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Programa de Doctorado:
BIOTECNOLOGA
Memoria que para optar al grado de Doctor en Ingeniera Qumica presenta:
FRANCISCO
VALERO
BARRANCO,
Profesor titular
del Departament
CERTIFICAN:
Que el licenciado Antonio Snchez Ferrer ha realizado, bajo
nuestra direccin, el trabajo que, con ttulo "Recuperacin,
purificacin y caracterizacin de lipasas producidas por
Candida
rugosa.
Aplicacin
la
resolucin
de
.V
A mis padres
Agradecimientos
A lo largo de los 3 aos y medio que me ha ocupado la realizacin de este trabajo, muchas han sido las
personas que con su ayuda, atencin, saber escuchar o simple compaa se han hecho merecedoras de
aparecer en este apartado. Sin embargo, todas las tesis, corno las personas, nunca son por definicin
completas o perfectas, como estoy seguro que no lo ser la lista de gente incluida aqu en este momento.
En primer lugar, quera dedicar este trabajo a mis padres, las personas que han hecho que yo estudiara y
que siempre han procurado, dentro de sus posibilidades, que yo tuviera lo mejor.
Tambin quiero dedicar este trabajo a Laura, la que ha sido mi compaera durante todos estos aos,
recordndole la deuda que tengo con ella por todo el tiempo que este trabajo nos ha robado.
A mis amigos, Alex, Joan, Julin, Javi, Ramn, Jos Ramn y los que ahora no recuerdo, por formar parte
de mi vida y haber compartido tantas cosas conmigo, convirtindose en una parte fundamental de mi vida.
Quiero agradecer a mis directores de tesis, Paco y Javier, adems de formarme como cientfico, el haber
sabido convertirse en mis amigos, tanto que se me haga difcil llamarles ms "jefes" o "directores". A
ellos, que siempre han estado a mi lado, querra recordarles que mi compromiso personal con ellos va ms
all de estos 3 aos y medio.
Quiero dejar constancia aqu tambin de la suerte que he tenido de trabajar en un grupo de investigacin
como el de lipasas. Los conocimientos tanto cientficos como humanos que he obtenido del trabajo en este
grupo no se pueden explicar en cuatro lneas, pero me gustara citar aqu a Alberto Sanz, que ha
compartido tantas y tantas cosas y horas conmigo, Pau Ferrer y Jos Lus Montesinos, que me han
inculcado el rigor como norma de trabajo, y a Caries Casas, cuya experiencia y sentido comn han sido
uno de los pilares de mi formacin.
Mencin aparte querra hacer de Alicia, que para m ha sido como un soplo de aire fresco en momentos
crticos de mi trabajo. Su simpata, compaa y ayuda quedarn siempre en mi memoria.
A Oriol, me gustara desearle toda la suerte del mundo en su tesis.
Me gustara hacer extensivo este agradecimiento a toda la gente del Departament d'Enginyeria Qumica,
por crear el entorno de trabajo adecuado en el que ha sido posible desarrollar este trabajo.
En particular, me gustara agradecer a todos aquellos que me han demostrado que ser Doctor es algo ms
que comparecer ante un tribunal durante unos minutos y redactar un manuscrito, entre ellos a Pau Ferrer,
Jos Lus Montesinos, Montse Sarr, Joan Albiol, Jos Lus del Ro, Eugenio Ferreira, Fel Vzquez,
Nuria Adroer, Caries Campmaj y sobretodo, Goyo Alvaro, cuya colaboracin fue clave en ciertos
momentos de esta tesis.
Tambin me gustara dar las gracias a aquella gente que me ha ayudado en un momento u otro en el
laboratorio, en particular a Silvia Romero y Merc Fit.
A Juan Baeza y David Gabriel, por compartir tantos conocimientos, experiencias y otras cosillas.
A la gente del grupo de Pptidos, por el inters que demostraron y por sus aportaciones a este trabajo, en
especial, a Gloria Caminal.
A dos personas para m muy especiales que compartieron conmigo algo ms que sus horas de trabajo,
Rosi Tello y Manuel Plaza, que adems pueden sentirse coautores de este trabajo.
A la gente de la Escuela de Mollet, en particular Xavi y Ma Angels, por haber confiado en m, y a los que
espero corresponder en los prximos aos.
A Caries Sol, por sus clases.
A Manel Poch, por haberse interesado siempre en m y en mi trabajo.
A la gente de Purac Bioqumica, por los ocho meses que pas all aprendiendo a ver las cosas desde otro
punto de vista.
A Nacho, por todos los momentos que hemos compartido "en las ondas" y a toda la gente annima que he
conocido virtualmente.
A la tropa que nos reunimos a comer en la Merc, Joan, Jos Lus, Alberto, Femando, Oriol, etc. por los
ratos que hemos pasado juntos.
A las seoras de la limpieza de la UAB, por haber sido mi nica compaa en muchas horas de la
realizacin de este trabajo.
A la Generalitat de Catalunya, que me financi con una beca durante la realizacin del trabajo y a la
Universitat Autnoma de Barcelona, que me permiti la realizacin de este trabajo.
A los programas BIO-4-96-0005 (European Program on Biotechnology), QFN94-4627-C02-1 (Programa
de Qumica Fina, Plan Nacional de R+D. CIRTT, Generalitat de Catalunya) y CICYT-QUI97-0506-C03
(Programa Espaol en Tecnologas de Procesos Qumicos) que financiaron nuestro proyecto de
investigacin durante estos aos.
A toda la gente que particip en dichos proyectos y con la que he tenido la suerte de trabajar, A Marisa
Ra y su equipo de la Universidad de Vigo, a Jos Manuel Guisan y su equipo del Instituto de Catlisis y
Petroleoqumica de Madrid y a Jos Mara Snchez-Montero, Chami, Isidoro, Andrs, Jos Vicente y
compaa del Departamento de Qumica Orgnica y Farmacutica de la Facultad de Farmacia de Madrid
por su acogida cuando estuve all. Tambin me gustara acordarme de Ernst Wehtje (you really saved my
life!).
A toda la fauna del Koko, y a los buenos ratos de mi vida que han pasado all.
A los hroes (definidos por Alexis Mquina), a SK o RB, a los hermanos Gallagher y a la lluvia
ndice
NDICE
0. Resumen
1. Introduccin
11
12
12
14
1.3.3. Cromatografa
16
17
17
19
21
1.3.3.5. Cromatoenfoque
22
1.3.4. Electroforesis
22
23
26
26
27
29
32
35
35
36
37
II
ndice
1.5.3.1. Introduccin
37
38
41
43
43
1.6.2. Modelos de
46
flujo
46
47
47
48
51
53
53
58
61
64
66
1.7.5.1. Precedentes
66
68
80
81
81
83
2. Objetivos
85
3. Materiales y mtodos
87
87
3.1.1. Fermentacin
87
87
88
89
3.1.2. Separacin
90
ndice
i.J.1
91
91
92
filtracin
93
3.1.4. Electroforesis
93
94
94
94
3.1.6. Inmovilizacin
94
94
95
95
95
97
97
98
98
98
98
99
99
100
101
102
102
103
104
105
106
IV
ndice
107
108
4. Resultados y discusin
109
109
109
111
4.1.3. Conclusiones
120
121
121
124
124
125
127
4.2.3. Conclusiones
129
131
131
131
,
131
4.3.1.3. Costes
133
4.3.1.4. Amortizacin
136
136
137
4.3.3. Conclusiones
138
139
139
144
144
ndice
147
149
155
157
4.5.2. Conclusiones
162
163
163
163
164
167
170
172
4.6.4. Conclusiones
174
175
175
177
178
4.7.4. Conclusiones
182
185
185
186
188
199
205
207
212
215
VI
ndice
4.8.9. Conclusiones
223
225
225
232
234
235
4.9.5. Conclusiones
237
5. Conclusiones
239
6. Nomenclatura
241
7. Bibliografa
243
7.1. Referencias
243
262
8. Apndices
263
263
264
265
266
267
268
269
270
271
272
273
275
276
280
Resumen
0. RESUMEN
En esta memoria se presentan los resultados obtenidos en el estudio de la aplicacin de
las lipasas producidas por Candida rugosa mediante fermentacin en la resolucin de
compuestos quirales de inters farmacutico por medio de reacciones de esterificacin en
medio orgnico.
