Filtracion Membrana PDF

VALIDACIN SECUNDARIA DEL MTODO DE FILTRACIN POR
MEMBRANA PARA LA DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO
ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PBLICA DEL HUILA
LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al ttulo de
Microbiloga Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOT, D.C.
Noviembre de 2008
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique nada contrario al dogma y
a la moral catlica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.
APROBADO
_________________________________
Gloria Mara Rivera Daz, Bacteriloga
Directora
APROBADO
_________________________________
Gloria Mara Rivera Daz, Bacteriloga
Directora
_____________________________ _______________________________
Rosario del Pilar Ortiz, Bacteriloga Lorena Valencia, Microbiloga
Jurado Jurado
APROBADO
_____________________________ _______________________________
Ingrid Schuler , Ph. D Janeth Arias Palacios M.Sc, M.Ed.
Decana Acadmica Directora de carrera
Le doy gracias a Dios por permitirme lograr este triunfo, a mis padres por el
esfuerzo y apoyo que me han brindado, ya que sin su ayuda no lo hubiera podido
lograr, a mis hermanos que de una u otra forma me han brindado su confianza y
apoyo para seguir adelante, al Gordo por brindarme su amor y apoyo
incondicional, a toda mi familia y en especial a mi mam, que ha sido la persona
que ha estado conmigo en todo este proceso brindndome lo mejor de s y con
muchas ganas de que yo comience una nueva etapa en mi vida como es la de ser
Profesional.
AGRADECIMIENTOS
Al Laboratorio de salud Publica del Huila, por permitirme llevar a cabo este trabajo
en sus instalaciones, A la Doctora Gloria Mara Rivera Daz, por brindarme su apoyo
y recursos necesarios para llevar a cabo este trabajo, al Dr. Gerardo Navas del
Instituto Nacional de Salud, por su valiosa colaboracin y al personal del rea
ambientes del Laboratorio por su colaboracin.
vii
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ............................................................................................................................. xiii

1. INTRODUCCIN .......................................................................................................... 14
2. MARCO TEORICO ........................................................................................................ 16
2.1. GENERALIDADES DE LA VALIDACIN ......................................................... 16
2.1.1. Validacin ....................................................................................................... 17
2.1.2. Validacin primaria......................................................................................... 17
2.1.3. Validacin secundaria ..................................................................................... 18
2.1.4. Tipos de validacin ......................................................................................... 19
2.1.4.1. Validacin prospectiva ............................................................................ 19
2.1.4.2. Validacin retrospectiva ......................................................................... 19
2.1.4.3. Validacin concurrente ........................................................................... 20
2.1.5. Parmetros analticos del proceso de validacin ............................................. 20
2.1.5.1. Limite de deteccin ................................................................................. 20
2.1.5.2. Limite de cuantificacin.......................................................................... 21
2.1.5.3. Exactitud ................................................................................................. 21
2.1.5.4. Especificidad ........................................................................................... 21
2.1.5.5. Selectividad ............................................................................................. 22
2.1.5.6. Precisin .................................................................................................. 22
2.2. CARTAS DE CONTROL R/ PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD
ANALITICA INTERNA DEL LABORATORIO .............................................................. 23
2.2.1. Generalidades del grupo Coliforme ................................................................ 23
2.2.1.1. Coliformes Totales .................................................................................. 23
2.2.1.2. Coliformes fecales................................................................................... 24
2.3. ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUAS ..................................................... 25
2.3.1. Plan de muestreo (recoleccin y recepcin de muestras) .............................. 25
2.3.1.1. Toma de muestras en grifos o llaves ...................................................... 27
2.3.1.2. Toma de muestras en pozos carentes de bomba ...................................... 27
2.3.1.3. Toma de muestras en ros, lagos, quebradas, represas ............................ 28
viii
2.3.1.4. Transporte y almacenamiento de las muestras ........................................ 28
2.4. MTODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA ............................................... 29
2.4.1. Fundamento del mtodo de filtracin por membrana ..................................... 29
2.4.2. Caractersticas del filtro de membrana ............................................................ 29
2.4.3. Ventajas y desventajas del mtodo de filtracin por membrana ..................... 30
2.4.4. Uso del equipo de filtracin por membrana ................................................... 30
3. JUSTIFICACIN ........................................................................................................... 33
4. OBJETIVOS ................................................................................................................... 35
4.1. OBJETIVO GENERAL .......................................................................................... 35
4.2. OBJETIVOS ESPECFICOS .................................................................................. 35
5. MATERIALES Y MTODOS ....................................................................................... 36
5.1. DISEO DE LA INVESTIGACIN ..................................................................... 36
5.2. MATERIALES ....................................................................................................... 36
5.3. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS ................................. 38
5.4. PREPARACIN DEL PATRN DE MCFARLAND ........................................... 39
5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO............................. 39
5.5.1. Control de esterilidad ...................................................................................... 39
5.5.2. Prueba de selectividad y eficacia .................................................................... 40
5.6. CONTROL DE AMBIENTES................................................................................ 41
5.7. CONTROL DE EQUIPOS...................................................................................... 41
5.8. VALIDACIN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PARA
LA DETECCION DE COLIFORMES TOTALES Y E. coli EN MUESTRAS DE AGUAS
PARA EL CONSUMO HUMANO .................................................................................... 42
5.8.1. Estandarizacin del tubo 0.5 de Mcfarland ..................................................... 42
5.8.2. Ensayo preliminar de repetibilidad ................................................................. 44
5.8.3. Validacin del mtodo de filtracin por membrana ........................................ 47
5.8.3.1. Descripcin de soluciones y muestras..................................................... 48
5.8.4. Elaboracin de cartas R/ para el control de calidad analtica interna del
laboratorio ....................................................................................................................... 49
5.8.5. Evaluacin de la validacin ............................................................................ 49
5.9. INFORME DE RESULTADOS ............................................................................. 50
ix
6. RESULTADOS Y DISCUSIN DE RESULTADOS ................................................... 51
6.1. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS DE REFERENCIA . 51
6.2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO............................. 53
6.2.1. Control de esterilidad ...................................................................................... 53
6.2.2. Prueba de selectividad y eficacia .................................................................... 54
6.3. CONTROL DE EQUIPOS...................................................................................... 55
6.4. CONTROL DE AMBIENTES................................................................................ 56
6.5. VALIDACIN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA ............................... 57
6.5.1. Estandarizacin del tubo 0.5 de Mcfarland .................................................... 58
6.5.2. Ensayo preliminar de repetibilidad ................................................................. 61
6.5.3. Validacin del mtodo de filtracin por membrana....................................... 63
6.5.3.1. Determinacin de la precisin ................................................................ 67
6.5.3.2. Determinacin de la exactitud ................................................................ 69
6.5.4. Cartas de control R ...................................................................................... 74
7. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 76
8. RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 77
9. BIBLIOGRAFA .................................................................................................................. 78
9.1. RECURSOS ELECTRONICOS ...................................................................................... 80
10. ANEXOS ....................................................................................................................... 81
x
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 Recuento de bacterias aerobias mesfilas, hongos y levaduras ............................. 57
TABLA 2 Comparacin de absorbancias del tubo 0.5 de Mcfarland y la suspensin de E. coli

................................................................................................................................................ 59
TABLA 3 Lectura de absorbancias de la suspensin de E. coli ............................................. 60
Tabla 4 Calculo de la media, desviacin estndar y coeficiente de variacin de las

concentraciones de 5, 20 y 70 bacterias/mL ........................................................................... 62
TABLA 5 Recuento de coliformes totales en medio Endo. .................................................... 64
TABLA 6 Recuento coliformes fecales en medio m-FC. ....................................................... 65
TABLA 7 Clculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estndares para

coliformes totales .................................................................................................................... 68
Tabla 8 Clculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estndares para

coliformes fecales ................................................................................................................... 68
Tabla 9 Recuperacin M1 + A1, coliformes totales ............................................................... 70
TABLA 10 Recuperacin M1 + A1, coliformes fecales......................................................... 71
TABLA 11 Recuperacin M2 + A2, coliformes totales ......................................................... 72
TABLA 12 Recuperacin M2 + A2, coliformes fecales......................................................... 73
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Esquema de la estandarizacin del tubo 0.5 de Mcfarland. . ............................... 43
FIGURA 2. Esquema para preparar la concentracin de 5 bacterias/ml ................................ 46
FIGURA 3 Crecimiento de E. coli en agar Mc Conkey ......................................................... 51
FIGURA 4 Identificacin bioqumica de E. coli .................................................................... 52
FIGURA 5 Crecimiento de S. aureus en agar sangre.............................................................. 52
FIGURA 6 Crecimiento de E.coli en medio Endo y en medio m-FC ..................................... 55
FIGURA 7 Crecimiento de S. aureus en medio Endo y en medio m-FC ............................... 55
FIGURA 8 Recuento de E. coli en medio Endo y m-FC. ..................................................... 61
FIGURA 9 Recuento de los estndares de 5, 20 y 70 bacterias /100 mL de E. coli ............... 63
FIGURA 10 Recuento de E. coli en medio Endo y medio m-FC. .......................................... 67
FIGURA 11 Grafico de control para coliformes totales ......................................................... 74
FIGURA 12 Grafico de control para coliformes fecales ........................................................ 75
xii
RESUMEN
Con el fin de contribuir con los procesos de Mejoramiento de la Calidad del

Laboratorio de Salud Publica del Huila y con el objetivo de iniciar un proceso de
acreditacion, se realiz una validacin secundaria de tipo concurrente del mtodo de
filtracin por membrana para la deteccin de coliformes totales y Escherichia coli en
muestras de agua para consumo humano. Al inicio del proceso de validacin se reviso
el historial de mantenimiento y calibracin de los equipos para garantizar los
procedimientos y resultados obtenidos. Antes de iniciar la etapa de validacin se
estandarizo la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland, para comprobar que efectivamente
se estaba partiendo de 150 millones de bacterias/mL. As mismo, se realizo un
ensayo preliminar de repetibilidad con el fin de obtener un dominio del mtodo.
Para la validacin se sigui un diseo experimental establecido por el Instituto

Nacional de Salud, en donde la cantidad de soluciones analizadas que conformaron
el diseo experimental fue de 48, distribuidas en seis (6) lotes, de ocho (8) soluciones
cada una, analizando las siguientes soluciones en cada lote: 2 blancos, dos muestras
naturales, dos muestras ms adicin de 0.4C y 0.7C y dos soluciones estndares. El
estudio se proces durante seis das, en donde cada lote era un da. La precisin del
mtodo fue evaluada con la aceptabilidad de las desviaciones estndares de cada
solucin, las cuales deban de estar en el rango de la meta a alcanzar (W),
correspondiente al 5% de la concentracin de la gran media a 0.25 veces el valor
mnimo de inters que en este caso fue 8 y la exactitud se evalu mediante la
recuperacin de una concentracin conocida de Escherichia coli en las dos muestras
naturales.
Al finalizar el estudio de validacin se comprob que mediante la validacin

realizada se cumplieron con los dos parmetros evaluados, la precisin y la exactitud.
1. INTRODUCCIN
El recurso hdrico para el consumo humano debe ser entregado a las comunidades,
con excelente calidad, la cual inicia desde la misma generacin, proteccin de fuentes
y recorridos hasta las plantas de tratamiento y posteriormente hasta el servicio
domiciliario. A pesar de ello Las enfermedades derivadas de la ingestin de agua son
muy frecuentes en los pases en desarrollo y dentro de estos hay zonas de mayor o
menor compromiso epidemiolgico.
El acceso de los colombianos al agua potable deja mucho que desear en el pas a
pesar de las cifras globales que demuestran que el 56% de la poblacin rural, el 97%
de la urbana, para un total general del 86% tienen agua potable.
Las enfermedades bacterianas, parasitarias, virales y qumicas que tienen origen en la

transmisin de estos agentes por el agua adquieren una especial connotacin sanitaria
cuando las poblaciones ribereas con inadecuado suministro del agua potable o
aquellas comunidades que a travs de muchos aos han carecido del recurso hdrico
necesario para la vida del hombre, deben ser controlados por el estado.
En este sentido, los laboratorios de salud pblica tienen la obligacin de proteger las
comunidades bajo su cuidado territorial y por ello deben implementar la tecnologa y
la metodologa que les permita realizar el control de calidad del agua que consumen
los ciudadanos.
Cada laboratorio debe utilizar mtodos y procedimientos apropiados para todas las
calibraciones y ensayos considerados en su alcance. Estos incluyen muestreo,
transporte, almacenamiento y preparacin de los elementos a ser calibrados o
ensayados.
14
Los laboratorios deben realizar controles internos los cuales garantizan que van
generar resultados altamente confiables, mediante el seguimiento de procedimientos
altamente calificados, los cuales van a depender del programa que se haya
implementado en el laboratorio donde generaran idoneidad y confiablidad de los
resultados emitidos.
Estos programas de control interno incluyen evaluacin continua de los principales

materiales y objetos que se utilizan en los diferentes anlisis, tales como, control de
los medios de cultivo a utilizar, personal idneo, equipos, estandarizacin y
documentacin de los procesos, con el fin de garantizar un buen desarrollo del
procedimiento y asegurar que este se est efectuando en forma correcta cada vez que
se ejecute, lo cual se lograra con la realizacin de la validacin de los mtodos
utilizados por el laboratorio para sus respectivos anlisis.
La validacin de una tcnica es el proceso por el cual se establece mediante estudios

de requerimientos la aplicacin analtica propuesta, siendo su principal objetivo
confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos. Con ella se
determinan las posibles variaciones que se presentan entre diferentes nmeros de
ensayos y de esta manera disminuir las posibilidades de error dentro del mtodo,
generando un alto grado de confianza en los resultados finales arrojados por el
mtodo validado.
Basada en etas premisas el presente trabajo de grado tiene como finalidad Validar el
Mtodo de Filtracin por Membrana para la deteccin de Coliformes Totales y
Escherichia coli en muestras de aguas para consumo humano, con el fin de asegurar
que el laboratorio va a tener un alto grado de confiabilidad en sus resultados
emitidos.
15
2. MARCO TEORICO
Las enfermedades infecciosas se transmiten principalmente a travs de las excretas de

seres humanos y animales, en particular de las heces. El uso de esta agua para beber o
preparar alimentos, el contacto de ella durante el bao o el lavado de ropa, e incluso
la inhalacin de vapor o aerosoles, pueden producir la infeccin. La carga bacteriana
incide directamente en la potabilidad del agua y en las caractersticas y las
condiciones que la hacen apta para el consumo humano.
En muchas regiones, esta calidad de agua se consume sin ningn tipo de control de
calidad ni tratamiento. Las enfermedades relacionadas con la insalubridad del agua y
la falta de saneamiento son una de las causas de morbimortalidad. El nmero total
anual de defunciones producidas por diarreas y enteritis es aproximadamente de
12.000 casos al ao y la morbilidad por las mismas causas es de 300.000 casos al ao.
La poblacin ms afectada en Colombia por estos factores es la poblacin rural y
marginal dispersa de la zona pacifica, la costa atlntica y el suroriente del pas, sobre
todo en lugares densamente poblados. (OTALORA, 2005).
Por esta razn se hace necesario llevar a cabo un anlisis microbiolgico del agua,
que asegure que es apta para el consumo humano y que posee las condiciones de
calidad necesarias para cumplir con la normatividad gubernamental.
2.1. GENERALIDADES DE LA VALIDACIN
Para conseguir la idoneidad en un resultado analtico es imprescindible la utilizacin

de un mtodo confiable. Para asegurar confiabilidad, los mtodos analticos deben
someterse a un procedimiento de validacin ya sea de carcter prospectivo,
retrospectivo o de revalidacin; para comprobar, si el mtodo es lo suficientemente
confiable, y si los resultados previstos satisfacen los requisitos analticos prefijados.
16
La validacin constituye un requisito imprescindible para las buenas prcticas de
laboratorio, conforme lo establecen diferentes agencias regulatorias y la
determinacin de la incertidumbre debe formar parte de este proceso de validacin y
es esencial para un control continuo de la calidad. A partir del criterio de que no
existe un modelo nico para validacin y que los parmetros a evaluar cambian de
acuerdo con los requisitos legales de diferentes organizaciones y de los
requerimientos analticos particulares; solo es recomendable el seguimiento de una
gua general para la validacin de mtodos analticos, en conformidad con pautas
aceptadas internacionalmente. (OTALORA, 2005).
2.1.1. Validacin
Consiste en demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia

documentada que un proceso especifico producir de forma consistente y permanente
productos que poseern las caractersticas de calidad predefinidas (WHO technical
Report Series, No. 823, 1992).
Es el proceso por el cual se establecen mediante estudios de laboratorio que las

caractersticas de desempeo del mtodo analtico cumplen los requerimientos para la
aplicacin analtica propuesta (USP XXVI, 2003), siendo su principal objetivo
confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos.
La validacin de mtodos analticos consiste es la obtencin de pruebas

documentadas que demuestran que un mtodo analtico es lo suficientemente
confiable para producir un resultado previsto dentro de intervalos definidos.
(CORTES, 2006).
2.1.2. Validacin primaria
La validacin primaria es un proceso exploratorio que tiene la meta de establecer los

lmites operacionales y las caractersticas de desempeo de un mtodo nuevo,
modificado o caracterizado en forma inadecuada. Debe dar origen a especificaciones
17
numricas y descriptivas para el desempeo e incluir una descripcin detallada y
precisa del objeto de inters.
Caractersticamente, la validacin primaria procede mediante el uso de esquemas de

ensayos especialmente diseados.
Los laboratorios que desarrollan un mtodo en casa o una variante de una norma
existente deben realizar los pasos de la validacin primaria. (PADILLA, 2007)
2.1.3. Validacin secundaria
Demostracin por experimento que un mtodo establecido funciona de acuerdo con

las especificaciones en las manos del usuario. Esta validacin se denomina
verificacin la cual es la confirmacin mediante el aporte de pruebas objetivas, de
que se han cumplido los requisitos establecidos. (ISO 9000:2000).
Normalmente la validacin secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas

de los mismos procedimientos empleados en la validacin primaria, aunque
posiblemente extendidas por un tiempo mayor. Las muestras naturales constituyen el
material de ensayo ptimo y el trabajo solo requiere tratar el procedimiento dentro de
los lmites operacionales establecidos por la validacin primaria. (GTC 84, 2003).
Para un laboratorio de anlisis es importante validar sus tcnicas, para as optimizar

sus procesos, lo cual implica reducir gastos, el tiempo de desarrollo de la tcnica, y
generar confiabilidad en los resultados que se emiten. De igual forma, sirve para dar
cumplimiento a las normas legales pertinentes o al logro de cumplimiento de normas
que aunque no son de obligatorio cumplimiento contribuyen a la credibilidad del
laboratorio y a obtener altos niveles de confiabilidad que generan confianza dentro de
sus clientes.
18
2.1.4. Tipos de validacin
2.1.4.1. Validacin prospectiva
Se basa en informacin obtenida antes de implantar el proceso de validacin. Se debe

realizar un anlisis de riesgo para determinar si podran conducir a situaciones
crticas; se investigan posibles causas y se determina la probabilidad de que sucedan.
Posteriormente, se efectan y se evalan los ensayos y se hace una valoracin
general. Si los resultados son aceptables al final, el proceso es satisfactorio. Los
procesos no satisfactorios se tienen que modificar y mejorar hasta que una nueva
validacin demuestre su carcter satisfactorio. Adems este tipo de validacin busca
prever errores o limitar el riesgo de que estos se presenten durante el proceso.
(CORTES, 2002).
2.1.4.2. Validacin retrospectiva
Se lleva a cabo por medio de la revisin y anlisis de la informacin histrica del

proceso. Con esta recopilacin de datos histricos se obtiene documentacin til para
la determinacin de la reproducibilidad de dicho proceso. Por esto, para la obtencin
de informacin no es necesario aplicar ensayos analticos, o supervisin del proceso
en forma explcita. (GALEANO, 2007).
Los pasos involucrados en este tipo de validacin requieren la preparacin de un

protocolo especfico, el reporte de los resultados de los datos analizados. Dentro de
este tipo de validacin es necesario tener en cuenta el control de la materia prima,
controles ambientales, controles microbiolgicos, equipos, procedimientos, mtodos
analticos y especificaciones; es aplicada para productos que se encuentran en el
mercado que conlleven a unas conclusiones y recomendaciones. (PADILLA, 2007).
19
2.1.4.3. Validacin concurrente
La informacin requerida en este tipo de validacin se obtiene durante la

implementacin del mismo. Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de las
variables criticas que demuestre que el proceso est bajo control y el registro de datos
sobre la marcha del proceso est en estado productivo. Sin embargo cada
aproximacin tiene sus caractersticas y limitaciones, y por lo tanto, antes de
desarrollar una validacin deber evaluarse que tipo de validacin pueda dar mejor
informacin sobre la seguridad y la estabilidad del proceso. (GARCIA, 2001).
2.1.5. Parmetros analticos del proceso de validacin
Los parmetro de rendimiento se establecen de acuerdo a la categora a la que

pertenecen el mtodo y siguiendo los requisitos exigidos por distintos organismos
internacionales que incluyen: intervalo de trabajo, linealidad, sensibilidad, limite de
deteccin, limite de cuantificacin, exactitud, precisin, repetibilidad,
reproducibilidad, robustez, incertidumbre, etc.
Est implcito que los estudios para determinar los parmetros de rendimiento se
llevan a cabo mediante equipos que cumplen con las especificaciones, funcionan
correctamente y estn adecuadamente calibrados. Igualmente el operador que realiza
los estudios debe ser competente en el campo de trabajo en estudio y debe contar con
suficientes conocimientos respecto al trabajo, como para poder tomar decisiones
apropiadas a partir de las observaciones realizadas a medida que progrese el estudio.
(OTALORA, 2005).
2.1.5.1. Limite de deteccin
Es la concentracin mnima del analito que puede detectarse en una muestra, pero no
es necesariamente cuantificada, bajo condiciones analticas especificas.
20
Tambin se conoce como mnima concentracin neta detectable o limite de
determinacin/limite de decisin y El mnimo contenido de analito, de existir analito
presente, que se detectara y se podr identificar.
El lmite de deteccin es un nmero, expresado en unidades de concentracin (o

cantidad) que describe el ms bajo nivel de concentracin (o cantidad) de una
sustancia que puede determinarse como estadsticamente diferente del blanco.
(OTALORA, 2005).
2.1.5.2. Limite de cuantificacin
Es la concentracin mnima del analito que puede ser cuantificada con exactitud y
precisin en una muestra, bajo condiciones analticas especificas.
2.1.5.3. Exactitud
Indica la capacidad del mtodo analtico para obtener resultados lo ms prximo

posible al valor verdadero. A diferencia de la precisin que refleja el error aleatorio,
la exactitud refleja el error sistemtico o la tendencia a l. (GALEANO, 2007).
2.1.5.4. Especificidad
Es la capacidad del mtodo para diferenciar precisa y especficamente, el compuesto

de inters, en presencia de los dems componentes, que se esperan estn presentes en
la matriz de la muestra. Estos componentes pueden ser precursores de la sntesis o
subproductos de la misma, impurezas, excipientes o productos de degradacin.
(WHO TECHNICAL REPORT, No823, 1992).
21
2.1.5.5. Selectividad
Se define un mtodo selectivo como aquel que produce resultados exactos para todos
los analitos de inters, o cuando diferentes microorganismos pertenecientes al mismo
grupo deben ser detectados por el mtodo.
2.1.5.6. Precisin
Es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando

se aplica el mtodo repetidamente a muestras separadas e idnticas, obtenidas del
mismo lote del material homogneo. (USP 29, 2006). El parmetro estadstico que
caracteriza a este estudio es la variacin estndar o preferiblemente el coeficiente de
variacin (variacin estndar relativa). Este parmetro permite evaluar la
incertidumbre en la estimacin de la media, es decir, el error aleatorio que
corresponde con la dispersin de los datos alrededor de la media. (CASTILLO Y
GONZALEZ, 1996). Puede ser una medida del grado de reproducibilidad o de
repetibilidad del mtodo analtico en condiciones normales de operacin (USP 29,
2006).
Reproducibilidad: Es la medida de la precisin de los resultados de ensayos

realizados sobre la misma muestra homognea, pero analizado en diferentes
laboratorios, por diferentes analista, diferentes das, diferentes instrumentos
(precisin entre laboratorios).
Repetibilidad: Es la medida de la precisin de un mtodo cuando este se realiza por el

mismo analista, el mismo da, los mismos reactivos, los mismos instrumentos
(precisin dentro del ensayo).
22
2.2. CARTAS DE CONTROL R/ PARA EL CONTROL DE LA
CALIDAD ANALITICA INTERNA DEL LABORATORIO
La finalidad principal de un laboratorio de agua, es producir informacin precisa y

confiable que muestre las caractersticas cualitativas del cuerpo de agua bajo estudio.
Un elemento esencial para garantizar que los resultados analticos son precisos y
confiables es el control de la calidad analtica precisa CCA, el cual consiste en la
aplicacin rutinaria de los procedimientos necesarios para controlar el proceso de
medicin.
El objetivo primordial de un programa de control de calidad interno es el de asegurar

que los resultados que se obtengan en el laboratorio se enmarquen dentro de los
lmites aceptables de desviacin a partir de los valores verdaderos. Se pueden hacer
duplicados de muestras naturales, de estndares, de muestras adicionadas, o de
blancos y para ello se utilizan las cartas de control.
Las cartas R son cuadros de control, en los cuales el mbito promedio de las muestras
duplicadas R es la lnea central. El lmite de control inferior es cero y el lmite de
control superior LCS se estima como: LCS = 3.27 x R/
Las cartas R hacen posible el control de los errores aleatorios y el lmite de deteccin
con los blancos. (OTALORA, 2005)
2.2.1. Generalidades del grupo Coliforme
2.2.1.1. Coliformes Totales
Los coliformes totales son un grupo de microorganismos que comprende varios

gneros de la familia enterobacteriaceae. Este grupo de microorganismos se encuentra
ampliamente difundido en la naturaleza, agua y suelo, adems, es habitante normal
del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente.
23
Se caracterizan por ser bacilos Gram. negativos, aerobios o anaerobios facultativos,
son oxidasa negativa, no formadores de esporas y son capaces de fermentar la lactosa
con produccin de acido y gas a 35C +/- 2C en un tiempo mximo de 48 horas.
(ORDOEZ, 2000).
El grupo de bacterias coliformes es el principal indicador de la adecuacin del agua

para usos domsticos, industriales o de otro tipo. La experiencia ha mostrado que la
densidad del grupo de los coliformes es un indicador del grado de contaminacin, y
por tanto, de la calidad sanitaria. (AWWA-WPC, 2000).
2.2.1.2. Coliformes fecales
Los coliformes fecales, tambin denominados coliformes termotolerantes, se

caracterizan por soportar temperaturas hasta 45C; comprende un grupo muy
reducido de microorganismos, entre los que se destaca Escherichia coli siendo el ms
reconocido representante de contaminacin de alimentos por origen fecal, por lo tanto
es el principal indicador de higiene en los alimentos. (ORDOEZ, 2000).
Escherichia coli se caracteriza por ser una bacteria Gram. negativa, capaz de
fermentar la lactosa a una temperatura entre 44C y 44.5C, es indol positivo, y tiene
un origen especficamente fecal, pues est siempre presente en grandes cantidades en
las heces de los seres vivos de sangre caliente y rara vez se encuentra en agua o suelo
que no haya sufrido algn tipo de contaminacin fecal.
Desde hace tiempo se reconoce que los organismos del grupo coliforme son un buen
indicador microbiano de la calidad del agua potable, debido principalmente a que son
de fcil deteccin y se pueden enumerar en el agua. La presencia de Escherichia coli
en muestras de agua potable, indica la existencia de fallas en la eficacia de
tratamiento de aguas, en la integridad del sistema de distribucin, y por tanto
evidencia de contaminacin de diferentes orgenes: suelo, superficies de agua dulce y
tracto digestivo. (MILLIPORE, 2005).
24
2.3. ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUAS
El agua cruda o el agua inadecuadamente tratada, puede contener microorganismos

patgenos, es decir, que pueden causar enfermedades y aun la muerte. Las bacterias
del grupo coniforme, estn asociadas con los organismos patognicos y son un buen
ndice del grado de seguridad bacteriolgico del agua. Las bacterias coliformes viven
y hacen parte de la flora del intestino humano y de otros animales, y son descargados
en gran cantidad en las heces humanas y las de esos animales. Cuando aparecen
bacterias coliformes en el agua, se asume que otra clase de microorganismos capaces
de causar enfermedades, pueden estar presentes. De igual forma, su ausencia es un
indicativo de que el agua es bacteriolgicamente segura para el consumo humano.
En el anlisis microbiolgico de las aguas crudas no se buscan directamente las

bacterias o virus patgenos, sino algunas bacterias indicadoras de contaminacin por
heces fecales y que sin ser patgenas residen en el intestino del hombre y de los
animales, las bacterias coliformes.
Existen diversas tcnicas de anlisis microbiolgico que permiten detectar la

presencia de ciertos microorganismos indicadores de contaminacin tales como el
mtodo de filtracin por membrana, la tcnica del NMP o fermentacin en tubos
mltiples, los cuales son utilizados como control de calidad en acueductos o
industrias donde se requiere procesar un gran nmero de muestras. (ORTIZ, 1999)
2.3.1. Plan de muestreo (recoleccin y recepcin de muestras)
Todo programa que se establezca para el control de calidad del agua tiene como base
fundamental el muestreo, la seriedad y responsabilidad con que se lleve a cabo esta
actividad.
25
Para la recoleccin de muestras de aguas se deben utilizar frascos de vidrio de fcil
esterilizacin los cuales son suministrados por el laboratorio que realiza el anlisis,
con capacidad de 300 mL. El frasco estril debe ser llenado hasta las tres cuartas
partes de su capacidad y tapado inmediatamente. Si la muestra es agua tratada con
cloro, el frasco debe contener 0.5 mL de tiosulfato de sodio al 10%. La solucin de
tiosulfato de sodio acta como inhibidor del cloro para evitar la muerte de los
microorganismos presentes en la muestra. (PALMA, 1999)
La muestra debe llevarse lo ms rpidamente posible al laboratorio (no demorar ms

de 4 horas). Si es necesario demorarla ms tiempo se debe refrigerar desde el
momento de la toma (no ms de 20 horas).
Condiciones generales para la recoleccin de muestras:
Disponer de los recipientes y dems materiales apropiados segn el estudio que

se vaya a realizar.
Cerciorarse que el frasco tenga el aditivo apropiado (Tiosulfato de sodio)
Asegurarse que la composicin de la muestra tomada, refleje fielmente la del

total del suministro o fuente de agua, es decir, que sea representativa del sistema.
Utilizar tcnicas de recoleccin que no afecten por descuido u omisiones la

calidad del agua recolectada, con respecto a su fuente original.
Cuando se vaya a tomar muestra para anlisis microbiolgico no enjuagar el

frasco con la muestra.
Para anlisis fsico-qumico el frasco no debe tener aditivos y debe enjuagarse

el frasco con la misma muestra.
Identificar la muestra.
Consignar inmediatamente despus de la toma todos los datos importantes que

permitan identificar correctamente la muestra:
26
* Lugar exacto del muestreo
* Fecha y hora de toma
* Cloro residual (total o libre) encontrado en el momento del muestreo
* Otras condiciones especiales: si la muestra viene directamente de la red de

distribucin, de un tanque subterrneo o elevado, pozo, etc.
* Si es agua de ro, quebrada, laguna, estanque, etc, o motivo de la solicitud

