga de la llave y la cerradura para explicar la especificidad enzimtica; una enzima es
especfica hacia su substrato de la misma forma que una cerradura slo puede ser abierta
por una llave determinada. Esta idea se ha mantenido bsicamente inalterada durante
dcadas, y ha dado lugar a lo que podramos llamar el modelo de interaccin estereoqumica
que explica no slo la accin enzimtica, sino muchos otros fenmenos biolgicos que
tienen lugar a travs de la interaccin de una protena y un ligando (por ejemplo, la accin
hormonal y el efecto de frmacos).
La teora del ajuste inducido conduce a un desarrollo ulterior sobre la accin enzimtica.
sta puede ser descrita en trminos de estabilizacin del estado de transicin. El estado de
transicin es una especie qumica inestable, situada en un mximo de energa potencial, con
una configuracin tridimensional que no es ni la de los reactivos ni la de los productos, sino
una forma intermedia. As, la fijacin al centro activo de la enzima depende de la disposicin
estereoqumica precisa y complementaria de una serie de grupos qumicos. Esta
complementaridad se refiere, pues, sobre todo al estado de transicin, y no a los reactivos o
productos en su estado basal. Este concepto ser analizado ms detenidamente en el
captulo 6 de esta obra, cuando se hable de los llamados anlogos de estado de transicin,
poderossimos bloqueadores de la accin enzimtica (figura 2.8).
CAPTULO 3: Clasificacin y nomenclatura de las enzimas.
Reacciones enzimticas
A lo largo del s.XIX y durante gran parte del XX no se dispona de una nomenclatura o
clasificacin sistemtica de las enzimas. El nombre de cada enzima reflejaba vagamente la
reaccin catalizada en el mejor de los casos, y no era en absoluto extrao encontrar
nombres nacidos directamente de la jerga del laboratorio descubridor: diastasa (separador,
por separar dextrinas solubles a partir de almidn insoluble); Zwischenferment (enzima
intermedia), Gelbferment (enzima amarilla), y otros que an siguen hoy en plena vigencia a
pesar de su inadecuacin o su falta de sistemtica descriptiva: catalasa, pepsina, tripsina,
etc. En otras ocasiones se pretenda reflejar el gnero o especie biolgica de procedencia;
as, la ficina, un grupo de enzimas proteolticas extradas del gnero Ficus, o la papana,
aislada del latex de la papaya. Por ltimo, y ya de una forma semisistemtica, se intentaba
denominar a la enzima por el substrato atacado y aadiendo al mismo el sufijo -asa: ureasa,
maltasa, tirosinasa, etc. El inconveniente de esta forma de denominacin era obvio: no
daba ningn detalle sobre el tipo de reaccin catalizada.
Para tratar de poner orden y dar lugar a un criterio uniforme de clasificacin, en los aos 50
del siglo pasado se constituy en el seno de la I.U.B. una Comisin para redactar una serie
de reglas a partir de las cuales la denominacin de las distintas enzimas fuera inequvoca.
Esta Comisin (Enzyme Commission, E.C.) present sus primeras propuestas al V Congreso
de la IUB celebrado en Mosc (1961), propuestas que han sido revisadas y perfeccionadas
varias veces y forman la base de la clasificacin que hoy se utiliza, aun cuando estas
recomendaciones no son ni mucho menos seguidas al pie de la letra en la bibliografa
bioqumica. Muy brevemente expondremos los principios generales de la Clasificacin
Internacional, que pueden encontrarse en las direcciones web
http://www.expasy.ch/enzyme/ (Base de datos ENZYME en el entorno ExPASy), y
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ (Nomenclatura de enzimas en la pgina de
la IUPAC IUBMB).
3.1.1 Nomenclatura
La clasificacin de las enzimas se hace sobre la base de la reaccin catalizada. sta, junto
con los substratos, forma el nombre completo de la enzima. Adems de este nombre
sistemtico, en muchas enzimas se recomienda tambin un nombre ms corto, en general
menos descriptivo pero ms consagrado por el uso. En todo caso las recomendaciones de la
E.C. cuidan que en estos casos no haya ambigedades o equvocos en la denominacin.
Adems del nombre sistemtico y del nombre usual, cada enzima es reconocida por un
nmero sistemtico formado por cuatro elementos numricos separados por punto y
precedido de las siglas E.C. Por ejemplo,
Ahora bien, enzimas que catalizan una misma reaccin pueden proceder de muy diversas
fuentes (microorganismos, vegetales, animales), y vara ampliamente su estructura
molecular; igualmente, dentro de un mismo organismo, enzimas que catalizan la misma
reaccin pueden corresponder a estructuras moleculares distintas (isoenzimas). Por ello, se
suele aadir entre parntesis la fuente biolgica de la enzima, y en su caso el rgano; por
ejemplo,
3.1.2 Clasificacin
En el contexto de esta obra, sera excesivo seguir al pie de la letra las recomendaciones de la
EC para hacer una descripcin elemental de las enzimas. Se ha presentado esta clasificacin
nicamente a efectos informativos.
- (a) Deshidrogenasas
NAD+ NADH + H+
- (b) Oxidasas
Son las enzimas que utilizan como aceptor electrnico el oxgeno molecular, producindose
por lo general H2O2 o H2O, o incluso el anin superxido O2- ,en el curso de la reaccin. Al
utilizar O2, estas reacciones son aerbicas, mientras que las catalizadas por deshidrogenasas
pueden tener lugar aerbica o anaerbicamente. Las oxidasas suelen ser flavoprotenas o
metaloprotenas, o ambas cosas a la vez; las reacciones que catalizan suelen ser bastante
complejas.
EC 1.1.3.4, Glucosa oxidasa. (GOD) Se trata de una enzima de origen fngico con una gran
cantidad de aplicaciones biotecnolgicas. Es una flavoprotena con estructura de
homodmero, y utiliza FAD como cofactor. La gran mayora de los mtodos actuales de
determinacin de glucosa en fluidos biolgicos se basa en la reaccin catalizada por esta
enzima.
HOCH2 O2 H2O2
HOCH2
O O
OH OH O
OH OH EC 1.1.1.34 OH
OH OH
D-Glucosa D-Gluconolactona
- (c) Peroxidasas
2H2O2 2H2O + O2
CH2 COO-
COO-
OH
Homogentisato Maleilacetoacetato
- (e) Hidroxilasas
CH2 O2 H 2O CH2
+
H C NH3 H C NH3+
COO- COO-
Fenilalanina Tirosina
- (f) Reductasas
A-X + B A + B-X
En rigor, esta reaccin general sera asimismo vlida para las oxidorreductasas si el grupo
transferido X fuera un par electrnico, dos tomos de hidrgeno o un ion hidruro.
Asimismo, las hidrolasas catalizan una reaccin similar. Igualmente, las reacciones de
fosforolisis, similares a las de hidrlisis, son catalizadas por enzimas de este grupo que
reciben el nombre de fosforilasas. Desde el punto de vista de nomenclatura, las transferasas
forman su nombre sistemtico como
Dador:aceptor grupo-transferasa
El subgrupo 2.1 comprende a las transferasas de grupos monocarbonados, esto es, que
transfieren entre dador y aceptor los grupos metilo -CH3, hidroximetilo -CH2OH, formil -CHO
y formimino -CHNH. Las metiltransferasas utilizan normalmente como dador la coenzima
S-adenosil metionina (SAM); las transferencias de los restantes grupos se hacen a partir de
coenzimas folnicas. Estos ltimos tienen particular importancia en la sntesis de
nucletidos, entre otros procesos.
OH OH
OH O CH3
HO C H SAM SAHC HO C H
CH2 CH2
+
NH3 NH3+
Noradenalina 3-O-Metilnoradrenalina
En el subgrupo 2.4 estn las glicosiltransferasas, que transfieren restos glicosilo entre dador
y aceptor. En ocasiones el aceptor es fosfato inorgnico, y en ese caso hablamos de
fosforilasas. Estas reacciones suelen ser reversibles en las condiciones intracelulares, de
modo que la fosforilasa, por ejemplo, puede catalizar la transferencia de restos glicosdicos
desde un ster fosfato a una cadena de poli- u oligosacrido. Otras veces se transfiere todo
un segmento oligosacrido, como en el caso de la enzima ramificante del glucgeno.
Asimismo, muchas de estas enzimas utilizan como substratos derivados de
nuclesido-difosfatos, como el UDP, ADP o CDP. En este subgrupo encontramos enzimas de
una gran importancia metablica; adems de las ya citadas fosforilasas, tenemos todos los
implicados en la glucuronoconjugacin de compuestos, importantsima reaccin de los
procesos destoxificantes del organismo.
Utiliza como cofactor piridoxal fosfato.La enzima heptica controla, mediante esta reaccin,
el nivel de glucemia sistmica. Por ello no es de extraar que sea una enzima fuertemente
regulada; alostricamente, mediante una activacin ejercida por AMP e inhibicin por ATP,
ADP y glucosa-6-fosfato; y lo que es ms importante, a travs de una compleja cascada de
modificaciones covalentes, que se exponen detalladamente en el captulo 9 de esta obra.
Otro importante subgrupo de transferasas es el 2.6 que agrupa las enzimas encargadas de la
transferencia de grupos nitrogenados, y particularmente el 2.6.1 (aminotransferasas o
transaminasas). Estas ltimas catalizan el intercambio de un grupo amino entre un
aminocido y un cetocido; se trata de reacciones reversibles que utilizan como coenzima el
piridoxal fosfato. Una pareja aceptor-dador muy frecuente en estas reacciones es
oxoglutarato-glutamato. De esta manera en el catabolismo de los aminocidos el nitrgeno
amnico va concentrndose en forma de glutamato, para formar posteriormente amonaco
libre mediante la glutamato dehidrogenasa. Por otra parte, las aminotransferasas tienen
una gran importancia en Bioqumica Clnica, como elementos diagnsticos de enfermedades
hepticas y miocrdicas (v. cap. 14)
NH3+
CO H C NH3+
H C CO
CH2
+ CH2 + CH2
CH2
CH2 CH2
COO- COO-
-
COO COO-
Aspartato Oxalacetato
-Cetoglutarato Glutamato
- COO- COO-
COO COO -
NH3+
CO H C NH3+
H C CO
CH3
+ CH2 + CH2
CH3
CH2 CH2
Alanina COO- Piruvato COO-
-Cetoglutarato Glutamato
El subgrupo 2.7 contiene a unas enzimas de gran importancia metablica y fisiolgica: las
fosfotransferasas. Dentro del mismo, los apartados 2.7.1 a 2.7.4 contienen las enzimas
llamados comnmente kinasas. Normalmente el compuesto dador es el ATP, o ms
propiamente, el complejo ATP-Mg2+. La importancia de estas enzimas deriva del hecho de
ser enzimas activantes de multitud de substratos, que entran en el metabolismo en forma
de steres fosfricos. En el subgrupo 2.7.7 encontramos las nucleotidil transferasas, entre
las que se encuentran enzimas como las DNA polimerasas y las RNA polimerasas.
EC 2.7.3.2, Creatinkinasa (CK, Creatinfosfokinasa, CPK). Cataliza la transferencia de un
fosfato desde el ATP a la creatina para formar creatinfosfato, un fosfgeno muy abundante
en tejidos cuyas necesidades energticas son grandes y pueden fluctuar ampliamente, como
el msculo esqueltico, corazn, cerebro y espermatozoides.
ADP O
NH3+ ATP
HN C NH P O-
N CH2 COO- HN C O-
CH3 N CH2 COO-
CH3
Creatina Creatinfosfato
Son enzimas que catalizan reacciones de hidrlisis. La reaccin general catalizada puede
representarse como
El nombre de las hidrolasas se forma a partir del substrato seguido de "hidrolasa". Ahora
bien, el nombre comn o recomendado de estas enzimas se forma con el nombre del
substrato seguido del sufijo "asa"; es decir, en nombres como ureasa, fosfatasa, amilasa,
etc., se entiende que se trata de enzimas hidrolticas. En muchos casos, particularmente en
las proteinasas, se conservan nombres consagrados por el uso sin que tengan ninguna
sistemtica; por ejemplo, tripsina, pepsina, papana, ficina, etc.
H 2O
CH3 CH3
+ -
CH3 CO O CH2 CH2 N CH3 CH3 COO + HO CH2 CH2 N+ CH3
CH3 CH3
Acetilcolina Acetato Colina
H2O
O O
R O P O- R OH + HO P O-
O- Alcohol O-
Fosfomonoster
Fosfato inorgnico
EC 3.4.21.4 Tripsina. Es asimismo una enzima pancretica, producida como zimgeno que se
activa al ser secretado a la luz intestinal por la accin de la propia enzima o de la
enteropeptidasa (EC 3.4.21.9). Se trata tambin de una serin proteinasa con un centro
activo y un mecanismo cataltico muy parecido al de la quimotripsina. Rompe enlaces
constitudos por un aminocido dibsico y cualquier otro aminocido, es decir, -Arg-X y -Lys-
X
(d) Metaloproteinasas
A=B + X AXB
Substrato grupo-liasa
Entre los nombre recomendados para estas enzimas, encontramos, por ejemplo,
descarboxilasas, enzimas que eliminan CO2; sintasas (no confundir con sintetasas), cuando
la reaccin relevante es la de unin; aldolasas, cuando catalizan condensaciones aldlicas;
hidratasas, cuando la reaccin consiste en una adicin de agua a un doble enlace.
El subgrupo 4.1 contiene varios sub-subgrupos importantes de enzimas. 4.1.1 son las
descarboxilasas, enzimas que eliminan grupos carboxilo, de gran importancia en el
metabolismo. Muchas de ellas utilizan tiamina difosfato o piridoxal fosfato como coenzimas.
El sub-subgrupo 4.1.2 son las aldehido-liasas o aldolasas, que catalizan condensaciones
aldlicas; en 4.1.3 estn agrupadas las oxocido-liasas, con enzimas de gran importancia
metablica, como la citrato sintasa o enzima condensante. Veremos su accin detallada al
estudiar el metabolismo.
N N
HN HN
Histidina Histamina
El subgrupo 4.2 son las liasas C-O. En el apartado 4.2.1 encontramos las hidro-liasas
(hidratasas o dehidratasas), enzimas que catalizan la adicin o eliminacin de agua en un
doble enlace.
Requiere zinc como cofactor, y se conocen al menos siete formas moleculares distintas de la
enzima en mamferos. Tiene una gran importancia fisiolgica, ya que participa en el proceso
de transporte de gases en sangre, en la secrecin de HCl por el estmago y en la excrecin
renal de bicarbonato.
3.2.5 Grupo 5: Isomerasas
El subgrupo 5.1 contiene las racemasas y las epimerasas, que catalizan la inversin de
configuracin en un carbono asimtrico. Son importantes las que actan sobre aminocidos
y sobre monosacridos o sus UDP-derivados.
EC 5.1.1.1 Alanina racemasa. Presentamos esta reaccin como ejemplo de las aminocido
racemasas. Requiere piridoxal fosfato como cofactor. Es una enzima importante en el
metabolismo bacteriano, en el que la D-alanina es necesaria en la sntesis del
peptidoglicano.
COO- COO-
H 3N + C H H C NH3+
CH3 CH3
L-Alanina D-Alanina
O
- O
O P O CH2 -
O P O CH2 O CH2OH
O- O -
O
OH
OH
OH
OH OH
OH
OH -D-Fructosa-6-fosfato
D-Glucosa-6-fosfato
1,3-bisfosfoglicerato 2,3-bisfosfoglicerato
o bien
El subgrupo 6.1 contiene las ligasas que forman enlaces C-O. Entre ellas, el sub-subgrupo
6.1.1 es el correspondiente a las aminoacil-tRNA sintetasas, enzimas encargadas de la
activacin de los aminocidos en la sntesis de protenas.
