Bioprocesos industriales se basan comnmente en el empirismo en lugar de la comprensin
cientfica proceso de fi co. En esta revisin, se resumen las estrategias actuales para el diseo de bioprocesos sciencebased y el control de los hongos fi filamentosas el objetivo de reducir los tiempos de desarrollo y el aumento de la economa del proceso. Se discute la evolucin y las tendencias recientes en relacin con tres aspectos cruciales a lo largo del ciclo de vida de bioprocesos de hongos fi filamentosas, a saber, (i) la tensin y la caracterizacin del inculo, (ii) la morfologa, y (iii) la reologa, as como sus efectos sobre el rendimiento del proceso. interconexiones complejas entre la tensin, el inculo, la morfologa, la reologa y el diseo del proceso se describen y discuten. Slo la combinacin de diferentes sensores de tipo duro con tecnologa de sensores suave y el desarrollo de modelos mecanicistas simpli fi cados puede permitir el diseo de bioprocesos basados en la ciencia de los hongos fi filamentosas. aplicacin industrial de fi hongos filamentosas Econmico, y bioprocesos controlables fiables para fi organismos filamentosas, en particular, fi hongos filamentosas, son de suma importancia para la produccin a gran escala de una amplia gama de productos con valor agregado que incluyen cidos orgnicos, enzimas y antibiticos. Debido a las interacciones complejas entre la tecnologa de proceso, fi morfologa filamentosas (Figura 1), y el rendimiento global del proceso, el diseo tradicional de bioprocesos est siendo llevada a cabo por etapas comnmente por mucho tiempo, estrategias empricas (Figura 2). En contraste con los productos biofarmacuticos, la mayora de los productos de fi hongos filamentosas son (blanco) productos industriales biotecnolgicos a granel y por lo tanto no estn sujetos a las exigencias normativas estrechos. En consecuencia, los fabricantes pueden optimizar continuamente sus cepas de produccin y procesos industriales para asegurar la competitividad. enfoques empricos comunes, sin embargo, una visin cientfica falta en ingeniera de procesos y parmetros de proceso clave (KPPS) (seeGlossary) bioprocesos inevitablyleadingtosub-optimallydesigned y altas tasas de fracaso del proceso. Por lo tanto, los ingenieros de bioprocesos persiguen dos objetivos generales resumidos as'two-times50% ', whichmeanstwicetheproductivityand reducir el tiempo de desarrollo de bioprocesos a 50%. Con el fin de cumplir estos requisitos econmicos, es necesario entender y controlar el sistema biolgico utilizado. En esta revisin, se dar una visin general de las estrategias de medicin y control se han desarrollado recientemente para los principales obstculos a lo largo del ciclo de vida de bioprocesos de fi hongos filamentosas que afecta de forma significativa el rendimiento global del proceso. Puntos que impactan en el rendimiento del proceso son: (i) la cepa y el inculo, (ii) la morfologa, y (iii) la reologa. Adems, proporcionamos perspectivas futuras dirigidas a una comprensin holstica de las interdependencias complejas en el diseo del proceso basado en la ciencia ficcin de los hongos filamentosas. Colar y inculo La deteccin de caractersticas de las cepas El primer paso en el diseo de bioprocesos es la identificacin de cepas promisorias candidatos (Figura 2). Para lograr la automatizacin y de alto rendimiento, las cepas estn comnmente identificados en los sistemas de placa de microvaloracin (MTP). Adems de identificacin de cepas altamente productivos, el cribado inicial tambin debe tener en cuenta las caractersticas morfolgicas, como la morfologa de crecimiento complejo o crecimiento de la pared adherente, lo que signi fi cativamente afectan la reproducibilidad de los resultados y el procedimiento posterior ampliacin. Faltan estos factores importantes, los clones seleccionados pueden fallar en la entrega de las productividades observadas a pequea escala. La reduccin del espacio de cabeza fue demostrado ser una estrategia til para prevenir el crecimiento de la pared y las consiguientes heterogeneidades [1-3]. Otro estudio compar el rendimiento fisiolgico y morfolgico proceso en el MTP y reactores de sobremesa de 1 litro. La adicin de perlas de vidrio promovi el crecimiento del micelio revisin Glosario tasa de desprendimiento de dixido de carbono y la tasa de absorcin de oxgeno (CER / OUR): la frecuencia respiratoria que reflejan la actividad fisiolgica de cultivo. atributo fundamental de la calidad (CQA): un examen fsico, qumico, biolgico, microbiolgico o caracterstica que debe estar dentro de un lmite apropiado, gama o distribucin para garantizar la calidad del producto deseado. de parmetros de procesos crticos (CPP): un parmetro de proceso cuya variabilidad tiene un impacto en un atributo fundamental de la calidad y por lo tanto debe ser supervisado o controlado para asegurar que el proceso produce la calidad deseada. Diseo de Experimentos (DOE): un mtodo estructurado, organizado para determinar la relacin entre los factores que afectan a un proceso y la salida de ese proceso. parmetro de proceso clave (KPP): un parmetro ajustable (variable) del proceso que, cuando se mantiene dentro de un rango estrecho, asegura un rendimiento ptimo proceso. Un parmetro clave proceso no afecta de manera significativa atributos crticos de calidad del producto. Rangos para KPPS se establecen durante el desarrollo del proceso, y los cambios en los rangos de funcionamiento sern gestionados dentro del sistema de calidad. tecnologa de proceso analtico (PAT): un sistema para disear, analizar y controlar la fabricacin a travs de mediciones puntuales de calidad y de rendimiento atributos crticos de las materias primas y en proceso y procesos con el objetivo de garantizar la calidad del producto final. Calidad ByDesign (QbD): un todevelopment systematicapproach thatbeginswith objetivos predefinidos