(Intoxicacin, control, etc.)
* Anotar las condiciones en el momento de tomar la muestra (temperatura del

ambiente, temperatura del agua, viento, lluvia, etc.).
2.3.1.1. Toma de muestras en grifos o llaves
Se debe limpiar cuidadosamente el grifo o tubo. La abertura de salida y sus

inmediaciones deben flamearse con llama de alcohol. Se deben escoger grifos que no
tengan escapes por el vastazo, debido a que el agua que sale por all se contamina e
invalida la muestra. Se deja fluir el agua lo ms intensamente posible para quitar las
impurezas adheridas. Posteriormente se debe regular el chorro de agua al espesor de
un lpiz. Se llena rpidamente el frasco hasta la mitad ms o menos, si es para
examen microbiolgico evitando salpicaduras y totalmente lleno si es para anlisis
fsico-qumico.
En pozos con bomba debe bombearse lenta y uniformemente durante 10 minutos

antes de tomar la muestra.
2.3.1.2. Toma de muestras en pozos carentes de bomba
Preparar el frasco de la siguiente manera:
27
Fijar un alambre al cuello del frasco. Envolver el conjunto en papel de aluminio y
esterilizar. Al tomar la muestra no tocar el exterior del frasco. No tomar de la parte
sobrenadante del pozo.
2.3.1.3. Toma de muestras en ros, lagos, quebradas, represas
Se debe estudiar la situacin de acuerdo con los recursos del laboratorio, objeto del
examen, fuente de contaminacin, etc., excepto en casos especiales, no tomar muestra
superficialmente en sitios donde permanezca estancada ni donde se presenten
turbulencias por agitacin accidental.
Se realiza el procedimiento de la siguiente manera:
* Colocarse frente a la direccin de las corrientes de agua.
* Sumergir el frasco debajo de la superficie del agua unos 15 a 20 cm, realizando un

semicrculo en la direccin de la corriente. As se evita contaminar el agua por las
manos del operario. Si no hay corriente de agua, crearla por el movimiento del frasco.
* Evitar recoger material flotante. Este se puede tomar como muestra especial.
* Evitar tomar material del fondo.
2.3.1.4. Transporte y almacenamiento de las muestras
Si las muestras no van a ser analizadas antes de una hora de haber sido tomadas,
deben refrigerarse durante el transporte a 4C, y deben estar completa e
inconfundiblemente identificadas.
No debe de transcurrir ms de 6 horas entre la toma de muestra y el anlisis y

mximo 2 horas en el laboratorio. Si esto no se puede cumplir, las muestras deben ser
conservadas a temperatura inferior a 4C sin ser congeladas.
28
2.4. MTODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA
Para la deteccin de coliformes totales y coliformes fecales (E. coli) es utilizado el

mtodo de filtracin por membrana, el cual es un mtodo altamente reproducible,
puede usarse para analizar volmenes de muestra relativamente grandes y se obtienen
resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a
cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones. Tambin se encuentra entre los
mtodos standards. A los efectos de la filtracin por membrana debe replantearse la
definicin de coliformes: bastones Gram. (-), aerobios o anaerobios facultativos, que
dan colonias oscuras con brillo metlico en medio Endo, luego de 24 horas de
incubacin a 35C +/- 2C. La determinacin de coliformes fecales por filtracin
puede hacerse a partir de las colonias desarrolladas en Endo o directamente
incubando la membrana en medio m-FC e incubando a 44,5C.
2.4.1. Fundamento del mtodo de filtracin por membrana
La muestra de agua se hace pasar mediante vaco por un filtro de celulosa de 0.45
micras de tamao de poro, para que queden retenidas en l, las bacterias de tipo
coniforme y las mesoflicas. El filtro es colocado en un medio de cultivo especifico
para lo que se desea determinar en la muestra (coliformes totales, coliformes fecales y
microorganismos mesoflicos), incubando a 35C +/- 2C durante 18 a 20 horas.
(PALMA, 1999 ).
2.4.2. Caractersticas del filtro de membrana
Se debe utilizar filtro de membrana con un dimetro de poro que permita una
completa retencin de las bacterias coliformes. Se debe tener en cuenta que estos
filtros estn libres de qumicos susceptibles de inhibir el crecimiento y desarrollo
bacteriano, que posean una velocidad de filtracin satisfactoria. (MILLIPORE, 2005).
29
2.4.3. Ventajas y desventajas del mtodo de filtracin por membrana
El mtodo de filtracin por membrana es un mtodo gil y poco dispendioso. La

lectura de resultados se da en un menor tiempo (24 horas) a comparacin del mtodo
NMP, adems se puede utilizar en pruebas de campo, empleando accesorios
adecuados. El anlisis se dificulta en muestras de aguas muy turbias o con abundante
carga bacteriana. Este inconveniente es posible remediarlo, haciendo diluciones de la
muestra o haciendo inculos muy pequeos de acuerdo con el tipo de muestra a
analizar. (PALMA, 1999 ).
2.4.4. Uso del equipo de filtracin por membrana
Colocar el portafiltros estril

sobre la base del manifold
Colocar el embudo estril sobre el receptculo y

fijarlo con las pinzas que trae el equipo
Llenar el embudo con 80 a 100 ml de agua destilada

estril
Dejar filtrar aplicando vacio
Cerrar las llaves del manifold y adicionar 20 30

mLde alcohol al 70%
30
Pasar el mechero por cada filtro para encender el
alcohol, dejar el alcohol encendido durante 3
minutos
Abrir las llaves del manifold y dejar filtrar
Adicionar nuevamente 100 mL de agua destilada

estril y dejar filtrar
Cerrar las llaves del manifold y retirar el embudo
Con pinzas estriles colocar un filtro de celulosa en

cada portafiltros, con la cuadricula hacia arriba,
sobre la parte porosa del receptculo
31
Colocar el embudo y adicionar la muestra a analizar
Agua Tratada Agua Cruda
Filtrar 100 mL de cada Diluir la muestra 1/10

muestra a analizar y filtrar
Cuando finalice el filtrado de cada una de las

muestras cerrar las llaves del manifold, retirar el
embudo, tomar el filtro con pinzas estriles y
colocarlo sobre la superficie del medio Endo y
m-FC
Incubar las cajas a la temperatura adecuada:

Medio Endo: 37C +/- 2C
Medio m-FC: 44.5C en bao mara
Realizar el recuento de las colonias caractersticas:
Medio Endo: colonias rojas
Medio m-FC: colonias azules
(Apha, 2005)
32
3. JUSTIFICACIN
La acreditacin es un proceso que contribuye a la mejora continua de la calidad de los

servicios que prestan los laboratorios. La participacin en los procesos de
acreditacin es decisin de la direccin de cada laboratorio, y por lo tanto, debe ser
accesible a todos los establecimientos que estn debidamente registrados y
habilitados por las autoridades nacionales del pas. El propsito de la acreditacin es
formalizar el reconocimiento, por un ente independiente, que los laboratorios han
implementado un sistema que pretende garantizar la calidad de sus servicios.
Para llevar a cabo el proceso de acreditacin los laboratorios deben dar cumplimiento
a la norma ISO/IEC 17025 Requisitos generales para la competencia de laboratorios
de prueba y calibracin, la cual es de vital cumplimiento en el proceso de
acreditacin del laboratorio. Esta norma contiene todos los requisitos que los
laboratorios de ensayo y de calibracin deben conocer, si desean demostrar que
operan de acuerdo a un sistema de calidad, son tcnicamente competentes y son
capaces de generar resultados vlidos tcnicamente. Segn la norma ISO/IEC 17025
los laboratorios deben validar todos los mtodos que se utilicen en el laboratorio,
tanto los desarrollados por ellos mismos como aquellos procedentes de fuentes
bibliogrficas o desarrollados por otros laboratorios. Adems, es necesario que el
laboratorio valide los mtodos de referencia; aunque en este caso, no es necesario que
el laboratorio realice una validacin completa.
El laboratorio de salud pblica del Huila (LSPH) est en busca de la acreditacin, la

cual tiene por objeto reconocer la competencia tcnica y la idoneidad de organismos
de certificacin e inspeccin, con las normas y los reglamentos que le son de
aplicacin, a travs de evaluacin y auditora de las mismas, siguiendo criterios
transparentes y pblicos.
Debido a esto se hace necesario validar el mtodo de filtracin por membrana para la
deteccin de Coliformes totales y Escherichia coli, en muestras de para consumo
33
humano, el cual es utilizado diariamente en el laboratorio para el anlisis
microbiolgico aguas para consumo humano.
34
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Realizar la validacin secundaria del mtodo de filtracin por membrana para la

deteccin de Coliformes Totales y Escherichia coli en aguas para consumo humano
analizadas en el Laboratorio de Salud Publica del Huila.
4.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
Evaluar la calidad de los medios de cultivo Endo y m-FC por medio de

pruebas de esterilidad, selectividad y eficacia.
Evaluar la precisin del mtodo de filtracin por membrana para la deteccin

de Coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de agua para consumo
humano.
Evaluar la exactitud del mtodo de filtracin por membrana para la deteccin

de Coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de agua para consumo humano.
Realizar el anlisis estadstico de los resultados obtenidos durante el estudio.
35
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1. DISEO DE LA INVESTIGACIN
Se realiz un estudio experimental basado en la metodologa aplicada por el Instituto

Nacional de Salud, donde la validacin fue de tipo concurrente, ya que la informacin
fue obtenida durante el tiempo que duro el estudio, realizando monitoreo de todo el
proceso para garantizar que se estaba trabajando bajo control.
El presente trabajo de grado fue realizado en el Laboratorio de Salud Publica del

Huila.
Para llevar a cabo la validacin del mtodo de filtracin por membrana, se analizaron
dos muestras de agua, que posean las caractersticas requeridas para las cuales el
mtodo es utilizado rutinariamente, as mismo, se evaluaron los parmetros de
precisin y exactitud del mtodo.
5.2. MATERIALES
Filtros de membrana (poro de 0.45um)
Pinzas
Micro pipeta automtica 100-1000 UL
Puntas azules estriles
Cepas microbianas
Cepa de Escherichia coli con nmero de referencia ATCC 25922
Cepa de Staphylococcus aureus con nmero de referencia ATCC 25923
36
Material de vidrio
Tubos tapa rosca
Frascos grandes mbar con alcohol al 70%
Frascos grandes mbar con agua destilada estril
Frascos Schott de 250 ml
Material de plstico
Cajas de petri grandes
Medios de cultivo
Cajas de petri plsticas con medio Endo listo para su uso
Cajas de petri plsticas con medio m-FC listo para su uso
Agar plate Count
Agar OGY
Agar Mc Conkey
Agar Sangre
Reactivos
Cloruro de bario
Acido sulfrico
37
Equipos
Incubadora a 35C +/- 2C
Bao de mara a 44.5C
Espectrofotmetro
Vortex
Equipo de filtracin por membrana
5.3. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS
Se verific que las cepas de referencia utilizadas para el estudio de validacin, ATCC
25922 Escherichia coli y ATCC 25923 Staphylococcus aureus, estuvieran viables y
con una pureza del 100%. El Laboratorio de Salud Publica cuenta con su propio
cepario. Las cepas se encuentran conservadas en leche descremada a -70C. Se tomo
un vial de cada cepa y se sembr por agotamiento en medio Mc Conkey la cepa de
Escherichia coli y en agar sangre la cepa de Staphylococcus aureus, las cuales fueron
incubadas a 37C durante 24 horas. Pasado el periodo de incubacin se procedi a
realizar coloracin de Gram. e identificacin bioqumica de cada cepa, utilizando API
20 E para E. coli y realizando prueba de oxidasa, catalasa y coagulasa para la S.
aureus. De igual manera la cepa se identific en forma automatizada por el equipo de
Microscan, logrando un aceptabilidad de 99.9% con respecto a su identificacin..
Determinada la pureza y viabilidad de cada cepa, se realizaron repiques en los
respectivos medios, para el trabajo diario y as mantener las cepas en fase
exponencial.
38
5.4. PREPARACIN DEL PATRN DE MCFARLAND
Se preparo el tubo 0.5 de la escala de Mcfarland, utilizando 0.05 mL de cloruro de

bario al 1% y 9.95 mL de cido sulfrico al 1% el cual contena una pureza del 96.3%
leyndose su absorbancia a una longitud de onda de 620nm.
5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Para la deteccin de coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de aguas para

consumo humano se utilizaron los medios de cultivo Endo para Coliformes Totales y
el medio m-FC para la deteccin de Escherichia coli. Estos medios de cultivo son
medios que vienen listos para su uso, por lo tanto se verific su esterilidad,
selectividad y eficacia para as poder comprobar las especificaciones entregadas por
el fabricante (Palma, 1998). As mismo se realizo la prueba de esterilidad para los
medios de cultivos preparados, agar Mc Conkey, agar Ogy, agar Plate Count y para el
agar sangre el cual tambin viene listo para el uso, como tambin se realizo este
control al agua destilada estril.
5.5.1. Control de esterilidad
La prueba de esterilidad de los medios de cultivo utilizados para el anlisis se realiz

de la siguiente manera:
Se seleccion aleatoriamente el 10% de los medios de cultivo que se utilizaron

para la validacin. Las cajas fueron hidratadas con agua destilada estril. Las cajas
con medio Endo se incubaron a 37C durante 24 horas y las cajas con medio m-FC a
39
44.5C, con el fin de verificar que estos medios no presentaran crecimiento de ningn
tipo de microorganismo. (SARTORIUS, 2003).
Se sirvieron en cajas de petri estriles los medios Mc Conkey, Plate Count y

OGY, tomando el 10% de cada medio para su respectivo anlisis. Se incubo a 37C
durante 48 horas. Se verifico que pasado el tiempo de incubacin no hubiese
crecimiento de ningn tipo de microorganismo (Allaert, 2002)
Se comprob la esterilidad del agua destilada estril que se utiliz para la

hidratacin de los medios de cultivo, para las suspensiones y diluciones bacterianas.
Se tomaron 400 ml de agua la cual fue analizada por el mtodo de filtracin por
membrana, tomando 100 ml para cada replica. Se realizaron cuatro replicas de las
cuales 2 fueron incubadas en medio Endo a 37C y las otras dos fueron incubadas en
medio m-FC a 44.5C durante 24 horas. Se evalu el crecimiento solamente de estos
dos microorganismos ya que los medios son selectivos para el microorganismo en
estudio (E. coli) segn las especificaciones del fabricante.
5.5.2. Prueba de selectividad y eficacia
Para evaluar la selectividad y eficacia de los medios Endo y m-FC se utiliz una
suspensin de Staphylococcus aureus y una suspensin de Escherichia coli obtenidas
del cepario del Laboratorio de Salud Publica del Huila. Cada suspensin fue realizada
en 10 mL de agua destilada estril y comparada con la turbidez del tubo 0.5 del
patrn de Mcfarland, las cuales fueron analizadas por el mtodo de filtracin por
membrana, evaluando simultneamente las cajas con medio Endo y las cajas con
medio m-FC incubando a las respectivas temperaturas. Para comprobar la
selectividad y eficacia de cada medio, se verifico visualmente que solo hubiera
crecimiento de Escherichia coli y ausencia de crecimiento de Staphylococcus aureus,
ya que son medios listos para el uso.
40
El medio Endo se utiliza para la identificacin de coliformes totales a 37C durante
24 horas, usando filtros de celulosa con un tamao de poro de 0.45 micras. Al pasar
la muestra de agua a travs de este filtro mediante la aplicacin de vacio las bacterias
las cuales son de mayor tamao quedan retenidas en este. Los coliformes totales que
fermentan la lactosa crecen en este medio formando colonias rojas, brillantes y
convexas, en este medio E. coli crece con brillo verde metlico. (SARTORIUS,
2003).
El medio m-FC se utiliza para la determinacin de Escherichia coli y coliformes

fecales, a temperatura de incubacin de 44.5C. Estos microorganismos crecen
formando colonias de color azul intenso brillantes y convexas (SARTORIUS, 2003).
5.6. CONTROL DE AMBIENTES
Se seleccionaron tres puntos de muestreo. Mediante la tcnica de sedimentacin, en

cada punto se coloc una caja con agar OGY para el recuento de hongos y levaduras
y una caja con agar Plate Count para el recuento de bacterias mesfilas, durante 15
minutos. Las cajas con agar Plate count fueron incubadas a 37C +/- 2C durante 24
horas, y las cajas con agar OGY se dejaron a temperatura ambiente durante 5 das.
Finalizado el periodo de incubacin, se realizo el recuento de microorganismos. Este
procedimiento fue realizado cada vez que se realizaba el estudio de validacin.
5.7. CONTROL DE EQUIPOS
Se reviso la documentacin de mantenimiento y calibracin de equipos y se llevo el

registro del uso de cada uno de los equipos utilizados en el estudio de validacin,
mediante la utilizacin de formatos de registro que ya tiene establecido el Laboratorio
de Salud Publica del Huila.
41
5.8. VALIDACIN DEL METODO DE FILTRACION POR
MEMBRANA PARA LA DETECCION DE COLIFORMES
TOTALES Y E. coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA EL
CONSUMO HUMANO
La metodologa para realizar la validacin del mtodo de filtracin por membrana, se

llevo a cabo de acuerdo al protocolo descrito por el Instituto Nacional de Salud.
(Palma, 1998).
Antes de llevar a cabo el proceso de validacin se realiz la estandarizacin del tubo