Las sintetasas que forman enlaces C-N estn en el subgrupo 6.3. Entre ellas destacan la
asparragina- y glutamina sintetasas, encargadas de la introduccin de NH3 en el carboxilo
terminal de aspartato o glutamato.
El subgrupo 6.4 presenta las enzimas encargadas de formar enlaces C-C, normalmente en
reacciones de carboxilacin, por lo que las enzimas de este grupo son las llamadas
carboxilasas (no confundir con las descarboxilasas). La mayor parte de ellas contienen
biotina como grupo prosttico.
CO2
CO S CoA
CO S CoA CH2
CH3 COO-
ATP ADP + Pi
Acetil-CoA Malonil-CoA
CAPITULO 4: Coenzimas o cofactores
4.1 Introduccin
A-X + B A + B-X
NAD+ (Nicotinamido adenil dinucletido, Niacin adenil dinucletido) y NADP+ (NAD+ fosfato)
son dos importantes transportadores redox en el metabolismo celular. Actan
fundamentalmente como coenzimas de deshidrogenasas, pero tambin tienen un
importante papel, como veremos, en otros procesos como la ADP-ribosilacin de protenas.
En el trabajo clsico de Harden y Young de 1904 se estableca que la fermentacin acelular
de glucosa requera la presencia de un factor termoestable y dializable, que fue bautizado
por los autores como cozimasa. Purificado posteriormente por von Euler y cols. y por
Warburg y Christian en 1936, su conocimiento qued complementado por el
descubrimiento del NADP por estos ltimos autores como factor dializable necesario para la
oxidacin de la glucosa-6-fosfato en hemates. Estos dos factores han recibido los nombres
de Coenzima I y DPN (difosfopiridin nucletido), el NAD+, y Coenzima II y TPN (trifosfopiridin
nucletido) el NADP+. Ambas coenzimas estn ampliamente distribudas en todo tipo de
clulas y tejidos; dentro de su papel como transportadores redox, podemos decir en lneas
generales que el NAD+ participa preferentemente en procesos asociados a fermentaciones y
respiracin, mientras que el NADP+, o ms bien su forma reducida NADPH, suele proveer el
poder reductor necesario para las biosntesis celulares.
En el caso del NAD+, podemos ver que se trata de un nucletido de adenina unido a un
nucletido de nicotinamida a travs de sus fosfatos. La nicotinamida (tambin llamada
niacina) es la 3-amidopiridina (de ah el nombre de coenzimas piridnicas). Los enlaces de
ambas bases a sus respectivas ribosas son del tipo -N-glicosdico. La unin glicosdica en
- da lugar a anlogos inactivos de estos coenzimas (-NAD+ y -NADP+). En el NADP+ el
fosfato adicional aparece unido al C-2' de la ribosa adenosnica.
En el curso de la reduccin, pues, el substrato que se oxida pierde dos tomos de hidrgeno
(dos protones y dos electrones), transfirindose a la coenzima un ion hidruro (H-, un protn
y dos electrones) y liberndose a la solucin el protn restante.
CONH2 H H
CONH2
+
N
N
AH2 A + H+
Por esa razn las reacciones asociadas a estas coenzimas se representan as:
(a) NAD+
(b) NADP+
Por otra parte, el poder reductor generado en el proceso fotosinttico en plantas verdes o
microorganismos autotrficos toma normalmente la forma de NADPH.
Una gran cantidad de organismos, entre ellos el hombre, son incapaces de sintetizar el anillo
de nicotinamida (o el correspondiente cido nicotnico), por lo cual deben recibirlo como
factor diettico esencial. En el s.XVIII el mdico de la corte de Felipe V Gaspar de Casal
describi el "mal de la rosa" en poblaciones cuya alimentacin era esencialmente a base de
maz. Esta enfermedad, llamada asimismo pelagra, consiste en una serie abigarrada de
sintomatologa neurolgica, cutnea e intestinal (la trada dermatitis- diarrea-demencia). En
1937, Elvehjem y Woolley demostraron que la pelagra poda ser prevenida por la
administracin de cido nicotnico o de nicotinamida, recibiendo as el nombre de factor PP
(preventivo de la pelagra) reconocido por los estudios de von Euler y Warburg como un
componente de la primitiva cozimasa de Harden y Young. Tambin es conocida como
Vitamina B3.
La presencia de pigmentos flavnicos (del Lat. flavus, amarillo) fue detectada el siglo XIX en
preparaciones de suero de leche; pigmentos de este tipo fueron parcialmente
caracterizados en los aos 30 de este siglo por Szent-Gyrgyi y Ellinger, entre otros. Fue el
descubrimiento por Warburg de la enzima amarilla capaz de oxidar el NADPH producido en
la reaccin de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa lo que dio pie al conocimiento ms
sistemtico de estas coenzimas. Warburg observ que al tratar con metanol la enzima
amarilla se disociaba en un pigmento y una protena incolora. El pigmento fue caracterizado
como flavin mononucletido (FMN), nombre algo incorrecto dado que la unin de la base
(isoaloxazina) al azcar (en realidad el polialcohol ribitol) no es propiamente una unin
glicosdica; una forma ms correcta de denominarlo sera la de riboflavin fosfato. Con
posterioridad al descubrimiento del FMN, Warburg y Christian estudiaron la D-aminocido
oxidasa, otra flavoenzima pero conteniendo flavin adenin dinucletido (FAD). El FAD es la
unin del FMN con un nucletido de adenina a travs de los fosfatos, como en el caso del
NAD+ (figura 4.3).
O
H3C N
NH
FAD
H3C N N O
Flavin adenin dinucletido
CH2
H C OH
H C OH NH2
N
H C OH O O
N
CH2 O P O P O CH2 O N
O- O- N
H H
FMN (Riboflavin fosfato) H H 5'-AMP
OH OH
A pesar de lo que superficialmente pudiera parecer al ver las estructuras de las coenzimas
flavnicas, y particularmente del FAD, sus caractersticas biolgicas son bastante diferentes a
las de las coenzimas piridnicas. El rasgo diferencial ms acusado es sin duda la unin con la
protena. Mientras en el caso de NAD+ y NADP+ esta unin no es ms intensa que la de
cualquier substrato, las coenzimas flavnicas aparecen fuertemente unidas a la protena
enzimtica, formando lo que comnmente llamamos flavoprotenas. En la flavoprotena
tiene lugar normalmente todo el ciclo cataltico; la coenzima es reducida por un dador
electrnico y oxidada por un aceptor sobre la misma molcula, a diferencia de las coenzimas
piridnicas, que necesitan dos enzimas distintas, y por tanto, su disociacin de los mismas.
Otra importante diferencia estriba en que muchas coenzimas flavnicas, formando las
correspondientes flavoprotenas, pueden utilizar el oxgeno molecular como aceptor
electrnico.
La estructura de estas coenzimas se presenta en la figura 4.3. Constan de una base tricclica,
la isoaloxazina, unida a travs del N-10 al polialcohol ribitol. Esta estructura recibe el
nombre de riboflavina, y como su sntesis no es posible en el organismo humano, debe
ingresar como tal en la dieta. Tiene, por tanto, carcter vitamnico (vitamina B2).
O
H 3C N
NH
Semiquinona
H 3C N NH O
O
H 3C NH
NH
Forma reducida
H 3C N NH O
4.2.2.2 Flavoprotenas
FAD y FMN aparecen en la clula unidos a protenas formando las llamadas flavoprotenas.
Como ya se ha dicho, la unin de las coenzimas a la apoprotena es mucho ms fuerte que
en el caso de los piridin nucletidos, hasta el punto que pueden ser propiamente
considerados como grupos prostticos. La unin es muy fuerte, con constantes de
disociacin del orden de 10-8 M a pH 7. El aumento de la fuerza inica y el descenso del pH
favorecen la disociacin del grupo flavnico, dejando libre la apoprotena. En ocasiones
encontramos la coenzima unida covalentemente a la estructura proteica, generalmente a
residuos de histidina o cistena.
La unin con la protena produce cambios importantes en las propiedades de las flavinas:
(a) La unin a la protena determina la aparicin de especificidad. Las flavinas libres pueden
ser reducidas u oxidadas por multitud de dadores o aceptores electrnicos. La unin a la
protena hace mucho ms restringido el conjunto de compuestos que pueden reaccionar
con la flavina.
(b) La unin a la protena favorece la interaccin de las flavinas con otros grupos,
particularmente metales como Fe o Mo. Esto permite un gran espectro de actividades redox
para estas protenas. En este mismo sentido, podemos decir que aunque la mayor parte de
las flavoprotenas contienen un solo grupo prosttico, puede haberlas con dos, en cuyo
caso, teniendo en cuenta los modos de reduccin que veamos antes (reducida,
semiquinona y oxidada), los estados de oxidorreduccin de algunas flavoprotenas pueden
ser extremadamente variados.
La riboflavina no puede ser sintetizada por el organismo animal; de ah que fuera reconocida
como factor vitamnico en la dieta con el nombre de vitamina B2. Sin embargo, no se conoce
en el hombre una enfermedad carencial definida por la falta de riboflavina; s se ha
reconocido la falta de la misma en sndromes pluricarenciales, como el kwashiorkor y la
pelagra. Las caractersticas clnicas supuestamente debidas a la falta de riboflavina, como
lesiones en torno a la boca y lengua, o posibles alteraciones corneales, se observan tambin
en otros estados carenciales, por lo que no pueden ser consideradas como especficas.
H 3C N CH3
N Fe++ N
-
OOC CH2 CH2 N CH CH2
Hemo b
H 2C CH3
CH2
COO-
A diferencia de los grupos flavnicos y piridnicos que hemos visto hasta ahora, nuestro
organismo sintetiza por completo la porfirina, por lo cual no tiene carcter vitamnico. Est
descrita en humanos una serie interesantsima de trastornos metablicos relacionados con
la sntesis del grupo porfirnico, las denominadas porfirias. Y adems, el inters que
presentan estos compuestos se extiende tambin a sus productos de degradacin, los
pigmentos biliares (bilirrubina, biliverdina, etc.)
6
N4 N3
N1 N2
5
Figura 4.6: Forma octadrica de los ligandos de coordinacin al hierro en las
hemoprotenas. Las posiciones 1-4 estn ocupadas por los nitrgenos pirrlicos;
5 y 6, por ligandos de la protena o bien, el 6, por otros ligandos (oxgeno, agua,
cianuro, etc.)
Casi todas las peroxidasas conocidas suelen ser hemoprotenas que contienen una
ferriprotoporfirina IX. El modo de reaccin de las peroxidasas es bastante complejo y puede
seguirse por mediciones pticas y magnticas. As se ha podido determinar, por ejemplo,
que en el curso de la reaccin las posiciones quinta y sexta del complejo estn
esencialmente vacantes, y que el hierro pasa por estados de valencia superiores a tres
(iones ferrilo, 4+ y perferrilo, 5+).
La mayor parte de la catalasa celular est contenida en los peroxisomas, orgnulos celulares
que contienen tambin D-aminocido oxidasa y urato oxidasa. Estas partculas son
especialmente abundantes en los leucocitos polimorfonucleares, consumen una gran
cantidad del oxgeno celular y se cree que tienen un importante papel en la defensa
antioxidante. Hay quien cree que los peroxisomas son un vestigio de las partculas
respiratorias de las clulas protoeucariticas, antes del establecimiento evolutivo del
sistema simbitico mitocondrial.
Los citocromos fueron descubiertos por McMunn en el siglo XIX al estudiar tejidos animales
con un espectroscopio y observar sus bandas de absorcin caractersticas. Fue Keilin
alrededor de 1925 quien sistematiz el conocimiento en torno a estas hemoprotenas (y a
quien debemos el nombre de las mismas).
Los citocromos operan como transportadores electrnicos. Las reacciones en que participan
pueden representarse como
Los citocromos b suelen aceptar electrones a partir de substratos de bajo potencial dentro
de la cadena respiratoria. Su grupo prosttico es una protoporfirina IX con un ion de hierro,
es decir, el mismo grupo hemo que la hemoglobina y la mioglobina, con la diferencia de que
el ion de hierro oscila entre los estados 2+ y 3+. Dentro de este tipo nos encontramos,
aunque con caractersticas algo diferentes, al citocromo P-450, caracterstico de los sistemas
redox microsmicos de clulas animales, implicados en importantes procesos de
hidroxilacin (de esteroides, compuestos xenobiticos, compuestos aromticos, etc.). En
realidad, en torno al citocromo P-450 se establece todo un sistema de transporte
electrnico no mitocondrial responsable de una gran parte del consumo celular de oxgeno,
en el que se incluyen otros citocromos, flavoprotenas y ferrosulfoprotenas.
Los citocromos c tienen un potencial redox intermedio entre los a y los b; por ello los
encontramos como transportadores centrales en los sistemas redox celulares. Uno de ellos,
el citocromo c (los dems se conoces como c2, c3, etc.) tiene la particularidad de ser
fcilmente extrable de la mitocondria por su solubilidad en agua. Esta caracterstica lo hace
nico en su gnero, dado que los dems suelen estar fuertemente unidos a membranas de
manera que su estudio ha de hacerse necesariamente a partir de la disociacin de stas por
mtodos ms o menos drsticos: detergentes, pH, etc. El grupo prosttico en este tipo de
citocromos es el hemo C, cuya estructura es anloga al B excepto en la unin a la protena,
que en este caso es covalente a travs de dos residuos de cistena invariantes en la protena.
4.2.4 Quinonas
O OH
O OH
AH2 A
Las formas biolgicamente relevantes de este tipo de coenzimas aparecen sustitudas y con
una cadena lateral poliprenoide, a travs de la cual se piensa que estos cofactores se anclan
en las estructuras lipdicas relacionadas con el transporte electrnico. A diferencia de los
cofactores que hemos estudiado en los tres ltimos apartados, las ubiquinonas no aparecen
unidas a una protena en sus fuentes naturales. Existen tres grupos interesantes dentro de
este tipo de coenzimas: las ubiquinonas, las plastoquinonas y las vitaminas K.
CH3 O
n
O CH3
Ubiquinona (Coenzima Q)
Posee una cadena lateral poliprenoide compuesta por diez unidades isoprnicas en
mamferos y seis en algunas bacterias. La ubiquinona opera en el transporte electrnico
mitocondrial, entre los complejos I y III y entre los complejos II y III, cuestin que
estudiaremos detalladamente en el metabolismo.
Existen en la naturaleza muchas otras quinonas que operan como coenzimas redox: las
plastoquinonas, compuestos anlogos a la ubiquinona en la cadena de transporte
electrnico fotosinttico del cloroplasto; las vitaminas K o naftoquinonas y la
pirroloquinolina quinona (PQQ), grupo prosttico de las quinoprotenas, protenas presentes
en bacterias metilotrficas de gran inters biotecnolgico.
Se trata de una molcula muy abundante en todos los seres vivos que opera esencialmente
como transportador redox, aunque son relativamente pocas las reacciones enzimticas
conocidas en las que participa como coenzima. Por esta razn se piensa que su abundancia
en los tejidos se debe ante todo a su poder antioxidante, ya que reacciona de forma
espontnea con multitud de aceptores electrnicos. El cido ascrbico es una vitamina para
los primates y el cobaya; el resto de los seres vivos sintetiza la molcula. Su sndrome
carencial es el escorbuto, enfermedad ampliamente conocida por los marineros de la poca
de navegacin a vela. Fueron precisamente estudios conducidos por la Royal Navy britnica
durante el siglo XVIII los que sentaron las bases de la prevencin del escorbuto mediante las
verduras frescas, y sobre todo, el zumo de lima. Reconocido en el siglo XX como vitamina (la
vitamina C), fue aislado y cristalizado por Szent-Gyrgyi en 1928, determinando Haworth
posteriormente su estructura.