y hace hincapi en los productos y procesos comprensin y control de procesos, basado en conocimientos cientficos slidos y la gestin de riesgos de calidad. y concomitantemente disminucin del crecimiento de la pared [4]. Con este enfoque, los parmetros de rendimiento fisiolgicas identi fi cado durante el cribado MTP para mesas de trabajo fueron similares a los reactores. Los autores tambin estudiaron la influencia de diferentes regmenes de cultivo sobre el comportamiento del proceso morfolgico mediante la medicin de las distribuciones de tamao de partcula. Aunque physiologicalscreeningresultsweresimilaratminiaturizedand a escala de laboratorio, la morfologa de crecimiento era diferente, probablemente debido a las diferentes fuerzas de cizallamiento. Un sistema microbioreactor desechable para cribado de alto rendimiento de la germinacin e fi ciencia se ha introducido recientemente [5]. cmaras del reactor de 100 ml de volumen habilitada paralelizados caracterizacin de la morfologa de crecimiento durante la germinacin de esporas, as como la cuantificacin de la calidad del inculo. Aunque tales reactores miniaturizados no permiten la caracterizacin completa de la morfologa de crecimiento, se ha demostrado que los parmetros morfolgicos, como la unidad de crecimiento de las hifas de longitud, pueden ser correlacionados para sedimentar cintica de formacin y el tamao de pellet [6]. Otro factor crucial que tiene que ser considerado en el anlisis de caractersticas de las cepas es el medio de crecimiento (Cuadro 1). Caracterizacin de la concentracin de inculo de esporas de inculo, la calidad, y la viabilidad afectan gravemente la morfologa de hongos, la fisiologa, y la productividad [7] .Todatehowever, theamountofinoculumandthe ajuste de parmetros de proceso estn todava empricamente optimizado con cada lote de inculo. En consecuencia, los procesos iniciales llevados a cabo con un lote de inculo fresco slo llegan poco a poco una ptima emprica despus de varias pruebas de funcionamiento. Este procedimiento no est de acuerdo completamente con el objetivo global 'y dos veces el 50%' en (blanco) biotecnologa industrial. A este respecto, los dispositivos microbioreactor paralelas y sistemas de cultivo MTP [1,4,5] representan herramientas tiles forthecharacterizationofgerminationef viabilidad ciencyandspore fi. Por otra parte, la microscopa de fluorescencia [8] y transformada de Fourier (FTIR) spectromicroscopy infrarrojos [9,10] proporcionan una resolucin espacial de la composicin bioqumica intracelular de fi hongos filamentosas. A pesar de estas metodologas se encuentran todava en su infancia, los resultados son prometedores para un medio de cuantificar la calidad del inculo de esporas en el futuro. El punto de tiempo de transferencia correcta de la semilla reactor al reactor despus de la produccin exitosa germinacin de las esporas es tan crucial como la calidad inculo de esporas ptima. [(Figure_1) TD $ FIG] Las esporas El desarrollo de hifas dispersar la morfologa la morfologa de pellets Tendencias en Biotecnologa El desarrollo de hifas dispersar la morfologa la morfologa de pellets Figura 1. Ciclo de vida morfolgica de los hongos filamentosos. Independiente de la capitalizacin de Aspergillus spp. para la produccin de enzimas o cidos orgnicos, Trichoderma spp. para celulasas, o Penicillium spp. para los antibiticos, estos caballos de batalla industriales filamentosos todos comparten una morfologa nica de crecimiento y complejo. bioprocesos de hongos se inocularon comnmente a partir de esporas. Despus de la germinacin exitosa: ramificacin, que se extiende, y el entrelazamiento de las hifas sola introducir dispersar a las redes de hifas. Ms de duracin del proceso, los pellets pueden desarrollar a travs de crecimiento a partir de esporas individuales o por aglomeracin. fuerzas de cizallamiento de alta y de nutrientes limitacin causa la desintegracin de pellets. [(Figure_2) TD $ FIG] Tendencias en Biotecnologa El control del proceso a escala de fabricacin basado en KPP oscila iden? fi cado en el paso 2. Integra sin problemas? en de nuevos clones en la produccin? en es O? es obstaculizada por la falta de mechanis? c comprensin de aumento de escala ECTS e ff. La seleccin de alto rendimiento para las cepas altamente productoras. Proyeccin de la morfologa y la reologa proceso en esta etapa exige Veri fi cada, mechanis? C modelos de escalado. Medicin y control de KPP vacas? Cs en un caudal limitado en escala de litros. Ini? Inves Al? Ga? Sobre la morfologa del proceso y la reologa basado en la escala descendente hidrulica. 1. La cepa de cribado 2. Proceso de desarrollo 3. Implementa? En al produc? A escala Figura 2. Diseo de bioprocesos tradicional para los hongos filamentosos. La estrategia de desarrollo comienza con la deteccin cualitativa de clones adecuados, seguido por el desarrollo de bioprocesos cuantitativa en biorreactores a escala de laboratorio. De esta manera, se identifican los parmetros de proceso clave (KPPS) para asegurar que el sistema biolgico se guiados a sus blancos cantidad del producto. pilotaje subsiguiente apunta a la escalabilidad del proceso, el anlisis de la adaptacin de los parmetros del proceso, y los efectos de escala-up [53]. Revisin Trends in Biotechnology 2013 abril, vol. 31, N 1 38 La medicin de la tasa de evolucin de dixido de carbono (CER), la espectroscopia de fluorescencia mltiples longitudes de onda, la medicin de la turbidez y la espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR) se utilizan para determinar este punto temporal en lnea [11,12]. enfoques espectroscpicos no requieren el anlisis de gases de escape y por lo tanto se aplican tambin a los MTP y agitar matraces. Miniaturizedandparallelscreeningapproachesprovide rpida cuanti fi cacin de las caractersticas de la cepa y de inculo. La deteccin de las caractersticas