0.5 del patrn de Mcfarland y ensayos preliminares de repetibilidad, con el fin de
obtener un dominio del mtodo.
5.8.1. Estandarizacin del tubo 0.5 de Mcfarland
Se realizo la estandarizacin de la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland para comprobar

que efectivamente se estaba partiendo de 150 millones de bacterias/mL, realizando
varias mediciones para obtener un rango promedio de lectura de absorbancia. (Ver
figura 1).
a. Lectura tubo Mcfarland
Tubo 0.5 de
Leer a 620 nm
Mcfarland
42
b. Comparacin de la suspensin de E. coli con el tubo de Mcfarland
Tubo 0.5 de
Suspensin E.
Mcfarland
coli
10 mL
ADE
comparar
15 x 107 UFC/mL
Leer a 620 nm
c. Diluciones de la suspension bacteriana
1/100 1/100 1/100
1/10
15 x 107 15 x 105 15 x 103 15x 103 15 Bact/mL
FIGURA 1 Esquema de la estandarizacin del tubo 0.5 de Mcfarland. a) Lectura tubo

0.5 de Mcfarland. b) Comparacin del tubo 0.5 de Mcfarland con la suspensin de E. coli.
c) Preparacin de las diluciones de la concentracin de 5 bacterias/ml.
43
Obtenida la concentracin de 15 bacterias/ml, se realizaron cuatro replicas tomando 4
mL de esta suspensin y adicionando 1 ml a cada frasco que contena 99 ml de agua
destilada estril, para completar un volumen final de 100 ml, la totalidad de cada
frasco fue analizada por el mtodo de filtracin por membrana. Se realizaron 10
mediciones de cuatro replicas cada una, realizando una medicin diaria, de las cuales
dos eran para ser sembradas en medio Endo y dos en medio m-FC y se llevaron a
incubar a las respectivas temperaturas durante 24 horas. Despus de 24 horas se
realizo el recuento de las colonias caractersticas en cada medio. Este procedimiento
fue realizado cada vez que se hacia una medicin. (Ortiz, 2008)
5.8.2. Ensayo preliminar de repetibilidad
Se analizaron tres concentraciones diferentes de Escherichia coli, las cuales se

encontraran dentro del nivel bajo, medio y alto de deteccin del mtodo. Las
concentraciones analizadas fueron: 5 bacterias/ml, 20 bacterias/ml y 70 bacterias/ml.
En todo el proceso de validacin se parti inicialmente de una concentracin de 130

millones de bacterias/ml, la cual fue determinada a travs de las mediciones que se
realizaron en la estandarizacin de la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland.
Para llegar a la concentracin de 5 bacterias/ml se procedi de la siguiente manera:
Se prepar una suspensin de E. coli en 40 ml de agua destilada estril, se compar

con el tubo 0.5 de Mcfarland, se ley en el espectrofotmetro a 620 nm y se
comprob que estuviera entre el rango de absorbencias establecido anteriormente. A
partir de esta suspensin, para obtener la concentracin de 5 bacterias/mL, se utilizo
la frmula: V1 X C1 = V2 X C2 en donde:
V1= 10 ml
44
C1= 130.000.000 bacterias/mL
V2= ?
C2= 50.000.000 bacterias/mL
Despejando la formula se obtuvo un resultado en volumen que se denomin volumen

final.
V2 = 10 mL X 130.000.000 bac/mL = 26 mL
50.000.000 bac/mL
El volumen final para la concentracin de 50 millones de bacterias/mL fue de 26 mL,
como ya se tenan 10 mL del volumen inicial, al volumen final se le restaron estos 10
mL iniciales adicionando la diferencia en agua destilada estril, para completar el
volumen final de 26 mL. (Ver figura 2).
Tubo 0.5 de
Mcfarland
Comparar
40 mL
ADE
Suspensin E.coli
Adicionar
10 ml
45
Volumen final
26 mL
16 mL
ADE
50 X 106 UFC/ml
1/100 1/100 1/100 1/10
50 x 106 50 x 104 50 x 102 50 UFC/ml 5 UFC/ml
FIGURA 2. Esquema para preparar la concentracin de 5 bacterias/ml
Este mismo procedimiento fue realizado para las otras dos concentraciones teniendo
en cuenta la concentracin final a la que se quera llegar.
Una vez obtenida cada concentracin final 5, 20 y 70 bacterias, se tomo veinte

mililitros de cada una adicionando un mililitro a frascos schott estriles que contenan
99 mL de agua destilada estril para ser analizadas por el mtodo de filtracin por
membrana. Se realizaron veinte replicas de cada concentracin sembrando 10
46
replicas en medio Endo y 10 replicas en medio m-FC e incubadas en las respectivas
temperaturas.
Con los datos obtenidos se realizo el anlisis estadstico, calculando la media,

desviacin estndar y coeficiente de variacin el cual debe ser menor o igual al 10%.
(Ortiz, 2008)
5.8.3. Validacin del mtodo de filtracin por membrana
De acuerdo a la metodologa adoptada por el INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

(INS), la cantidad de soluciones analizadas que conformaron el diseo experimental
fue de 48, distribuidas en seis (6) lotes, de ocho (8) soluciones cada una, analizando
las siguientes soluciones en cada lote: 2 blancos, dos muestras naturales, dos muestras
mas adicin de 0.4C y 0.7C y dos soluciones estndares. El estudio se proces
durante seis das, en donde cada lote era un da.
Cada solucin fue preparada como se explico en el ensayo preliminar de

repetibilidad. (Ver figura 2), tomando cuatro mililitros de cada concentracin a
evaluar, para ser adicionado un mililitro en frascos schott que contenan 99mL de
agua destilada estril, para obtener un total de cuatro replicas por concentracin de las
cuales dos fueron para analizar coliformes totales y dos para analizar coliformes
fecales (E. coli). Cada solucin fue analizada por duplicado, con el fin de realizar las
cartas de control.
No se realizo un control negativo, ya que al momento de hacer la prueba de

selectividad y eficacia de los medios, se comprob cual era el crecimiento de E. coli y
S. aureus en cada medio.
47
5.8.3.1. Descripcin de soluciones y muestras
Blancos: Se utilizo agua destilada estril, el cual fue sometido al mismo

procedimiento analtico de las dems soluciones.
Soluciones estndares: Cubren el rango de deteccin del mtodo. Se usaron dos

estndares, los cuales estaban cerca al lmite inferior y superior del rango de
deteccin del mtodo (0.09 C y 0.9 C, donde C es el lmite superior de deteccin del
mtodo), el cual fue de 80 UFC/mL, que ya est establecido por el Instituto Nacional
de Salud, adems, es el mximo nivel en el que se puede hacer un recuento
significativo de microorganismos, que para este caso fue E.coli.
Muestras naturales: Deben de poseer las caractersticas para las cuales el mtodo es
utilizado rutinariamente. Las muestras naturales analizadas, eran agua en bolsa de dos
marcas diferentes. A estas bolsas de agua se les realizo una evaluacin antes del
proceso de validacin, con el fin de comprobar que no presentaban crecimiento de
coliformes totales ni fecales. Se analiz el 10% de las bolsas de agua de cada marca,
adicionando 100 ml de cada muestra a frascos Schott estriles de 250 ml que
contenan 0.5 ml de tiosulfato, el cual es un inhibidor del cloro presente en cada
muestra, que permite determinar la concentracin de microorganismos indicadores de
contaminacin presentes en cada una. Cada muestra fue analizada por el equipo de
filtracin por membrana sembrando simultneamente en medio Endo y en medio m-
FC e incubadas a las respectivas temperaturas durante 24 horas. Finalizado el periodo
de incubacin se comprob que ninguna de las dos marcas de agua presentara
crecimiento caracterstico en cada uno de los medios de cultivo.
Muestras adicionadas: Hace referencia a las muestras naturales, a las cuales se les
adicion una cantidad conocida del microorganismo en estudio, denominadas 0.4 C
(equivalente a 32 bacterias/ml) y 0.7 C (equivalente a 56 bacterias/mL). Con la
adicin de cada concentracin conocida se determino la exactitud del mtodo
mediante la evaluacin de la recuperacin.
48
5.8.4. Elaboracin de cartas R/ para el control de calidad analtica interna
del laboratorio
Para realizar las cartas de control, los datos fueron obtenidos durante el
procedimiento de validacin, en donde cada solucin se analizo por duplicado.
Al terminar la validacin se calcul el n (nmero de datos), E (sumatoria), y R/

(promedio) de la columna R.
Se calculo el LCS (lmite superior de control) mediante la frmula:
3.27 x R/
Se calcul el LCI (lmite inferior de control) mediante la frmula:
Rx0
(OTALORA, 2005)
5.8.5. Evaluacin de la validacin
Se realizo anlisis estadstico de los resultados obtenidos mediante un programa

elaborado en Excel (Aplicativo Validar 1.1). (Anexos 4-7). La precisin del mtodo
fue evaluada con la aceptabilidad de las desviaciones estndares de cada solucin, las
cuales deban de estar en el rango de la meta a alcanzar (W), correspondiente al 5%
de la concentracin de la gran media a 0.25 veces el valor mnimo de inters que en
este caso fue 8. As mismo se evalu la repetibilidad dentro de lotes, la cual fue
analizada solo para el blanco ya que fue la nica solucin que se realizo por
duplicado, y reproducibilidad entre los lotes, debido a que el estudio fue realizado en
6 das diferentes. A pesar de que todas las soluciones se realizaron por duplicado, el
valor de las dos mediciones fue tenido en cuenta para la elaboracin de las cartas
49
control. Mientras que para el aplicativo se realizo el promedio de las dos replicas,
tomando el resultado como el valor encontrado, puesto que el diseo establece que
solo los blancos se repiten, las dems soluciones no. (Ortiz, 2202).
La exactitud se evalu mediante la recuperacin de una concentracin conocida de

E. coli a las dos muestras naturales (0.4C y 0.7C), comprobndose que el promedio
de la recuperacin no difiere significativamente del 95 al 105% de la recuperacin
esperada.
5.9. INFORME DE RESULTADOS
Mediante la evaluacin de los parmetros estadsticos tales como la media,

desviacin estndar total dentro de lotes y entre lotes y recuperacin, se analizaron
los respectivos datos obtenidos, para determinar la precisin y exactitud del mtodo
de filtracin por membrana para la deteccin de coliformes totales y fecales (E. coli)
en muestras de agua para consumo humano.
50
6. RESULTADOS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
6.1. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS DE

REFERENCIA
Macroscpicamente la cepa de Escherichia coli, present las siguientes

caractersticas: colonias rosadas (lactosa positivas) grandes y redondas. (Figura 3).
FIGURA 3 Crecimiento de E. coli en agar Mc Conkey
En la coloracin de Gram. se observo solo la presencia de bacilos Gram negativos y

mediante la utilizacin del API 20E, se comprob la identificacin del
microorganismo evaluado, encontrndose el cdigo de lectura 5144552, el cual hace
referencia a Escherichia coli. (Figura 4).
51
FIGURA 4 Identificacin bioqumica de E. coli
La cepa de Staphylococcus aureus macroscpicamente present las siguientes

caractersticas: colonias de color amarillo cremoso con presencias de halo de
hemolisis. (Figura 5).
FIGURA 5 Crecimiento de S. aureus en agar sangre
52
Microscopicamente se evidenciaron cocos Gram positivos, y en la identificacion
bioquimica se obtuvieron los siguientes resultados: coagulasa (+), catalasa (+) y
oxidasa (-).
Con estos resultados se comprobo que las cepas utilizadas estaban completamente
puras ya que no se evidencio la presencia de microorganismos contaminantes como
se pudo observar en las coloraciones de Gram, de la misma manera, se comprobo la
viabilidad ya que las dos cepas obtuvieron un buen crecimiento en los respectivos
medios en que se realizaron las siembras.
6.2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
El control de calidad en la preparacin y evaluacin de los medios de cultivo es

considerado como parte esencial de las buenas prcticas de laboratorio, el cual es
necesario para mantener el nivel y la ejecucin de cualquier tcnica microbiolgica,
siendo este un proceso continuo que se extiende desde las materias primas, hasta el
producto final utilizado, el cual es evaluado directamente por el laboratorio que
emplea el medio de cultivo para su anlisis. Por esta razn, el control de calidad de
los medios de cultivo est considerado como uno de los puntos crticos de control, del
cual depende la seguridad y confiabilidad de los resultados que emiten los
laboratorios de ensayo. (Soler, 2006)
6.2.1. Control de esterilidad
Por medio del anlisis del 10% de los medios de cultivo utilizados en el proceso de
validacin, se comprob la esterilidad de cada uno, ya que no hubo crecimiento de
ningn tipo de microorganismo, permitiendo as la utilizacin satisfactoria de cada
medio.
53
El agua destilada estril que se utilizo, para la hidratacin de los medios Endo y m-
FC, como para las suspensiones y diluciones bacterianas, estaba completamente
estril, ya que al ser analizada por el mtodo de filtracin por membrana no presento
ningn tipo de crecimiento bacteriano.
6.2.2. Prueba de selectividad y eficacia
La composicin qumica de un medio de cultivo debe proveer los requerimientos

nutricionales bsicos para el crecimiento de los microorganismos. Debido a la
variabilidad de pequeos errores en la preparacin de los medios de cultivo, es
recomendable realizar una evaluacin antes de su utilizacin, sin embargo, un medio
de cultivo debe cumplir con dos caractersticas importantes, la selectividad y la
eficacia. (Padilla, 2002).
Este control fue realizado para comprobar la eficacia y selectividad de los medios
Endo y m-FC, observndose crecimiento de la cepa de Escherichia coli en los dos
medios de cultivo utilizados, y ausencia de crecimiento de Staphylococcus aureus,
comprobndose que los medios de cultivo evaluados son altamente selectivos y
eficaces, ya que permitieron solo el crecimiento de Escherichia coli inhibiendo
completamente el crecimiento de Staphylococcus aureus. (Figura 6 y 7). Comprobada
la ausencia de crecimiento de S. aureus, no se realizaron controles negativos durante
la validacin, ya que los medios de cultivo solamente permiten el crecimiento de E.
coli.
54
Medio Endo Medio m-FC
FIGURA 6 Crecimiento de E.coli en medio Endo y en medio m-FC
FIGURA 7 Crecimiento de S. aureus en medio Endo y en medio m-FC
6.3. CONTROL DE EQUIPOS
En la implementacin de la norma ISO 17025, es de gran importancia dentro de los

procesos de validacin de anlisis microbiolgicos, utilizar equipos debidamente
calibrados. Es importante que el laboratorio emplee mtodos y procedimientos
apropiados para todos los ensayos y/o calibraciones, ya que el laboratorio debe
equiparse con todos los elementos que garanticen un margen de trazabilidad en las
55
medidas que se realizan durante su utilizacin dentro de la ejecucin del anlisis o
mtodo microbiolgico y as avalar los resultados de las pruebas. (Soler, 2006).
En este caso el Laboratorio debe tener programas de mantenimiento y calibracin;

calibrar y revisar los equipo antes de ponerse en servicio, con el fin de establecer si
rene los requisitos de las especificaciones del Laboratorio y si cumple las
especificaciones de normatividad pertinente, (Soler, 2006).
De la misma manera, todos los equipos deben ser registrados con la indicacin de la
frecuencia de mantenimiento as como de las operaciones que realiza este y el
responsable de su verificacin. (Galeano, 2007).
Al iniciar el proceso de validacin se reviso el historial de los equipos utilizados en el

proceso de validacin, incluyendo certificados de calibracin, mantenimiento y
registro de su uso durante el estudio, (Anexo 3). Los equipos utilizados, se
encontraban funcionando correctamente y dentro de los rangos esperados.
6.4. CONTROL DE AMBIENTES
Durante el proceso de validacin se llevo a cabo el control de ambientes por medio

del mtodo de sedimentacin en medio Plate count para bacterias mesfilas aerobias
y en medio OGY para la determinacin de hongos y levaduras. EL recuento obtenido
se muestra en la tabla 1.
56
TABLA 1 Recuento de bacterias aerobias mesfilas, hongos y levaduras
PRUEBA REALIZADA Recuento de bacterias Recuento de Hongos y

mesfilas aerobias UFC/ levaduras UFC/15 min.
15 min. de exposicin De exposicin
Prueba de esterilidad 0 0
Prueba repetibilidad
1 5 2
2 3 0
3 4 0
Fuente: Autor
Los resultados obtenidos del control de ambientes del rea donde se realizo la
validacin del mtodo, indican una carga baja de microorganismos presentes, (Tabla
1), lo que permite inferir que se cumplen con buenas condiciones de limpieza y
desinfeccin de esta rea.
Los formatos de registro de limpieza del Laboratorio se encuentran en el anexo 3.
6.5. VALIDACIN DEL METODO DE FILTRACION POR