Resumen
Nordisk (que corresponde a lipasa deMucor tniehei inmovilizada sobre duolite) en reacciones
de sntesis no quiral.
Se ha desarrollado un
sistema
en continuo
para la resolucin
altamente
Introduccin
1. INTRODUCCIN
1.1. El papel de las lipasas en la Biotecnologa
1.1.1. Enzimas. Definicin de lipasas: actividad lipoltica y estersica
Una de las aplicaciones ms comunes de la Biotecnologa es la produccin y
utilizacin de enzimas. Las enzimas son substancias de naturaleza proteica y como
biocatalizadores presentan grandes ventajas sobre los catalizadores qumicos ms comunes
como son su mayor especificidad y selectividad, principalmente debido al hecho de que son
catalizadores pticamente selectivos, adems de trabajar en condiciones de reaccin cercanas
a las que se encuentran en medios fisiolgicos, al contrario de la mayora de reacciones
qumicas convencionales. Este hecho implica, adems, la ausencia de productos secundarios
con la consiguiente simplificacin, a priori, de las etapas de separacin y purificacin.
Por el contrario, las enzimas presentan una serie de inconvenientes como son su
elevado coste y su poca estabilidad en medios y condiciones alejadas de las fisiolgicamente
habituales, en particular, es marcada la dependencia de la actividad de una enzima con
factores ambientales como temperatura, presin o pH y operacionales como agitacin,
aireacin, etc. Por otro lado, la presencia de inhibiciones que modifican la actividad
enzimtica, obliga a trabajar habitualmente a concentraciones de substratos y productos bajas,
lo que muchas veces provoca un encarecimiento de la etapa de purificacin del producto de
inters.
Las lipasas (triacilglicerol ster hidrolasas: EC. 3.1.1.3) pertenecen a un grupo de
enzimas hidrolticos cuya funcin biolgica es catalizar la hidrlisis de triglicridos para
obtener como productos finales cidos grasos libres y glicerol o productos intermedios como
mono o diglicridos. En la figura 1.1 se puede observar cual sera la reaccin natural de las
lipasas en medio acuoso.
Introduccin
CH,OH
O-R
3H,O
CHOH
3RCOOH
-O R
CHiOH
HC'
O-R
Trigcrido
Glioerol
Acido graso
Introduccin
Introduccin
Por otro lado, la especificidad de las lipasas est directamente relacionada con el
microorganismo productor de las mismas. De acuerdo con esto, existen lipasas no
especficas, es decir, aqullas que hidrolizan el triglicrido en cualquiera de sus posiciones,
obtenindose como productos intermedios (1,2)(2,3)(1,3) diglicridos y monoglicridos. A
este grupo pertenece la lipasa de Candida rugosa y la de Candida crvala (Rose y Harrison,
1989). Por lo que se refiere a lipasas especficas, dicha especificidad puede ser de dos tipos:
Otras aplicaciones muy interesantes vienen dadas por la capacidad de estos enzimas de
Introduccin
O
II
R,COR2
Alcohlisis
R3OH
T
"
Lipasa
-^
i
R3COR,
ROH
un
O
II
Glicerlisis
R,COR,
un
Lipasa
UUJ
Url
/-XTT
OH
R2OH
OH
i?
R3COH
Lipasa ^
O
II
R,COH
O
II
R3COR2
O
II
R,COR4
O
II
R3COR2
Acidlisis
u
R,COR2
O
II
R3COR4
Lipasa
Introduccin
a) Reacciones de hidrlisis:
Hidrlisis de aceites vegetales en la industria oleoqumica (Piazza, 1991).
-
b) Reacciones de sntesis:
Sntesis de triglicridos (Ergan y Irani, 1991).
Sntesis de precursores de pptidos (Matos et al, 1987).
-
c) Reacciones de interesterificacin:
-
d) Reacciones de transesterificacin:
-
Introduccin
de
investigacin
en
el
campo
de
las
lipasas
como
biocatalizadores
enantiomricamente activos. Algunos de los trabajos en los que se est haciendo particular
hincapi son:
Produccin
de
agentes
antipsicticos
como
derivados
de
butiro fenonas
Introduccin
10
Introduccin
______
11
Es en este punto, en el que se tiene un gran conocimiento del sistema y una gran
monitorizacin del mismo, en el que se plantea la recuperacin de la enzima de nuestros
propios caldos de cultivos y su utilizacin en reacciones de qumica fina,
Introduccin
12
1.
2.
3.
1.
Introduccin
2.
13
3.
Decantacin: con el mismo principio que la centrifugacin pero los slidos son
separados por diferencia de densidad con respecto al lquido sometidos nicamente a la
accin de la fuerza de la gravedad.
Una vez se dispone de una corriente libre de biomasa, se impone la tarea de reducir de
forma considerable el volumen del caldo y concentrar, por tanto, el producto de inters. En
esta fase, se requerir tambin una disminucin de la concentracin de las sales u otros
complementos del medio. En este campo, existen diversas operaciones de uso muy general
(Deutscher, 1988):
1. Dilisis: usada para la eliminacin de componentes de bajo peso molecular, normalmente
sales inorgnicas, se basa en las propiedades de una membrana semipermeable que
permite el paso a molculas de un determinado corte molecular, siendo el transporte
consecuencia de una diferencia de concentracin a ambos lados de la membrana.
2. Ultrafiltracin: tambin basada en el uso de una membrana semipermeable con un rango
definido de corte molecular, aunque a diferencia de la dilisis implica el uso de fuerza
para favorecer el paso del lquido a travs de la membrana, ya sea con presin, vaco o por
fuerza gravitacional. Es una tcnica verstil cuyo uso es aplicable desde escala de
laboratorio a industrial. Las membranas de ultrafiltracin deben ser estructuras slidas,
rgidas y estables a la presin de trabajo y adems tener el corte apropiado para la
concentracin de la protena de inters, es decir, lo ms cercano posible al peso de la
protena pero asegurando la completa recuperacin. Una tendencia conocida de las
membranas de ultrafiltracin es su capacidad de adsorber protena en la superficie,
especialmente las de celulosa, siendo recomendable el uso de membranas de polisulfona
cuya afinidad qumica por las protenas es mucho menor. Otro efecto conocido en la
ultrafiltracin es la disminucin del flujo a travs de la membrana con el paso del tiempo,
fenmeno causado por la polarizacin de la membrana y que normalmente implica el
lavado de las membranas con soluciones limpiadoras de carcter alcalino, o tener
agitacin cerca de la membrana.
14
Introduccin
Introduccin
15
1) Sales inorgnicas:
Entre ellos, el sulfato amnico es, sin duda, el agente precipitante de protenas ms utilizado
(Jernejc y Legisa, 1996; Schaefer et a/., 1997) puesto que tiene una serie de caractersticas
que lo convierten en ptimo:
2) Disolventes orgnicos:
_16
Introduccin
El tratamiento con disolventes orgnicos debe realizarse con extremo cuidado en las
operaciones de precipitacin de protena para obtener buenos rendimientos (Ra et al., 1993)
Por ejemplo, en el caso del etanol, se requiere:
Adicin lenta del etanol para disminuir efectos de alta concentracin local de etanol.