fisiolgicas y morfolgicas relevantes en esta etapa inicial de diseo de bioprocesos facilitar la prediccin del comportamiento del proceso a escala grande. Morfologa coagulante frente a no coagulante especies El mecanismo de la formacin de grnulos depende de la cepa fngica. Una cepa fngica puede ser coagulante o no coagulante, una descripcin de los fenmenos de agregacin de conidios. Varios estudios han analizado el caso de la agregacin de conidios, que est ms influenciada por los medios de comunicacin, las fuerzas mecnicas, as como la concentracin de inculo y la viabilidad [7,13]. La agregacin se produce en dos etapas: (i) inmediatamente despus de la inoculacin, nicamente afectadas por el valor de pH y la osmolalidad del medio de [14]; (Ii) en la germinacin, afectada por el pH, la osmolalidad, agitacin y aireacin [13]. la agregacin de los conidios puede ser muy bien controlada por 2D espectroscopia de fluorescencia [11] y se ha descrito en un modelo de proceso fiable [7]. Para las cepas de hongos, pellets o bien thatgerminatesorfromentanglements no coagulante forma fromasinglespore de hifas ramificadas y dispersar grupos de micelio. El sporeinoculumconcentrationisaKPPforpelletformation. De hecho, la formacin de grnulos se acelera a la reduccin de las concentraciones de inculo de esporas [15]. Con el fin de describir de forma fiable el comportamiento de los hongos fi filamentosas sobre el proceso de produccin, el conocimiento de inculo y sus caractersticas de coagulacin debe integrarse en un balance global de la poblacin morfolgica, as como los modelos multivariados de prediccin [13]. Diferentes morfologas durante los procesos de produccin La mayora de los procesos de hongos fi filamentosas son cultivos de varias etapas durante las cuales los hongos fi filamentosas exhiben diferentes morfologas. La morfologa predominante durante cultivationsdependsonseveralfactorslikethestrain, thespore concentracin de inculo y la calidad, y la agitacin [15]. limitacin de nutrientes y la difusin de oxgeno que afectan a los gradientes de pellets micromorfologa [16], as como efectos de las concentraciones DO2 y DCO2 en el biorreactor en macromorfologa fngica tener toda cuanti fi cado sido recientemente [17- 19]. Esto es especialmente importante para la escalabilidad proceso porque contrapresin hidrosttica en el fondo de los vasos grandes que pueden crear altas concentraciones residuales DCO2 [17,18,20]. Otros estudios han investigado los cambios morfolgicos durante perodos prolongados de cultivo [21], en el que los gradientes de concentracin de sustrato a travs de grnulos de hongos afectan micromorfologa pellet y actividad de la biomasa [16]. Morfologa significativamente influye en varios otros KPPS incluyendo la viscosidad, la mezcla de caldo de la demanda de energa y la productividad, substratediffusion cparameterslike butalsostrain-especfica y los rendimientos [22]. Morfologa y reologa interdependencias pueden ser investigados por anlisis de imagen digital de anlisis de tamao de partculas [24] [23] o. Ciertas morfologas de crecimiento estn directamente relacionadas con la produccin de compuestos de inters industrial, por ejemplo, se prefieren los grnulos para la produccin de cido ctrico [15], mientras que el crecimiento del micelio aumenta la formacin de fructofuranosidasa [14]. Por lo tanto, el anlisis de la morfologa y control fiables son cruciales para bioprocesos optimizados. anlisis de la morfologa y la morfologa de Control del crecimiento se dirige cada vez ms como un proceso de KPP durante el desarrollo debido a la relacin indiscutible entre la morfologa de hongos y el rendimiento del proceso [15,22,25] .Aprerequisiteformorphologicalprocesscontrol es el conocimiento detallado de un hongo 'responsetoprocessparameters.Suchknowledge morfolgica, sin embargo, slo puede ser recogida si las herramientas precisos para el anlisis morfolgico estn disponibles. Una excelente revisin, recientemente publicado describe mtodos para analizar la morfologa de hongos incluyendo la microscopa de fuerza atmica, citometra de fl ujo, y las tcnicas aplicables en tiempo real [25]. Aunque para algunas de estas tcnicas de aplicabilidad en el entorno de produccin todava tiene que ser probada, la revisin vitrinas enfoques existentes para dilucidar la informacin morfolgica relevante, mecanicista para el desarrollo de bioprocesos optimizado. tcnicas analticas fiables deben permitir la investigacin detallada de los efectos de los cambios en los parmetros del proceso, incluyendo inculo de esporas, la composicin del medio, y la cintica de mezcla, en la morfologa de hongos [14,15,22,26,27]. Asi que Caja de desarrollo 1. Medios Hasta la fecha, la mayora de los procesos de produccin establecidos con hongos filamentosos se llevan a cabo en medios qumicamente definidos. Las principales ventajas de los medios complejos son que contienen una rica variedad de compuestos que permiten el crecimiento de microorganismos intactos y que estn hechos a partir de fuentes de bajo costo. Sin embargo, la variabilidad significativa de lote a gran cantidad de diferentes componentes en los resultados de los medios de comunicacin complejas en grandes variaciones en la eficiencia de la produccin. Actualmente, hay dos estrategias para abordar este problema: (i) la caracterizacin de las materias primas complejas y tomando las acciones correspondientes en funcin de las variaciones, y (ii) de conmutacin de los procesos de produccin de complejos de medios definidos. Para la caracterizacin de componentes de medios complejos, tcnicas espectroscpicas, incluyendo infrarrojo cercano (NIR), mediados infrarrojo (MIR), y de reflectancia total atenuada mediados espectroscopia de infrarrojo (ATR- MIR) son comnmente empleada [54]. Una visin global de la mayora de estos mtodos, que contiene valiosas sugerencias para posibles aplicaciones