4.2.5.1 Estructura qumica
La estructura del cido ascrbico se muestra en la figura 4.9. Opera como transportador
redox mediante la cesin de dos hidrgenos y su transformacin a cido dehidroascrbico.
La forma reducida tiene carcter cido por la ionizacin del grupo enediol. El anillo lactnico
se hidroliza fcilmente en el cido dehidroascrbico, dando lugar a la forma abierta, que ya
no puede volver a reducirse.
A AH2
OH H OH H
O O
H2C C O H2C C O
HO HO
HO OH O O
El cido ascrbico puede ser oxidado por multitud de aceptores electrnicos; entre ellos
tenemos diversos colorantes, nitrato de plata (dando lugar a plata metlica), oxgeno y yodo
en presencia de trazas de metal, etc.
4.2.6 Glutatin
La oxidacin a GSSG puede tener lugar mediante yodo o ferricianuro. Tambin puede ser
oxidado por oxgeno molecular y citocromo c.
Las funciones del glutatin pueden establecerse en dos categoras: (a) protectoras contra el
stress oxidativo y (b) de transporte y metablicas. Nos ocuparemos solamente de las
primeras.
(2) Participa asimismo como donador de la capacidad reductora necesaria para la formacin
de desoxirribonucletidos (sistema de la ribonucletido reductasa).
(3) El glutatin forma parte de sistemas de proteccin contra perxidos y radicales libres. La
enzima clave en estos procesos es la glutatin peroxidasa, en cuya reaccin acta como
correductora la forma GSH producindose GSSG. Posteriormente ste se reduce a GSH por
el concurso de la GSSG reductasa, enzima muy difundida que utiliza NADPH. As, una de las
consecuencias del dficit en glucosa-6-fosfato dehidrogenasa es la inversin de la relacin
celular normal GSH/GSSG, que en condiciones normales es muy superior a la unidad.
Asimismo hay en dicho dficit desnaturalizacin de la hemoglobina y destruccin de la
membrana.
O O
CH2 CH2 O P O P O-
H 3C O- O-
S
CH2 N+
N
Tiamina pirofosfato
H 3C N
La tiamina consta de una pirimidina sustituda unida a un grupo tiazlico, como se puede
apreciar en la figura 4.11. La parte activa de la molcula es el grupo tiazlico. La coenzima
activa es tiamina pirofosfato (TPP), que aparece unida a la protena enzimtica de una forma
bastante dbil.
La tiamina pirofosfato participa en varias reacciones enzimticas . Para nosotros, las ms
importantes son las ya citadas descarboxilaciones oxidativa y no oxidativa de -cetocidos.
Por ejemplo, la no oxidativa a acetaldehido y la oxidativa a acetil-CoA catalizada por el
complejo de la piruvato dehidrogenasa; una reaccin similar es la decarboxilacin de
-cetoglutarato a succinilCoA en el ciclo de Krebs. En estos dos ltimos casos, se trata de
reacciones muy complejas que requieren la accin concertada de varias enzimas y
coenzimas.
Los animales pluricelulares han perdido la capacidad de sntesis de tiamina, por lo cual debe
ingresar en la dieta como factor esencial, y en este contexto recibe el nombre de vitamina
B1. Es asimismo un factor indispensable para el crecimiento de muchos microorganismos.
CHO CHO O
HOH2C OH HOH2C O P O-
O-
CH2OH
N CH3 N CH3
HOH2C OH Piridoxal CHNH2
Piridoxal fosfato
HOH2C OH
N CH3
Piridoxol
N CH3
Piridoxamina
En la forma descrita, el piridoxal fosfato acta como coenzima en los grupos 2.4.1
(aminotransferasas o transaminasas), 4.1.1 (carboxiliasas o decarboxilasas) y 5.1.1
(aminocido racemasas), entre otros.
Otros enzimas o grupos en los que participa el piridoxal son: transferasas de grupos CH2OH-,
CHO-, CHNH2-, etc. (grupo 2.1.2) y algunas aldehido-liasas del grupo 4.1.2.
4.3.2.3 Carcter vitamnico
El cido flico fue primitivamente aislado a partir de levadura por Day como un factor
nutricional requerido para el crecimiento de Lactobacillus. Aislado posteriormente de las
hojas de espinaca, en las que se presenta en elevada concentracin, y de donde deriva
precisamente su nombre (Lat. folium, hoja), fue reconocido como factor vitamnico
(vitamina B9) en la dieta humana; su carencia es la responsable de la aparicin de anemias
megaloblsticas. Como veremos, algunos frmacos activos en la teraputica antineoplsica
son anlogos de cido flico (aminopterina y methotrexate, por ejemplo), por lo que el
sndrome carencial correspondiente tiene una cierta importancia clnica.
La coenzima activa es el cido tetrahidroflico (THF), forma reducida del cido dihidroflico
que se oxida muy fcilmente en presencia de O2, razn por la cual esta ltima es la forma
comn en que se asla esta coenzima a partir de fuentes biolgicas. El papel metablico del
cido tetrahidroflico est ntimamente relacionado con la transferencia de grupos
monocarbonados, particularmente formil (-CHO), hidroximetil (-CH2OH), formimino
(-CHNH), metileno (-CH2-) y metenil (-CH=); con menor frecuencia opera como
transportador de grupos metilo (-CH3). En este sentido podemos considerar al cido
tetrahidroflico como miembro de una familia de coenzimas involucrados de un modo u
otro en el metabolismo de grupos monocarbonados, y que estara integrado, adems del
THF, por S-adenosil metionina (como transportador principal de grupos metilo), la biotina
(de grupos carboxilo -COOH) y las coenzimas cobamdicas (cuya funcin no suele ser la de
transportadores estrictos, como los anteriores, sino que participan en sus
interconversiones).
H 2N N NH
H
N
NH N
CO OH
OH
CH2
CH2 Poliglutamato
4-Aminobenzoico C NH C H
O COO-
n
H 2N N NH O H
C H2N N NH
N N N5,N10 metenil THF
NH N
N
OH
OH HC N+
N10 formil THF
C NH Poliglutamato
O
C NH Poliglutamato
H2N N NH O
N
N
OH CH2 N
C NH Poliglutamato
O
La carencia de cido flico (vitamina B9) en la especie humana se traduce en una anemia de
tipo megaloblstico como principal sntoma (Se llaman megaloblsticas las anemias que
cursan con hemates de mayor tamao que el normal). La causa de la misma radica
probablemente en la incapacidad de sntesis de cidos nucleicos ante la carencia de cido
flico. En este sentido, sealaremos que las coenzimas folnicas participan en la
incorporacin de dos carbonos del anillo purnico (C2 y C8) y en la incorporacin del grupo
5-metil de la timina. En las carencias experimentales de cido flico puede observarse que el
suplemento de la dieta con purinas hace desaparecer el sndrome carencial.
En otro orden de cosas, la teraputica antibacteriana emplea desde principios del siglo XX
las sulfonamidas (ver fig.4.15) que son nalogos del cido 4-aminobenzoico y en cuya
presencia no puede tener lugar la sntesis normal de cido flico en bacterias (inhiben la
folato sintetasa de estos organismos). Por esta razn las sulfonamidas no actan sobre
organismos incapaces de formar cido flico, como por ejemplo la especie humana; y de ah
su inters teraputico. Una accin parecida puede atribuirse al cido p-aminosaliclico (PAS),
primer quimioterpico que se demostr efectivo en el tratamiento antituberculoso.
Las formas activas como coenzimas cobamdicas o corrinoides presentan la sexta posicin
de coordinacin del cobalto ocupada por un ligando distinto a los aniones con los que
suelen ser aisladas. En un caso se trata del nuclesido 5'-desoxiadenosina (otra singularidad:
los desoxinuclesidos del DNA son 2'-desoxi y no 5'-desoxi como en este caso), y hablamos
entonces de adenosilcorrinoides. En otros casos la sexta posicin est ocupada por agua, por
lo que hablamos de acuocorrinoides. Los sistemas enzimticos mejor caracterizados en los
que participan las coenzimas cobamdicas son por lo general sistemas bacterianos. Son muy
pocas las enzimas conocidas de tejidos de mamfero que requieran estas coenzimas.
CO S CoA CO S CoA
H C CH3 CH2
-
COO CH2 Succinil CoA
-
COO
Metilmalonil CoA
Las coenzimas cobamdicas participan en muchas otras reacciones, de distinto tipo; desde la
ribonucletido reductasa bacteriana (fundamental en la sntesis de DNA), pero no en la de
mamferos.
Ni las plantas superiores ni los animales son capaces de sintetizar coenzimas cobamdicas, y
para muchos microorganismos se trata de un factor necesario para su crecimiento. La
carencia "pura" de vitamina B12 no existe en la prctica; normalmente la flora bacteriana
intestinal sintetiza toda la necesaria en la nutricin. En la especie humana, el sndrome
carencial (anemia perniciosa) se debe esencialmente a la carencia de factor intrnseco. ste
es una glicoprotena producida por las clulas parietales del estmago, con un P.M. de 50
kDa, que fija vitamina B12 en la proporcin 1:1 y que es esencial para la absorcin de la
vitamina en los tramos distales del tubo digestivo. Una vez absorbidas, las cobalaminas
circulan en la sangre asociadas a dos protenas, transcobalaminas I y II.
Las principales fuentes naturales de esta vitamina se dan en los fangos y en el estircol; los
tejidos animales, como el hgado, pueden ser asimismo una fuente rica en la vitamina, pero
no los vegetales.
4.3.5 Biotina
HN NH
Biotina
S COOH
OC
HN NH CH R
HN
CO
NH
S CO CH
NH
Biotinil-protena OC
(unin a -amino de lisina) CH R'
HN
CO2
ATP ADP + Pi O
HN NH C N NH
HO Carboxibiotina
S COOH S COOH
Biotina
Figura 4.19: Estructuras de biotina y carboxibiotina
4.3.5.2 Avidina
La S-adenosil metionina (SAM, S-AM) es una coenzima que participa en la prctica totalidad
de las reacciones de metilacin que se dan el medio biolgico. No tiene carcter vitamnico,
siendo sintetizada por el organismo humano siempre que haya suministro diettico de
metionina (que es un aminocido esencial)
(a) Sistemas de metilacin de DNA. El reconocimiento del DNA como "propio" tiene lugar en
las clulas a travs de un patrn especfico de metilacin de las bases. Si ste no existe, el
DNA es degradado por enzimas de restriccin. Las metilaciones ms frecuentes tienen lugar
en N6 de adenina y C5 de citosina.
4.3.7 Pantetenas
La coenzima A es una molcula de muy amplia distribucin en todas las clulas. En realidad,
podemos decir que las formas metablicamente activas de los cidos grasos son derivados
de coenzima A, un poco de la misma manera que los steres fosfricos son la forma
metablica activa de los azcares.
El cido pantotnico (fig.4.21) es la pantoil -alanina. Es sta la parte de la molcula que los
organismos animales no pueden sintetizar y que es requerida por tanto en la dieta. La unin
del cido pantotnico con la cisteamina (producida por descarboxilacin de cistena) da
lugar a la pantetena, que es la estructura comn en estos dos coenzimas.
c. Pantotnico
CH3
CH2OH C CHOH CO NH CH2 CH2 COOH
CH3
Pantetena
CH3
CH2OH C CHOH CO NH CH2 CH2 CO NH CH2 CH2 SH
CH3
c. Pantoico -Alanina Cisteamina
La coenzima A se forma por unin de la pantetena a un 3'-fosfo ADP (fig.4.22) dando lugar a
una compleja estructura con muchos sitios reactivos potenciales; los estudios de Lynen, sin
embargo, demostraron que el grupo reactivo de la coenzima A es el tiol (-SH) terminal.
Como tantas otras coenzimas, pues, la coenzima A presenta una estructura de nucletido de
adenina.
NH2
H H HO H N
O O
N N N
HS C C O P O P O CH2 O N
O H
O 3 C CH3 O- O- N
H H
H H
Coenzima A
O OH
-
O P O
O-
La ACP opera en la sntesis de cidos grasos catalizada por el complejo de la cido graso
sintetasa citoplsmica. En este sentido, los derivados de ACP llevan a cabo reacciones muy
parecidas a los derivados de coenzima A.
4.3.8 Carnitina
No parece que la carnitina tenga carcter vitamnico. Ahora bien, su sntesis requiere lisina y
S-adenosilmetionina, por lo que algunos autores recomiendan su adicin a la dieta, sobre
todo a deportistas; parece que en muchos casos la concentracin de carnitina es limitante
en cuanto a la oxidacin mitocondrial de los cidos grasos.
El PAPS no tiene carcter vitamnico. Esta coenzima opera con todas las sulfotransferasas
del grupo 2.8.2. Algunas de las funciones ms importantes de este proceso son las
siguientes:
NH2
N
O O O
- N
O P O P O P O CH2 O N
O- O- O- N
H H
H H
Adenosina-5'-trifosfato (ATP)
OH OH
Las reacciones en que participa ATP pueden clasificarse dentro de dos grandes grupos:
transferencia de alguna porcin de la molcula de ATP a un aceptor adecuado, o bien rotura
de los enlaces pirofosfato del ATP para suministrar energa libre a reacciones en principio
desfavorables energticamente.
La gran mayora de las enzimas de los grupos 2.7.1-4 (fosfotransferasas o kinasas) utilizan
ATP para la transferencia de un fosfato a un aceptor adecuado.
El ATP participa tambin en procesos que normalmente no tendran lugar por sus
caractersticas energticas. En este caso, el proceso en cuestin aparece acoplado a la
hidrlisis de algn enlace del ATP que provee un intercambio energtico favorable.
4.3.11 Otros nucletidos que operan como coenzimas
Otros nucletidos participan tambin en reacciones similares. As, en los vegetales los
nucletidos de adenina sustituyen a los de uracilo en todas estas reacciones. En otros
procesos operan como coenzimas de transferencia los CDP-derivados (por ejemplo,
CDP-colina y CDP-etanolamina en la sntesis de lpidos complejos). Otros derivados
nucleotdicos lo son de GDP (p.e. GDP-manosa o GDP-fucosa) o de CMP
(CMP-N-acetilneuramnico).
CAPTULO 5: Cintica de las reacciones enzimticas
5.1 Introduccin
En los apartados que siguen estudiaremos muy someramente la cintica de las reacciones
enzimticas. En el contexto del presente curso, no tendra sentido discutir, por ejemplo, la
cintica multisubstrato o las cinticas de estado inicial (o pre-estado estacionario), as como
los efectos de pH y temperatura desde un punto de vista cuantitativo. Por esa razn nos
centraremos en la cintica monosubstrato, y con preferencia, bajo las suposiciones de
Michaelis-Menten. (ver ms abajo)
[1]
d [ P] d [ S ]
k[ E ]
dt dt
En general, este es un resultado propio de todos aquellos procesos que, como la catlisis,
son de ndole regenerativa, tal y como aparece expresado grficamente en la figura 5.3, y no
es atribuible a ninguna caracterstica especfica de las enzimas.
De hecho, uno de los argumentos que utiliz Krebs para postular el ciclo de los cidos
tricarboxlicos que lleva su nombre era la relacin lineal entre el consumo de oxgeno y la
concentracin de una serie de aniones orgnicos que como el citrato, succinato, malato y
oxalacetato, son intermediarios del mismo, y que por lo tanto se regeneran en cada ciclo de
reaccin (figura 5.4).
Un fenmeno parecido tiene lugar en la biosntesis citoplsmica de cidos grasos, proceso
enteramente dependiente de la presencia de CO2 y cuya velocidad es proporcional a la
concentracin del mismo (normalmente en forma de ion bicarbonato HCO3-). El CO2 se
incorpora mediante la acetil-CoA carboxilasa y posteriormente se regenera al condensarse
la unidad malonil- con la unidad acil- en la superficie de la sintetasa de cidos grasos (figura
5.5).