1.3.3. Cromatografa
La cromatografa es una tcnica ampliamente desarrollada en la separacin de
protenas y normalmente se usa para separar la protena de inters del resto de protenas o de
otras substancias que interaccionen fuertemente con la protena como pueden ser
polisacridos u otras macromolculas.
Introduccin
17
Los rellenos de columna utilizados pueden ser de intercambio amnico (relleno con
carga positiva) o catinico (relleno con carga negativa) y la eleccin de un relleno ser
funcin del valor de los puntos isoelctricos de las protenas que contenga la mezcla. En
concreto, para protenas que se hallen a un pH superior a su pl, la carga ser negativa, con lo
que tendrn que utilizarse rellenos de intercambio aninico, y al contrario para pH inferiores
alp.
Esta tcnica est ampliamente desarrollada para la separacin de un gran rango de
protenas y es de carcter general (Breccia et al, 1998; Alfonzo et al, 1997; Cai et al, 1998),
de hecho, se ha aplicado con xito en el campo de las lipasas (Shaw y Chang, 1989; Ra et
al, 1993; Linko y Wu, 1996).
Introduccin
18
+ Peso Molecular -
42
o
Tiempo
De nuevo, la eleccin del gel a utilizar depender del tamao de las protenas que se
quieran separar. Una buena indicacin del tamao molecular la da el peso molecular, aunque
en ocasiones no sea directamente proporcional al tamao ya que ste depende de otros
factores como conformacin tridimensional, estado de agregacin, asociacin con otras
macromolculas, etc. Sin embargo, y como orientacin, el valor del peso molecular es el que
se necesita a la hora de elegir un relleno, por ejemplo, la empresa Pharmacia Biotech tiene
rangos de trabajo que van desde pptidos a protenas de 8000 kDa, como se observa en la
tabla 1.1.
La determinacin del peso molecular es, por otro lado, poco compleja mediante
19
Introduccin
tcnicas de electroforesis, con lo cual ser un primer paso imprescindible antes de elegir esta
cromatografa como posible mtodo de separacin.
Relleno
Superdex Peptide
Superdex 30
Superdex 75
Superdex 200
Superse 6
Superse 12
Sephacryl S-100
Sephacryl S-400
<10
3-70
10-600
5-5000
1-300
1-100
20-8000
Tabla 1.1.: Rangos de separacin para algunos de los rellenos de Pharmacia Biotech.
Los materiales ms habituales en los que se construyen estos geles suelen ser
altamente porosos, destacando matrices de agarosa, dextranos o acrilamida con distintas
posibilidades por lo que se refiere a recuperacin, especificidad y estabilidad.
Como su nombre indica, esta tcnica se basa en las interacciones de los grupos
hidrofbicos de la protena con un soporte de naturaleza tambin hidrofbica. En este caso, la
forma de operar es la opuesta al caso de la cromatografa de intercambio inico. La columna
se carga con la protena disuelta en una disolucin de fuerza inica elevada, favoreciendo as
su interaccin con el soporte hidrofbico. Posteriormente, la fuerza inica se va disminuyendo
de manera que las protenas van eluyndose en funcin de su hidrofobicidad creciente, como
se ilustra en la figura 1.5.
Introduccin
20
Los materiales utilizados para esta cromatografa suelen ser matrices de agarosa o
derivados con ligandos tipo isopropil, butil, octil o fenil que son los que unen a los grupos
hidrofbicos que contienen ciertos aminocidos que componen las protenas. Por lo que se
refiere a eluyentes, los ms ampliamente usados son los basados en sales de elevada fuerza
inica, siendo el ms habitual el sulfato amnico en concentraciones superiores a 1 M.
ctf
O
'c
3
N
Tiempo
Si bien esta tcnica ser slo aplicable a casos en que se tenga un conocimiento de que
la protena de inters tenga un carcter hidrofbico, hay bastantes ejemplos de aplicacin de
esta cromatografa en distintas protenas (Chen et al., 1997a; Scott et al., 1997), habiendo sido
aplicada tambin a la resolucin de lipasas (Ra y Ballesteros, 1994).
Introduccin
21
1) Afinidad por ciertos grupos funcionales, como -NKfe, -OH, -SH, -COOH, -CHO de
especial uso en la separacin de pptidos.
2) Afinidad por protenas de fusin: donde los ligandos pueden ser nquel, IgG para
protenas especficas que interaccionen con estos grupos.
3) Afinidad por anticuerpos monoclonales y policlonales: para la purificacin de
anticuerpos monoclonales y policlonales IgG, donde los grupos utilizados son Protena A
o G nativa o recombinante.
4) Afinidad por glicoprotenas: bsicamente para glicoprotenas que contienen cc-Dmanosas y a-D-glucosas donde se usan como ligandos Concavalina A y diversos tipos de
lectinas.
5) Afinidad por enzimas: el grupo ms amplio donde existen ligandos especficos para
ATPasas, desoxiribonucleasas, exonucleasas, lipasas, enzimas dependientes de NAD+ y
NADP+, fosfodiesterarsas, proteasas y endonucleasas entre otras.
6) Afinidad por otras protenas: como albmina e interferon especficamente u otros
grupos de protenas como lipoprotenas, protenas de membrana, neurotransmisores,
factores de coagulacin, factores de crecimiento, etc.
Esta tcnica tambin se puede utilizar para la separacin de otros tipos de macromolculas
como ADN o clulas (cromatografa de afinidad celular).
22
Introduccin
1.3.3.5. Cromatoenfoque
1.3.4. Electroforesis
La electroforesis se define como la migracin de macromolculas cargadas bajo la
influencia de un campo elctrico, y suele emplearse casi siempre a escala de laboratorio con
fines analticos o de caracterizacin. Normalmente, se usa una solucin de elevada fuerza
inica para concentrar e inmovilizar las protenas, y se aplica una diferencia de potencial al
gel que contiene las protenas que migraran en funcin de su carga o de su peso molecular si
previamente han sido igualadas las cargas.
El mtodo ms popular de electroforesis de una dimensin es el conocido por SDSPAGE ("Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis") usado para la
determinacin de pesos moleculares de macromolculas como las protenas, que una vez
dotadas de una carga equivalente, migran bajo la accin de un campo elctrico sobre un gel en
funcin de su tamao molecular. Los pesos moleculares de las protenas se determinan por
comparacin de sus movilidades con algunos marcadores de peso molecular conocido.
Introduccin
23
Introduccin
24
pH a lo largo del capilar que permita a las molculas, en este caso protenas, moverse hasta
alcanzar el pH correspondiente a su punto isoelctrico, en el que dejarn de moverse. En este
punto, se iguala el pH de ctodo y nodo situando el mismo compuesto (cido o base) en cada
extremo de la columna, de manera que se rompe el gradiente de pH, y las protenas salen de la
columna consecutivamente por su pl de acuerdo a como se hayan distribuido en la primera
fase (Coligan et al., 1995).
r*^ ~*$S
S
(~*
W
Capilar
/ililllllll
\
Detector
Voltaje
Tampn/muestra
Tampn
Fig. I.6.: Esquema de una CE.