de la tcnica respectiva, se le dio en 2004 [55]. Los principales inconvenientes de herramientas espectroscpicas son sensor ensuciamiento durante la aplicacin en lnea, extensos procedimientos de calibracin para los modelos quimiomtricas cuantitativos fiables, as como la demanda de anlisis de datos multivariable complejo [54,56]. Por lo tanto, en aras de la simplicidad y capacidad de control, evitando la variabilidad materia prima por el cambio a medios de cultivo definido es preferible. la caracterizacin de cepas de hongos filamentosos rpido en lote cultivos en un medio complejo / combinado definido permite la identificacin de la cepa candidato ms prometedor para la conmutacin de la bioprocesos de complejos a los medios de comunicacin totalmente definidos [3]. Esta metodologa se basa en las necesidades analticas mnimas y la determinacin indirecta de las tasas de absorcin especficas de los componentes de los medios complejos mediante la aplicacin de tcnicas de balanceo de masas redundante estadsticamente verificadas. Este enfoque no slo ha permitido el cambio de complejos de medios definidos, sino tambin un aumento del doble del rendimiento global del espacio de la penicilina tiempo y un triple aumento en la tasa de formacin de penicilina especfica mxima [3]. Revisin Trends in Biotechnology 2013 abril, vol. 31, N 1 39 ahora, sin embargo, estos anlisis han sido en su mayora sobre la base de un nmero limitado de imgenes microscpicas grabadas manualmente utilizando tcnicas de anlisis de imgenes digitales introducidas hace ms de una dcada [27]. Debido a que la grabacin manual de imagen impide la aplicabilidad de alto rendimiento, automatizable caracterizacin morfolgica de bajo nivel enfoques basados en distribuciones de tamao de partcula debe utilizarse para aplicaciones de rutina industriales [4,24]. Para las penetraciones ms estrechos, los enfoques de caracterizacin morfolgica de nivel intermedio, que da acceso a la informacin morfolgica mecanicista, se puede utilizar. dimensiones fractales se pueden emplear como descriptores morfolgicos [28] y tambin describen el comportamiento de ramificacin y el pellet morfologa [29]. dimensiones fractales miden el grado de complejidad as como las propiedades de llenado de masas, y un gran nmero de parmetros morfolgicos se pueden reemplazar eficazmente por estos ndices [28]. Por otra parte, otro descriptor morfolgica, el nmero morfologa, est estrechamente correlacionada con la productividad de Aspergillus niger [14]. La estrategia ptima, sin embargo, es un alto rendimiento, alto nivel de enfoque de caracterizacin morfolgica describir la morfologa de hongos sobre la base de fi cacin y frecuencia distribuciones caciones morfolgicas para varios parmetros morfolgicos [6]. Estos planteamientos permiten el modelado y la comprensin de las heterogeneidades que afectan al rendimiento global del proceso sobre la base de los balances de poblacin [30]. , estrategias de modelado morfolgica estructurados prometedores para predecir el comportamiento del proceso morfolgico y el enlace a la productividad ya fueron introducidos en los aos 90, pero an no se han aplicado para el desarrollo de procesos industriales [31,32]. Hasta la fecha, la falta de herramientas fiables para el anlisis automatizada de alto rendimiento de la morfologa de hongos ha impedido el uso de anlisis morfolgico como un procedimiento de anlisis de rutina. Dispositivos para la lnea, en lnea y en tiempo real las mediciones microscpicas se han desarrollado en los ltimos aos, pero su aplicabilidad como herramientas automatizadas de medicin en lnea an no se ha demostrado [33]. A pesar de la disponibilidad de trabajo computacional flujos de reducir al mnimo la intervencin manual durante los anlisis morfolgicos [34,35], todava hay una necesidad de sistemas de anlisis de imagen con la adquisicin de imgenes y anlisis totalmente automatizado [14,36]. Un reciente mtodo de alto rendimiento para una rpida caracterizacin morfolgica de los hongos fi filamentosas articula la grabacin totalmente automatizada de miles de imgenes microscpicas con concomitante estadstica veri fi cacin para la completa y precisa cuanti fi cacin de la morfologa de hongos [6]. Pelletmicromorphologyandsubstratediffusionlimitationsaffectingpelletgrowth, erosin, andbreakagecanbe cuantificada mediante microscopa lser confocal [16]. Recientes, nuevas herramientas para el anlisis de micromorfolgico incluyen (i) FTIR imgenes spectromicroscopic, que permite la resolucin espacial en 3D de la micromorfologa pellet mediante la investigacin de la composicin bioqumica de las secciones de pellets de micrtomo, y (ii) MALDI-TOF clula intacta espectrometra de masas (ICMS), que proporciona El anlisis micromorfolgico thatfacilitatesidenti fi cationandquanti fi cationofprotein patrones en diferentes estados de los procesos fisiolgicos o morfolgicos (AE Posch et al., sin publicar). Tales tcnicas de alto nivel representan un paso importante hacia la modelizacin mecnica de las interdependencias entre las los parmetros del proceso, fisiologa, transferencia de masa, y micromorfologa. Hasta la fecha, las estrategias de control morfolgicas para la produccin industrial incluyen la seleccin de una cepa candidata que exhibe la morfologa deseada durante el desarrollo del proceso [6], as como el ajuste de la concentracin de inculo de esporas, la composicin del medio, y el rgimen de agitacin [15]. Por otra parte, las micropartculas se pueden utilizar para personalizar la morfologa de hongos [37]. Del mismo modo, el control de la osmolalidad facilita el control de la morfologa micelial dispersa [14]. Creemos que la caracterizacin morfolgica de alto rendimiento enfoques que van desde la microscopa ptica para citometra de flujo [6,24] facilitar morphology- y, por tanto, el control de bioprocesos en el futuro. La actualizacin de los