MEMBRANA
Es de vital importancia la validacin de mtodos dentro de un proceso de

acreditacin, ya que mediante la utilizacin de tcnicas validadas, se est dando la
confianza y seguridad requerida en los resultados que se emiten.
Para los Laboratorios de referencia se hace necesario llevar a cabo procesos de

validacin de tipo secundario, ya que en la mayora de estos laboratorios se emplean
57
mtodos de referencia. En este caso, el laboratorio emplea el mtodo de referencia de
filtracin por membrana para la deteccin de coliformes totales y fecales en muestras
de aguas para consumo.
Para llevar a cabo el proceso de validacin del mtodo de filtracin por membrana, se
evaluaron los parmetros de precisin y exactitud. La precesin fue evaluada en
funcin de repetibilidad y reproducibilidad. La repetibilidad solo fue evaluada en el
blanco ya que fue la nica solucin que se realizo por duplicado. Mientras que, la
reproducibilidad fue evaluada en todas las soluciones debido a que el estudio fue
realizado en seis das diferentes.
Se evalu la desviacin estndar total tanto para coliformes totales como para
coliformes fecales, en donde la desviacin estndar se compar con W (meta a
alcanzar). W fue tomado como el 5% de la concentracin de la gran media como
0.25 veces el valor mnimo de inters del mtodo. Para que la desviacin estndar
fuera aceptada esta deba de ser menor que W.
La exactitud se evalu mediante la recuperacin de una concentracin conocida de E.

coli a las dos muestras naturales utilizadas. Se tomo un nivel de confianza entre el 95
y 105%, con un margen de error del 5%. La recuperacin satisfactoria fue aceptada si
los resultados obtenidos estaban dentro de esta meta.
6.5.1. Estandarizacin del tubo 0.5 de Mcfarland
Antes de iniciar con la etapa de validacin, se estandarizo la lectura del tubo 0.5 de
Mcfarland y se realizaron ensayos preliminares con el fin de obtener dominio del
mtodo.
En los resultados obtenidos de la estandarizacin de la lectura de la suspensin de

E.coli para comprobar que se estaba partiendo de 150 millones de bacterias, se
observo que las mediciones realizadas con una absorbancia cercana a la encontrada
58
en la lectura del tubo 0.5 de Macfarland (Tabla, 2), presentaban una concentracin
inicial de 130 millones de bacterias/ mL. Al realizar las 10 replicas que se
establecieron, se obtuvo un rango de absorbancias entre 0.295 y 0.310, las cuales
permitan que cada vez que se preparaba la suspensin de E.coli se tena certeza de
que se estaba partiendo de una concentracin inicial de 130 millones de bacterias/mL
(Tabla 3) (Figura 8).
TABLA 2 Comparacin de absorbancias del tubo 0.5 de Mcfarland y la

suspensin de E. coli
Tubo 0.5 Suspensin E. coli
Absorbancia 0.296 0.295 0.310
Fuente: Autor
59
TABLA 3 Lectura de absorbancias de la suspensin de E. coli
ABSORBANCIA MEDIO MEDIO

ENDO
m-FC
R1 R2 PROMEDIO R1 R2 PROMEDIO
0.295 14 11 12 14 10 12
0.306 14 13 14 11 10 11
0.308 14 11 12 12 15 14
0.297 15 12 14 14 11 12
0.299 11 13 12 13 12 12
0.303 15 13 14 15 14 14
0.301 12 14 13 11 15 13
0.298 10 14 12 13 15 14
0.300 15 11 13 13 12 12
0.310 13 11 12 13 15 14
13 13
Fuente: Autor
60
a)
b)
FIGURA 8 Recuento de E. coli en medio Endo y m-FC. a) Recuento de E. coli a

una absorbancia de 0.295. b) Recuento de E. coli a una absorbancia de 0.310.
6.5.2. Ensayo preliminar de repetibilidad
En el ensayo de repetibilidad se obtuvieron coeficientes de variacin para las

concentraciones de 20 y 70 bacterias/mL menores al 10%, mientras que para la
concentracin de 5 bacterias/mL estos coeficientes de variacin se encontraron por
61
encima del 10% tanto para coliformes totales como para coliformes fecales,
presentando una mayor dispersin en los recuentos obtenidos, (Tabla 4) (Figura 6).
Esto es debido a que el valor de la concentracin esta cerca al lmite de deteccin del
mtodo, donde existe mayor incertidumbre y probabilidad de error. (Palma, 2008).
Tabla 4 Calculo de la media, desviacin estndar y coeficiente de variacin de

las concentraciones de 5, 20 y 70 bacterias/mL
5 BACTERIAS 20 BACTERIAS 70 BACTERIAS

ENDO m-FC ENDO m-FC ENDO m-FC
R1 8 7 29 27 73 74
R2 6 6 27 28 77 69
R3 7 6 28 26 75 72
R4 7 6 27 26 74 71
R5 6 7 28 27 75 73
R6 8 7 27 25 72 69
R7 6 8 29 28 77 74
R8 7 6 25 24 73 75
R9 6 5 28 27 72 74
R10 7 6 26 25 75 73
MEDIA 6.8 6.4 27.4 26.3 74.3 72.4
DESVIACION 0.79 0.84 1.26 1.34 1.828 2.118
ESTANDAR
COEFICIENTE 11.62% 13.18% 4.59% 5.09% 2.46% 2.92%
DE
VARIACION
Fuente: Autor
62
5 BACTERIAS
20 BACTERIAS
70 BACTERIAS
FIGURA 9 Recuento de los estndares de 5, 20 y 70 bacterias /100 mL de E. coli
6.5.3. Validacin del mtodo de filtracin por membrana
Los 48 resultados obtenidos fueron sometidos a tratamiento estadstico, mediante la

utilizacin del programa estadstico validar 1.1. Tanto para coliformes totales como
para coliformes fecales. Se obtuvieron datos como media, desviacin estndar total
dentro de lotes y entre lotes, las que representan la repetibilidad y reproducibilidad
interna del laboratorio respectivamente y recuperacin alcanzada.
En las tablas 5 y 6 se observan los resultados de los recuentos obtenidos de las

diferentes soluciones analizadas tanto para coliformes totales como para coliformes
63
fecales. En la figura 10 se observa el crecimiento de E. coli en medio Endo y medio
m-FC en las diferentes soluciones preparadas.
TABLA 5 Recuento de coliformes totales en medio Endo.
TABLA DE DATOS COLIFORMES TOTALES
Constantes U C v V LMS
M1 0,00 3200 1 99 80
Solucin LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6
1-BK1 0 0 0 0 0 0
2-BK2 0 0 0 0 0 0
3-E 0.9C 79 69 78 75 73 77
4-E 0.09C 5 9 8 7 4 8
5-M1 0 0 0 0 0 0
6-M2 0 0 0 0 0 0
7-M1+A1 34 31 36 33 35 32
8-M2+A2 60 57 55 52 56 58
Constantes U C v V
M2 0,00 5600 1 99
Fuente: Aplicativo validar 1.1
U: concentracin del agua natural sin adicin M1 y M2
C: Concentracin de la dilucin anterior del estndar M1
V: Volumen de agua natural adicionado en cada frasco
v: Volumen de la concentracin M1 + A1 para ser analizado por el mtodo de

filtracin por membrana
LMS: Lmite mximo de deteccin del mtodo.
64
TABLA 6 Recuento coliformes fecales en medio m-FC.
TABLA DE DATOS COLIFORMES FECALES
Constantes U C v V LMS
M1 0,00 3200 1 99 80
1-BK1 0 0 0 0 0 0
2-BK2 0 0 0 0 0 0
3-E 0.9C 77 70 76 78 74 75
4-E 0.09C 6 9 5 8 7 4
5-M1 0 0 0 0 0 0
6-M2 0 0 0 0 0 0
7-M1+A1 32 33 37 34 36 35
8-M2+A2 57 58 59 55 58 56
Constantes U C v V
M2 0,00 5600 1 99
Fuente: Aplicativo validar 1.1
U: concentracin del agua natural sin adicin M1 y M2
V: Volumen de agua natural adicionado en cada frasco
v: Volumen de la concentracin M1 + A1 para ser analizado por el mtodo de

filtracin por membrana
LMS: Lmite mximo de deteccin del mtodo.
a) b)
65
c) d)
e) f)
66
g)
FIGURA 10 Recuento de E. coli en medio Endo y medio m-FC.

a) Recuento de blancos. b) Recuento del estandar 0.09C. c) Recuento del estandar
0.9C. d) Recuento del estandar 0.4C. e) Recuento del estandar 0.7C. f y g) Recuento
de M1 y M2.
6.5.3.1. Determinacin de la precisin
Se evalu la desviacin estndar total de cada solucin la cual fue comparada con W
(meta a alcanzar). W se tomo como el 5% de la concentracin de la gran media
como 0.25 veces el valor mnimo de inters del mtodo, escogiendo la mayor de las
dos. Para que la desviacin estndar fuera aceptada esta deba de ser menor que
cualquiera de los de niveles de meta a alcanzar.
En los datos obtenidos tanto para coliformes totales como para coliformes fecales, se
evalu si la desviacin estndar total de cada solucin era menor o igual a la meta a
alcanzar. (Tablas 7 y 8), evidencindose que la desviacin estndar de cada solucin
fue aceptada, lo cual indica que el mtodo ha logrado su primer parmetro evaluado,
la precisin, ya que se cumpli con los requisitos de la meta establecida.
67
TABLA 7 Clculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones
estndares para coliformes totales
Valor mnimo de inters para

el parmetro
en
cuestin: 8 BLANCO 0.9 C 0.09 C M1 M1+A1 M2 M2+A2
St = Se , (St = Sd) para el

testigo Sd Se Se Se Se Se Se
0,0000 3,7103 1,9408 0,0000 1,8708 0,0000 2,7325
St2 = Se2 +
Sd2 = Varianza 0,0000 13,7667 3,7667 0,0000 3,5000 0,0000 7,4667
Desviacin
St = estndar 0,0000 3,7103 1,9408 0,0000 1,8708 0,0000 2,7325
Concentracin
(GMC) 0,0000 75,1667 6,8333 0,0000 33,5000 0,0000 56,3333
W (meta a 0.05 X
alcanzar) GMC 0,0000 3,7583 0,3417 0,0000 1,6750 0,0000 2,8167
0.25 X
VMI 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000
W 2,0000 3,7583 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,8167
St < W ? SI SI SI SI SI SI SI
Tabla 8 Clculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estndares

para coliformes fecales
Valor mnimo de nteres para
el parmetro
en

0,0000 2,8284 1,8708 0,0000 1,8708 0,0000 1,4720
St2 = Se2 +
Sd2 0,0000 8,0000 3,5000 0,0000 3,5000 0,0000 2,1667
St
(Desviacion
estndar) 0,0000 2,8284 1,8708 0,0000 1,8708 0,0000 1,4720
Concentracin
(GMC) 0,0000 75,0000 6,5000 0,0000 34,5000 0,0000 57,1667
W (meta a 0.05 X
alcanzar) GMC 0,0000 3,7500 0,3250 0,0000 1,7250 0,0000 2,8583
0.25 X VMI 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000
W 2,0000 3,7500 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,8583
68
6.5.3.2. Determinacin de la exactitud
Para la recuperacin se tomo un nivel de confianza entre el 95 y 105% , con un

margen de error del 5%. La recuperacin fue aceptada si los resultados obtenidos
estaban dentro de esta meta.
En las tablas de la 9-12 se observan varias hiptesis de la recuperacin experimental

contra la recuperacin terica. La primera hiptesis es 1) Observar si la recuperacin
experimental/recuperacin terica es menor o igual a 0.95. Si el resultado es positivo,
se continua con el anlisis. 2) Esta hiptesis consiste en evaluar si la recuperacin
experimental/recuperacin terica es menor o igual a 1.05, si el resultado es s,
entonces se infiere que la recuperacin fue satisfactoria.
En los datos obtenidos se observo que la recuperacin de M1 + A1 y M2 + A2 para

coliformes totales como para coliformes fecales fue satisfactoria (Tablas 9-12), por lo
tanto se cumpli con el segundo parmetro de la validacin, la exactitud.
69
Tabla 9 Recuperacin M1 + A1, coliformes totales
EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA ADICION
ESTANDAR-A1.
S 1,8708
1,5352
t0.95=2.015 con y = 5 tabla t blateral 2,01 2,01

S 1,5352
2.01
6
R/d R= 33,50 d= 32,00 1,047

R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 30,4
SI NO
1,05Xd 33,6
S S
0,95 d - 2,01
105
, d + 201
, 6 .=A
Recuperacin satisfactoria 6 35,14 (ii)
.=B
28,86 (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperacin
satisfactoria
Recuperacin no satisfactoria
Revisar metodologia y tcnica analtica
70
TABLA 10 Recuperacin M1 + A1, coliformes fecales

ESTANDAR-A1.
S 1,8708
1,5352
t0.95=2.015 con y = 5 tabla t bilateral 2,01 2,01

S
2.01
1,5352
6
R/d R= 34,50 d= 32,00 1,078

R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 30,4
SI NO
1,05Xd 33,6
S S
0,95 d - 2,01
105
, d + 201
, 6 .=A
Recuperacin satisfactoria 6 35,14 (ii)
.=B
28,86 (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperacin
satisfactoria
71
TABLA 11 Recuperacin M2 + A2, coliformes totales

ESTANDAR-A2.
S 2,7325
2,2422
t0.95=2.015 con y = 5 tabla t blateral 2,01
R/d R= 56,33 d= 56,00 1,006

R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 53,2
SI NO
1,05Xd
1, 58,8
cuperacin satisfactoria
Recuperacin 61,04 .=A (ii)
50,96 .=B (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperacin
satisfactoria
72
TABLA 12 Recuperacin M2 + A2, coliformes fecales
EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA
ADICION ESTANDAR-A2.
S 1,4720
1,2079
R/d
d R= 57,17 d= 56,00 1,021
R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 53,2
SI NO
1,05Xd 58,8
Recuperacin satisfactoria
ia 60,01 .=A (ii)
51,99 .=B (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperacin
satisfactoria
Revisar metodologia y tcnica
analtica
73
6.5.4. Cartas de control R
La grafica de control R, para coliformes totales arrojo un lmite superior de control de

7.01, un lmite medio de 2.14 , el lmite inferior de control fue cero. (Ver figura 11).
La grafica de control R, para coliformes fecales arrojo un lmite superior de control

de 7.32, un lmite medio de 2.24 y el lmite inferior de control fue de cero. (Ver figura
12).
Con los valores obtenidos en estas cartas de control, se analizo cada uno de los datos
despus de realizada la validacin, comprobndose que el proceso est bajo control
ya que ningn valor encontrado para coliformes totales como para coliformes fecales
estaban fuera de los limites de control superior calculados (ANEXO 8)
Grafico de Control R
LCS = 7.01
DIFERENCIAS
LC (R/) = 2.14
__________ ____ __________
LCI = 0
Ensayo/Tiempo
FIGURA 11 Grafico de control para coliformes
totales
74
Grafico de Control R
LCS = 7.32
DIFERENCIAS
LC (R/) = 2.24
__________ ____ __________
LCI = 0
Ensayo/Tiempo
FIGURA 12 Grafico de control para coliformes fecales
Figura 12.
Finalmente, gracias a los resultados obtenidos donde se evalu la deteccin

simultanea de los microorganismos indicadores de contaminacin presente en
muestras de aguas, se logr demostrar que se cumple con los parmetros evaluados
de precisin y exactitud.
Para que un mtodo sea valido completamente bajo normas nacionales e

internacionales se debern determinar adems de stos indicadores, otros parmetros
estadsticos como la determinacin del lmite de deteccin, el lmite de
cuantificacin, especificidad, sensibilidad y clculo del lmite de incertidumbre. Los
cuales debern ser evaluados por el laboratorio para concluir de manera satisfactoria
con los requerimientos y necesidades del proceso de validacin.
Con la realizacin de ste trabajo de grado se dio inicio al proceso de validacin, en

donde se determin la precisin y exactitud del mtodo segn los resultados
obtenidos, pero se deber de complementar con otros indicadores estadsticos, cuya
determinacin obedecer a las necesidades del laboratorio.
75
7. CONCLUSIONES
La validacin del mtodo de filtracin por membrana para el anlisis de

coliformes totales y E. coli en muestras de agua para consumo humano, permiti
obtener resultados reproducibles y confiables.
Se determin la precisin del mtodo mediante la aceptabilidad de las

desviaciones estndares de cada solucin analizada cumplindose con el requisito de
la meta a alcanzada.
Se determino la exactitud del mtodo, en donde la recuperacin de las

muestras adicionadas fue satisfactoria.
Se estandarizo la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland, a una turbiedad entre