Introduccin
25
26
_^
Introduccin
27
Introduccin
con los enlaces amina de los residuos que pertenecen a la cavidad de oxianin. Finalmente se
libera el alcohol, quedando el complejo acil-enzima, y mediante el ataque nuclefilo de un ion
hdroxilo se libera el cido graso y se regenera la enzima (Grochulski et al, 1993; Grochulski
etal., 1994).
73
2 cis-trans
73
cis-trans
Fig. I.7.: Conformaciones y posiciones de las dos tapas abierta (a) y cerrada (b) para lipasa de
Candida rugosa (Grochulski et al, 1994).
28
Introduccin
Lipl
5
19
22
30
35
40
45-46 49
APTA T LANGDTITGLNAI I NE A FLGIPFA E PPVG N LRFK D PVPY SG SL D G
Lip2
Lip3
Lip4
Lip5
Tabla I.2.: Secuencia de aminocidos para los distintos genes de lipasa de Candida rugosa.
Protena
Lipl
Lip2
Lip3
Lip4
Lip5
PM
57223
57744
57291
57051
56957
Pl
4.5
4.9
5.1
5.7
5.5
Puntos de glicosilacin
3
1
3
1
3
Tabla 1.3.: Prediccin terica para las distintas isoformas de lipasas de Candida rugosa.
Introduccin
___
29
En la tabla 1.4 se detalla una recopilacin de los distintos trabajos realizados por
distintos autores en la purificacin de las distintas isoformas presentes en preparados
comerciales. En la tabla tambin se indica si existe una correlacin entre las fracciones
obtenidas y alguna de las secuencias determinadas por Lotti et al. (1996) de la tabla 1.2. Esta
analoga se realiza normalmente por determinacin del N-terminal hasta el aminocido
distintivo de cada isoforma.
Introduccin
30
Procedencia
Fracciones
Caracterisitcas
Cromatografa utilizada
2 d y II)
PM=58,pI=5.6,5.8
PM=62
I. inico
Sigma
Sigma
Sigma
I. inico + 1. hidrofob.
Sigma
2 (I y II)
2 (I y II)
I inico + G. filtracin
Ra etal, (1993)
Sigma
2(AyB)(1)
PM=60,pI=5.5,4.8
I. inico + Afinidad
Sigma
Meito Sangyo
2
3
1
Sigma
2(AyB) w
I. hidrofob.+ G. filtracin
Fermentacin
2(ly2)
PM=60
PM=57,60
Autor
Veeraragavan y Gibbs (1989)
Amano
Ra y Ballesteros ( 1 994)
Gordilloefa/. (1995)
Biocatalyst
2 (1 y 2)
Sigma
3(CELl,2y3) w
"
Sigma
2(AyB)CT
PM=60
LinkoyWu(1996)
(1)
3 (A, B y C)
I. inico
I. inico
I. hidrofob.+ G. filtracin
I. hidrofob.+ G. filtracin
+ 1. inico
I. inico
La lipasa A corresponde a Lip3 con un grado de glicosilacin del 6.7 %, mientras que la
lipasa B, mayoritaria, puede corresponder a Lip 1,2,4 o 5, con un grado de glicosilacin del
2.7 %.
(2)
Variacin del mtodo propuesto para separar las isoenzimas A y B del punto(1).
(3)
(4)
CEL-1 y CEL-3 se identifican con Lipl y CEL-2 es el producto del gen Lip2, de nuevo
Lipl aparece como mayoritaria, sin embargo, contrariamente a lo descrito por Ra et al.
(1993), no aparece Lip3. En este trabajo han sido identificadas protenas de naturaleza
estersica en preparados de Sigma tipo VII (Diczfalusy y Alexson, 1996; Diczfalusy et al,
1997) por medio de cromatografa hidrofbica. Concretamente se trata de acil-CoA
tioesterasas/carboxilesterasas presentes en pequeas cantidades en el liofilizado comercial.
(5)
Como se puede observar en la tabla 1.4, los resultados obtenidos son muy diversos y
siguiendo diferentes tcnicas de purificacin o incluso cambiando de proveedor o de lote se
obtienen distintas proporciones e incluso se identifican distintas isoenzimas. Adems, en
Introduccin
31
PM (kDa)
62
64
60
60
58
pl
4.8
5.5
-
% Glicosilacin
3.6%
8.0%
5.0%
1.5%
Autor
Raetal. (1993)
Ra et al (1993)
Grochulski et al (1993)
Diczfalusye/a/. (1997)
Diczfalusy et al. (1997)
Tabla 1.5.: Resumen de los trabajos de purificacin realizados con lipasas de Candida rugosa
en los que se llega a una identificacin de un gen descrito por Lotti et al. (1996).
Otro factor a tener en cuenta es que en este tipo de cromatografas normalmente los
rendimientos obtenidos son muy bajos, contabilizando la actividad que se recupera en las
fracciones con respecto a la de partida. Esto normalmente viene compensado por unos
elevados factores de purificacin que reflejan el aumento producido en la actividad especfica.
Por ejemplo, la tabla 1.6 proporcionada por Ra et al. (1993) muestra claramente la
disminucin del rendimiento al mismo tiempo que el aumento del factor de purificacin:
Purificacin
Crudo
Prec. etanol
DEAE
Lip A
Lip B
Sephacryl
Lip A
Lip B
134
230
2.0
3.5
15
49
4.5
20
750
744
11.5
11.3
5
21
32
Introduccin
(1989) hablan de
recuperaciones del orden del 20 % y factores de purificacin cercanos a 6, mientras que datos
de Diczfalusy y Alexson (1996) obtienen rendimientos inferiores al 20 % con factores de
purificacin cercanos a 20 para el mejor de los casos.
Existe la presencia de dos isoformas, de las cuales la mayoritaria corresponde al gen Lipl.
Esta forma mayoritaria correspondiente al gen Lipl es la denominada LipB por Ra et al,
(1993).
Existen pocos estudios donde se haya determinado distinta reactividad entre las dos
isoformas mayoritarias presentes en las lipasas comerciales de Candida rugosa. De todas
formas, los primeros estudios realizados por Shaw y Chang (1989) sugeran que haba
diferencias en la actividad enzimtica de las distintas fracciones separadas al variar la longitud
de la cadena del grupo acilo del ster que se hidrolizaba. Estos resultados fueron confirmados
por Brahimi-Horn et al. (1989) cuando se compar la actividad estersica de ambas fracciones
y por Ra et al. (1993), ya que cuando separaron las lipasas A y B (que por primera vez
Introduccin
33
Sin embargo, Allenmark y Ohlsson (1992) fueron los primeros en probar distintas
fracciones de lipasas en substratos de naturaleza quiral, observando como los excesos
enantiomricos obtenidos variaban en funcin de la fraccin utilizada. Otros estudios
posteriores apuntan a que en reacciones de transesterificacin la lipasa B origin unos
resultados mucho mejores en selectividad y conversin que la lipasa A (Linko y Wu, 1996).
Sin embargo, estudios recientes (Lundell et al,
34
Introduccin
Expresin del gen en un microorganismo que codifique igual que Candida rugosa
como es Candida maltosa (Mileto et al, 1998).
Mutagnesis del gen natural de Lipl y expresin en S. cerevisiae (Brocea et al.,
1998).
Sntesis qumico-enzimtica del gen y expresin de ste en S. cerevisiae y Pichia
Pastoris (Brocea et al, 1998).
3.
Introduccin
35_
A modo de resumen, entre las ventajas de trabajar en medio orgnico se pueden citar
(Godtfredsenea/., 1985; Dordick, 1991; Kvittingen, 1994):
Mejora de la termoestabilidad.
Potencial uso de las enzimas para ser utilizadas directamente en un nuevo o ya existente
proceso qumico.
