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Tema 02. - Cultivo de Microorganismos PDF
Tema 02. - Cultivo de Microorganismos PDF
CRECIMIENTO MICROBIANO
Los cultivos de microorganismos de los que hemos hablado son asincrnicos puesto
que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular.
Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran clulas que
acaban de dividirse, otras que estn replicando su ADN, otras que estn credciendo,
otras que estn iniciando la divisin celular, etc.
Los cultivos sincrnicos son muy difciles de mantener por lo que su importancia
est principalmente ligada a los estudios bsicos de biologa microbiana. Sin embargo,
en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento
prximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronizacin del culti-
vo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente
se comporten como relativamente sincrnicas.
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Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
MEDIOS DE CULTIVO
C4H7O2N
lo que supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa alrede-
dor del 50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%), azufre (en
torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co,
Mb, Cu y Zn.
C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056
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Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser lquidos o slidos si se aade algn
agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente
agar).
En funcin de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden
ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos
mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferencia-
les cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de
microorganismos (por ejemplo medios con hemates para identificar colonias de micro-
organismos hemolticos), selectivo-diferenciales cuando combinan las dos caractersti-
cas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), y
medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganis-
mo a partir de una mezcla una poblacin mixta de gran tamao.
MTODOS DE AISLAMIENTO
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esenciales para poder estudiar las caractersticas de los microorganismos y para poder
identificarlos con seguridad.
Si la bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas que se
producen en cada divisin continan su vida independientemente formndose una sus-
pensin de clulas libres.
1.- Fase lag o de adaptacin durante la que los microorganismos adaptan su meta-
bolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones
de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.
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4.- Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del
cultivo.
Las fases, parmetros y cintica de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos
lquidos se presentan tambin en cultivos slidos. La cintica de crecimiento, en este
caso, se puede estudiar siguiendo la evolucin del nmero de clulas viables por unidad
de superficie o por unidad de masa.
Cuando una clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un substrato slido, el
resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se deno-
mina unidad formadora de colonia (UFC) a una clula bacteriana viva y aislada que si
se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la produc-
cin de una colonia en un breve lapso de tiempo. Si el nmero inicial de bacterias por
unidad de superficie es muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se lla-
ma un csped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio.
Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicacin (crecimiento)
de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las con-
diciones fsicas o qumicas del entorno. En estos casos, podramos considerar como
muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de
nuevo favorables.
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2.- Medida de la masa de clulas: el sistema se basa en que las clulas en suspen-
sin dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa en
suspensin y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parmetro de
medida ms fcil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad de clulas debe ser
del orden de 105 por ml.
6.- Medida de actividad metablica de las bacterias como que respiran producen
una disminucin del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia
del consumo de oxgeno (utilizacin de colorantes sensibles a oxidacin-reduccin tales
como el azul de metileno).
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N = N0 2n (ecuacin 1)
n=t/ (ecuacin 2)
N = N0 2t/ (ecuacin 3)
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Las ecuaciones exponenciales son muy difciles de manejar grficamente, por ello es
mejor transformarlas en otras ms simples. Para transformar una ecuacin exponencial
en una recta, tomamos logaritmos en los dos trminos y resulta:
Esto es: el logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el tiempo a razn
de una constante igual a ln2/. Si el tiempo de generacin es muy grande, el creci-
miento tendr poca pendiente (ser lento) y si es pequeo el crecimiento ser rpido.
dN/dt = N (ecuacin 5)
esto es: el incremento del nmero de clulas (dN) por unidad de tiempo (dt) es propor-
cional al nmero de clulas presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionali-
dad () se le denomina tasa de crecimiento.
N = N0 et (ecuacin 6)
esto es: el incremento del logaritmo del nmero de clulas aumenta linealmente con el
tiempo siendo la constante de proporcionalidad .
Comparando esta ecuacin (7) con la similar presentada ms arriba (4), podemos
concluir que = ln2/ y, por consiguiente, que = ln2/. Es decir, que hay una correla-
cin inversa entre el valor de la tasa de crecimiento () y el tiempo de generacin ().
Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el nmero de clulas, masa celular,
etc. despus de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos ; o bien, poder calcular la
tasa de crecimiento a partir de medidas experimentales del incremento en el nmero
de clulas, biomasa, etc.
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En funcin de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que pue-
den crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halfilos y xerfilos
segn toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente.
El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las clulas ya que,
en muchos casos, la obtencin de energa metablica depende de la existencia de una
diferencia en la concentracin de protones a ambos lados de la membrana citoplsmica.
El pH interno en la mayora de los microorganismo est en el rango de 6.0 a 7.0.
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Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de
crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra parte, la bajada del pH del
medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a
otros microorganismos competidores. As, por ejemplo, las bacterias lcticas que produ-
cen grandes cantidades de cido lctico como consecuencia de su metabolismo primario
reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacte-
rias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4.5). De esta forma, las bacterias
competidoras mueren y las lcticas se convierten en la poblacin dominante.