0.295 y 0.310 absorbancia, medido en espectrofotmetro a 620 nm.
Se verifico que los medios de cultivo utilizados para el anlisis de coliformes

totales y E. coli, son altamente selectivos y eficaces ya que permitieron solo el
crecimiento del microorganismo de inters y completamente estriles ya que no se
evidencio crecimiento de ningn tipo de microorganismo.
Se manejaron condiciones adecuadas de limpieza y desinfeccin, ya que se

evidencio baja carga de microorganismos presentes en el ambiente.
El mantenimiento y calibracin de los equipos garantizaron que las

mediciones realizadas arrojaran resultados confiables.
El adecuado manejo del cepario (cepas completamente puras y viables),

facilito que no se encontraran microorganismos contaminantes que interfirieran en el
proceso de validacin.
76
8. RECOMENDACIONES
Se deber tener un Contrato de Mantenimiento permanente para calibracin

de equipos, con el fin de asegurar que se estn utilizando equipos completamente
calibrados.
Adems de realizar validacin secundaria, se deber complementar con otras

pruebas, como el clculo de la incertidumbre, permitiendo de esta manera obtener una
mayor confiabilidad en los resultados emitidos.
Este mtodo se debe comparar con otro alterno que permita asegurar la
veracidad de los resultados.
Una vez determinados estos dos parmetros de la validacin (Precisin y

exactitud), se deber complementar con la determinacin del Lmite de deteccin
para asegurar resultados plenamente confiables que satisfagan las necesidades del
cliente.
77
9. BIBLIOGRAFA
APHA- AWWA-WPCF, 2005. Standard methods for analysis of waters and

wastewaters. Edicin 21. Editorial Diaz de Santos. Madrid, Espaa. 1150 pginas.
Castillo, B. Gonzales, R. 1996. Protocolo de validacin de mtodos analticos para la

cuantificacin de frmacos. Revista cubana de Farmacia. Enero abril, Volumen 30.
No 1.
Cortes, Alejandra. 2002. Validacin de la prueba de esterilidad para vacunas virales

preparadas en vehculos oleoso y acuoso. Carrera Microbiologa. Facultad Ciencias.
Bsicas. Departamento Microbiologa. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de
Pregrado. Bogot D.C. 93 pginas.
Cortes, Natalia. Mndez, Y. Junio, 2006. Validacin de las pruebas de esterilidad por
la tcnica de filtracin por membrana y endotoxinas bacterianas por el mtodo de
LAL en 3 productos farmacuticos. Carrera Microbiologa. Facultad Ciencias.
Pregrado. Bogot D.C.
Galeano, Norma. 2007. Validacin de la retencin microbiana en los filtros de acetato

y nitrato de celulosa empleados en la tcnica de filtracin por membrana para la
prueba de esterilidad. Carrera Microbiologa. Facultad Ciencias. Bsicas.
Departamento Microbiologa. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado.
Bogot D.C.182 paginas.
GTC GUA TECNICA COLOMBIANA 84. 2003. Calidad del agua. Gua para la
orientacin acerca de la validacin de mtodos de anlisis microbiolgicos. Editado
ICONTEC, Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Cientficas.
ISO 9000:2000. Sistemas de gestin de calidad.
78
MILLIPORE, 2005. Anlisis microbiolgico. Madrid, Espaa. 48 paginas.
NTC ISO /IEC 17025: 2005. Requisitos generales de competencia de laboratorios de

ensayo y calibracin.
NTC 3529-2 Exactitud (veracidad y precisin) de mtodos de medicin y resultados.

Parte 2: Mtodo bsico para la determinacin de repetibilidad y reproducibilidad de
un mtodo normalizado de medicin.
Ordoez, J. 2000. Microorganismos de los alimentos. Volumen 1, segunda edicin.

Editorial Acribia S.A, Zaragoza, Espaa.
Otlora Andrs. Ortiz, J. Pearanda, S. Palma, R. Puentes, W. Murillo, C. Peralta, A.

Tovar, G. Junio, 2005. Sptimo curso taller VALIDACIN DE MTODOS
ANALTICOS. Laboratorio Salud Ambiental. Programa de vigilancia de la calidad
del agua potable, metales y no metales de inters en Salud Publica. Bogot, D.C.
Padilla, Jos Esteban. 2007. Validacin secundaria del mtodo de recuento en placa
en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en muestras de alimentos en
un laboratorio de referencia. Carrera Microbiologa. Facultad Ciencias. Bsicas.
Bogot D.C. 109 paginas.
Palma Ruth Marien. Ortiz, J. Garnica, E. Lpez, L. Pearanda, S. Raad, J. 1999.

Anlisis de agua para consumo humano. Instituto Nacional de Salud. Santa Fe de
Bogot, D.C.
Sartorius. 2003. Microbiological testing of foods, beverages and Pharmaceuticals.

SARTORIUS, Publication No SM-4017-e97116. Goettingen, Germany, 19 paginas.
THE UNITED STATES PHARMACOPOEIA. USP 29. 2006. Pruebas

microbiolgicas. Prueba de esterilidad 71. Pginas 2728 2733.
USP, 2003. The United States Pharmacopoeia XXVI. The National Formulary 21
(NF21), United States Pharmacopoeial convention, Rockville, MD.
79
9.1. RECURSOS ELECTRONICOS
Garcia, E. 2001. Optimizacin, validacin y modelizacin de un proceso de

fabricacin de comprimidos. Desarrollo de una aplicacin interactiva multimedia.
Doctorado en farmacia. Universitat de Barcelona. Facultat de farmacia. Barcelona,
Espaa, 166 paginas, [EN LINEA] http://www.tdx.cesca.es/TESIS
UB/AVAILABLE/TDX-0618102-102213//TOL82A.pdf. Consulta 12 de febrero de
2008. Hora 10 am.
Who Expert committee on Specifications for Pharmaceutical Preparation. Reporte 32

Ginebra, Suiza. World Healt Organization 1992. (WHO Technical Reports Series
No. 823). [En linea]. <http//whglibdoc.who.int/trs/WHO TRS 823.pdf>. consulta 17
de febrero de 2008. Hora 3:30 pm.
80
10. ANEXOS
Anexo 1. Certificado de las cepas ATCC
81
82
Anexo 2. Certificados de medios de cultivo
83
84
Anexo 3. Certificados de mantenimiento y calibracin de equipos
Destilador de agua
85
Equipo filtracin por membrana
86
Analizador qumico RA-50
87
Bao mara
88
89
Incubadora
90
91
Micropipeta 100-1000 UL
92
93
94
Anexo 4. Registro del uso de los equipos
95
96
ACTIVIDAD DIARIA: Cada vez que se use:
1. Limpiar exterior bomba de vaco

2. Lavar Manifold
3. Revisin funcionamiento llave de paso
4. Esterilizar portafiltros (alcohol y mechero)
ACTIVIDAD SEMANAL: Esterilizar en autoclave portafiltros y equipo
ACTIVIDAD ANUAL: Revisin tcnica de la Bomba de vaco
Noviembre 2008
Da: Mes: Ao:
Bomba de vaco / Manifold Esteriliza

Limpieza exterior Revisin cin
Fecha de la bomba Lavado llave de portafiltro Firma
paso sy
equipo
4 X X 1 JHISEL
PAEZ
5 X X 1 JHISEL
PAEZ
6 X X 1 JHISEL
PAEZ
7 X X 1 JHISEL
PAEZ
10 X X 1 JHISEL
PAEZ
97
11 X X 1 JHISEL
PAEZ
12 X X 1 JHISEL
PAEZ
13 X X 1 JHISEL
PAEZ
14 X X 1 JHISEL
PAEZ
18 X X 1 JHISEL
PAEZ
19 X X 1 JHISEL
PAEZ
20 X X 1 JHISEL
PAEZ
21 X X 1 JHISEL
PAEZ
24 X X 1 JHISEL
PAEZ
28 X X 1 JHISEL
PAEZ
1. C = CONFORME
2. NC = NO CONFORME
98
Anexo 4. Calculo de la Gran Media
Coliformes Totales Media

SOL. No LOTE 1 LOTE 2 LOTE 3 LOTE 4 LOTE 5 LOTE 6 X ( GMC )
1-BK1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

2-BK2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
3-E 0.9C 79,000 69,000 78,000 75,000 73,000 77,000 75,167
4-E 0.09C 5,000 9,000 8,000 7,000 4,000 8,000 6,833
5-M1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

6-M2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
7-M1+A1 34,000 31,000 36,000 33,000 35,000 32,000 33,500
8-M2+A2 60,000 57,000 55,000 52,000 56,000 58,000 56,333
COLIFORMES FECALES Media

SOL. No LOTE 1 LOTE 2 LOTE 3 LOTE 4 LOTE 5 LOTE 6 X ( GMC )
1-BK1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2-BK2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
3-E 0.9C 77,000 70,000 76,000 78,000 74,000 75,000 75,000
4-E 0.09C 6,000 9,000 5,000 8,000 7,000 4,000 6,500
5-M1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
6-M2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
7-M1+A1 32,000 33,000 37,000 34,000 36,000 35,000 34,500
8-M2+A2 57,000 58,000 59,000 55,000 58,000 56,000 57,167
99
Anexo 5. Calculo de factor unico
a) Clculo factor nico coliformes totales

SOLUCION
TESTIGO COLIFORMES TOTALES Suma de
filas
LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 ; x
Prueba 1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
Prueba 2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
Suma de 0,000
columnas
L 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2
; L 0,000
; x2 0,000
m = nmero de
lotes. n 2 ; L2/n 0,000
n =
rplicas. m 6 ; ; L)2/mxn 0,000
Fuente: aplicativo validar 1.1
b) Clculo factor nico coliformes fecales.

SOLUCION
TESTIGO COLIFORMES FECALES Suma de
filas
Prueba 1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
Prueba 2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
Suma de 0,000
columnas
L 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2
; L 0,000
; x2 0,000
m = nmero de
lotes. n 2 ; L2/n 0,000
n =
rplicas. m 6 ; ; L)2/mxn 0,000
Fuente: aplicativo validar 1.1
100
c) Clculo factor nico estndar 0.9C, coliformes totales
SOLUCION
ESTANDAR
0,9C C. TOTALES Suma de
filas
Prueba 1 79,000 69,000 78,000 75,000 73,000 77,000 451,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 451,000
columnas
L 79,000 69,000 78,000 75,000 73,000 77,000 451,000
; L2 33969,000
; x2 33969,000
m = nmero de lotes. n 1 ; L2/n 33969,000
n =
rplicas. m 6 ; ; L)2/mxn 33900,167
d) Calculo factor nico estndar 0.9C, coliformes fecales

SOLUCION C.
ESTANDA FECALE
R 0,9C S Suma de
filas
LOTE
LOTE1 LOTE2 LOTE3 4 LOTE5 LOTE6 ; x
Prueba 1 77,000 70,000 76,000 78,000 74,000 75,000 450,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 450,000
Columna
s
L 77,000 70,000 76,000 78,000 74,000 75,000 450,000
33790,00
; L2 0
33790,00
; x2 0
33790,00
m = nmero de lotes. n 1 ; L2/n 0
n = ; ; L)2/mx 33750,00
rplicas. m 6 n 0
101
e) Calculo factor nico estndar 0.09C, coliformes totales
SOLUCION
ESTANDAR C. Suma
0,09C TOTALES de
filas
Prueba 1 5,000 9,000 8,000 7,000 4,000 8,000 41,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 41,000
Columnas
L 5,000 9,000 8,000 7,000 4,000 8,000 41,000
2
; L 299,000
; x2 299,000
2
m = nmero de lotes. n 1 ; L /n 299,000
n =
rplicas. m 6 ; ; L)2/mxn 280,167
f) Calculo factor nico estndar 0.09C, coliformes fecales

SOLUCION
ESTANDAR C.
0,09C FECALES Suma de
filas
Prueba 1 6,000 9,000 5,000 8,000 7,000 4,000 39,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 39,000
Columnas
L 6,000 9,000 5,000 8,000 7,000 4,000 39,000
2
; L 271,000
; x2 271,000
2
n = ; ; L)2/mx
rplicas. m 6 n 253,500
102
g) Calculo factor nico estndar 0.4C, coliformes totales
MUESTRA
NATURAL
ADICIONAD C.
A M1+A1 TOTALES Suma de
Filas
Prueba 1 34,000 31,000 36,000 33,000 35,000 32,000 201,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 201,000
Columnas
L 34,000 31,000 36,000 33,000 35,000 32,000 201,000
; L2 6751,000
; x2 6751,000

n =
rplicas. m 6 ; ; L)2/mxn 6733,500
103
h) Calculo factor nico estndar 0.4C, coliformes fecales
MUESTRA
NATURAL C.
ADICIONAD FECALE
A M1+A1 S Suma de
Filas
LOTE LOTE
LOTE1 LOTE2 LOTE3 4 5 LOTE6 ; x
Prueba 1 32,000 33,000 37,000 34,000 36,000 35,000 207,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 207,000
Columna
s
L 32,000 33,000 37,000 34,000 36,000 35,000 207,000
; L2 7159,000
2
; x 7159,000
2
2
n = ; ; L)/mx
rplicas. m 6 n 7141,500
104
i) Calculo factor nico estndar 0.7C, coliformes totales
MUESTRA
NATURAL
ADICIONADA C.
M2+A2 TOTALES Suma de
Filas
LOTE
LOTE1 LOTE2 3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 ; x
Prueba 1 60,000 57,000 55,000 52,000 56,000 58,000 338,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 338,000
Columnas
L 60,000 57,000 55,000 52,000 56,000 58,000 338,000
; L2 19078,000
; x2 19078,000

n =
rplicas. m 6 ; ; L)2/mxn 19040,667
105
j) Calculo factor nico estndar 0.7C, coliformes fecales
MUESTRA
NATURAL C.
ADICIONADA FECALE
M2+A2 S Suma de
Filas
Prueba 1 57,000 58,000 59,000 55,000 58,000 56,000 343,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 343,000
Columnas
L 57,000 58,000 59,000 55,000 58,000 56,000 343,000
; L2 19619,000
; x2 19619,000
m = nmero de lotes. N 1 ; L2/n 19619,000

n =
rplicas. M 6 ; ; L)2/mxn 19608,167
106
Anexo 6.
Anlisis de varianza entre y dentro de lotes
Anlisis de varianza para coliformes totales
ANALISIS DE VARIANZA
FUENTE DE VARIABILIDAD
Suma de
los Cuadrado
Cuadrados Grados de Libertad s Medios
Dentro Dentro
del Entre del Entre Dentro del
SOLUCION Entre lotes lote TOTAL lotes lote Total lotes lote
SQ1 SQ0 SQt N1 No Nt M1 Mo
TESTIGO 1Y2 0,0000 0,0000 0,0000 5 6 11 0,0000 0,0000000
3-E 0.9C 3 68,8333 0,0000 68,8333 5 0 5 13,7667 -
4-E 0.09C 4 18,8333 0,0000 18,8333 5 0 5 3,7667 #DIV/0!
5-M1 5 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 5 0,0000 -