La gran variedad de reacciones que son capaces de catalizar las enzimas en medios
orgnicos.
_36
Introduccin
Las enzimas presentan inhibicin por muchos de los productos y substratos hidroflicos
que aparezcan en la reaccin.
Introduccin
37
Las enzimas necesitan esta capa de hidratacin para realizar su actividad cataltica, sin
embargo, depender de cada caso la cantidad de agua necesaria para preservar la capa de
hidratacin y en este aspecto tendr mucha importancia el tipo de disolvente utilizado y sus
caractersticas.
38
Introduccin
Adsorcin
Introduccin
39
Adsorcin
"Crosslinking"
Enlace covalente
Inclusin
Este mtodo se ha aplicado ampliamente para enzimas de todo tipo y en concreto para
lipasas (Murray et a/., 1997; Knezevic et al, 1998), en particular mediante el empleo de
soportes que favorecen las interacciones hidrofbicas (Bastida et al, 1998).
Algunos de los soportes utilizados ms comnmente para realizar este tipo de
inmovilizacin son: almina, celulosa, agarosa, concavalina A, silica gel, vidrio poroso,
resinas de intercambio inico, celitas y diversos tipos de polmeros.
Introduccin
40
Enlace covalente
Grupo funcional
del soporte
Hidroxilo
Carboxilo
Amino
Aldehido
Imidosteres
Tiol
Ejemplos de soporte
Agente acoplador
Dextranos, celulosas
Bromuro de
ciangeno
Carbodii midas
Glutaraldehdo
Nitrito sdico
Reaccin directa
Poliacrilamidas
Cermicas
modificadas
Aldehidos
polimricos
Derivados de niln
Polisacridos
modificados
Reaccin directa
Reaccin directa
Grupo reactivo de la
protena
Amino
Amino
Amino
Amino y otros
Amino
Cis-tiol
Tabla 1.7: Algunos mtodos comunes de formacin de enlace covalente entre enzima y
soporte.
Uno de los problemas ms importantes que presenta este tipo de protocolo es que las
prdidas de actividad suelen ser mayores que en el caso de la adsorcin, debido a que se
producen modificaciones qumicas en algn aminocido de la enzima.
Introduccin
41
"Crosslin king"
Inclusin
42
Introduccin
Caracterstica
Preparacin
Actividad
enzimtica
Especificidad
de substrato
Fuerza de
enlace
Regeneracin
Aplicabilidad
Coste
Enlace
covalente
Difcil
Alta
"Crosslinking"
Inclusin
Difcil
Moderada
Difcil
Alta
No
modificable
Moderada
Modificable
Modificable
Fuerte
Fuerte
No
modificable
Fuerte
Posible
Moderada
Bajo
Imposible
Moderada
Alto
Imposible
Baja
Moderado
Imposible
Alta
Bajo
Adsorcin
fsica
Fcil
Baja
Enlace inico
No
modificable
Dbil
Posible
Baja
Bajo
Fcil
Alta
Introduccin
La eleccin del trazador es de vital importancia para obtener una informacin precisa
acerca del comportamiento del fluido dentro del bioreactor. Los requisitos que debe cumplir
el trazador son los siguientes:
Introduccin
44
C"
Entrada
QL
Salida ideal
flujo pistn
tanque agitado
t'Cdt
JO
(1)
(2)
'
Introduccin
45
Entrada \,
Salida ideal
~ flujo pistn
tanque agitado
En este caso, de la aplicacin del balance de materia para el sistema se deduce el test
de consistencia, que viene dado por la ecuacin (3):
Cmaxl=mV/QL2
(3)
La curva normalizada para los experimentos en escaln se conoce como curva F que
se calcula como Qi/C/m, mientras que el tiempo de residencia real se calcula segn la
ecuacin (4):
46
Introduccin
mm
_!
' ~~ fCme,
c
Una vez conocidos los datos de distribucin de tiempo de residencia para un sistema
determinado, las caractersticas de flujo han de ser evaluadas cuantitativamente mediante el
uso de ajuste de modelos matemticos. Los modelos de flujo no ideal pueden dividirse en tres
grupos:
Modelos de dispersin: correspondientes a pequeas variaciones del modelo de flujo en
pistn.
-
(5)
Introduccin
'. =
D,
47
(6)
donde:
L es la longitud del reactor
u es la velocidad del fluido en el reactor
Dz es el coeficiente de dispersin axial.
y expresa el grado de mezcla del reactor, es decir, un Pe = O significa un sistema de tanque
agitado perfecto, mientras que Pe = oo indica un flujo pistn ideal.
Para variaciones pequeas del flujo pistn, las curvas que predice el modelo son
simtricas, mientras que para desviaciones ms considerables la forma de la curva no es
simtrica, y esto ocurre para valores inferiores de 100 del nmero de Peclet.
(N-)\
exp(-W)
(7)
Con esta ecuacin se puede generar una familia de curvas dando distintos valores a N.
48
Introduccin
zonas muertas
Comparando la curva real de DTR y las curvas tericas para diferentes combinaciones
de compartimentos y flujos, se puede determinar que modelo se ajusta mejor al reactor real.
Levenspiel (1979) realiza una descripcin detallada de algunos de los modelos
compartimentados tpicos que describen algunas situaciones reales.
Cuando
se
utilizan
biocatalizadores
inmovilizados,
existen
dos
posibles
reactor "air-lift"
mientras que los sistemas con partculas fijas se conocen como reactores de lecho fijo (Brink
et al, 1988) e incluyen los reactores de membranas.
El reactor de tanque agitado es el ms simple de diseo y uno de los ms utilizados,
aunque su uso no es recomendable para enzimas inmovilizadas debido a la poca resistencia de
las partculas al esfuerzo cortante de las palas del agitador, o en casos donde exista inhibicin
Introduccin
49
por producto, ya que trabaja a las condiciones de salida. No obstante, existen algunos trabajos
utilizando enzimas libres (Margot etal, 1998).
El reactor de lecho fluidizado se caracteriza por que las partculas del biocatalizador
se mantienen en suspensin en el reactor mediante el caudal de alimentacin, la recirculacin
del lquido o el gas producido y/o aportado al sistema. En este caso se necesitan partculas de
tamao pequeo y de densidad cercana a la del medio para favorecer la fluidizacin, con lo
que se favorece la transferencia de materia entre el medio y el biocatalizador. Sin embargo, su
principal desventaja es el mantenimiento de la fluidizacin que depende fuertemente de la
densidad de las partculas. Este sistema es poco empleado en enzimas aunque existe alguna
aplicacin con lipasas (Fishman y Zviely, 1998).
En el reactor air-Iift se distinguen dos zonas diferenciadas, de las cuales slo una es
alimentada con un gas. La diferencia de composicin en la zona aireada y la no aireada
provoca una diferencia de densidad que provoca la circulacin del fluido. De nuevo, la
ventaja de este tipo de reactores son los elevados coeficientes de transferencia conseguidos.
Existen algunos ejemplos de este tipo de reactor como son la produccin de cido glucnico
con glucosa oxidasa (Nakao etal., 1997).
Introduccin
50
muy grandes provocan poca prdida de carga pero tienen limitaciones difusionales
importantes mientras que con el uso de partculas pequeas se favorece la difusin interna
pero aumentan los problemas de prdida de carga a travs del lecho.
Este sistema est ampliamente utilizado para todo tipo de enzimas, normalmente en el
caso de medios orgnicos con enzimas inmovilizados en distintos tipos de soportes, como
acilasas (Bianchi et al, 1997), enzimas pectolticas (Dinella et al., 1997), amilasas (Arica et
al, 1998), destacando su aplicacin en sistemas de determinacin analtica tipo FIA (Flow
Injection Analysis) (Kiba et al, 1997).