modelos mecanicistas morfolgicas, estructuradas con los datos morfolgicos cuantitativos avanzar enfoques para el modelado predictivo morfolgica 3D de pellets y dispersar la morfologa [38]. combinacin de sensores de sonido para el volumen de biomasa [39], por ejemplo, material dielctrico (DE) espectroscopia, y el equilibrio de la masa elemental redundante para la estimacin de la produccin de biomasa [3] puede ser un camino prometedor para facilitar el seguimiento en tiempo real de las caractersticas de la biomasa mediante sensores suaves. Reologa de la reologa y la morfologa Hay interconexiones complejas entre la morfologa, concentracin de biomasa, y la reologa [23,40]. A continuacin, destacamos la dependencia de la reologa de la morfologa de hongos. el crecimiento de hongos libremente dispersado causa alta viscosidad caldo y deteriora la transferencia de oxgeno. A menos que haya un directlinkagebetweenmorphologyandproductivity, la morfologa de pellets es el preferido en los procesos de produccin debido a la menor viscosidad. Sin embargo, los lmites de crecimiento pellet sustrato de difusin para el ncleo del grnulo en dimetros de pellets crticos, lo que provoca la lisis de las clulas de ncleo de grnulo [6]. Este evento ha sido resuelta en el espacio por microscopa confocal de barrido lser [16]. Hydrodynamicconditionsinthebioreactorin fl uencethe desarrollo morfolgico del hongo y por lo tanto la reologa. velocidades de agitacin altas, que son necesarios para la transferencia de masa ptima, conducir a la tensin de alta cizalla. En consecuencia, las redes de micelio estn fragmentados, aumentando la cantidad de filamentos libres y por lo tanto la viscosidad. La alta viscosidad provoca insu fi ciente de transferencia de masa y la limitacin de oxgeno [41]. Modelado de la fragmentacin de hongos requiere el clculo de la fuerza de las hifas y las fuerzas mecnicas ejercidas sobre el hongo por el de flujo turbulento. A este respecto, es crucial saber la disipacin de energa por impulsores y aireacin. Mayor disipacin de energa provoca una fuerte erosin y cambios en la morfologa de pellets como se muestra forA.niger [41] .Ingeneral, la formacin de grnulos hydrodynamicconditionsaffect en tres niveles: (i) la interaccin de los pellets y remolinos; (Ii) el impacto entre los pellets y agitadores / BAF es fl; y (iii) de colisin entre los grnulos de [42]. Estas interacciones pueden quitarse hifas o romperse por completo grnulos enteros. Para describir de forma fiable un bioproceso hongos, la influencia de la tensin de cizallamiento hidrodinmico en la morfologa, la reologa y la productividad tiene que ser integrado en los modelos. La entrada de energa media, un parmetro de fcil acceso, se puede utilizar para caracterizar la dinmica fluidas y reologa. Este parmetro, sin embargo, depende de la disposicin experimental y por lo tanto Revisin Trends in Biotechnology 2013 abril, vol. 31, N 1 40 no puede ser transferida a travs de modelos. Un modelo holstico tiene que utilizar parmetros transferibles y describir todos los procesos independientes de las condiciones de funcionamiento. Por lo tanto, la interaccin entre los remolinos y las superficies de pellets necesita estar relacionada con las fuerzas de corte. Las fuerzas de corte estn distribuidos de manera desigual dentro del reactor, por lo que la velocidad de cizallamiento mximo en lugar de parmetros medios deben ser utilizados para describir la reologa en un biorreactor [41]. herramientas de medicin de la reologa, an se necesitan enfoques automatizables fiables para la determinacin oportuna de las caractersticas reolgicas de caldo. Las tcnicas tradicionales se pueden agrupar en tres categoras: (i) tcnicas capilares, (ii) las tcnicas de rotacin, y (iii) la cada de las tcnicas de bolas [43]. Sin embargo, estas tcnicas cannotbeusedforfungalfermentationbrothsbecausethey se considera que son lquidos no newtonianos. fermentationbrothsareacomplexsystem Fungal: atthebeginningof un proceso el caldo bsicamente describe un lquido newtoniano, pero debido a crecimiento de la biomasa y el cambio de la morfologa de hongos, el caldo se vuelve heterogneo que presenta la tecnologa developmentsininstrument no Newtoniancharacteristics.Recent para reometra, especialmente con respecto a nonNewtonianliquids, havebeenachieved [43,44 ] .Despitethe disponibilidad de viscosmetros en lnea de la industria qumica, la reologa es comnmente no se mide en tiempo real para bioprocesos fi filamentosas. Novela, dispositivos miniaturizados, incluyendo herramientas espectroscpicas de ultrasonido, resonadores acsticos electromagnticos, y que vibran los dispositivos de puente estn todava en su infancia, pero describen una herramienta en lnea prometedora para Cuadro 2. Prediccin de reologa requisitos de energa proyectados de laboratorio a gran escala a menudo disminuyen la economa del proceso o incluso exceden la disponibilidad de energa. Por lo tanto, bioprocesos con hongos filamentosos necesitan ser adaptados durante el pilotaje para satisfacer potencia disponible en escala de fabricacin, por ejemplo, mediante la adaptacin de medios y la introduccin de etapas de dilucin [20]. Hasta la fecha, la ampliacin de bioprocesos filamentosos se dirige habitualmente usando la regla emprica de los pulgares para arriba hidrulica escala, incluida la velocidad tangencial mxima o la velocidad punta del impulsor, el valor de kla, saturacin de oxgeno, la entrada de energa volumtrica, y el tiempo de mezclado [57-59] . diseo del proceso basado en la ciencia la aplicacin de modelado predictivo para reolgico morfolgica morfolgica ampliacin representara un paso importante hacia el aumento de la tasa de xito del proceso y contribuir as a reducir los tiempos de desarrollo de procesos y el aumento de la economa del proceso (Figura I). Desafortunadamente, todava es muy complejo y