[2]
k+1 k+2
E+S ES E+P
k-1
Las nicas soluciones posibles son las numricas o bien aquellas que introducen ciertas
suposiciones simplificadoras del mecanismo. En cualquier caso, la velocidad de la reaccin
siempre ser
[3]
v k 2 x
Brown y Henri en 1902 fueron los primeros en sugerir el mecanismo [2], es decir, que la
accin enzimtica tiene lugar formndose primero un complejo ES que posteriormente se
descompone a E + P. En 1913, Michaelis y Menten postularon una suposicin adicional
sobre este mecanismo que conduce a una solucin sencilla que concuerda con los datos
experimentales en la mayora de los casos (suposicin de equilibrio rpido)
Estos autores introdujeron una nueva simplificacin (aadida a la suposicin de que s >> e0)
en este mecanismo al postular que la formacin del complejo ES a partir de enzima y
substrato es mucho ms rpida que su descomposicin ulterior a enzima y producto; y por
tanto, se alcanza el equilibrio muy rpidamente. Dicho de otra forma, k+1 k-1 >> k+2. En ese
caso, y utilizando la misma nomenclatura que en el apartado anterior, podemos utilizar una
ecuacin de equilibrio para obtener la concentracin x del complejo ES:
[4]
Km
E S es e0 x s
ES x x
En donde Km es la constante de equilibrio de disociacin del complejo ES, y por tanto, igual
al cociente de las constantes de velocidad k-1/k+1. Despejando x,
[5]
e0 s
x
Km s
Pero la velocidad de la reaccin enzimtica, segn [3] es dp/dt = k+2x; por lo tanto, al
sustituir el valor de x por [5] obtenemos
[6]
dp k es
v k 2 x 2 0
dt Km s
[7]
Vmax s
v
Km s
5.3.3 Concepto de Km
[9]
Glucosa + ATP Glucosa-6-fosfato + ADP
Ahora bien, se debe tener presente que el concepto de Km como medida de afinidad es
solamente vlido en aquellos casos en que el mecanismo obedezca a las condiciones de
Michaelis y Menten, es decir, cuando la formacin de complejo ES sea mucho ms rpida
que la descomposicin de ste hacia el producto, lo cual es por lo general la regla en
muchas reacciones enzimticas.
4. En el captulo 2 vimos que podemos considerar al centro activo de las enzimas como
dotado de dos funciones: (1) la fijacin estereoqumicamente complementaria del substrato
y (2) su transformacin cataltica. Estas dos funciones no son necesariamente
independientes la una de la otra. Con las reservas oportunas, podemos decir que la Km
describe cuantitativamente la primera de estas dos funciones. Veremos este concepto con
ms detenimiento al hablar de la inhibicin enzimtica.
5. Cuando la concentracin de un substrato es aproximadamente igual o menor a su Km, la
dependencia de la velocidad respecto a la concentracin de substrato es ms o menos
lineal. Esto significa que en dicho intervalo de concentraciones las variaciones que pueda
haber en la concentracin de substrato dan lugar a variaciones aproximadamente
proporcionales en la velocidad. Por ello, a estas concentraciones de substrato, podemos
considerar que las enzimas poseen una cierta autoregulacin; una acumulacin de substrato
conduce a un incremento en la velocidad de la enzima que lo transforma, y viceversa. Se ha
pretendido que las concentraciones intracelulares de estado estacionario de los substratos
tienden a estar en los niveles prximos a su Km. No se puede dar una norma general a este
respecto, pero este hecho es cierto para muchos metabolitos.
2. La propia definicin de Vmax como k+2e0 (en el mecanismo [2]) nos permite deducir que la
Vmax es directamente proporcional a la concentracin de enzima. En este contexto se
prefiere denominar a la constante k+2 como kcat que es el nmero de recambio o de turnover
de la enzima, es decir, el nmero de moles de substrato transformadas en la unidad de
tiempo por mol de enzima, y sus dimensiones son de t-1. e0 es la concentracin molar de
enzima. Por tanto, Vmax queda establecida como el producto kcate0. Al ser kcat independiente
de la concentracin de enzima, hoy da se prefiere el uso de esta constante en lugar de Vmax.
[10]
dx/dt= k+1es -(k-1+ k+2) x
[11]
dx/dt= k+1es -(k-1+ k+2) x = 0
Entonces,
[12]
k 1es
x
k 1 k 2
Pero sabemos que
[13]
e0 = e + x || e = e0 - x
[14]
k+1e0s xs = (k-1 + k+2)x
Despejando x,
[15]
e0 s
x
k 1 k 2
s
k 1
[16]
e0 s
x
Km s
[17]
k 2 e0 s
v k 2 x
Km s
[18]
Vmax s
v
Km s
En la cual no aparece ningn trmino en s, lo que nos indica que en estas condiciones la
reaccin enzimtica es orden cero respecto al substrato. Sin embargo, a concentraciones
bajas de substrato (s << Km), la ecuacin de Michaelis-Menten toma la forma
[20]
Vmax
v e0 s
Km
En la que vemos que la reaccin es primer orden respecto a substrato y segundo orden
global (ya que depende de dos trminos de concentracin, e0 y s, siendo la constante
kcat/Km la constante de velocidad de segundo orden. Esta constante representa la eficiencia
cataltica de la enzima, y su valor ser tanto mayor cuanto ms eficiente sea sta. Pero
enzimas y substratos se encuentran normalmente en un medio acuoso, y en ltimo trmino
la velocidad de la reaccin llegara a estar controlada por la velocidad de difusin de
enzimas y substratos en dicho medio. La estructura molecular de las enzimas puede llegar a
hacerse extremadamente eficiente en la catlisis, pero es obvio que no tiene ningn sentido
evolutivo obtener eficiencias catalticas superiores a la velocidad de difusin. sta se ha
calculado en un orden de magnitud de 108 moles/segundo; por ello, esta cifra representa un
lmite mximo a la eficiencia cataltica de las enzimas. Muchas enzimas conocidas alcanzan
esta cifra: se dice que son enzimas controladas por difusin, o bien enzimas plenamente
evolucionadas. Algunas se presentan en la tabla I:
Tabla I
Una vez realizado el ensayo, representamos en una grfica los resultados obtenidos; la
concentracin de substrato en el eje X, y la velocidad inicial obtenida para cada condicin en
el eje Y. Un resultado tpico se presenta en la figura 5.10, en la que los resultados parecen
seguir claramente la ecuacin de Michaelis. A partir de ella podemos determinar la Vmax
(como la asntota superior) y a continuacin la Km como concentracin de substrato que da
lugar a una velocidad igual a Vmax/2 .
Ahora bien, este tipo de grficas no nos permite una determinacin precisa de Vmax, y por
tanto de Km. El error de los puntos experimentales hace muy difcil situar exactamente la
asntota; por otra parte, ajustar los puntos a una hiprbola es ms difcil que hacerlo a una
lnea recta. Por estas razones se prefiere hacer transformaciones lineales de la ecuacin de
Michaelis-Menten.
[22]
s 1 K
s m
v Vmax Vmax
[23]
v
v K m Vmax
s
Podemos ver que se trata de otras tantas ecuaciones de una recta. En el primer caso [21],
tenemos que la representacin de 1/v en funcin de 1/s nos da una lnea recta cuya
pendiente es Km/Vmax; su corte en ordenada es 1/Vmax y el corte en abscisa es -1/Km , tal y
como aparece en la figura 5.11. Este tipo de representacin se llama recproca doble, o bien
representacin de Lineweaver y Burk.
El uso cada vez ms generalizado de ordenadores en el anlisis de datos cinticos hace que
el inters de estos mtodos sea cada vez ms reducido. En general, hoy da los programas
cinticos parten de regresiones no lineales, lo que les hace mucho ms eficientes y
verstiles. Existen hoy da paquetes de programas adaptados al clculo de las constantes
cinticas que brindan una gran cantidad de informacin adicional.
5.4 Efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimticas
El pH del medio es una de las variables a las que ms sensible es la accin enzimtica. En
general, cuando representamos el efecto del pH sobre la actividad de una enzima se suelen
obtener grficas como la presentada en la figura 5.12.
Se trata de una curva acampanada que muestra una regin de actividad mxima (el pH
ptimo de la enzima) con regiones de actividad decreciente a uno y otro lado. En algunos
casos falta una de las dos ramas descendentes; en otros, la regin ptima est extendida en
una amplia gama de pH; pero la forma ms usual de dependencia es la citada en primer
lugar.
En algunos casos un estudio detenido de los efectos del pH puede dar informacin muy
valiosa sobre los grupos presentes en el centro activo. Pero los efectos del pH son, por lo
general, mucho ms complejos. Teniendo en cuenta que el pH determina el estado de
ionizacin de los grupos qumicos tanto del substrato como de la enzima, el efecto de esta
variable puede ejercerse sobre: (a) la ionizacin del substrato; (b) la ionizacin de los grupos
enzimticos del centro activo, que a su vez pueden determinar variaciones sobre la fijacin
del substrato o sobre la actividad cataltica, o ambas a la vez; (c) la ionizacin de grupos en
la molcula de enzima no directamente relacionados con la actividad enzimtica, pero s con
el mantenimiento de su estructura tridimensional, y de ah su efecto indirecto sobre los
grupos del centro activo.
Podramos citar de esta manera ejemplos para casi todas las enzimas en las que conocemos
la estructura y el mecanismo cataltico.
El interior celular posee una alta concentracin protenica y sin duda es sta la defensa
principal del citoplasma ante cambios del pH. No ocurre as, sin embargo, en el medio
interno (es decir, el medio extracelular) de organismos pluricelulares; de ah que en el curso
de la evolucin hayan surgido complejos sistemas de regulacin cido-base. En los
mamferos, estos sistemas implican a la sangre (plasma y glbulos), al aparato respiratorio,
al rin, al sistema nervioso y al sistema endocrino. Su estudio queda fuera de contexto en
este manual, pero no est de ms recordar su existencia a efectos de una mejor
comprensin del efecto del pH.
Estos dos factores operan en sentido inverso; una mayor temperatura acelera la velocidad
de las reacciones individuales, tal como establece la ecuacin de Arrhenius:
[15]
Ea
k cat A exp
RT
Respecto a este ltimo efecto, podemos ver que la temperatura inactiva a las enzimas casi
de forma generalizada. Temperaturas de 70 C son suficientes para hacer desaparecer la
actividad en unos pocos minutos; la fosfatasa alcalina del tejido seo presenta un
semiperodo de inactivacin a 56 C de escasamente dos minutos. Las enzimas
termorresistentes conocidas proceden de microorganismos habituados a altas temperaturas
ambientales, como Bacillus stearotermophilus (entre las Bacterias) o bien las Arqueas
termoacidfilas que se encuentran en manantiales termales o en los fondos marinos
cercanos a la crestas medioocenicas, en las que la actividad volcnica permite
temperaturas locales extremadamente altas para las que se observan normalmente en
dichos ambientes.
Se denomina inhibidor a todo agente capaz de hacer disminuir la actividad de una enzima.
En el estudio de la Enzimologa, sin embargo, el trmino inhibidor posee un significado algo
ms restringido. Dentro de la definicin que hemos adelantado es lgico que podamos
considerar, por ejemplo, al ion H+ como inhibidor, dado que muchas enzimas pierden
actividad por el lado cido de la escala de pH, o bien al ion OH- por una razn similar; las
temperaturas elevadas seran tambin inhibitorias; los agentes desnaturalizantes de la
protena enzimtica tambin lo seran, y as sucesivamente.
Por esta razn vamos a restringir el uso del trmino inhibidor a aquellos agentes que hacen
disminuir la actividad enzimtica al interaccionar con los grupos especficos responsables de
la accin cataltica o de su regulacin. Esta accin cataltica la concebimos en un doble
sentido: fijacin especfica del substrato y su transformacin qumica. Ntese que podamos
haber establecido esta restriccin a los agentes que actan sobre el centro activo. No lo
hemos hecho as porque como veremos, pueden existir regiones en la molcula de la
enzima no directamente relacionadas con el mismo y que sin embargo pueden modular su
accin cataltica (los centros alostricos). Aun cuando los agentes capaces de actuar sobre
centros alostricos pueden perfectamente ser denominados inhibidores en el sentido de
esta definicin, dejaremos su estudio para un captulo ulterior.
4. Muchos inhibidores son tan especficos como el substrato. De esta forma, se pueden
disear inhibidores que afectan solamente a una determinada enzima sin alterar para nada
a ninguna otra. Esto constituye la base de toda la teraputica qumica o Farmacologa.
Podemos apreciar claramente este concepto cuando ampliamos el modelo
enzima-substrato a toda interaccin entre una protena y su ligando especfico. De esta
forma, el modo de accin de los frmacos llega en ltimo trmino a interpretarse siempre
como una competicin entre el frmaco y el ligando fisiolgico (que es el substrato en el
caso de las enzimas). Hay que hacer notar que esta competicin no tiene por qu ser
necesariamente inhibitoria; en muchos casos, es, de hecho, agonstica. Por ejemplo: el
ligando fisiolgico del receptor colinrgico muscarnico es la acetilcolina; el alcaloide
muscarina (obtenido del hongo Amanita muscaria) excita al receptor de la misma manera
que la acetilcolina (es decir, la muscarina es un agonista) mientras que el alcaloide atropina
(obtenido de la planta Atropa belladonna) se fija al receptor pero bloquendolo (por lo que
la atropina es un antagonista). De un modo parecido actan los receptores hormonales y,
en general, los receptores a todas las seales qumicas.
5. Al igual que los frmacos, muchos otros agentes de gran importancia econmica son
inhibidores enzimticos. Por ejemplo, los insecticidas, tando clorados como
organofosforados; los herbicidas, defoliantes y todo tipo de fitosanitarios; muchos aditivos
de la industria alimentaria, etc.
Los inhibidores reversibles son aquellos cuyo efecto desaparece cuando los eliminamos de
la solucin por dilisis o cualquier otro procedimiento. La inhibicin se ejerce a travs de su
fijacin reversible a la enzima segn el proceso
[1]
Ki
E+I EI
en el que el equilibrio se alcanza muy rpidamente. Para este equilibrio definimos una
constante de disociacin, Ki (obsrvese que se trata de una K mayscula, lo que indica una
constante de equilibrio), que tiene respecto al inhibidor el mismo significado que la Km en la
teora de Michaelis respecto al substrato. Por tanto, una Ki pequea supondr una afinidad
grande del inhibidor hacia la enzima, y viceversa. Tengamos en cuenta tambin que la
fijacin del inhibidor puede tener lugar a los diferentes complejos que aparecen en el curso
de la accin enzimtica. As, habr inhibidores que se fijan a la forma libre de la enzima E
(como en [1]); otros lo harn al complejo ES; y otros pueden hacerlo a ambos, E y ES.
La actividad de una enzima viene descrita por dos constantes, Km y kcat. En este sentido, los
inhibidores pueden actuar sobre una de ellas o sobre las dos. Segn este criterio, se
distinguen tres tipos bsicos de inhibidores reversibles: Inhibidores competitivos, cuando su
efecto consiste en un aumento aparente de la Km respecto al substrato sin efecto sobre Vmax
(o ms propiamente, sobre la kcat); Inhibidores no competitivos, cuando disminuyen el valor
de la Vmax sin afectar al valor de la Km; e Inhibidores mixtos, cuando ambas constantes
aparecen afectadas. Dentro de este ltimo grupo se suele hacer distincin entre los
inhibidores mixtos y los inhibidores acompetitivos o anticompetitivos. En esta exposicin
estudiaremos con cierto detenimiento los primeros.