Un caso particular muy utilizado en reactores enzimticos son los reactores con
membranas, cuya configuracin ms habitual es la conocida como fibras huecas (hollow
fibers). Estos reactores operan como flujos en pistn en los cuales la enzima est inmovilizada
en el espacio libre entre las fibras, el substrato difunde a travs de la membrana, reacciona con
la enzima y el producto se devuelve por difusin a la zona de suspensin homognea (Fig.
1.11).
Enzima
Inmovilizado
Producto
Alimento *
Substrato
Producto
Este sistema est muy implementado en todo tipo de enzimas como amilasas (LopezUlibarri y Hall, 1997), aunque ha sido empleado con xito junto a reactores de membrana en
general fundamentalmente utilizando lipasas debido a la capacidad de stas de inmovilizarse
en superficies (Prazeres et al, 1993; Matsumae et al, 1994).
Introduccin
51
Proceso
Fermentacin
alcohlica
Enzimas analticos
(biosensores)
Enzimas analticos
(diagnosis)
Produccin de pasta
Enzima(s)
a-amilasa
glucoamilasa
Varios
Varios
Amilasas
Carbohidrasas
Proteinasas y lipasas
Produccin de cerveza Proteasas
a-amilasa
Produccin de queso
Lipasas
Lisozima
Produccin de fructosa Xilosa isomerasa
Modificacin de aceites Lipasas
y grasas
Produccin de
Termolisina
aspartamo
Produccin de esteres
Lipasas
que dan sabores
Produccin de
emulsifi cantes
Productos
farmacuticos
Lipasas
Lipasas
Proteasas
Aci lasas
Aminotransferasas
Proteasas
Detergentes
Lipasas
Amilasas
Celulasas
Tratamiento de residuos Varios
Produccin de zumos
Varios
Acilasas
Produccin de
aminocidos
Lipasas
Produccin de
bloqueantes quirales
Proteasas
Produccin de pieles
Extraccin de aceite
Fosfolipasas
Inmovilizacin
Enzima libre
Inclusin
Crosslinking
Enzima libre
Bioreactor utilizado
tanque agitado
Enzima libre
tanque agitado
Enzima libre
tanque agitado
Enzima libre
Enzima libre
Adsorcin
tanque agitado
lecho fijo
Enzima libre
tanque agitado
Adsorcin
tanque agitado
lecho fluidizado
lecho fijo
tanque agitado
Enzima libre
Adsorcin
Enlace covalente
Crosslinking
tanque agitado
lecho fijo
Enzima libre
Enzima libre
Enzima libre
Enzima libre
tanque agitado
tanque agitado
reactor de membrana
Inclusin
reactor de membrana
Enzima libre
Enzima libre
tanque agitado
Introduccin
52
Produccin de papel
Celulasas
Enzima libre
tanque agitado
Hidrlisis de almidn
Industria textil
Produccin de vino
Enriquecer alimento
de animales
Ami lasas
Amilasas
Pectinasas
Varios
Enzima libre
Enzima libre
Enzima libre
Enzima libre
tanque agitado
Introduccin
53
Introduccin
54
primer caso se suele lavar el soporte con agua destilada o tampn mientras que en el
segundo caso se produce una deposicin de la lipasa sobre el soporte.
- Los mtodos de inmovilizacin por enlace covalente son posibles pero se emplean en
menor medida, as como los de inclusin o "crosslinking". Estos mtodos incluyen un
pretratamiento del soporte y suelen provocar prdidas o cambios importantes en la
actividad enzimtica.
-
Las lipasas inmovilizadas con distintos mtodos pueden ser utilizadas en una gran
variedad de reacciones, tanto de hidrlisis como de sntesis, as como en todo tipo de
medios, acuosos, orgnicos o bifsicos.
Introduccin
a
e
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55
C/3
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Candida
Candida
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Duolite
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Hidrlisis de
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Hidrlisis
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Hidrlisis y s
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Os
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Adsorcin
HSC
Pseudomonas sp.
y otras especies
Mucor miehei
Penicillium roquefort
Pncreas de cerdo
Rhizopus niveous
Rhizopus javanicus
Candida rugosa
No descrito
Candida antrctica
Mucor miehei
Candida antrctica
Mucor miehei
Pseudomonas
fluorescens
Candida rugosa
Selmietal. (1997)
Fureby etal. (1997)
Bagietal. (1997)
ChenyWang(1997b)
BomvQretal. (1997)
Moreno et al. (1997)
NaviayClair(1997)
De Castro y Gago
(1998)
Bourg-Garros el al.
(1998)
Lee y Swaisgood (1998)
Knezevic etal. (1998)
Adsorcin
Adsorcin
Adsorcin
Adsorcin
Covalente
Covalente
Crosslinking
Adsorcin
Inclusin
Adsorcin
Adsorcin
Covalente
Adsorcin
Crosslinking
No
S
No
No
No
No descrito
Estabilidad
Actividad
No descrito
No descrito
Actividad
Hidrlsis de aceites
Hidrlisis de grasas
Biosensores
Sntesis de amidas
quirales
Sntesis de acetatos
Actividad
Estabilidad
No descrito
No descrito
No descrito
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Enantioselectividad
No descrito
No descrito
Estabilidad
No
No
Actividad
No descrito
No
Estabilidad
Sntesis de esteres
No descrito
de ceras
Hidrlisis de grasas No descrito
Hidrlisis de esteres Estabilidad
Sntesis de esteres
Alcohlisis
Hidrlisis
Sntesis de
surfactantes
Sntesis
enantioselectiva
Sntesis
enantioselectiva
Zeolite
Clulas sobre
celulosa
Fibras huecas
Agarosa
Silica gel
Cristales
Resina acrlica
Duolite
Resina acrlica
Duolite
Vidrio poroso
Duolite
EP100
Poliacrilamida
Celita
Glutaraldehdo
Adsorcin
Resina acrlica
Candida antrctica
Adsorcin
Danielietal. (1997)
Adsorcin
Poliestireno
EP400
Resina acrlica
Candida antrctica
Hidrlisis
enantioselectiva
No descrito
Covalente
Covalente
Adsorcin
Agarosa
Silica gel
EP 100
Hidrlisis de aceite
No descrito
Adsorcin
Aspergillus niger
Candida rugosa
P seudomonas flores.
Humicola lanuginosa
Peniclium cyclopiami
Peniclium roquefort
Rhizopus delemar
Rhizopus niveus
Rhizopus jaconicus
Candida rugosa
Aspergillus niger
Candida rugosa
Candida lipolytica
Humicola lanuginosa
Mucor javanicus
Peniclium camembert
Peniclium roquefort
Rhizopus delemar
Rhizopus oryzae
Geotrichum candidum
Candida rugosa
Sntesis de esteres
Adsorcin
Celita
Polmeros
Fibras huecas
Candida rugosa
Hidrlisis de aceite
Crosslinking
Poliuretano
Candida rugosa
Balcaoetal. (1996a)
Ferreira-Dias y
da Fonseca (1995)
Basnet al. (1996)
I-
Adsorcin
HSC
Pseudomonas sp.
y otras especies
Mucor miehei
Penicillium roquefort
Pncreas de cerdo
Rhizopus niveous
Rhizopus javanicus
Candida rugosa
No descrito
Candida antrctica
Mucor miehei
Candida antrctica
Mucor miehei
Pseudomonas
fluorescens
Candida rugosa
Selmietal. (1997)
Fureby etal. (1997)
Bagietal. (1997)
ChenyWang(1997b)
BomvQretal. (1997)
Moreno et al. (1997)
NaviayClair(1997)
De Castro y Gago
(1998)
Bourg-Garros el al.