difcil de predecir la reologa de un caldo de fermentacin. frmulas importantes que describen diferentes aspectos que influyen en la reologa son las frmulas conocidas para la viscosidad aparente, la ley de potencia mtodo Metzner y Otto, y el modelo de Herschel-Bulkley. Sin embargo, una sola frmula no puede describir los complejos procesos que contribuyen a la viscosidad en un biorreactor. Complementando el anlisis de imgenes de bajo rendimiento para el modelado convencional reolgico [23], mtodos multivariantes, y los datos de distribucin del tamao accesible de alto rendimiento pueden utilizarse para predecir las propiedades reolgicas en un biorreactor [24]. Los parmetros ms importantes para describir la reologa caldo se pueden predecir con xito de la distribucin del tamao, concentracin de biomasa, y el modo de alimentacin. Los enfoques actuales se combinan los datos de distribucin de tamao de partculas y concentracin de biomasa y analizar estos datos utilizando diferentes herramientas quimiomtricas, como mnimos cuadrados parciales (PLS) modelos. Estas propiedades reolgicas enfoques multivariado modelo de caldos de fermentacin filamentosos con igual o mayor precisin que las relaciones tradicionales de tipo ley de potencia basados en los datos promedio de anlisis de imgenes [24]. Sin embargo, el modelo calibrado es especfico para una determinada cepa de hongo, la escala y las condiciones de funcionamiento y por lo tanto slo es vlida en un rango limitado. Creemos que los mtodos de caracterizacin de partculas superiores (highthroughput, anlisis de imgenes estadsticamente verificado) aumentarn significativamente el poder predictivo de los modelos de la reologa en el futuro, proporcionando mtodos de modelizacin mecanicistas [23,38] con los datos de poblacin morfolgicos cuantitativos highdimensional [6]. Por lo tanto, sugerimos predictivo morfolgica ampliacin, junto con las estrategias de control escalables y no lineales para la extrapolacin fiable del rendimiento del proceso de produccin de los resultados del examen. [(Box_2) TD $ FIG] Miniaturiza? En y paralleliza? En El anlisis de alto rendimiento y datos verificables ca? a monitoreo y modelacin en lnea diseo del proceso basado en la ciencia Colar y inculo Morfologa reologa Tendencias en Biotecnologa Figura I. estrategias para el diseo de procesos basados en la ciencia de orientacin tiempos de desarrollo de procesos ms bajos y mayor economa del proceso recomendado. Durante los prximos aos, veremos la aplicacin de sensores avanzados recientemente introducidas para la tensin y la caracterizacin del inculo, la morfologa, la reologa y el rendimiento del proceso, as como su mejora concomitante. Esto permitir un registro ms preciso de KPPS y dar acceso a un nmero mucho mayor de datos de proceso (en lnea). La extraccin de la informacin pertinente de dichos datos multidimensionales accesibles mediante anlisis multivariante, y la integracin en los modelos de procesos mecnicos simplificados ser necesario aumentar la tasa de xito del proceso de muestreo miniaturizado a escala de fabricacin. La combinacin de las tcnicas de medicin, como complemento ortogonal de sensores de sonido suaves ya permite la resolucin de la interaccin de KPPS altamente entrecruzados y por lo tanto describe un enfoque prometedor hacia el diseo de bioprocesos basados en la ciencia para los hongos filamentosos. Revisin Trends in Biotechnology 2013 abril, vol. 31, N 1 41 la medicin de la viscosidad fi filamentosas caldo. Por lo tanto, los esfuerzos actuales se centran en modelos fiables que predicen la reologa caldo basado en mediciones de los parmetros ms fcilmente accesibles que incluyen la concentracin de biomasa, la distribucin del tamao de partcula [24], andenergyinput [45] .Accuratemeasurement de reologa caldo as como su prediccin durante escala-up es crucial para el diseo de bioprocesos xito (Recuadro 2). Efectos sobre el rendimiento del proceso Cuantificar el rendimiento del proceso de fi hongos filamentosas, la concentracin de biomasa, viabilityas as como su estado fisiolgico deben ser monitoreados. concentracin de biomasa y la productividad volumtrica viabilidad, el parmetro objetivo en el diseo del proceso industrial, depende en gran medida de la concentracin de biomasa y la cantidad de viable, produciendo activamente clulas. Tambin KPPS, tales como la reologa [23], son influenciados por la concentracin de biomasa. determinacin en lnea fiable de la concentracin de biomasa y la cantidad de biomasa activa representaran un gran paso hacia el control de bioprocesos eficaz. Para monitorear las caractersticas de la biomasa, diferentes estrategias, como las mediciones de turbidez, espectroscopia IR, espectroscopia 2D, espectroscopa dielctrica (DE), y diferentes sensores suaves se han desarrollado [46,47]. viscosidad caldo se puede utilizar como un indicador de la concentracin de biomasa de la fi filamentosas organismo modelo Streptomyces spp .. La viscosidad es proporcional a la concentracin de biomasa hasta el final de la fase exponencial de crecimiento [48]. Sin embargo, durante las etapas posteriores del proceso, la viscosidad no indica la concentracin de biomasa debido a cambios en las propiedades reolgicas del caldo de fermentacin resultante de cambios en la morfologa [48]. Biocalorimetry se utiliza para controlar la produccin de calor durante bioprocesos en lnea. La produccin de calor metablico se correlaciona con el crecimiento, la morfologa y la fisiologa [49,50]. La investigacin de la evolucin de calor sobre duracin del proceso por las llamadas curvas de potencia en tiempo proporciona informacin sobre biomassgrowthandphysiology.Furthermore, patrones heatrelease tambin re fl ejan cambios en la morfologa de hongos, por lo que esta estrategia en lnea podra ser una herramienta til para la monitorizacin no invasiva morfologa [49,50] . sensores