Los inhibidores irreversibles son aquellos que reaccionan con la enzima, modificndola de
forma covalente, de tal manera que aunque eliminemos al inhibidor la accin del mismo
persiste. En contraste con los inhibidores reversibles, cuyo equilibrio se establece
rpidamente, una caracterstica distintiva de los inhibidores irreversibles es que su accin es
dependiente del tiempo; es decir, el grado de inhibicin depende del tiempo a que haya sido
expuesta la enzima al inhibidor. Por ello, su accin se describe a partir de una ecuacin de
velocidad:
[2]
ki
E E'
[3]
vi = ki[E][S]
donde vi es la velocidad de inactivacin. Ntese que en este caso (a) no consideramos la
existencia de un equilibrio: esta inhibicin es irreversible; (b) el proceso se describe por una
constante de velocidad de segundo orden ki, y no por una constante de disociacin Ki como
en el caso de los inhibidores reversibles.
Ahora bien, conviene no tomar el trmino irreversible demasiado al pie de la letra. Una
enzima atacada por un inhibidor irreversible puede en ocasiones reactivarse mediante un
tratamiento qumico que produzca el efecto inverso al del inhibidor. As, los grupos -SH
transformados en disulfuro -S-S- por un agente oxidante pueden reactivarse mediante un
agente reductor. Por ello hay quien prefiere llamar a la inhibicin irreversible inactivacin, y
al proceso contrario, reactivacin.
[4]
S
k+1 k+2
E ES E+P
k-1
I
k+3 k-3
EI
En el cual vemos que tanto el substrato como el inhibidor pueden fijarse a la enzima siendo
esta fijacin mutuamente exclusiva; el inhibidor impide la fijacin del substrato, y ste, la
del inhibidor (es decir, ambos compiten por la fijacin a la enzima). Es por esta competicin
entre uno y otro por lo que este tipo de inhibicin recibe su nombre. Naturalmente, el
complejo EI es improductivo y no da lugar a productos. A partir de estos dos equilibrios
podemos fcilmente darnos cuenta de que para una concentracin dada de inhibidor, las
concentraciones altas de substrato harn desaparecer la inhibicin, alcanzndose la misma
Vmax que en la reaccin no inhibida. Eso s, har falta una mayor concentracin de substrato
para llegar a este nivel; y por tanto, una mayor concentracin de substrato para llegar a
Vmax/2, lo que nos muestra el principal dato cintico de la inhibicin competitiva: un
aumento aparente de la Km hacia el substrato en presencia del inhibidor, y sin que se
modifique la Vmax.
[5]
Km
E S Ki
E I
ES EI
[6]
e0 x y s e0 x y i
Km Ki
x y
Para obtener una ecuacin de velocidad en funcin de las concentraciones de substrato e
inhibidor, sabiendo que v = k+2x, resolveramos el sistema de ecuaciones [6] para x y
obtendramos
[7]
e0 s
x
i
K m 1 s
Ki
[8]
Vmax s
x
i
K m 1 s
Ki
Por regla general, los inhibidores competitivos son todos ellos anlogos estructurales del
substrato, es decir, molculas muy parecidas. Si a esto unimos el hecho de que la inhibicin
competitiva es tan especfica como la interaccin enzima-substrato, as como las
peculiaridades cinticas de la inhibicin competitiva, surge inmediatamente la idea de que
el inhibidor en este caso es un "falso substrato" que ocupa el lugar de ste en el centro
activo, pero que no reacciona. Es decir, tiene la suficiente similitud con el substrato como
para poder fijarse a los grupos complementarios (impidiendo la fijacin del substrato
normal), pero tambin las suficientes diferencias como para no poder reaccionar. La accin
de un inhibidor competitivo se representa esquemticamente en la figura 6.3.
Es importante, sin embargo, no llevar demasiado lejos esta equivalencia entre anlogo e
inhibidor competitivo. El concepto de inhibicin competitiva es puramente cintico, y se
refiere al aumento aparente de la Km por el substrato. Que muchos inhibidores competitivos
sean anlogos qumicos del substrato no significa necesariamente que todos los anlogos
vayan a ser inhibidores o viceversa. Como veremos, muchos inhibidores fisiolgicos, es
decir, efectores de la normal regulacin de una enzima, se comportan como inhibidores
competitivos en el sentido de aumentar la Km aparente, pero sin que tengan ningn
parecido estructural con el substrato (y por esa razn se les llama alostricos, en
contraposicin a los aqu tratados, que seran isostricos).
En general, los anlogos de substrato caen en alguna o varias de las siguientes clases:
enantiomricos, cuando se trata de la imagen especular de una molcula asimtrica;
anomricos, referidos a las formas o del enlace glicosdico; ismeros posicionales,
ismeros geomtricos; productos de reaccin, que en muchos casos compiten con el
substrato por la enzima libre, o bien, en general, compuestos con parecido estructural por el
substrato. As, en el bien conocido caso de la succinato dehidrogenasa, han sido descritos
como inhibidores competitivos, entre otros, los compuestos que aparecen en la figura 6.4.
La analoga estructural de uno de ellos (oxalacetato) se ilustra en la figura 6.5.
Cada enzima tiene, lgicamente, sus propios inhibidores competitivos. Una lnea muy
importante de stos son los anlogos de base o anlogos de nuclesido, que interfieren en
todos los procesos asociados al DNA o al RNA (replicacin, transcripcin, transcripcin
inversa, etc.).
Adems de los anlogos de substrato, un grupo de compuestos muy importante son los
anlogos de cofactor o coenzima, sobre todo por su uso teraputico; por ejemplo, las
sulfonamidas (anlogos del cido 4-aminobenzoico, figura 6.6) o los antiflicos como el
methotrexate (figura 6.7); otros anlogos de cofactores son piridin-3-sulfonato (anlogo de
nicotinamida), desoxipiridoxol fosfato (anlogo de piridoxal fosfato), piritiamina (anlogo de
tiamina), etc.
Otro grupo muy interesante de inhibidores, que se suelen comportar como competitivos (o
como inhibidores suicidas, v. ms adelante), son los inhibidores naturales. Entre stos
tenemos la avidina, protena presente en la clara de huevo capaz de fijar biotina (un
cofactor enzimtico, cap. 4) con extraordinaria afinidad (Kd 10-15 M); la 1-1-antitripsina y
protenas relacionadas, que inhiben la actividad de serinproteasas (llamadas genricamente
serpinas); las cistatinas, que inhiben las tiolproteasas, etc.etc.
Los AET son unos inhibidores muy potentes de la accin enzimtica; lo que unido a su
especificidad, hace que exista una investigacin muy activa en este campo para el diseo de
frmacos, lo cual, a su vez, impulsa el estudio del modo de accin de las enzimas para el
conocimiento de los diferentes estados de transicin.
Muchos frmacos utilizados en clnica humana son AETs. Por ejemplo, el Captopril, utilizado
ampliamente como agente antihipertensivo, es un AET de la enzima convertidora de
angiotensina. Esta enzima cataliza la produccin de angiotensina II, pptido cuya accin
vasoconstrictora es muy potente (figura 6.9)
6.3.5 Anticuerpos catalticos
Por otra parte, los AET se han utilizado para la produccin de anticuerpos catalticos o
inmunoenzimas. Se trata de anticuerpos monoclonales desarrollados contra haptenos que
son anlogos de estado de transicin de determinadas reacciones qumicas. Los anticuerpos
as producidos presentan una complementaridad estereoqumica con el estado de
transicin de la reaccin, lo que en determinadas circunstancias permite que el anticuerpo
tenga actividad cataltica. Tal es el caso de la 4-nitrofenil fosforilcolina, que es anlogo del
estado de transicin de la hidrlisis del correspondiente carbonato (figura 6.10). Un
anticuerpo monoclonal producido contra 4-nitrofenil fosforilcolina (como hapteno) es capaz
de catalizar la hidrlisis del carbonato.
6.3.6 Importancia prctica de la inhibicin competitiva
La inhibicin competitiva representa una manera de inhibir de forma especfica una enzima,
o en un sentido ms amplio, de inhibir la fijacin de un ligando determinado a su receptor, y
tambin de forma especfica. Por esta razn, los inhibidores competitivos constituyen el
principal contingente de compuestos que utiliza la Farmacologa, y el fenmeno de
competicin, en su forma ms general, la base y fundamento de toda la Teraputica
qumica. En la mayora de casos en los que se conoce el modo de accin de una droga
encontramos una competicin como razn ltima de la accin del frmaco. Pero adems, al
ser este fenmeno especfico, por estar mediado a travs de una interaccin estereoqumica
complementaria, la inhibicin competitiva permite la supresin o atenuacin de un proceso
concreto sin alterar en principio ningn otro. Claro est que nos estamos refiriendo aqu a
una generalizacin, con todos sus inconvenientes. No todos los frmacos son inhibidores;
los hay que actan como agonistas, es decir, produciendo los mismos efectos que el ligando
fisiolgico; aunque en estos casos el efecto del frmaco suele ser ms persistente que el de
aqul, al no ser metabolizado eficientemente. De la misma forma, no todas las drogas
teraputicas (o de abuso) son estrictamente inhibidores competitivos, en el sentido cintico
del trmino; las hay con modos de inhibicin mucho ms complejo, o que operan como
inhibidores irreversibles (v. ms adelante). Asimismo, este sentido restrictivo que hemos
dado a la Farmacologa excluye, sin razn aparente, a todo tipo de teraputica sustitutiva.
La idea que realmente pretendemos comunicar es que las acciones farmacolgicas que
emprendemos sobre un organismo, y que se hacen con compuestos muchas veces
radicalmente extraos al mismo, en ltimo trmino van dirigidas a la modificacin de una
interaccin entre un ligando y su receptor. Las ms de las veces esta modificacin es una
inhibicin competitiva.
[9]
Vmax s
(1 i K i )
v
Km s
en la que vemos que Vmax aparece dividida por el factor (1+i/Ki). Esto nos muestra el
carcter cintico de la inhibicin no competitiva, a saber: un descenso del valor de Vmax (o
ms propiamente, de la kcat) sin alteracin de la Km. Por tanto, aun cuando la concentracin
de substrato suba indefinidamente, la inhibicin no desaparece. Este efecto, como veremos,
puede tambin ser visto en los inhibidores irreversibles, en los que se aprecia una
disminucin aparente de Vmax; pero en este caso, el efecto se realiza sobre e0, la enzima
total; mientras que el de los inhibidores no competitivos reversibles tiene lugar sobre kcat.
6.5.1 Generalidades
A diferencia de todos los modos inhibitorios que hemos tratado hasta ahora, la inhibicin
irreversible consiste en una reaccin qumica entre el inhibidor y la enzima de tal manera
que se alteran los grupos funcionales de sta, bien sean los encargados de la fijacin del
substrato o de su transformacin cataltica, o de ambos. La inhibicin irreversible
corresponde en general al mecanismo
[11]
ki
E+I E'
En el que la molcula enzimtica reacciona con el inhibidor para dar una forma inactiva (o
menos activa) E', dependiendo este proceso de una constante de velocidad ki (y que por ello
representamos con k minscula). Cinticamente, la inhibicin irreversible se describe con
una ecuacin de segundo orden como
[12]
de
k i E I
dt
Otra caracterstica general de los inhibidores irreversibles es que suelen ser sustancias muy
txicas para los organismos. La especificidad enzimtica est sobre todo determinada por
los grupos encargados de la fijacin del substrato a la enzima. Los grupos reactivos del
centro activo, por su parte, son comunes a muchsimas enzimas. Como tendremos ocasin
de ver ms adelante, estos grupos son, por ejemplo, el -OH de la serina, el imidazol de la
histidina, el -SH de la cistena, y el -amino de la lisina, aparte de metales que puedan
desempear un papel importante en el mecanismo cataltico. Por ello, todos los agentes
que puedan reaccionar con estos grupos se comportarn como inhibidores irreversibles no
slo de una enzima (que sera el caso de los inhibidores competitivos) sino de todas las
enzimas que tuvieran en su centro activo el grupo en cuestin. Su accin por tanto se
extiende a muchas enzimas a la vez; y por eso suelen ser altamente txicos in vivo. Dentro
de este tipo de inhibidores estudiaremos los reactivos de grupo SH, los metales pesados y
los agentes quelantes de cationes esenciales.
La cadena lateral del aminocido cistena desempea un papel muy importante tanto en el
mantenimiento de la estructura tridimensional de una protena, a travs del grupo disulfuro
(-S-S-) como en el centro activo de una enzima, a travs de las propiedades del grupo -SH.
En forma de tiolato -S- se trata de un nuclefilo potente con propiedades muy parecidas al -
OH de la serina. Hay muchos agentes capaces de reaccionar con este grupo. Entre los
principales, tenemos:
1. Reactivos que promueven la alquilacin de grupos -SH como por ejemplo: halocidos y
sus derivados (yodoacetato, yodoacetamida), mostazas S y N, cloroacetofenona,
cloropicrina, bromobencilcianuro, fluoropiruvato. Estos agentes inducen la formacin de un
tiolter estable a hidrlisis, y por lo tanto las enzimas no son susceptibles de reactivacin.
Esta reaccin es dependiente de pH, ya que el grupo reaccionante es el ion -S-. En la figura
6.13 se presenta el modo de accin del yodoacetato.
2. Reaccin con dobles enlaces, como por ejemplo el cido maleico y la N-etilmaleimida
(NEM). Se trata de una reaccin parecida a la anterior, dado que se forma un tiolter
estable, siendo la reaccin dependiente de pH (figura 6.13)
4. Agentes oxidantes, que promueven la oxidacin del grupo tiol -SH a disulfuro -S-S- (figura
6.15): glutation oxidado, sulfito, tetrationato, c.perfrmico, perxido de hidrgeno,
aloxana, ferricianuro y ditio(bis)nitrobenzoico.
6.5.3 Metales pesados
1. Los iones cianuro (CN-), sulfuro (S-), las azidas y el monxido de carbono deben su accin
inhibitoria a la formacin de complejos con metales. Por tanto, todas las metaloenzimas son
susceptibles de ser inactivados por estos agentes. En particular, es llamativa la inactivacin
en sistemas que contienen Fe, Cu y Zn; en menor medida, Mn y Co. El efecto txico del
cianuro se debe a la inactivacin de la citocromo oxidasa al ocupar la sexta posicin de
coordinacin de un hemo a, grupo prosttico de los citocromos a (ver cap. 4).
Reaccionan con un grupo especfico que est en el centro activo o sus proximidades, sin
reaccionar con otros aminocidos iguales presentes en la misma protena.
6.5.5.1 Organofosfricos
Son agentes que en su estructura incluyen grupos qumicos susceptibles de reaccionar con
los residuos de aminocidos presentes en las proximidades del centro activo. El prototipo de
los marcadores de afinidad son los derivados clorometilcetona. Las halometilcetonas
reaccionan con los grupos tiol e imidazol cercanos al centro activo y pueden ser fcilmente
introducidas en compuestos con estructura anloga a substratos de enzima. En la figura
6.17, la estructura derivada de la reaccin de una histidina activa (esto es, perteneciente a
una trada Ser-His-Asp) con el marcador de afinidad tosil-L-fenilalanina clorometilcetona
(TPCK) (tosil es la abreviatura de 4-toluenosulfonil)
Los marcadores de afinidad se han empleado sobre todo en estudios estructurales del
centro activo.
[13]
I
k+1
kcat ki
E EI EI* E'
k-1
En donde:
(a) el inhibidor suicida I se fija a la enzima E con la misma especificidad que un substrato o
un inhibidor competitivo (con constantes k+1 y k-1; la unin es reversible) dando lugar a un
complejo EI
(b) El inhibidor I as fijado es transformado a una especie qumica muy reactiva I* por accin
de la propia enzima, con constante cataltica kcat (igual que un substrato)
(c) I* reacciona con los grupos qumicos del centro activo con constante de velocidad ki
(como los inhibidores irreversibles) dando paso a una forma inactivada de la enzima E,
En resumen: la propia enzima transforma el inhibidor en una especie qumica que la inactiva
irreversiblemente.