(1998)
Lee y Swaisgood (1998)
Knezevic etal. (1998)
Adsorcin
Adsorcin
Adsorcin
Adsorcin
Covalente
Covalente
Crosslinking
Adsorcin
Inclusin
Adsorcin
Adsorcin
Covalente
Adsorcin
Crosslinking
No
S
No
No
No
No descrito
Estabilidad
Actividad
No descrito
No descrito
Actividad
Hidrlsis de aceites
Hidrlisis de grasas
Biosensores
Sntesis de amidas
quirales
Sntesis de acetatos
Actividad
Estabilidad
No descrito
No descrito
No descrito
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Enantioselectividad
No descrito
No descrito
Estabilidad
No
No
Actividad
No descrito
No
Estabilidad
Sntesis de esteres
No descrito
de ceras
Hidrlisis de grasas No descrito
Hidrlisis de esteres Estabilidad
Sntesis de esteres
Alcohlisis
Hidrlisis
Sntesis de
surfactantes
Sntesis
enantioselectiva
Sntesis
enantioselectiva
Zeolite
Clulas sobre
celulosa
Fibras huecas
Agarosa
Silica gel
Cristales
Resina acrlica
Duolite
Resina acrlica
Duolite
Vidrio poroso
Duolite
EP100
Poliacrilamida
Celita
Glutaraldehdo
Adsorcin
Resina acrlica
Candida antrctica
Adsorcin
Danielietal. (1997)
Adsorcin
Poliestireno
EP400
Resina acrlica
Candida antrctica
Hidrlisis
enantioselectiva
No descrito
Covalente
Covalente
Adsorcin
Agarosa
Silica gel
EP 100
Hidrlisis de aceite
No descrito
Adsorcin
Aspergillus niger
Candida rugosa
P seudomonas flores.
Humicola lanuginosa
Peniclium cyclopiami
Peniclium roquefort
Rhizopus delemar
Rhizopus niveus
Rhizopus jaconicus
Candida rugosa
Aspergillus niger
Candida rugosa
Candida lipolytica
Humicola lanuginosa
Mucor javanicus
Peniclium camembert
Peniclium roquefort
Rhizopus delemar
Rhizopus oryzae
Geotrichum candidum
Candida rugosa
Sntesis de esteres
Adsorcin
Celita
Polmeros
Fibras huecas
Candida rugosa
Hidrlisis de aceite
Crosslinking
Poliuretano
Candida rugosa
Balcaoetal. (1996a)
Ferreira-Dias y
da Fonseca (1995)
Basnet al. (1996)
I-
58
Introduccin
Sin embargo, cuando los esteres que se hidrolizan son solubles (actividad estersica)
no existe dicha interfase y las lipasas suelen seguir cinticas de tipo Michaelis-Menten
(Redondo^ al, 1995).
No obstante, hay que sealar que en muchas ocasiones, aunque no se siga una cintica
simple, se adopta el uso de pseudocinticas de tipo sencillo como primer orden o la propia de
Michaelis-Menten como simplificacin de cinticas mucho ms complejas, originndose en
este caso lo que se conocen corno constantes aparentes (Gargouri et al., 1991; Arroyo et al.,
1996).
Cuando se trabaja con lipasas inmovilizadas, las diferencias que pueden aparecer con
respecto a la enzima libre son muy importantes, obtenindose constantes cinticas que pueden
Introduccin
59
diferir en rdenes de magnitud para enzimas libres e inmovilizados sobre diferentes soportes o
mediante distintas tcnicas. Por ejemplo, Snchez et al. (1996) obtienen para Candida rugosa
cambios de hasta 20 veces en las constantes cinticas cuando se inmoviliz covalentemente la
enzima en silica y agarosa, aunque estos cambios eran notablemente diferentes en el caso de
que se tratara de actividad estersica o lipoltica. Al mismo tiempo, cuando las lipasas
inmovilizadas se utilizaron para llevar a cabo reacciones quirales, las velocidades de reaccin
para cada enantimero eran distintas.
Otros autores, sin embargo, han encontrado diferentes resultados para otros tipos de
lipasas. Lieberman y Ollis (1975) utilizando mtodos de inmovilizacin tipo "crosslinking"
con lipasa pancretica sealan la obtencin de los mismos parmetros cinticos para la enzima
libre e inmovilizada. Pencreac'h y Baratti (1997) con lipasas de Pseudomonas cepacia
observan que la enzima libre o inmovilizada sobre polipropileno poroso obedeca a cintica de
Michaelis-Menten pero con constantes variables segn el tipo de substrato con respecto a la
lipasa libre.
Por lo que se refiere a lipasas libres e inmovilizadas trabajando en medio orgnico,
recientemente se han publicado diversos trabajos proponiendo distintas cinticas asociadas a
diversos mecanismos de reaccin, adems de las clsicas pseudocinticas descritas para
medios acuosos. Entre ellas destacan:
Introduccin
60
-r
e
Fig. 1.12: Esquema del mecanismo de una reaccin de esterifcacin segn el modelo PingPong Bi Bi descrito por Chen y Wang (1997b). E: enzima. S: cido graso, W: agua, C:
alcohol, P: ster, EC: complejo enzima-alcohol, ES: complejo enzima-cido graso, E*S:
complejo acil-enzima, E*SC: complejo intermediario.
5) Por ltimo, sealar que en trabajos recientes se ha llegado a diferenciar distintos
comportamientos cinticos para isoenzimas A y B puros de lipasa de Candida rugosa
(Plou et al., 1997). En el trabajo se constata como para distintos substratos las cinticas
podan ser diferentes para ambos isoenzimas. A modo de resumen:
-
Actividad lipsica (tributirina): el valor de la constante especfica aparente de MichaelisMenten es el doble para la lipasa A.
Introduccin
61
Los cinco tipos de bioreactores que ms comnmente se han empleado con lipasas
inmovilizadas son:
-
reactor de membrana
En el trabajo deBalcao etal. (1996b) se recogen con detalle muchos de los trabajos en
de tanque agitado
son
los
ms utilizados,
caracterizndose por un sistema de operacin sencillo as como una recuperacin simple por
filtracin o centrifugacin de la enzima. Sin embargo, el problema de operar en discontinuo
genera la aparicin de tiempos de carga y descarga que limitan en ciertos procesos su
aplicacin a gran escala. En esteriflcaciones en medio orgnico, donde se produce agua que
puede ser causante de un descenso en el rendimiento del reactor, normalmente este sistema
tendr que llevar acoplado un sistema efectivo de eliminacin del agua de los que el ms
habitual es la adicin de sales o de tamiz molecular (Vzquez-Lima et al., 1995; Han y Rhee,
1998). En este sistema se han desarrollado la mayora de reacciones descritas con lipasas tanto
libres como inmovilizadas (Balcao etal., 1996b).
62
Introduccin
Los reactores de lecho fijo constituyen una buena alternativa debido a su alta
eficacia, facilidad de constmccin y forma de operar (como reactor de flujo pistn) y han sido
utilizados tradicionalmente en operaciones a escala industrial. En este caso tambin suele ser
necesario algn sistema de control de agua en reacciones de esterifcacin (Rosell et al.,
1996). Normalmente, los problemas asociados a este tipo de reactor son la prdida de carga a
travs del reactor y la posible limitacin de la difusin. Esta configuracin de reactor se ha
empleado en reacciones en medio orgnico incluyendo sntesis de esteres, interesterificacin,
transesterificacin, alcohlisis y en algunas casos para hidrlisis de aceites cuando la
inmovilizacin era de tipo covalente (Balcao et al., 1996b) y en algunas resoluciones de
mezclas racmicas (Battistel et al., 1991).