blandos se pueden utilizar para estimar con precisin la biomasa mediante la combinacin de datos de fcil seguimiento, al igual que la tasa de dixido de carbono evolucin (CER), la tasa de consumo de oxgeno (OUR), o el consumo de base, con sensores de tipo duro, que estn estrechamente relacionados a la biomasa de crecimiento [51]. Por lo tanto, los sensores suaves son un enfoque poderoso para KPPS de seguimiento, que slo seran accesibles para la medicin directa de costosos equipos y mano de obra. Siempre que los componentes relevantes han sido identificados y puedan ser medidos en lnea, fi el balance de masas estequiomtrica principio de primera lnea permite la estimacin de la concentracin de biomasa, incluso para cultivos en medios complejos, slidos [3]. Una comparacin de sensores comunes de biomasa en lnea ha demostrado que el DE espectroscopia, medicin de la turbidez, y CER dieron las estimaciones ms exactas. Una combinacin de sensores tambin revela informacin sobre la morfologa de los hongos, los rendimientos de los cambios, y la biomasa viabilidad [39]. Actualmente, una gran variedad de diferentes herramientas de medicin para determinar la concentracin de biomasa fngica est disponible. Tabla 1 da una visin general de estas tecnologas, muestra sensibilidades cruzadas, y describe las etapas del ciclo de vida de bioprocesos de hongos, en donde la tecnologa respectiva se puede utilizar. En resumen, a lo largo de todas las etapas de bioprocessdesign, principios thecombinationofcomplementarymeasurement con primer principio de equilibrio de masa estequiomtrica de sensores soft es muy recomendable. viabilidad de la biomasa, la concentracin, morfologa, y la actividad se puede estimar para facilitar en ltima instancia, el modelado de procesos de prediccin y control. Adems de estas mediciones representativas de biomasa, el estado fisiolgico proceso debe controlarse de forma fiable (Cuadro 3). Tabla 1. Mtodos para la determinacin en tiempo real de fi filamentosas biomassa Mtodo sensibilidad cruzada Aplicabilidad Refs burbujas de gas Morfologa sensor de componentes de medios Contenido de sal de alta densidad celular slido ensuciamiento Screening Fomento de la Produccin de Microscopa - + - - + RAAR [33,47] Turbidimetra RR - RRRAAR [46,47] La citometra de flujo - R - R + - NA AA [24,47] vibracional espectroscopa RR - - R / + RAAR [12,46, 54] dielctrica RRR espectroscopa - + - NA AA [39,46, 47 ] espectroscopia de fluorescencia RR - - R / + RAAR [11,39, 46,47] Calorimetra - - - - + - NA AA [49,50] Balance de masa de la adicin de pH / base - - - - - RAAA [51] masa equilibrio de pO2 / NUESTRO de pO2 - - - - - RAAA [51] El gas de escape de medicin - - - - - - NA AA [3,11, 12,39] sensores soft - - - - - - AAA [3,46 , 51] aAbbreviations: +, cuanti fi cables sensibilidad cruzada; -, Sin sensibilidad cruzada; R, la evaluacin de riesgos fi co caso espec necesaria debido a la no cuanti fi cables sensibilidad cruzada; A, aplicable; NA, no aplicable. Revisin Trends in Biotechnology 2013 abril, vol. 31, N 1 42 Observaciones finales y tendencias futuras retos en el diseo de bioprocesos para fi hongos filamentosas son fuertemente interdependientes (vase la Figura I en el recuadro 2). Sistemtica Diseo de Experimentos investigationofinterdependenciesbetweenKPPsrequiresa enfoque (DoE). procesar la informacin relevante debe ser extrado de los datos experimentales primas por estadsticamente Veri fi cado equilibrio macroscpica y anlisis morfolgico [3,6]. Por otra parte, la informacin fisiolgica subyacente debe ser examinado con el modelado mecanicista [45,52]. Aunque todava no es una amenaza reguladora, creemos que despus de Calidad por Diseo (QbD) directrices [ICH (2009) Q8, Desarrollo Farmacutico (R2); ver http://www.ich.org] sera tambin beneficioso en fi thecaseofindustrial (blanco) biotechnologicalbulkproducts. desarrollo de procesos basados en la ciencia basada en la evaluacin del riesgo inicial y la identi fi cacin de los atributos crticos de calidad (CQA), los parmetros crticos del proceso (CPP), y KPPS followedbysystematicresolutionoftheirinterdependencies hasbeendemonstratedfortheproductionofbiopharmaceuticals [CMC-Biotech-Trabajo de Grupo (2009) A-Mab: un estudio de caso en Desarrollo de bioprocesos; http: //www.casss. org / asociaciones / 9165 / archivos / A-Mab_Case_Study_Version_ 2-1.pdf, 1-278]. Implementacin de una obra tan automatizado de flujo tambin permitir una rpida integracin de la novela, cepas mejoradas en la produccin, disminuir el desarrollo tiempos, y la economa incremento de procesos para la produccin de productos de valor aadido de los hongos fi filamentosas. Referencias 1 Siebenberg, S. et al. (2010) La reduccin de la variabilidad de la produccin de antibiticos en Streptomyces mediante el cultivo en placas de pozos profundos de 24 cuadrados. J. Biosci. Bioeng. 109, 230-234 2 Meyer, V. et al. (2010) La gentica, la manipulacin gentica, y se acerca a la tensin mejora de fi hongos filamentosas, En Manual de Microbiologa Industrial y Biotecnologa, (3 edicin), Sociedad Americana de Microbiologa, pp. 318-329 3 Posch, AEetal. (2012) Switchingindustrialproductionprocessesfrom complejo de fi nida medios: el desarrollo de mtodos y estudio de caso en el ejemplo de Penicillium chrysogenum. Microbial. Hecho celular. 11, 88 4 Sohoni, S.V. et al. (2012), el cultivo plataforma robusta a pequea escala para Streptomyces coelicolor. Microbial. Hecho celular. 11, 9 5 Demming, S. et al. (2011) desechable poli paralelo (dimetilsiloxano) microbioreactorwithintegratedreadoutgridforgerminationscreening de Aspergillus ochraceus. uidics Biomicro fl 5, 6 14104 Posch, A. E. et al. (2012) Un nuevo mtodo para la rpida y estadsticamente comprobable ed caracterizacin morfolgica de los hongos fi filamentosas. Fungal Genet. Biol. 49, 499-510 7 Grimm, L. H. et al. (2004) Estudios cinticos sobre la agregacin de las conidias de Aspergillus niger. Biotechnol. Bioeng. 