Los criterios para definir un compuesto como substrato suicida seran: (a) Debe fijarse con la
misma especificidad que un substrato o un inhibidor competitivo; (b) el inhibidor no debe
ser capaz de reaccionar en ausencia de enzima; (c) debe ser activado especficamente por la
enzima; (d) la presencia de substrato o de un inhibidor competitivo convencional a
concentracin alta dificulta o suprime la accin del inhibidor.
Los antibiticos -lactmicos son inhibidores suicidas de la transpeptidasa. Una vez unidos
al centro activo, el ciclo -lactmico es atacado y roto por la enzima y reacciona con la
serina del centro activo, inactivando irreversiblemente a la transpeptidasa (figura 6.19). Se
impide as la sntesis normal del peptidoglicano. Al no disponer de pared celular, las fuerzas
osmticas del medio destruyen a la bacteria (son, por tanto, antibiticos bactericidas).
Estos antibiticos solamente operan a travs de su unin al centro activo de la
transpeptidasa, siendo transformados por sta en la especie qumica que inactiva la enzima
por reaccin con la serina activa. Son, por tanto, inhibidores suicidas.
En resumen, hemos visto hasta aqu cmo unos inhibidores suicidas de una serin-enzima
(los antibiticos -lactmicos sobre la transpeptidasa) son potenciados por otro inhibidor
suicida que opera sobre otra serin-enzima (el cido clavulnico sobre la -lactamasa).
6.6.3 Otros inhibidores suicidas
7.1.1 Concepto
Hemos visto en los captulos anteriores que todos los modelos aceptados hoy da para
explicar la accin enzimtica dan por sentado que las enzimas ejercen su accin a travs de
la formacin de un complejo ES (complejo enzima-substrato), de naturaleza estequiomtrica
y en muchos casos no covalente. Cuando a esta generalizacin aadimos el hecho de la
especificidad enzimtica, se llega a la conclusin de que la fijacin del substrato se hace a un
lugar especfico de la enzima, cuya configuracin espacial, determinada por las cadenas
laterales de los aminocidos que la integran o por la presencia de un grupo prosttico, es tal
que slo el substrato o compuestos anlogos del mismo pueden fijarse. Por otra parte, de
esta fijacin resulta la transformacin cataltica del substrato. Llamamos centro activo a esta
zona especfica de la molcula enzimtica. Hasta este momento hemos tratado del centro
activo en un sentido puramente cintico; los datos experimentales apuntan a la existencia
de un centro activo. En este captulo trataremos en primer lugar de la evidencia estructural
que nos lleva a esta conclusin. El conocimiento detallado de la estructura de muchos
centros activos permite que hoy da conozcamos asimismo multitud de mecanismos de
accin enzimtica, que tambin sern estudiados en el presente captulo.
La existencia del centro activo enzimtico presupone que cualquier descripcin del mismo
deba necesariamente explicar:
- Adems, cualquier descripcin del centro activo debe explicar la eficiencia cataltica de las
enzimas. Los nmeros de recambio tan enormes que encontramos a veces en la catlisis
enzimtica no encuentran una explicacin satisfactoria hasta que no se llega a conocer en
detalle la estructura del centro activo. En este sentido, el conocimiento del mismo puede
brindar claves extraordinariamente tiles en el diseo e implementacin de enzimas
artificiales, tema abordado por la moderna Biotecnologa.
2. Muchas enzimas son protenas conjugadas a un grupo prosttico, y en estos casos puede
demostrarse fcilmente que la actividad cataltica est en parte o en su totalidad ligada al
mismo. El grupo prosttico ocupa una parte especfica de la molcula, y su actividad est
condicionada por el entorno de la molcula proteica. Hoy sabemos que en la mayora de
estos casos el grupo prosttico no es capaz per se de llevar a cabo el proceso cataltico
completo. As, en las hemoenzimas (enzimas con grupo prosttico de tipo hemo) el entorno
proteico es absolutamente fundamental en la accin cataltica, y lo mismo podemos decir
de las flavoenzimas y de todas las dems.
Esta convergencia estructural en enzimas de muy diversa procedencia habla a favor de una
configuracin altamente especfica de la molcula enzimtica que, al conservarse, implica
una zona de la molcula fundamental para su actividad cataltica.
7. Por ltimo, podemos mencionar los estudios fsicos, estructurales, realizados sobre
complejos enzima-substrato (o una vez ms, anlogos de substrato). Entre ellos los ms
significativos son los realizados por cristalografa de rayos X. En 1965, Phillips public sus
resultados sobre la cocristalizacin de la lisozima con su substrato, y la estructura a alta
resolucin del complejo. Ya el hecho de que el complejo ES (o EI, en el caso de un anlogo
competitivo) pueda co-cristalizar indica que la fijacin del substrato tiene necesariamente
que hacerse a un grupo especfico, el mismo en todas las molculas enzimticas. Pero la
estructura resultante de estos estudios va an ms all; no slo se demuestra claramente la
existencia de un lugar de fijacin especfico del substrato, sino que explica con todo detalle
los pormenores de la actividad cataltica del mismo. En la actualidad se ha logrado la
cocristalizacin de muchos complejos ES y se ha podido estudiar su estructura por
cristalografa de rayos X, con el mismo resultado que en el caso de la lisozima.
- En las enzimas que contienen serinas reactivas en el centro activo podemos determinar el
nmero de stos mediante reaccin con organofosfricos (por ejemplo, DFP, diisopropil
fosfofluoridato, figura 7.1). Es obvio, en este caso, que el nmero de moles de DFP
consumidas equivaldr al nmero de centros activos de la enzima. En este caso es
importante hacer notar que los organofosfricos reaccionan nicamente con la serina
activa, sin hacerlo con las dems serinas que pudiera haber en el resto de la molcula
enzimtica.
- Lo mismo puede hacerse con otros inhibidores irreversibles, y muy particularmente con
substratos suicidas.
(a) Supongamos que se desea sustituir la serina activa de la quimotripsina por otro
aminocido. Para ello, se sintetiza un oligonucletido de unos 15 nucletidos de secuencia
complementaria al DNA original, excepto en una sola base, correspondiente a la segunda del
codon de serina (TCT, cuyo complementario sera AGA y sin embargo hemos puesto AAA).
Por ello, serina (TCT) se ver sustituda por TTT (fenilalanina) (figura 7.3). Es obvio que el
apareamiento Watson-Crick entre la secuencia del oligonucletido y la del gen clonado que
se pretende mutar no es perfecto; pero llevando a cabo la hibridacin en condiciones de
alta concentracin salina se obtiene el apareamiento a pesar de la zona imperfecta.
(b) Se procede a entonces a tratar el hbrido con DNA polimerasa, con lo que producimos
DNA con la secuencia mutante deseada. Este DNA, propagado por la reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR) se transcribe a un mRNA que expresado en un sistema de sntesis de
protena dar lugar a la enzima con el aminocido mutado (figura 7.4).
6. Estudios fsicos. Se conoce hoy da la estructura tridimensional de miles de enzimas. En
muchos casos se puede obtener la cocristalizacin de las mismas con su substrato o un
anlogo del mismo, con lo que se hace accesible al estudio por difraccin de rayos X, lo cual
supone el estudio ms completo que cabe hacer tanto del centro activo como del
mecanismo cataltico de las enzimas. Ms adelante en este mismo captulo estudiaremos a
modo de ejemplo una serie de mecanismos determinados por esta y otras tcnicas.
Uno de los problemas ms interesantes que plantea la enzimologa es determinar las causas
de la gran eficiencia cataltica de las enzimas. La catalasa, por ejemplo, transforma substrato
en el orden de 108 molculas de substrato por segundo y centro activo. Estas velocidades
corresponden a una disminucin de la energa de activacin (v.cap.1) de varios rdenes de
magnitud. La explicacin de estas activaciones tan intensas no radica en una sola causa.
Muy esquemticamente podemos cifrar la accin enzimtica en los siguientes mecanismos:
(b) Presentacin de grupos con reactividades especficas (cido, base, nuclefilo, electrfilo,
etc.) presentes en la molcula enzimtica y que determinan la accin cataltica.
(c) Disminucin de la estabilidad del estado basal de las molculas e incremento de la misma
en el estado de transicin.
Si bien estos efectos, uno por uno, no llegan a explicar las enormes velocidades de la accin
enzimtica, en conjunto pueden dar una idea relativamente aproximada de los mecanismos
intrnsecos de la accin enzimtica.
Existen muchos aminocidos en las protenas cuyas cadenas laterales son susceptibles de
disociacin cido-base, pudiendo actuar como catalizadores generales cidos o bsicos.
Pero adems, el entorno en el interior de la molcula altera el pK a de los grupos disociables,
llevndolos a zonas de pH ms cercanas al del interior celular, de forma que grupos
qumicamente idnticos pueden actuar como cido y como base en la misma molcula.
el cual es roto por el protn de la His 12, liberndose as el fragmento 5 del polinucletido
primitivo y volviendo el centro activo a su configuracin original (figura 7.9, 7)
Reacciones de sustraccin y cesin protnicas como la citada, llevadas a cabo por bases
(generalmente por el par electrnico de la histidina), tienen una enorme importancia no
slo en esta enzima, sino en toda la catlisis enzimtica en general.
Se llaman grupos nuclefilos aqullos que tienen abundancia de electrones (por ejemplo,
grupos con N, O y S) y por lo tanto presentan afinidad hacia los ncleos (y de ah el nombre).
Los ataques nuclefilos tienen una gran importancia en multitud de mecanismos
enzimticos. Nuclefilos muy potentes son el -OH de la serina (cuando est en las
proximidades de una histidina que tiende a retirar un protn H + del grupo alcohlico y se
transforma en grupo enolato O- de gran reactividad), el N de la histidina (en estado de base
conjugada, es decir, con el par electrnico libre) y el -SH de la cistena (en presencia
asimismo de un grupo bsico que induzca en sta una sustraccin protnica y lo transforme
en tiolato, S-).
Son grupos electrfilos los que con pocos electrones tienen afinidad por stos; no hay en las
protenas grupos electrfilos potentes; pero s lo son los tomos e iones metlicos (Zn 2+,
Cu2+, etc.) que con mucha frecuencia aparecen formando parte en las molculas enzimticas
con diversas geometras de coordinacin y mucha importancia en el mecanismo de catlisis.
El caso mejor estudiado, que ya hemos tenido ocasin de examinar, es el de las serin
proteinasas. La accin cataltica en estas enzimas consiste en una sustraccin protnica
llevada a cabo por la histidina activa y que convierte al -OH sernico en un fuerte nuclefilo
que ataca al grupo carbonilo del enlace amida con formacin de una acil-enzima que puede
aislarse fcilmente. Se describe al final de este captulo el mecanismo detallado de accin de
una serinproteinasa, la quimotripsina.
Los intermediarios covalentes no slo se forman a partir de serina. Un intermediario
covalente de gran importancia en la catlisis enzimtica, adems de otros muchos, es
la formacin de bases de Schiff. El grupo carbonilo -CO- de aldehidos o cetonas
reacciona con aminas primarias (por ejemplo, la cadena lateral de la lisina) con prdida
de agua para formar las llamadas bases de Schiff. Tal es el caso de la aldolasa, enzima
que ataca a la fructosa 1,6 bisfosfato para dar dos triosa-fosfatos en la glicolisis (figura
7.10).
A lo largo de esta discusin hemos podido comprobar que las serin proteinasas son
quiz las enzimas cuyo mecanismo conocemos mejor. Para terminar este captulo,
estudiaremos el mecanismo reactivo de la quimotripsina (EC 3.4.21.1), que es el
prototipo de las serin proteinasas. Se presenta su estructura en la figura 7.11.
El centro activo de la quimotripsina est formado por una trada cataltica serina-
histidina-aspartato (figura 7.12, 1), propio de las serinproteinasas y de muchas otras
enzimas. La presencia de esta trada la hace sensible a inhibidores organofosfricos,
entre otros.
La investigacin sobre inhibidores de serin proteinasas es un campo muy activo, dada
la importancia que tienen las roturas proteolticas mediadas por estas enzimas en
multitud de procesos celulares y fisiolgicos (desde la apoptosis hasta la coagulacin
de la sangre, pasando por la formacin de protenas de cubierta vricas).
A este centro activo accede el substrato (figura 7.12, 2). En el caso de la quimotripsina,
se trata del interior de un pptido, fijndose con la especificidad propia de esta enzima
(ver ms arriba).
La accin cataltica comienza con la sustraccin de un protn por parte del par
electrnico libre de la histidina activa (figura 7.13, 3) cuyo grupo imidazol pasa a
imidazolio, con carga positiva, y el OH de la serina se convierte en enolato O-. El
enolato, un nuclefilo potente, ataca al enlace peptdico dando lugar a un primer
estado de transicin, con el grupo carbonilo C=O del enlace convertido
transitoriamente en un carbono tetradrico (figura 7.13, 4). La carga negativa del
aspartato estabiliza al grupo imidazolio de la histidina.
La histidina, a continuacin, cede el protn captado previamente al estado de
transicin, rompindose el enlace y liberndose el primer producto (el fragmento C-
terminal del pptido atacado), mientras que el fragmento C-terminal queda unido
covalentemente a la serina, dando lugar al complejo acil-enzima (figura 7.14, 5).
A continuacin entra en el centro activo una molcula de agua (figura 7.14, 6) que es
atacada a su vez por el par electrnico de la histidina libre, que sustrae un protn del
agua para dar un hidroxilo reactivo (figura 7.15, 7) y nuevamente un imidazolio,
estabilizado por el aspartato. El hidroxilo ataca al enlace acil-enzima. Este ataque
produce un segundo estado de transicin con carbono tetradrico (figura 7.15, 8).
8.1 Generalidades
Una elemental consideracin de las capacidades de los seres vivos nos lleva a admitir
sin gnero de dudas la necesidad de un control de sus funciones, tanto a nivel
fisiolgico como a nivel celular. El concepto de homeostasis de Cannon, heredero de la
fixit du milieu intrieur de Claude Bernard lleva implcito la existencia de mecanismos
de control que mantengan todas las funciones a un nivel fijo y de referencia. Pero an
hay ms: una de las caractersticas ms notables de los seres vivos es su capacidad de
adaptacin a circunstancias ambientales cambiantes; y as como determinadas
funciones deben mantenerse a su nivel de referencia homeosttico, otras deben
necesariamente alterarse en respuesta a un ambiente en cambio y potencialmente
hostil. Los varios millares de reacciones metablicas que pueden tener lugar en un ser
vivo no han de estar necesariamente siempre en funcionamiento; es obvio que el
escenario ambiental ha de determinar en ltimo trmino las capacidades metablicas.
No es lo mismo, por ejemplo, un cultivo bacteriano creciendo en un medio mnimo que
el mismo cultivo en un medio completo; ni un animal herbvoro paciendo
tranquilamente que el mismo animal sometido al ataque de un predador; ni la
actividad de una planta iluminada que la misma en la oscuridad. En todos estos casos
podemos desentraar una cadena de acontecimientos fisiolgicos que en ltimo
trmino vienen determinados por variaciones en el metabolismo; y como son las
enzimas la condicin necesaria y suficiente de ste, encontraremos que es
precisamente la variacin de la actividad y la concentracin de enzimas el causante
ltimo de todas las adaptaciones fisiolgicas. Actividad y concentracin enzimticas,
pues, estn sometidas a mltiples controles relacionados con la adaptabilidad del ser
vivo a su entorno.