6-M2 6 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 5 0,0000 #DIV/0!
7-M1+A1 7 17,5000 0,0000 17,5000 5 0 5 3,5000 -
8-M2+A2 8 37,3333 0,0000 37,3333 5 0 5 7,4667 #DIV/0!
107
Anlisis de varianza coliformes fecales
ANALISIS DE VARIANZA
FUENTE DE VARIABILIDAD
Suma de Cuadrados
los Cuadrados Grados de Libertad Medios
Dentro Entre Dentro Dentro del
SOLUCION Entre lotesdel lote TOTALlotes del lote Total Entre lotes lote
SQ1 SQ0 SQt N1 No Nt M1 Mo
TE
STIGO 1Y2 0,0000 0,0000 0,0000 5 6 11 0,0000 0,0000000
3-
E 0.9C 3 40,0000 0,0000 40,0000 5 0 5 8,0000 -
4-
E 0.09C 4 17,5000 0,0000 17,5000 5 0 5 3,5000 #DIV/0!
5-
M1 5 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 5 0,0000 -
6-
M2 6 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 5 0,0000 #DIV/0!
7-
M1+A1 7 17,5000 0,0000 17,5000 5 0 5 3,5000 -
8-
M2+A2 8 10,8333 0,0000 10,8333 5 0 5 2,1667 #DIV/0!
108
Anexo 7.
Calculo de las desviaciones estndares
Calculo desviaciones estndares coliformes totales
CALCULO DE LAS DESVIACIONES ESTANDARES.
BLANCO 0.9C 0.09C M1 M1+A1 M2 M2+A2
M0 0,0000000 - #DIV/0! - #DIV/0! - #DIV/0!
M1 0,00000 13,76667 3,76667 0,00000 3,50000 0,00000 7,46667
Sd 0,00000 - #DIV/0! - #DIV/0! - #DIV/0!
Se 0,00000 3,71035 1,94079 0,00000 1,87083 0,00000 2,73252
GMC 0,000 75,167 6,833 0,000 33,500 0,000 56,333
Calculo desviaciones estndares coliformes fecales
CALCULO DE LAS DESVIACIONES ESTANDARES.
BLANCO 0.9C 0.09C M1 M1+A1 M2 M2+A2
M0 0,0000000 - #DIV/0! - #DIV/0! - #DIV/0!
M1 0,00000 8,00000 3,50000 0,00000 3,50000 0,00000 2,16667
Sd 0,00000 - #DIV/0! - #DIV/0! - #DIV/0!
Se 0,00000 2,82843 1,87083 0,00000 1,87083 0,00000 1,47196
GMC 0,000 75,000 6,500 0,000 34,500 0,000 57,167
109
Anexo 8.
Datos para elaborar los grficos de control
Datos para realizar la carta control de coliformes totales

LECTURA LECTURA DIFERENCIA
ENSAYO CONCENTRACIN X1 X2 PROMEDIO X1 X2
1 BK 0 0 0 0
2 0.09C 6 4 5 2
3 0.9C 77 81 79 4
4 M1 0 0 0 0
5 M1 + A1 31 37 34 6
6 M2 0 0 0 0
7 M2 + A2 62 58 60 4
8 BK 0 0 0 0
9 0.09C 7 11 9 4
10 0.9C 70 68 69 2
11 M1 0 0 0 0
12 M1 + A1 33 29 31 4
13 M2 0 0 0 0
14 M2 + A2 54 60 57 6
15 BK 0 0 0 0
16 0.09C 7 9 8 2
17 0.9C 76 80 78 4
18 M1 0 0 0 0
19 M1 + A1 35 37 36 2
20 M2 0 0 0 0
21 M2 + A2 58 52 55 6
22 BK 0 0 0 0
23 0.09C 8 6 7 2
24 0.9C 74 76 75 2
25 M1 0 0 0 0
26 M1 + A1 31 35 33 4
27 M2 0 0 0 0
28 M2 + A2 50 54 52 4
29 BK 0 0 0 0
30 0.09C 4 4 4 0
31 0.9C 71 75 73 4
32 M1 0 0 0 0
33 M1 + A1 32 38 35 6
34 M2 0 0 0 0
35 M2 + A2 54 58 56 4
36 BK 0 0 0 0
37 0.09C 10 6 8 4
38 0.9C 75 79 77 4
39 M1 0 0 0 0
40 M1 + A1 29 35 32 6
110
41 M2 0 0 0 0
42 M2 + A2 56 60 58 4
Datos carta control para coliformes fecales
LECTURA LECTURA DIFERENCIA

ENSAYO CONCENTRACIN X1 X2 PROMEDIO X1 X2
1 BK 0 0 0 0
2 0.09C 7 5 6 2
3 0.9C 79 75 77 4
4 M1 0 0 0 0
5 M1 + A1 34 30 32 4
6 M2 0 0 0 0
7 M2 + A2 56 58 57 2
8 BK 0 0 0 0
9 0.09C 11 7 9 4
10 0.9C 68 72 70 4
11 M1 0 0 0 0
12 M1 + A1 31 35 33 4
13 M2 0 0 0 0
14 M2 + A2 55 61 58 6
15 BK 0 0 0 0
16 0.09C 6 4 5 2
17 0.9C 73 79 76 6
18 M1 0 0 0 0
19 M1 + A1 34 40 37 6
20 M2 0 0 0 0
21 M2 + A2 58 60 59 2
22 BK 0 0 0 0
23 0.09C 6 10 8 4
24 0.9C 76 80 78 4
25 M1 0 0 0 0
26 M1 + A1 33 35 34 2
27 M2 0 0 0 0
28 M2 + A2 58 52 55 6
29 BK 0 0 0 0
30 0.09C 5 9 7 4
31 0.9C 71 77 74 6
32 M1 0 0 0 0
111
33 M1 + A1 32 33 39 6
34 M2 0 0 0 0
35 M2 + A2 60 56 58 4
36 BK 0 0 0 0
37 0.09C 5 3 4 2
38 0.9C 74 76 75 2
39 M1 0 0 0 0
40 M1 + A1 37 33 35 4
41 M2 0 0 0 0
42 M2 + A2 54 58 56 4
112
Anexo 9
INFORME DE VALIDACIN
113
Neiva, Noviembre de 2008
114
OBJETIVO
Realizar la validacin secundaria del mtodo de filtracin por membrana para la

deteccin de Coliformes Totales y Escherichia coli en aguas para consumo humano
analizadas en el Laboratorio de Salud Publica del Huila.
INTRODUCCIN
El recurso hdrico para consumo humano debe ser entregado a las comunidades, con
excelente calidad, la cual debe ser iniciada desde la misma generacin, proteccin de
fuentes y recorridos hasta las plantas de tratamiento y posteriormente hasta el servicio
domiciliario.
Las enfermedades bacterianas, parasitarias, virales y qumicas que tienen origen en la
transmisin de estos agentes por el agua adquieren una especial connotacin sanitaria
cuando las poblaciones ribereas con inadecuado suministro del agua potable o
aquellas comunidades que a travs de muchos aos han carecido del recurso hdrico
necesario para la vida del hombre, deben ser controlados por el estado.
En este sentido, los laboratorios de salud pblica tienen la obligacin de proteger las
comunidades bajo su cuidado territorial y por ello deben implementar la tecnologa y
la metodologa que les permita realizar el control de calidad del agua que consumen
los ciudadanos.
Cada laboratorio debe utilizar mtodos y procedimientos apropiados para todas las
calibraciones y ensayos considerados en su alcance. Los laboratorios deben de
realizar controles internos los cuales garantizan que van generar resultados altamente
confiables, mediante el seguimiento de procedimientos altamente calificados
115
Estos programas de control interno incluyen evaluacin continua de los principales
materiales y objetos que se utilizan en los diferentes anlisis, tales como, control de
los medios de cultivo a utilizar, personal, equipos, estandarizacin y documentacin
de los procesos, con el fin de garantizar un buen desarrollo del procedimiento y
asegurar que este se est efectuando en forma correcta cada vez que se ejecute, lo
cual se lograra con la realizacin de la validacin de los mtodos utilizados por el
laboratorio para sus respectivos anlisis.
MTODOS
Para la validacin del mtodo de filtracin por membrana, se analiz

simultneamente la deteccin de coliformes totales y fecales en medio Endo y m-FC.
El medio Endo se utiliza para la identificacin de coliformes totales a 37C durante
24 horas, usando filtros de celulosa con un tamao de poro de 0.45 micras. Al pasar
la muestra de agua a travs de este filtro mediante la aplicacin de vaco las bacterias
las cuales son de mayor tamao quedan retenidas en este. Los coliformes totales que
fermentan la lactosa crecen en este medio formando colonias rojas, brillantes y
convexas, en este medio E. coli crece con brillo verde metlico. El medio m-FC se
utiliza para la determinacin de Escherichia coli y coliformes fecales, a temperatura
de incubacin de 44.5C. Estos microorganismos crecen formando colonias de color
azul intenso brillantes y convexas.
Procedimiento del mtodo de filtracin por membrana
Esterilizar el equipo de filtracin por membrana de acuerdo a las especificaciones

del fabricante
Colocar el portafiltros estril sobre la base del manifold

Colocar el embudo estril sobre el receptculo y fijarlo con las pinzas que trae el
equipo
116
Llenar el embudo con 80 a 100 ml de agua destilada estril
Dejar filtrar aplicando vaco
Cerrar las llaves del manifold y adicionar 20 30 mL de alcohol al 70%
Pasar el mechero por cada filtro para encender el alcohol, dejar el alcohol
encendido durante 3 minutos
Abrir las llaves del manifold y dejar filtrar
Adicionar nuevamente 100 ml de agua destilada estril y dejar filtrar
Cerrar las llaves del manifold y retirar el embudo
Con pinzas estriles colocar un filtro de celulosa en cada portafiltros, con la
cuadricula hacia arriba, sobre la parte porosa del receptculo
Colocar el embudo y adicionar la muestra a analizar

Para aguas tratadas filtrar 100 ml de la muestra a analizar y para aguas turbias
realizar dilucin 1/10 y filtrar
Cuando finalice el filtrado de cada una de las muestras cerrar las llaves del
manifold, retirar el embudo, tomar el filtro con pinzas estriles y colocarlo sobre
la superficie del medio Endo y m-FC
Incubar las cajas a la temperatura adecuada, el medio Endo a 37C +/- 2C y el
medio m-FC: 44.5C en bao mara
Realizar el recuento de las colonias caractersticas:
Medio Endo: colonias rojas
Medio m-FC: colonias azules
MATERIALES Y METODOS
Filtros de membrana (poro de 0.45um)
Pinzas
Micro pipeta automtica 100-1000 UL
117
Puntas azules estriles
Equipos
Incubadora a 35C +/- 2C
Bao de mara a 44.5C
Espectrofotmetro RA-50
Vortex
Equipo de filtracin por membrana
Medios de cultivo
Cajas de petri plsticas con medio Endo listo para su uso
Cajas de petri plsticas con medio m-FC listo para su uso
Agar plate Count
Agar OGY
Agar Mc Conkey
Agar Sangre
Cepas microbianas
Cepa de Escherichia coli con nmero de referencia ATCC 25922
Cepa de Staphylococcus aureus con nmero de referencia ATCC 25923
118
Material de vidrio
Tubos tapa rosca
Frascos grandes mbar con alcohol al 70%
Frascos grandes mbar con agua destilada estril
Frascos Schott de 250 ml
Reactivos
Cloruro de bario
Acido sulfrico
Preparacin de suspensiones bacterianas:
Se utilizo agua destilada estril para preparar las suspensiones de Escherichia coli y
Staphylococcus aureus, utilizadas en la validacin para efectuar las diluciones
correspondientes y obtener la concentracin bacteriana requerida.
Volumen de muestra:
Se utilizaron 100 mL de agua por cada suspensin de las bacterias utilizadas en

concentracin conocida.
Volumen de trabajo diario:
Se utilizaron aproximadamente 3500 mL de agua destilada estril, con las cuales se

realizaron diluciones y suspensiones.
Fuente:
Se utiliz agua de dos marcas de agua diferente, para ser analizadas por el mtodo de
filtracin por membrana.
119
Control de calidad:
Control de ambientes: Se realizo por el mtodo de sedimentacin durante 15

minutos, utilizando agar Plate Count para bacterias mesfilas aerobias y agar OGY
para hongos y levaduras. Las cajas con agar Plate count se incubaron a 37C durante
48 horas y las cajas con agar OGY se dejaron a temperatura ambiente durante 5 das.
Esterilidad de los medios de cultivo: Se escogi el 10% de los medios de cultivo

utilizados siendo estos preparados en el laboratorio y listos para el uso, incubndose a
las respectivas temperaturas (m-FC a 44.5C, OGY a temperatura ambiente, los
dems a 37C), verificando crecimiento.
Selectividad y eficacia de los medios de cultivo: Se realizaron suspensiones de

Escherichia coli y Staphylococcus aureus en 10 ml de agua destilada estril, cada
suspensin se analizo por el mtodo de filtracin por membrana incubando en medio
Endo y m-FC cada suspensin, verificando que solo hubiera crecimiento de
Escherichia coli.
Control de equipos: Se reviso el historial de mantenimiento y calibracin de los

equipos utilizados en la validacin.
Cepas utilizadas: Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC

25923 obtenidas del cepario con que cuenta el Laboratorio de Salud Publica. A estas
cepas se les realizaron pruebas bioqumicas que incluyeron, oxidasa, coagulasa y
catalasa para Staphylococcus aureus y se monto API 20E para la identificacin de
Escherichia coli, para verificar la pureza y viabilidad de las mismas.
120
VALIDACIN
Antes de llevar a cabo el proceso de validacin se realizo la estandarizacin del tubo

0.5 del patrn de Mcfarland y ensayos preliminares de repetibilidad, con el fin de
obtener un dominio del mtodo. Para los ensayos preliminares y la validacin se
utilizo la cepa de Escherichia coli, la cual se mantena en fase exponencial realizando
repiques diarios en agar Mc Conkey. De las colonias obtenidas se realizaron
suspensiones en tubos que contenan 10 ml de agua destilada estril, equivalente a la
turbiedad del tubo 0.5 de Mcfarland correspondiente a 0.296 absorbencias, ledo en
un espectrofotmetro a una longitud de onda de 620 nm, obtenindose 130 millones
de bacterias/ml.
La cantidad de soluciones analizadas que conformaron el diseo experimental fue de

48 , distribuidas en seis (6) lotes, de ocho (8) soluciones cada una, analizando las
siguientes soluciones en cada lote: 2 blancos, dos muestras naturales, dos muestras
ms adicin de 0.4C y 0.7C y dos soluciones estndares. El estudio se proces
durante seis das, en donde cada lote era un da.
A partir de la suspensin preparada de Escherichia coli se realizaron diluciones en

base 100 y 10 en frascos Schott que contenan 99 y 90 ml de agua destilada estril,
necesarias para preparar los estndares 0.09C (7 bacterias/ml) , 0.9C(72
bacterias/mL), 0.4C (32 bacterias/mL) y 0.7C(56 bacterias/ml).
Para la preparacin de estas soluciones se utilizo el siguiente procedimiento:
El lmite superior de deteccin ( C ) para el mtodo de filtracin por membrana es de

80 UFC/100mL, teniendo estndares de 0.09C (7 bacterias/mL) , 0.9C(72
bacterias/mL), 0.4C (32 bacterias/mL) y 0.7C(56 bacterias/mL).
A partir de la suspensin de 130 millones de bacterias en 40 mL de agua destilada

estril, para obtener el estndar de 72 bacterias/mL y 7 bacterias/mL, se utilizo la
frmula V1 X C1 = V2 X C2 en donde:
121
V1= 10 ml
C1= 130.000.000 bacterias/ml
V2= ?
C2= 72.000.000 bacterias/ml
Despejando la formula se obtuvo un resultado en volumen que se denomin volumen

final.
V2 = 10 mL X 130.000.000 bac/mL = 18.1 mL

72.000.000 bac/ml
El volumen final para la concentracin de 72 millones bacterias/ml fue de 18.1 ml,

como ya se tenan 10 ml del volumen inicial, al volumen final se le restaron estos 10
ml iniciales adicionando la diferencia en agua destilada estril, para completar el
volumen final de 18.1 ml
Se agrego a un frasco Schott estril 8.1 ml de agua destilada estril y 10 ml de la

suspensin de E. coli, para obtener las 72 millones de bacterias/ml. A partir de esta
suspensin se realizaron diluciones en escala 100 hasta obtener 72 bacterias/ml y una
dilucin en base 10 a partir de la concentracin de 72 bacterias/ml para obtener una
concentracin de 7 bacterias/mL aproximadamente. De la concentracin de 72 y 7
bacterias/mL se tomaron 4 mL de cada una adicionando un mililitro de cada una a
frascos que contenan 99 mL de agua destilada estril para completar un volumen
final de 100 y ser analizado por el equipo de filtracin por membrana,. Se sembraron
dos replicas en medio endo y dos replicas en medio m-FC incubando a las
temperaturas adecuadas
Se realizo anlisis estadstico de los resultados obtenidos mediante un programa

elaborado en Excel (Aplicativo Validar 1.1). La precisin del mtodo fue evaluada
con la aceptabilidad de las desviaciones estndares de cada solucin, las cuales
deban de estar en el rango de la meta a alcanzar (W), correspondiente al 5% de la
122
concentracin de la gran media a 0.25 veces el valor mnimo de inters que en este
caso fue 8.
La exactitud se evalu mediante la recuperacin de una concentracin conocida de