La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberacin
de cidos orgnicos de cadena corta (frmico, actico, lctico) por ciertas bacterias. En
este sentido, hay que tener en cuenta que la accin bactericida de estos cidos orgnicos
de cadena corta es ms potente que la debida nicamente a la bajada del pH que produ-
cen. Esto es, los cidos orgnicos de cadena corta son txicos para algunas bacterias por
s mismos.
El efecto letal del pH cido sobre los microorganismos tiene aplicacin en la conser-
vacin de alimentos acidificndolos. De esta forma, la adicin de cido actico en forma
de vinagre permite la conservacin de alimentos perecederos (escabeches, por ejemplo)
y la produccin de cidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la
vida de los alimentos (coles fermentadas, por ejemplo).
4.- Potencial redox: nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar elec-
trones, esto es: sus caractersticas oxidantes o reductoras. Uno de los factores que in-
tervienen en el potencial redox, aunque no el nico, es la concentracin de oxgeno
[O2].
Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que
otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganis-
mos presenta diferencias notables. El requerimiento de condiciones oxidantes o reducto-
ras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxgeno para que
se produzca el crecimiento.
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electrones que acta como oxidante ambiental. Por ejemplo, las bacterias que "respiran"
nitratos (NO3-), sulfatos (SO42-) u otros compuestos orgnicos oxidados (respiracin
anaerobia).
Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabo-
lismo. Esto es: en presencia de oxgeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su
ausencia, fermentativo. El rendimiento de los procesos fermentativos es menor que el
de los respirativos: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen
fermentando que cuando lo hacen respirando.
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Ys = dN/dS (ecuacin 8)
Ys = dN/dS (ecuacin 8)
= Ys qs (ecuacin 11)
Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido, tambin mayor
ser la tasa de crecimiento.
Sin embargo, hay una cierta compensacin entre la tasa de consumo del substrato y
el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de
substrato tienen rendimiento ms bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta
tasa, el rendimiento disminuye). A esta relacin inversa se le conoce con el nombre de
efecto Pasteur.
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La expresin "3engordar" est usada de forma metafrica: las bacterias no engordan. La uso porque
resulta til esta metfora antropmrfica para entender algunos de los conceptos relacionados con el ren-
dimiento de cultivos.
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En la prctica, los valores de Ks suelen ser muy bajos, lo que indica que los microor-
ganismos crecen con tasas () muy prximas a las mximas (max) a concentraciones de
substrato bajas y slo cuando estas son extremadamente bajas, la velocidad de creci-
miento se reduce. Esto es debido a que los sistemas de transporte de nutrientes suelen
tener valores de Km considerablemente reducidos (La Km indica la concentracin de
substrato a la que la velocidad de transporte es la mitad de la mxima)
Los cultivos continuos son importantes para trabajar con microorganismos que estn
creciendo constantemente de manera que sean capaces de producir constantemente pro-
ductos de inters (biomasa, metabolitos secundarios, etc.). Este tipo de cultivo es tam-
bin importante en los estudios de fisiologa y de ecologa microbiana. En la naturaleza
un ejemplo de cultivo continuo lo constituye el rumen de ciertos animales y el conjunto
de procesos microbianos intestinales de todos los animales.
QUIMIOSTATO
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donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Por consi-
guiente, las dimensiones de D son [h-1]. El valor D indica el nmero de volmenes de
reactor (volmenes de fermentador) que pasan a travs el reactor por unidad de tiempo.
Este valor es el recproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de subs-
trato est dentro del reactor.
Tiempo de generacin
concentracin de substrato
Velocidad de dilucin
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que permite calcular cmo vara la concentracin del nutriente limitante en el efluente
en funcin de la tasa de dilucin D.
TURBIDOSTATOS
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En realidad, esto no es una demostracin de que en el steady state las tasas de dilucin y crecimiento se
igualan, ya que en los cculos se parta de esta condicin para poder reformular la ecuacin de Monod.
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CULTIVO SEMI-CONTINUO
Podemos distinguir dos grandes tipos de fermentadores segn el estado del medio de
cultivo: fementadores lquidos y slidos.
FERMENTADORES LQUIDOS
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Fermentadores en tanque
La aireacin se consigue por un difusor de aire que emite desde la parte inferior de la
cuba de fermentacin. La transferencia de oxgeno al cultivo se hace por las burbujas
que van ascendiendo por el volumen de cultivo.
Fermentadores Air-lift
la entrada de aire produce un conveccin que se canaliza por un tubo vertical interior en
la cuba. La aireacin tambin permite reducir la cantidad de calor producida durante la
fermentacin.
En este fermentador, las burbujas de aire van aumentando de tamao conforme as-
cienden por el tubo interior por lo que su relacin superficie/volumen disminuye y la
transferencia de oxgeno al cultivo es menor.
Fermentadores Deep-Jet
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FERMENTADORES SLIDOS
1. Tambor
2. Bandejas
3. Sistema de lecho (bed system)
Por otra parte, existen sistemas semislidos en los que los microorganismos estn
adheridos a superficies estticas y los nutrientes pasan por filtracin o goteo a travs de
ellos (sistema de la produccin de vinagre por goteo), o los microorganismos se en-
cuentran formando agregados que se mantienen en suspensin por medio de una co-
rriente de medio de cultivo lquido (reactores de lecho fluidificado).
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