Las enzimas celulares pueden ser clasificadas en dos grandes grupos: (a) Enzimas
constitutivas, que se mantienen siempre al mismo nivel independientemente de las
variaciones ambientales. El ejemplo tpico de estas enzimas son las de la va glicoltica.
(b) Enzimas inducibles, que slo son producidas en respuesta a estmulos del medio
ambiente. A stas ltimas se refiere esencialmente este tipo de control. Por ejemplo,
una bacteria puede utilizar varias fuentes de carbono. En un momento dado la bacteria
est creciendo en glucosa y sbitamente se le cambia a un medio con lactosa. Existen
sistemas que inducen la sntesis de las enzimas implicadas en la degradacin de la
lactosa. Anlogamente, una clula bacteriana creciendo en un medio mnimo debe
sintetizar todos los aminocidos proteicos. Si en un momento dado suplementamos el
medio con un determinado aminocido, por ejemplo, histidina, existen sistemas que
reprimen la sntesis de enzimas encargadas de la produccin de histidina. En los
eucariotas existen sistemas de induccin y represin mucho ms complejos, pero que
ejercen su accin asimismo sobre el aparato de transcripcin de la clula. No hay que
olvidar que, en este caso, los controles trascienden del mbito restringido del
metabolismo, dando paso a la accin de seales qumicas tales como hormonas,
neurotransmisores, factores de crecimiento, etc.
Este tipo de controles, mucho peor conocidos que los anteriores, se ejercen
acelerando o enlenteciendo el ritmo de degradacin proteoltica de las enzimas
celulares.
Aqu no vamos a tratar estos tipos de controles, puesto que se suelen estudiar
formando parte de la Gentica Molecular, ya que estn todos ellos ntimamente
relacionados con los procesos de expresin gentica.
Van a ser el objeto principal de estudio en este captulo y en el siguiente. Este tipo de
controles se ejerce sobre la actividad intrnseca de la enzima, e implican por lo general
alteraciones conformacionales de la molcula enzimtica. Los controles sobre la
actividad enzimtica pueden a su vez realizarse sobre (a) la funcin de fijacin del
substrato, haciendo variar la Km aparente hacia el mismo; (b) la funcin de
transformacin cataltica del substrato, lo que lleva a alteraciones en la kcat de la
enzima; (c) ambas funciones.
En muchos casos las enzimas pueden ser modificadas covalentemente por otros
sistemas enzimticos, resultando variaciones en su actividad con significado
regulatorio, y que muchas veces son activaciones on-off, es decir, todo o nada. Se van
conociendo cada da ms y ms modificaciones covalentes de esta naturaleza. Las ms
generalizadas, aunque ni mucho menos las nicas, consisten en fosforilacin o
defosforilacin de la protena enzimtica. Las modificaciones covalentes suelen darse
en respuesta a seales fisiolgicas, y son frecuentes las activaciones "en cascada" de
estos sistemas. El cambio en actividad enzimtica puede variar en rdenes de
magnitud, a diferencia del control alostrico, que induce variaciones relativamente
pequeas en la actividad del sistema.
Dentro del control por modificacin covalente podemos incluir la activacin por
modificacin proteoltica. Algunas enzimas son producidas como zimgenos, es decir,
precursores inactivos que pueden ser activados por la rotura de un enlace peptdico
especfico. En estos sistemas es regla la activacin o inactivacin en cascada, y suelen
aparecer en aquellos procesos que en un momento dado deben ponerse en
funcionamiento rpida e intensamente, como por ejemplo la coagulacin sangunea.
Por ejemplo, la mquina de vapor fue posible cuando James Watt invent un
dispositivo que regulaba la presin del vapor en funcin de la velocidad de la mquina,
y al que dio el nombre de gobernador (governor). El trmino gobernador o
gobierno procede de la misma raz griega (, kybernetes, el piloto de una
nave) que Ciberntica, ciencia que estudia el comportamiento de los sistemas de
control en abstracto.
En la figura 8.1, vemos que el efector o planta transforma una entrada en una salida.
Esta salida, a travs del lazo de retroalimentacin, se compara a una seal de
referencia en el comparador. Para ello se requiere que exista un transductor que
convierta la seal de salida a una magnitud directamente comparable a la seal de
referencia. Como resultado de la comparacin se enva una seal de control a un
regulador que aumenta o disminuye la entrada en respuesta a la seal de control. El
trayecto entre la salida y el regulador se conoce como lazo de retroalimentacin (Ingl.,
feedback loop).
Como veremos, este mismo esquema, con las oportunas modificaciones, puede ser
aplicado al control de la actividad enzimtica en muchas ocasiones.
Esta reaccin se ve fuertemente inhibida por CTP, nucletido que bien puede
considerarse uno de los productos finales de esta concreta va metablica.
Nuevamente el nivel de producto final es el determinante ltimo de su biosntesis (es
decir, CTP se comporta como la isoleucina en el caso anterior, inhibiendo su propia
biosntesis). Pero en este caso concreto, hay otro hecho de importancia: el ATP,
nucletido purnico, se comporta como un activador de esta misma reaccin (figura
8.5). El significado fisiolgico de este hecho es claro: la sntesis de pirimidinas debe
necesariamente estar concertada con la de purinas; en el caso concreto del DNA,
conforme a las reglas de Chargaff, la cantidad de purinas debe ser exactamente igual
que la de pirimidinas.
Estos descubrimientos fueron los primeros de toda una serie que condujo al
establecimiento de ciertas generalizaciones sobre el control enzimtico por
realimentacin, y que veremos seguidamente.
8.2.2 Caractersticas generales del control enzimtico por retroalimentacin negativa
Tabla I
3. Los tipos de inhibicin observados, desde el punto de vista cintico pueden ser
competitivos, no competitivos y mixtos, aunque los primeros suelen aparecer con ms
frecuencia. Por las razones que veremos ms adelante, y siguiendo a Monod, Wyman
y Changeux, se prefiere denominar efectos K y efectos V las inhibiciones de tipo
competitivo o no competitivo, respectivamente, en este contexto.
En resumen, muchas vas metablicas estn reguladas por su producto final, que se
comporta como inhibidor de una enzima de la misma que por lo general tiene un papel
limitante en el flujo a su travs, y que muchas veces puede fcilmente etiquetarse
como "primera enzima" o como primer paso comprometido o como enzima
limitante. A continuacin trataremos de estudiar los mecanismos moleculares que
determinan estos fenmenos. El mecanismo mejor estudiado y ms generalizado en
este contexto es el alosterismo.
8.3 Alosterismo
8.3.1 Definicin
1. Las enzimas sometidas a regulacin por producto final poseen dos tipos de sitios
para la fijacin de substratos y efectores: el centro activo, lugar de la fijacin normal de
substratos y efectores isostricos, y un centro alostrico responsable de la fijacin de
efectores reguladores, como la isoleucina en el caso de la treonina deshidratasa y el
CTP en el de la aspartato transcarbamilasa.
3. Las enzimas alostricas son por lo general difciles de purificar; en el curso de las
maniobras de purificacin es bastante frecuente que se pierda la sensibilidad a
efectores mientras que la actividad cataltica permanece intacta.
El modelo alostrico as propuesto ha resultado ser una idea muy fecunda en el campo
de la regulacin de la actividad enzimtica y sus extensiones naturales a la regulacin
de las interacciones protena-ligando en general. No han tenido la misma suerte los
distintos modelos que se han propuesto para explicar el comportamiento alostrico.
Ahora bien, la idea de efectores fijndose a un lugar distinto del centro activo e
induciendo con ello cambios conformacionales en la protena enzimtica que resultan
en variaciones de su actividad sigue siendo un modelo plenamente aceptado por la
Enzimologa actual.
2. Que la afinidad de la enzima por el substrato no puede ser descrita por una simple
constante como la Km en las condiciones de Michaelis-Menten, sino que en todo caso
habra que describir tantas constantes como sitios de fijacin haya en la molcula; en
el caso de la hemoglobina, cuatro.
3. Que necesariamente tiene que haber un mecanismo de interaccin entre sitios de
manera que la fijacin a uno de ellos repercuta en la fijacin a otro; excludas las
acciones a distancia, hemos de pensar en enzimas con mltiples sitios para el
substrato; y por lo tanto, en enzimas con estructura cuaternaria, es decir, compuestas
por varias subunidades.
- Efectos heterotrpicos, que son los ejercidos por los distintos ligandos sobre la
fijacin de otros ligandos, y que se traduce en incrementos (inhibidores) o
disminuciones (activadores) de la cooperatividad del sistema.
1. Las enzimas sometidas a regulacin alostrica tienen no slo un centro activo, sino
que disponen de otros tantos sitios para la fijacin de efectores (centros alostricos).
Es obvio que toda teora que trate de dar una interpretacin mecanstica de los
fenmenos alostricos, en el sentido restringido discutido hasta aqu, debe explicar,
por una parte, los fenmenos comunes a todas las enzimas (cinticas saturantes y
efectos isostricos) al tiempo que por otra parte ha de dar cuenta asimismo de la
fenomenologa especfica de aqullos (cooperatividad, cintica sigmoide, efectos
homotrpicos y heterotrpicos, etc.). Se han propuesto muchos modelos para la
explicacin del alosterismo; pero el nico que ha ofrecido hasta ahora concordancia
con los datos experimentales es el que se expone resumidamente a continuacin.
1. Las protenas con comportamiento alostrico son oligmeros formados por varios
protmeros, y existiendo en la estructura cuaternaria resultante al menos un elemento
de simetra. La palabra protmero alude no estrictamente a subunidad, sino al menor
elemento de la estructura que puede fijar substrato y efectores (ntese que un
protmero puede constar de varias subunidades, aunque no necesariamente).
2. El sistema puede estar en dos estados diferentes, llamados R (de relajado) y T (de
tenso). Entre las protena en forma R y la protena en forma T se establece un
equilibrio cuya constante es L, definida de esta forma (ec.[1]):
[1]
L
T0
R0
Siendo R0 y T0 las concentraciones de enzima en formas R y T, respectivamente, en
ausencia de ligandos.
[2]
1 n1
y
L 1
n
[3]
L' L
1
n
1 n
En la que representa la concentracin normalizada de inhibidor, [i/KI] y la
concentracin normalizada de activador [a/KA].
De las caractersticas del modelo se deduce que el comportamiento del sistema ser
tanto ms cooperativo cuanto mayor sea el valor de la constante alostrica L, lo que
indicara que en ausencia de substrato y efectores, prcticamente todo el sistema est
en forma T. Al calcular los valores de estas constantes para la aspartato
transcarbamilasa y la hemoglobina se ha encontrado un acuerdo prcticamente
perfecto con los datos experimentales. A continuacin veremos con cierto detalle la
aplicacin del modelo a estos sistemas.
En trminos del modelo alostrico restringido antes citado, tenemos para esta enzima
los siguientes datos:
2. Por estudios de fijacin y por estudios estructurales de la enzima, se sabe que los
substratos y los efectores se fijan a sitios distintos. Tiene, pues, centro activo y centros
alostricos.
- Todos los elementos de simetra que existen en la molcula (un eje ternario y
tres ejes binarios) se conservan en la transicin, y no han podido ser detectados
estados intermedios.
Por todo ello se considera que este sistema sigue casi al pie de la letra el modelo de
Monod, Wyman y Changeux.
8.3.6 La hemoglobina
4. Los efectores H+, CO2 y 2,3-BPG afectan heterotrpicamente a la fijacin del O2.
Todos ellos se comportan como inhibidores alostricos, disminuyendo la afinidad de la
hemoglobina por el oxgeno, provocando un incremento en la P 50. Recurdese que la
P50 representa la presin parcial de oxgeno con la que se alcanza un 50 % de
saturacin de la hemoglobina, siendo por tanto un parmetro comparable a la Km de
los sistemas enzimticos michaelianos.
9.1 Introduccin
Obsrvese que a medida que progresaba esta sucinta descripcin, hemos ido
abandonando el trmino enzima para sustiturlo por el de protena efectora. El
fenmeno de la modificacin covalente se extiende, por lo que sabemos, a todo tipo
de interaccin entre ligando y protena, enzimtica o no.
R CH ATP ADP R CH
C O C O
HN HN O
CH CH2 OH CH CH2 O P O-
O C O C O-
NH NH
R CH R CH
R CH R CH
H2O Pi
C O C O
HN O HN
CH CH2 O P O- CH CH2 OH
O C O- O C
NH NH
R CH R CH
y que son el objeto de influencias de tipo regulatorio de la misma manera que las
protein kinasas, por lo que su estudio es tan importante como el de stas.
R CH R CH NH2
ATP PPi
C O C O N
O N
HN HN
CH CH2 OH CH CH2 O P O CH2 O N N
O C O C O-
NH NH
R CH R CH
OH OH
o en otros casos, uridilacin (con UTP como donador) o ADP-ribosilacin (con NAD+
como donador de ADP-ribosa)
Glucgeno (n-1)
CH2OH
Glucosa-1-fosfato
O
OH O
O P O-
OH
OH O-
Se trata de una enzima muy grande y muy compleja. Normalmente se presenta como
un homotetrmero (cuatro subunidades iguales), pero la forma funcional es el
homodmero: dos subunidades iguales, cada una de 842 aminocidos y un P.M. de
alrededor de 96 kDa. Gracias a los trabajos del grupo de L.N.Johnson, de la universidad
de Oxford, conocemos muy detalladamente las relaciones estructura-funcin de esta
enzima.
Ahora bien, la forma b, que es la forma menos activa, est, adems, regulada
alostricamente. Presenta, por una parte, cooperatividad positiva en la fijacin de
substratos (glucgeno y fosfato inorgnico). La enzima tambin presenta efectos
heterotrpicos. As, la enzima muscular es activada por AMP (que a concentracin
elevada indica que existe un bajo nivel energtico en la clula, al ser producto de la
hidrlisis de ATP) mientras que es inhibida por indicadores de un alto nivel energtico
(ATP y glucosa-6-fosfato). El comportamiento de la fosforilasa b se aproxima bastante
al modelo de Monod-Wyman-Changeux que vimos en el captulo 8 (con sus estados R y
T, como veremos). La fosforilasa a, fosforilada en el residuo Ser 14, puede ser
considerada como una fosforilasa b bloqueada en el estado R (mucho ms activo) e
insensible a efectores alostricos.
En estado de reposo, las tres subunidades estn unidas y la subunidad est ocupada
por GDP. Cuando un ligando L se une al receptor R (1), la subunidad intercambia GDP
por GTP (2). Al fijarse el GTP a la subunidad sta se disocia de las otras dos, que
quedan formando un dmero (3) mientras que -GTP se une a la adenilato ciclasa
(AC), activndola de manera que convierte ATP en cAMP (4). Esta activacin dura
mientras el nucletido unido a la subunidad sea GTP. Ahora bien, esta subunidad
tiene actividad GTPasa, de manera que el GTP fijado va convirtindose en GDP poco a
poco (5). Cuando esto ocurre, la subunidad -GDP se disocia de la adenilato ciclasa y
vuelve a unirse al dmero (6), con lo que se restablece la situacin de reposo. Si el
ligando L persiste unido al receptor R, se producira un nuevo ciclo de activacin.
La fosforilasa kinasa es una protena muy grande. La enzima muscular tiene una
estructura cuaternaria ()4 y est sometida a dos tipos de control:
- Por una parte, la propia fosforilasa kinasa puede ser fosforilada por una protein
kinasa (protein kinasa A), siendo esta reaccin dependiente de cAMP, como veremos a
continuacin. La forma fosforilada es de alta actividad frente a la defosforilada.
De entre las aproximadamente mil protein kinasas conocidas hasta ahora, reciben el
nombre de protein kinasas A las que son activadas por cAMP (3'5' adenosin
monofosfato cclico, figura 9.4).