87, 213-218 8 Herbrich, S.etal. NAD (P) H analysisoffreeandenzymebound (2012) Label-freespatial en presencia de altas concentraciones de melanina. J. FLUORESC. 22, 349-355 9 Kaminskyj, S. et al. (2008) de alta resolucin espacial de anlisis celular del hongo bioqumica-reduccin de la brecha analtica utilizando FTIR sincrotrn spectromicroscopy. FEMS Microbiol. Letn. 284, 1 al 08 10 Szeghalmi, A. et al. (2007) Una investigacin sincrotrn FTIR microespectroscopa de hifas de los hongos cultivados bajo condiciones ptimas y recalc. Anal. Bioanal. Chem. 387, 1779- 1789 11 Ganzlin, M. et al. (2007) En la espectroscopia de fluorescencia mltiples longitudes de onda situ como herramienta eficaz para controlar simultneamente la germinacin de esporas, la actividad metablica y la produccin de protenas cuantitativa en recombinantAspergillus cultivos por lote nigerfed. J. Biotechnol. 132, 461-468 12 Nordon, A. et al. (2008) En la vigilancia in situ de la etapa de semilla de un proceso de fermentacin por espectrometra NIR no invasiva. Analyst 133, 660-666 13 Grimm, L. H. et al. (2005) Influencia de la tensin mecnica y la interaccin superficie sobre la agregacin de las conidias de Aspergillus niger. Biotechnol. Bioeng. 92, 879-888 14 Wucherpfennig, T. et al. (2011) Morfologa de ingeniera osmolaridad y su efecto sobre la morfologa y la productividad de Aspergillus niger. Microbial. Hecho celular. 10, 58 15 Papagianni, M. (2004) la morfologa de hongos y la produccin de metabolitos en los procesos de micelio sumergido. Biotechnol. Adv. 22, 189-259 16 Hille, A. et al. (2005) Oxgeno per fi les y la biomasa de distribucin en biopellets de Aspergillus niger. Biotechnol. Bioeng. 92, 614-623 17 El-Sabbagh, N. et al. (2006) efectos dixido de carbono disuelto en el crecimiento, el consumo de nutrientes, la sntesis de la penicilina y la morfologa de los cultivos discontinuos de Penicillium chrysogenum. Enzyme Microb. Technol. 39, 185-190 18 El-Sabbagh, N. et al. (2008) Efectos de dixido de carbono disuelto en el crecimiento, el consumo de nutrientes, la sntesis de la cefalosporina C y la morfologa de Acremonium chrysogenum en cultivos discontinuos. Enzyme Microb. Technol. 42, 315-324 19 Li, P. et al. (2008) Los efectos de los parmetros de bioprocesos en proteasas extracelulares en un recombinante de Aspergillus niger B1-D. Appl. Microbiol. Biotechnol. 78, 333-341 20 Junker, B.etal. (2009) a escala piloto de produccin antifngico processdevelopmentandscaleupfor. Bioprocesos Biosyst. Ing. 32, 443-458 21 Haack, M. B. et al. (2006) cambio en la morfologa de las hifas de Aspergillus oryzae durante el cultivo de alimentacin discontinua. Appl. Microbiol. Biotechnol. 70, 482-487 22 Wucherpfennig, T. et al. (2010) Morfologa y reologa en fi cultivos filamentosas. Adv. Appl. Microbiol. 72, 89-136 23 Riley, G. L. y Thomas, C. R. (2010) Aplicabilidad de Penicillium chrysogenum correlaciones reolgicas a caldos de otras cepas de hongos. Biotechnol. Letn. 32, 1623-1629 Cuadro 3. Monitoreo de rendimiento de los procesos fisiolgicos Diferentes estrategias se pueden aplicar y se combinaron para el seguimiento in situ del estado del proceso fisiolgico. espectroscopia de fluorescencia 2D se puede emplear para controlar la productividad y la actividad metablica de una cepa de A. niger recombinante durante cultivos fed-batch [11]. La glucosa en Streptomyces coelicolor cultivos ha sido objeto de seguimiento con precisin mediante espectroscopia NIR [60]. El rendimiento de un proceso de produccin en medios complejos para una lnea de clula animal recombinante ha sido muy bien predicho mediante la combinacin de NIR y 2D espectroscopia de fluorescencia [61]. Creemos que esta estrategia tambin describe una herramienta potencial para bioprocesos con hongos filamentosos. Desafortunadamente, es difcil desarrollar modelos fiables para los mtodos espectroscpicos. La biomasa y el caldo de absorbancia puede ocultar absorbancia de otros analitos, y los picos en los espectros pueden superponerse; muestras de filtrado tienen que ser analizados por separado con el fin de formular un modelo para un determinado analito tecla [54,60]. Las relaciones entre la tensin, el inculo, la morfologa, la reologa y el diseo de procesos con la fisiologa y la productividad son complejas. Hasta la fecha, la tecnologa analtica de procesos fiable y verificada (PAT) herramientas para el seguimiento in situ de bioprocesos de hongos filamentosos son todava escasos. estrategias de muestreo en lnea que permite automatizar en tiempo real en lnea se han sugerido medicin de parmetros para otros sistemas microbianos en los ltimos aos e ilustrar la investigacin en curso en este campo (por ejemplo, [62]). Sin embargo, las tcnicas de muestreo deben ser validados para cada aplicacin especfica [63]. Por otra parte, las herramientas PAT que se han desarrollado para sistemas unicelulares no pueden ser transferidos fcilmente a los hongos filamentosos debido a varias caractersticas especficas de hongos, tales como la morfologa de crecimiento complejo o crecimiento de la pared adherente que afecta el ensuciamiento de la sonda. Simplificado de modelado, mecanicista presenta una estrategia alternativa para predecir y controlar la productividad, reologa, y la morfologa [52]. En este contexto, un enfoque mecanicista de modelo de produccin de la enzima en A. oryzae se ha basado en los parmetros hidrulicos comunes, incluyendo la agitacin y regmenes de aireacin sino tambin 1st relaciones principales para la estequiometra de reaccin, la transferencia de masa, y el caldo de la viscosidad [45]. El modelo infiere precisin KPPS incluyendo la productividad, la viscosidad de caldo, y la transferencia de oxgeno, as como la tasa de crecimiento especfica a diferentes regmenes de cultivo.