E. coli a las dos muestras naturales (0.4C y 0.7C), comprobndose que el promedio
de la recuperacin no difiere significativamente del 95 al 105% de la recuperacin
esperada.
RESULTADOS
Los resultados de la validacin se muestran en las tablas siguientes tablas:
Tabla 1. Recuento de coliformes totales en medio Endo.
Tabla 2. Recuento coliformes fecales en medio m-FC.
Tabla 3. Clculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estndares para

coliformes totales
coliformes fecales
Tabla 5. Recuperacin M1 + A1, coliformes totales
Tabla 6. Recuperacin M1 + A1, coliformes fecales
DISCUSION
Los 48 resultados obtenidos se sometieron a tratamiento estadstico, mediante la

utilizacin del programa estadstico validar 1.1(Figura 1). Tanto para coliformes
totales como para coliformes fecales, se obtuvo media, desviacin estndar total
123
dentro de lotes y entre lotes, las que representan la repetibilidad y reproducibilidad
interna del laboratorio respectivamente y recuperacin alcanzada. (Tablas 1-8).
Se observo que los blancos fueron los nicos que presentaron reproducibilidad y
repetibilidad, reproducibilidad porque est en funcin de seis lotes y repetibilidad
porque fue el nico que se analizo por duplicado. En las dems soluciones solamente
existe reproducibilidad.
Se evalu la desviacin estndar total tanto para coliformes totales como para
coliformes fecales, en donde la desviacin estndar se compar con W (meta a
alcanzar). W se tomo como el 5% de la concentracin de la gran media como 0.25
veces el valor mnimo de inters del mtodo. Para que la desviacin estndar fuera
aceptada esta deba de ser menor que W. En los datos obtenidos tanto para coliformes
totales como para coliformes fecales, se observo que estas desviaciones fueron
aceptadas (Tablas 3-4), por lo cual se infiere que el mtodo cumple con el primer
parmetro evaluado la precisin.
Para la recuperacin satisfactoria se tomo un nivel de confianza entre el 95 y 105% ,

con un margen de error del 5%. La recuperacin satisfactoria se aceptada si los
resultados obtenidos estaban dentro de esta meta. En los datos obtenidos se observo
que la recuperacin de M1 + A1 y M2 + A2 para coliformes totales como para
coliformes fecales fue satisfactoria (Tablas 5-8), por lo tanto se cumpli con el
segundo parmetro de la validacin, la exactitud.
Finalmente, los anlisis realizados demostraron que se cumpli con los parmetros
evaluados de precisin y exactitud, gracias a los resultados obtenidos evaluando la
deteccin simultanea de los microorganismos indicadores de contaminacin presentes
en muestras de aguas.
124
CONCLUSIONES
La validacin del mtodo de filtracin por membrana para el anlisis de

coliformes totales y E. coli en muestras de agua para consumo humano, permiti
obtener resultados reproducibles y confiables.
Se determin la precisin del mtodo mediante la aceptabilidad de las

desviaciones estndares de cada solucin analizada cumplindose con el requisito de
la meta a alcanzada.
Se determino la exactitud del mtodo, en donde la recuperacin de las

muestras adicionadas fue satisfactoria.
Se estandarizo la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland, a una turbiedad entre

0.295 y 0.310 absorbancia, medido en espectrofotmetro a 620 nm.
Se verifico que los medios de cultivo utilizados para el anlisis de coliformes

totales y E. coli, son altamente selectivos y eficaces ya que permitieron solo el
crecimiento del microorganismo de inters y completamente estriles ya que no se
evidencio crecimiento de ningn tipo de microorganismo.
Se manejaron condiciones adecuadas de limpieza y desinfeccin, ya que se

evidencio baja carga de microorganismos presentes en el ambiente.
El mantenimiento y calibracin de los equipos garantizaron que las

mediciones realizadas arrojaran resultados confiables.
El adecuado manejo del cepario (cepas completamente puras y viables),

facilito que no se encontraran microorganismos contaminantes que interfirieran en el
proceso de validacin.
125
RECOMENDACIONES
Se deber tener un Contrato de Mantenimiento permanente para calibracin

de equipos, con el fin de asegurar que se estn utilizando equipos completamente
calibrados.
Adems de realizar validacin secundaria, se deber complementar con otras

pruebas, como el clculo de la incertidumbre, permitiendo de esta manera obtener una
mayor confiabilidad en los resultados emitidos.
Este mtodo se debe comparar con otro alterno que permita asegurar la
veracidad de los resultados.
Una vez determinados estos dos parmetros de la validacin (Precisin y

exactitud), se deber complementar con la determinacin del Lmite de deteccin
para asegurar resultados plenamente confiables que satisfagan las necesidades del
cliente.
REFERENCIAS
1. Cortes, Alejandra. 2002. Validacin de la prueba de esterilidad para vacunas

virales preparadas en vehculos oleoso y acuoso. Carrera Microbiologa. Facultad
Ciencias. Bsicas. Departamento Microbiologa. Pontificia Universidad Javeriana.
Trabajo de Pregrado. Bogot D.C. 93 pginas.
2. Cortes, Natalia. Mndez, Y. Junio, 2006. Validacin de las pruebas de

esterilidad por la tcnica de filtracin por membrana y endotoxinas bacterianas por el
mtodo de LAL en 3 productos farmacuticos. Carrera Microbiologa. Facultad
126
Ciencias. Bsicas. Departamento Microbiologa. Pontificia Universidad Javeriana.
Trabajo de Pregrado. Bogot D.C.
3. Galeano, Norma. 2007. Validacin de la retencin microbiana en los filtros de

acetato y nitrato de celulosa empleados en la tcnica de filtracin por membrana para
la prueba de esterilidad. Carrera Microbiologa. Facultad Ciencias. Bsicas.
Bogot D.C.182 paginas.
4. NTC ISO /IEC 17025: 2005. Requisitos generales de competencia de

laboratorios de ensayo y calibracin.
5. Otlora Andrs. Ortiz, J. Pearanda, S. Palma, R. Puentes, W. Murillo, C.

Peralta, A. Tovar, G. Junio, 2005. Sptimo curso taller VALIDACIN DE
MTODOS ANALTICOS. Laboratorio Salud Ambiental. Programa de vigilancia
de la calidad del agua potable, metales y no metales de inters en Salud Publica.
Bogot, D.C.
6. Padilla, Jos Esteban. 2007. Validacin secundaria del mtodo de recuento en

placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en muestras de
alimentos en un laboratorio de referencia. Carrera Microbiologa. Facultad Ciencias.
Pregrado. Bogot D.C. 109 paginas.
7. Palma Ruth Marien. Ortiz, J. Garnica, E. Lpez, L. Pearanda, S. Raad, J.

1999. Anlisis de agua para consumo humano. Instituto Nacional de Salud. Santa Fe
de Bogot, D.C.
127
ANEXOS
Tabla 1. Recuento coliformes totales en medio Endo
TABLA DE DATOS COLIFORMES TOTALES
Constantes U C V V LMS
M1 0,00 3200 1 99 80
1-BK1 0 0 0 0 0 0
2-BK2 0 0 0 0 0 0
3-E 0.9C 79 69 78 75 73 77
4-E 0.09C 5 9 8 7 4 8
5-M1 0 0 0 0 0 0
6-M2 0 0 0 0 0 0
7-M1+A1 34 31 36 33 35 32
8-M2+A2 60 57 55 52 56 58
Constantes U C v V
M2 0,00 5600 1 99
Tabla 2. Recuento coliformes fecales en medio m-FC.
TABLA DE DATOS COLIFORMES FECALES
Constantes U C V V LMS
M1 0,00 3200 1 99 80
1-BK1 0 0 0 0 0 0
2-BK2 0 0 0 0 0 0
3-E 0.9C 77 70 76 78 74 75
4-E 0.09C 6 9 5 8 7 4
5-M1 0 0 0 0 0 0
6-M2 0 0 0 0 0 0
7-M1+A1 32 33 37 34 36 35
8-M2+A2 57 58 59 55 58 56
Constantes U C V V
M2 0,00 5600 1 99
128
a) b) c)
d) e) f)
g)
Figura 1. Recuento de E. coli en medio Endo y medio m-FC. a) Recuento de blancos. b)

Recuento del estandar 0.09C. c) Recuento del estandar 0.9C. d) Recuento del estandar 0.4C.
e) Recuento del estandar 0.7C. f y g) Recuento de M1 y M2.
129
coliformes totales
Valor mnimo de inters para

el parmetro
en

0,0000 3,7103 1,9408 0,0000 1,8708 0,0000 2,7325
St2 = Se2 +
Sd2 = Varianza 0,0000 13,7667 3,7667 0,0000 3,5000 0,0000 7,4667
Desviacin
St = estndar 0,0000 3,7103 1,9408 0,0000 1,8708 0,0000 2,7325
Concentracin
(GMC) 0,0000 75,1667 6,8333 0,0000 33,5000 0,0000 56,3333
W (meta a 0.05 X
alcanzar) GMC 0,0000 3,7583 0,3417 0,0000 1,6750 0,0000 2,8167
0.25 X
VMI 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000
W 2,0000 3,7583 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,8167

coliformes fecales
Valor mnimo de nteres

para el parmetro
en cuestin: 8 BLANCO 0.9 C 0.09 C M1 M1+A1 M2 M2+A2

0,0000 2,8284 1,8708 0,0000 1,8708 0,0000 1,4720
St2 = Se2 +
Sd2 0,0000 8,0000 3,5000 0,0000 3,5000 0,0000 2,1667
St
(Desviacion
estndar) 0,0000 2,8284 1,8708 0,0000 1,8708 0,0000 1,4720
Concentracin
(GMC) 0,0000 75,0000 6,5000 0,0000 34,5000 0,0000 57,1667
W (meta a 0.05 X
alcanzar) GMC 0,0000 3,7500 0,3250 0,0000 1,7250 0,0000 2,8583
0.25 X
VMI 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000
W 2,0000 3,7500 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,8583
130
EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA ADICION ESTANDAR-

A1.
S 1,8708
1,5352
t0.95=2.015 con y = 5 tabla t blateral 2,01 2,01

S 1,5352
2.01
6
R/d R= 33,50 d= 32,00 1,047

R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 30,4
SI NO
1,05Xd 33,6
S
S 0,95 d - 2,01 .=A
105
, d + 201
, 6
Recuperacin satisfactoria 35,14 (ii)
6
28,86 .=B (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
131
EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA ADICION ESTANDAR-

A1.
1,870
S 8
1,535
2
2,0
t0.95=2.015 con y = 5 tabla t bilateral 1 2,01
S 1,535
2.01
6 2
R/d R= 34,50 d= 32,00 1,078

R/d>=0.95
?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 30,4
SI NO
1,05Xd 33,6
S 0,95 d -
S
2,01
Recuperacin satisfactoria 105
, d + 201
, 6 35,14 .=A (ii)
6
28,86 .=B (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperacin
satisfactoria
132

ESTANDAR-A2.
S 2,7325
2,2422
d
R/d R= 56,33 d= 56,00 1,006
R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 53,2
SI NO
1,05Xd 58,8
.=A
Recuperacin satisfactoria 61,04 (ii)
.=B
50,96 (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperacin
satisfactoria
133

ESTANDAR-A2.
S 1,4720
1,2079
t0.955=2.015
con y = 5 tabla t blateral 2,01
d
R/d R= 57,17 d= 56,00 1,021
R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 53,2
SI NO
1,05Xd 58,8
.=A
cuperacin satisfactoria
Recuperacin 60,01 (ii)
.=B
51,99 (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
134

Filtracion Membrana PDF

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Filtracion Membrana PDF

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

VALIDACIN SECUNDARIA DEL MTODO DE FILTRACIN POR

MEMBRANA PARA LA DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y

Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO

ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PBLICA DEL HUILA

LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

MEMBRANA PARA LA DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y

Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO

ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PBLICA DEL HUILA

LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA

MEMBRANA PARA LA DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y

Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO

ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PBLICA DEL HUILA

LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA

MEMBRANA PARA LA DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y

Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO

ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PBLICA DEL HUILA

LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA

RESUMEN ............................................................................................................................. xiii

TABLA 1 Recuento de bacterias aerobias mesfilas, hongos y levaduras ............................. 57

TABLA 2 Comparacin de absorbancias del tubo 0.5 de Mcfarland y la suspensin de E. coli

TABLA 3 Lectura de absorbancias de la suspensin de E. coli ............................................. 60

Tabla 4 Calculo de la media, desviacin estndar y coeficiente de variacin de las

TABLA 5 Recuento de coliformes totales en medio Endo. .................................................... 64

TABLA 6 Recuento coliformes fecales en medio m-FC. ....................................................... 65

TABLA 7 Clculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estndares para

Tabla 8 Clculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estndares para

Tabla 9 Recuperacin M1 + A1, coliformes totales ............................................................... 70

TABLA 10 Recuperacin M1 + A1, coliformes fecales......................................................... 71

TABLA 11 Recuperacin M2 + A2, coliformes totales ......................................................... 72

TABLA 12 Recuperacin M2 + A2, coliformes fecales......................................................... 73

FIGURA 1 Esquema de la estandarizacin del tubo 0.5 de Mcfarland. . ............................... 43

FIGURA 2. Esquema para preparar la concentracin de 5 bacterias/ml ................................ 46

FIGURA 3 Crecimiento de E. coli en agar Mc Conkey ......................................................... 51

FIGURA 4 Identificacin bioqumica de E. coli .................................................................... 52

FIGURA 5 Crecimiento de S. aureus en agar sangre.............................................................. 52

FIGURA 6 Crecimiento de E.coli en medio Endo y en medio m-FC ..................................... 55

FIGURA 7 Crecimiento de S. aureus en medio Endo y en medio m-FC ............................... 55

FIGURA 8 Recuento de E. coli en medio Endo y m-FC. ..................................................... 61

FIGURA 9 Recuento de los estndares de 5, 20 y 70 bacterias /100 mL de E. coli ............... 63

FIGURA 10 Recuento de E. coli en medio Endo y medio m-FC. .......................................... 67

FIGURA 11 Grafico de control para coliformes totales ......................................................... 74

FIGURA 12 Grafico de control para coliformes fecales ........................................................ 75

Con el fin de contribuir con los procesos de Mejoramiento de la Calidad del

Para la validacin se sigui un diseo experimental establecido por el Instituto

Al finalizar el estudio de validacin se comprob que mediante la validacin

Las enfermedades bacterianas, parasitarias, virales y qumicas que tienen origen en la

Estos programas de control interno incluyen evaluacin continua de los principales

La validacin de una tcnica es el proceso por el cual se establece mediante estudios

Las enfermedades infecciosas se transmiten principalmente a travs de las excretas de

2.1. GENERALIDADES DE LA VALIDACIN

Para conseguir la idoneidad en un resultado analtico es imprescindible la utilizacin

Consiste en demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia

Es el proceso por el cual se establecen mediante estudios de laboratorio que las

La validacin de mtodos analticos consiste es la obtencin de pruebas

2.1.2. Validacin primaria

La validacin primaria es un proceso exploratorio que tiene la meta de establecer los

Caractersticamente, la validacin primaria procede mediante el uso de esquemas de

2.1.3. Validacin secundaria

Demostracin por experimento que un mtodo establecido funciona de acuerdo con

Normalmente la validacin secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas

Para un laboratorio de anlisis es importante validar sus tcnicas, para as optimizar