Cataliza la reaccin de formacin del nucletido cclico cAMP a partir de ATP, tal como
se presenta en la figura 9.4.
9.2.3.5 Protenas G
Las protenas G son una familia de protenas heterotrimricas, constitudas por tres
subunidades distintas: subunidad (39-46 kDa), subunidad (37 kDa) y subunidad (8
kDa). La subunidad puede fijar con gran afinidad nucletidos de guanina (GDP o
GTP). La estructura se presenta en la figura 9.16. Las subunidades y funcionan
normalmente como si fueran una sola. El estado inactivo de la protena G consiste en
la asociacin de las tres subunidades, hecho que se da cuando el sitio de alta afinidad
de la subunidad est ocupado por GDP. El funcionamiento del sistema est descrito
en la figura 9.5.
Se conocen muchas otras protenas G cuyo funcionamiento es bsicamente el mismo,
aunque los efectos desencadenados pueden ser muy diferentes (por ejemplo, los
impulsos nerviosos ligados a la visin o a la olfacin, la reproduccin sexual de las
levaduras, los movimientos del hongo Dyctiostelium, etc.). En general, suele ser la
subunidad la que determina los diversos tipos conocidos de protenas G. Entre los
sistemas efectores activados o inhibidos por protenas G, tenemos la adenilato ciclasa
(el caso que estamos estudiando), canales inicos (de Na+, K+ y Ca2+), fosfolipasas A2 y
C, cGMP fosfodiesterasa, etc. Otras protenas G caracterizadas hasta la fecha son las Gi
(siendo el prototipo la presente en los fotorreceptores retinianos, que recibe el
nombre especfico de Gt, transducina), las Gq (presentes en linfocitos B y T) y las G12
(de amplia distribucin). Como es lgico, en una misma clula pueden coexistir
diversos tipos de protenas G, asociados al mismo o a distintos receptores de
membrana.
Con niveles de especificidad y respuesta a seales similares a las de las protein kinasas,
existen en la clula multitud de protein fosfatasas especficas. Las protein fosfatasas
catalizan la defosforilacin hidroltica de los residuos hidroxlicos de protenas
fosforiladas por protein kinasas. Se conocen varios tipos de protein fosfatasas (PP1,
PP2A, PP2B, PP2C y tirosin fosfatasas) y en el caso que nos ocupa, la glucgeno
fosforilasa puede ser defosforilada por la protein fosfatasa propia de este sistema,
conocida como PP1. En condiciones de receptores desocupados, la protein fosfatasa es
activa y mantiene prcticamente a cero los niveles de fosforilasa activada. Cuando el
receptor se ocupa por las seales fisiolgicas que hemos visto (adrenalina y glucagon),
la propia protein kinasa A inactiva a la PP1.
La PP1, por su parte, es activada por la insulina, hormona que a este nivel presenta
efectos antagnicos a los de adrenalina y glucagon. Esta activacin de la insulina est
mediada por protein tirosin kinasas.
La accin de esta enzima consiste en el ataque hidroltico al cAMP para dar 5'-AMP:
NH2
N NH2
H2 O
N
N O
O -
H2C O P O CH2 N
- O
O O
P O OH
O O- OH OH
HO CH2 O
O HN
O O O
OH
O P O P O CH2 N
OH - - O
O O
OH
OH OH
UDP
Esta enzima se presenta en dos formas, que por analoga con la glucgeno fosforilasa
denominamos glucgeno sintasa a y glucgeno sintasa b. La forma b presenta una
actividad muy reducida y es activada alostricamente por glucosa-6-fosfato. Esta
forma de la enzima se presenta fosforilada en un residuo de serina, siendo la protein
kinasa A la responsable de esta fosforilacin. La glucgeno sintasa a, por su parte,
tiene niveles muy altos de actividad y no est fosforilada. Puede observarse aqu cmo
las diferentes seales tienen efectos antagnicos: la fosforilacin mediada por protein
kinasa A activa a la fosforilasa e inactiva a la sintasa. Esta es la respuesta normal a
adrenalina y glucagon; por el contrario, la respuesta a insulina consiste en la
inactivacin de la fosforilasa y la activacin de la sintasa, gracias al efecto estimulador
de esta hormona sobre la protein fosfatasa 1 (PP1).
Las protein kinasas A (PKA) son enzimas que responden caractersticamente a la accin
del cAMP, y la fosforilasa estudiada en el apartado anterior es el ejemplo clsico de las
mismas.
9.3.2 Protein kinasas G
Son un tipo de protein kinasas que responden a la elevacin intracelular del segundo
mensajero cGMP (3',5' Guanosina monofosfato cclico). El sistema mejor estudiado es
el del msculo liso. La guanilato ciclasa existente en el msculo liso (en particular el
vascular) es activada por el radical libre xido ntrico (NO.); el cGMP producido
entonces induce la relajacin muscular (y de ah el efecto hipotensor del NO.)
El DAG activa directamente a la protein kinasa C, siendo esta accin mimetizada por
los steres de forbol, compuestos carcingenos presentes en el aceite de crotn y que
se emplean experimentalmente para inducir una activacin sostenida de la protein
kinasa C, ya que no se degradan con la rapidez del DAG, del que actan como
anlogos.
Los niveles intracelulares de calcio inico (Ca2+) son bajos por la abundancia de steres
fosfricos en el interior de la clula, ya que el producto de solubilidad de fosfatos
clcicos tiene un valor muy reducido. Todas las clulas poseen bombas de Ca2+, esto es,
sistemas de transporte encargados del mantenimiento del nivel intracelular de este
ion. Las bombas de Ca2+ operan tanto en la membrana plasmtica como en las
membranas organelares (mitocondrial, sarcoplsmica, etc.).
El Ca2+ se fija con gran afinidad a grupos de oxgeno cargados (p.e. aniones
carboxlicos) y no cargados (carbonilos), lo que le permite inducir cambios
conformacionales importantes en las protenas. Gran parte de las acciones
desencadenadas por el Ca2+ se deben a su unin con una protena especfica, la
calmodulina (figura 9.13) Bien sea como entidad aislada o formando parte de protenas
oligomricas (como el caso ya visto de la fosforilasa kinasa), la calmodulina sufre un
importante cambio conformacional al fijar Ca2+ del que resultan sus diversas acciones.
La calmodulina es una protena fijadora de calcio de 17 kDa; consiste en dos dominios
globulares unidos por un tramo largo en -helicoide; cada dominio tiene dos manos
EF, motivo estructural propio de muchas protenas fijadoras de Ca2+. La mano EF
consiste en dos tramos en -helicoide separados por un tracto de 12 aminocidos,
cinco de los cuales son dicarboxlicos (Asp o Glu). La calmodulina consta de cuatro
manos EF, formando dos lbulos con dos manos cada uno separados de una tracto
largo en -helicoide. La unin del Ca2+ a los aminocidos dicarboxlicos de cada una de
las cuatro manos EF induce un importante cambio conformacional en el calmodulina
que de esta manera transmite el mensaje a otras protenas (figura 9.13).
9.3.4.2 Inositolfosftidos
Los inositolfosftidos de la membrana plasmtica participan de forma muy activa en la
transduccin de seales hormonales a travs de la membrana plasmtica. El fosfatidil
inositol 4,5 bisfosfato (PIP2), que constituye hasta un 8 % de los lpidos de membrana
da lugar a travs de hidrlisis a tres segundos mensajeros hormonales (figura 9.18): (a)
Inositol 1,4,5 trisfosfato (IP3); (b) diacilglicerol (DAG); y eventualmente tambin a (c)
cido araquidnico, presente en la posicin sn-2, que puede ser substrato de la
ciclooxigenasa (dando lugar a prostaglandinas y tromboxanos) o de la lipooxigenasa
(con formacin de leucotrienos) (v. Biomolculas, cap. 4).
El IP3 liberado se une a una receptor especfico del retculo endoplsmico, segn
hemos visto ms arriba, lo que conduce a una liberacin de iones Ca2+ desde el mismo
hacia el citoplasma, los cuales llevan a cabo diferentes efectos, entre ellos la activacin
de protein kinasas calcio-calmodulina dependientes. El DAG, por su parte, activa a la
protein kinasa C segn hemos visto anteriormente.
Otro tipo de protein kinasas son las protein tirosin kinasas (PTK), que se caracterizan
precisamente porque la fosforilacin dependiente de ATP se lleva a cabo sobre
residuos fenlicos de tirosina y no sobre serina o treonina como los vistos hasta ahora.
Una caracterstica distintiva de estas protein kinasas es su capacidad de
autofosforilacin. Las protein tirosin kinasas son activadas por factores de crecimiento
e insulina, y responden por autofosforilacin en mltiples residuos de Tyr.
Varios experimentos han demostrado un papel de las protenas ras (producto del
protooncogen del mismo nombre) en la transduccin de seales ligada a receptores
PTK. Se requiere activacin de stas para la mitognesis inducida por diversos factores
de crecimiento (y de ah su potencial oncognico)
9.4.1 ADP-ribosilacin
9.5.1 Pepsina
La pepsina es una enzima digestiva producida por las clulas principales de la mucosa
gstrica en forma de un zimgeno inactivo, el pepsingeno. La pepsina es el prototipo
de las proteasas cidas, caracterizadas por tener varios residuos cidos en el centro
activo y tener ptimos de pH muy bajos. A este respecto, la pepsina es excepcional por
cuanto su pH ptimo de accin est alrededor de 2. En su centro activo hay dos
residuos de aspartato.
9.5.2 Tripsina
9.5.3 Quimotripsina
La integridad fsica del sistema vascular de los animales es una condicin indispensable
para el mantenimiento de su homeostasis. Tanto las grandes arterias y venas como en
particular los capilares estn sometidos continuamente a una gran cantidad de
traumas mecnicos que de no solventarse daran lugar a una prdida irreversible de
presin en el sistema vascular incompatible con la vida. Pero por otra parte, la
formacin intravascular de cogulos puede representar asimismo un grave peligro,
sobre todo en rganos con vascularizacin terminal como el miocardio o en rganos
que a pesar de poder desarrollar vascularizacin alternativa tienen funciones tan
crticas como para no poder interrumpir su actividad, como es el caso del cerebro y del
tejido nervioso en general. Por todo ello, tanto los fenmenos de coagulacin de la
sangre como de fibrinolisis (destruccin del cogulo) son sistemas de modificacin
covalente (ataque proteoltico) organizados como activaciones en cascada. Ello
permite su rpida puesta en marcha y su actuacin en dimensiones espaciales muy
superiores a las celulares.
(A)2(B)22 2A + 2B + 222
9.6.4.1 La va extrnseca
9.6.3.2 La va intrnseca
El factor XIIa activa al XI; el XIa al IX; el IXa, junto con el VIIIa, activan al factor X. El
factor VIII (o factor antihemoflico), es activado en un proceso que tambin requiere
Ca2+, una superficie plaquetaria y trombina. La carencia congnita de factor VIII da
lugar a la enfermedad conocida como hemofilia A, que se transmite de forma ligada al
sexo. El resumen de la va intrnseca se presenta en la figura 9.28.
Todos los factores activados tienen una vida media muy corta. Adems de las
actividades antiserinproteinasa existentes en el medio plasmtico (1-antitripsina,
etc.), existen otros sistemas anticoagulantes:
De la relacin
v= kcate
Las enzimas presentes en el suero proceden siempre del interior de las clulas, donde
son sintetizadas. Ahora bien, la diferenciacin de clulas y tejidos hace que la
concentracin intracelular de enzimas vare segn el tejido de procedencia. Por
ejemplo, la fosfatasa cida es mucho ms abundante en la prstata que en otros
rganos o tejidos; la creatin kinasa es propia del tejido muscular; la alanina
aminotransferasa, aunque presente en muchos tejidos, es francamente abundante en
el hepatocito. Por ello, aumentos constatables en suero de dichas enzimas son
indicativos de alteraciones en los respectivos tejidos de procedencia, y de ah el inters
general de las determinaciones enzimticas en suero.
Las enzimas pueden estar aumentadas en el suero por alguna de las siguientes razones
(en orden de importancia):
Si el dao celular es grande, la clula puede morir y todo su contenido pasa al medio
extracelular y de ah al plasma. En este caso, a diferencia del anterior, podemos
encontrar en el suero enzimas ligadas a fracciones particuladas (mitocondrias,
membranas, etc.) a veces ligadas a fracciones de muy alta masa molecular.
Tanto en el caso anterior como en ste, la magnitud del aumento refleja la extensin
del dao celular.
Muchas enzimas del organismo son inducibles, esto es, su sntesis aumenta ante
determinados estmulos ambientales. Y por ello puede aumentar su concentracin en
el suero. Tal es el caso de las enzimas hepticas relacionadas con diversos mecanismos
de desto -glutamil transferasa es inducible por multitud de drogas
que han de ser metabolizadas por el hgado, como por ejemplo alcohol, antidepresivos
tricclicos, fenitona, etc.
(a) Intoxicaciones
Muchas enfermedades crnicas cursan con una actividad celular disminuida, lo que se
refleja en un descenso en determinadas actividades enzimticas del suero. Tal es el
caso, por ejemplo, de las aminotransferasas en la cirrosis heptica. Estas
disminuciones tienen poco valor diagnstico.
10.1.3.1 Aminotransferasas
COO- COO-
-
COO C O COO- H C NH3+
H C NH3 + ALT
+ CH2 C O + CH2
CH3 CH2 CH3 CH2
-
COO COO-
Alanina -Cetoglutarato Piruvato Glutamato
Las aminotransferasas son enzimas abundantes en todos los tejidos, pero lo son
particularmente en aqullos muy activos metablicamente, como el hgado y el
msculo. La AST est repartida indistintamente en los compartimentos citoslico y
mitocondrial; la ALT, por su parte, aparece casi exclusivamente en el citosol.
10.1.3.2 Creatinkinasa
O O
R O P O- + R' OH R OH + R' O P O-
O- O-
10.1.3.5 -Amilasa
La -amilasa es una glicosidasa que hidroliza enlaces -1,4 situados en el interior de
las cadenas polisacridas de almidn y glucgeno. Se trata de una enzima de gran
importancia digestiva, ya que el almidn es uno de los principales contingentes de la
dieta, tanto animal como humana. La -amilasa est presente en la saliva y en el jugo
pancretico, dando lugar a dos formas moleculares distintas, S (de saliva) y P (de
pncreas), distinguibles por electroforesis. En ambos casos, la -amilasa es una
protena de pequeo tamao, y por ello puede fcilmente pasar a la orina, donde es
posible detectar actividad amilsica (amilasuria) en enfermedades que cursan con
incremento srico de esta actividad.
Por el contrario, las afecciones crnicas del pncreas, como las pancreatitis crnicas y
la fibrosis qustica del pncreas cursan con disminuciones de la amilasemia.
La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima de muy amplia distribucin; por ello
sus elevaciones son poco especficas de rgano. Cataliza la siguiente reaccin:
NADH + H+ NAD+
COO- COO-
C O HO C H
CH3 CH3
Piruvato L-Lactato
Los liposomas pueden formarse en presencia de la enzima que queremos dirigir hada
las clulas afectadas. Una vez inyectados en el organismo, la bicapa del liposoma se
funde con la de la clula, liberando al interior de sta el contenido del mismo. El
problema principal en el empleo de liposomas estriba en alcanzar las clulas
especficas a las que va dirigida la enzima. Una lnea muy prometedora en este sentido
radica en el estudio de los marcadores de superficie, oligosacridos complejos
presentes como glicolpidos o glicoprotenas en la superfde celular y que en muchos
casos son especificos de la clula objetivo. Intercalando en los liposomas ligandos
complementarios de estos oligosacridos (anticuerpos, lectinas, etc.) se puede
conseguir la interaccin especfica de aqullos con las clulas diana.