Por lo que se refiere al reactor continuo de tanque agitado, su uso es bastante
limitado a pesar de su bajo coste debido a que normalmente requiere mayor volumen de
reaccin para las cinticas que describen el comportamiento de las Hpasas. Otro impedimento
importante que presenta es el efecto negativo que suele tener la agitacin mecnica sobre el
soporte de inmovilizacin y sobre la propia enzima (Lee y Choo, 1989). Esta configuracin se
ha empleado en algunas reacciones de hidrlisis, acidlisis y sntesis de esteres (Balcao et al.,
1996b).
El reactor de lecho fluidizado se presenta como un intermedio entre los dos tipos
anteriores y es una opcin para eliminar restricciones difusionales. Sin embargo, su
complejidad de operacin ha limitado su uso con Hpasas a algunas reacciones de
esterifcacin (Balcao et al, 1996b).
Los reactores de membrana han sido ampliamente utilizados con Hpasas. En estos
reactores, la lipasa se inmoviliza en una membrana, que puede ser en forma de superficie o en
forma de fibra hueca. Estos reactores son muy indicados en sistemas bifsicos y su principal
problema operacional es el de la polarizacin de la membrana. Un resumen de las posibles
configuraciones se recoge en el trabajo de Prazeres y Cabral (1994). Los tipos de membranas
que se han utilizado son muy variables, hidroflicas e hidrofbicas, aunque en trabajos
recientes se sealan las hidroflicas como las mejores en trminos de productividad (Bouwer
et al., 1991).
Introduccin
63
Algunas de las reacciones en las que se han aplicado con xito lipasas inmovilizadas en
reactores de membrana se detallan en la tabla 1.11.
Autor
Lipasa
Reaccin
Hoqetal. (1984)
Chromobacterium
viscosum
Sntesis de
glicridos
Hoqetal. (1985)
Candida rugosa
Hidrlisis de
aceite de
oliva
Glicerlisis de
grasas
Thermomyces lanuginosus
Hidrlisis de
grasas
Pronke/a/. (1988)
Candida rugosa
Hidrlsis de
triglicridos
Hidrlisis de
aceite
Tipo de
membrana
Microporosa de
polipropileno
(Hidrofbica)
Microporosa de
polipropileno
(Hidrofbica)
Microporosa de
polipropileno
(Hidrofbica)
Microporosa de
niln
(Hidrofbica)
Celulosa
(Hidroflica)
Microporosa de
polipropileno
(Hidrofbica)
Configuracin
Superficie
Fibra hueca
Superficie
Superficie
Fibra hueca
Fibra hueca
64
Introduccin
Este valor relaciona la conversin total con el exceso enantiomrico para dar un valor entre O
para reaccin no enantioselectiva e infinito para una reaccin completamente enantioselectiva.
En trminos generales, se considera una reaccin enantioselectiva a partir de valores de E
superiores a 25, aunque este valor depende fuertemente de la rente consultada. La ventaja de
usar este valor es que no depende de la conversin y, por tanto, no ha de variar a lo largo de la
reaccin, teniendo su origen en consideraciones cinticas. Tambin puede ser calculado a
partir del EE del producto o del reactivo.
Conversin (X):
Este valor tiene el significado general de conversin, con lo que se puede calcular de distintas
formas a partir de las concentraciones de productos o reactivos.
Introduccin
65
Inhibicin enzimtica
Concentracin en exceso de enzima
Homogeneidad de las fases
Equilibrio qumico
Mezcla incompleta
Tipo de reactor
Aunque los parmetros descritos por Chen et al. (1982) han sido ampliamente
utilizados en todo tipo de resoluciones (Kazlauskas et al., 1991; Chiou et al., 1992;
Santaniello et al., 1993, Secundo et al., 1997), algunos autores proponen otras formas de
cuantificar la enantioselectividad; as, Straathof et al. (1995) proponen el uso de un balance
quiral en el caso de que la resolucin sea cintica,
= EEIEET
V (10)
'
66
Introduccin
Las principales razones que han motivado este cambio en el inters por este tipo de
compuestos son:
Cambios en la normativa de regulacin del uso de este tipo de medicamentos. Las nuevas
normativas promovidas por las autoridades correspondientes estn favoreciendo
fuertemente el desarrollo de productos farmacuticos que contengan nicamente el
enantimero biolgicamente activo y no la mezcla racmica, siendo prohibida, en un futuro
no muy lejano, la presencia del racmico incluso en aquellos casos en que parezca ser
inocuo la presencia del biolgicamente no activo.
67
Introduccin
Compuesto
Acido 2-fenil
propinico
Frmula
Estructura
HO
O
Ibuprofeno
C13H1802
Naproxeno
Ketoprofeno
Flunoxaprofeno
Ci6Hi2FN03
Benoxaprofeno
Ci6H12ClN03
Flurbiprofeno
Ci5H13F02
Tabla 1.12: Estructuras de algunos de cidos 2-aril propinicos resueltos con lipasas.
68
Introduccin
Introduccin
69
Suministrador
Biocatalyst (UK)
Sigma (USA)
Meito-Sangyo (JP)
BDH(UK)
Novo Industri (DM)
Origen microbiano
Candida rugosa
Geotrichum candidum
Rhizopus arrhizus
Aspergillus niger
Penicillium cyclopium
Aspergillus niger
Candida rugosa
Pseudomonas fluorescens
Mucor javanicus
Rhizopus arrhizus
Candida rugosa
Extracto de pncreas porcino
Candida rugosa
Candida rugosa
Rhizomucor miehei (Lipozyme IM)
Candida antrctica (Novozyme 435)
Tabla 1.13: Principales lipasas comerciales probadas para la esterifcacin de cidos 2-arilpropinicos en medio orgnico (Mustranta, 1992).
70
Introduccin
De todos estos preparados enzimticos los nicos que fueron capaces de realizar la
sntesis del ibuprofeno fueron los derivados de Candida rugosa, Mucor javanicus, y los
preparados de Novo Industri de Khizomucor miehei y Candida antrctica, catalizando
preferencialmente la esterificacin del S-enantimero. Mustranta (1992) centr sus estudios
en el preparado de Candida rugosa por la mayor enantioselectividad mostrada en
comparacin con la de Khizomucor miehei bajo las mismas condiciones de ensayo. Pero
tambin existen estudios interesantes de la resolucin del ibuprofeno con Mucor javanicus
(Goto et al, 1996), Rhizomucor miehei (Lpez-Belmonte et al, 1997) y Candida antrctica
(Arroyo y Sinisterra, 1994).
Es muy curioso tambin ver las diferencias manifiestas entre los preparados
suministrados por los diversos proveedores. Si bien esta dispersin podra entenderse entre
diferentes suministradores, se han encontrado discrepancias en las propiedades catalticas de
un mismo suministrador dependiendo del lote utilizado. Estas variaciones muchas veces no
slo deben imputarse al suministrador, sino tambin a la manipulacin del preparado y al
almacenamiento del mismo (Tsai y Dordick, 1996b).
Los resultados se recogen en la tabla 1.14. En dicha tabla se observa una correlacin
entre los valores de actividad de hidrlisis frente a aceite de oliva con los de esterificacin de
ibuprofeno, mientras que esta correlacin no existe en el caso del contenido en protena total.
Segn esto, una medida de actividad lipoltica sera ms representativa que una de protena
total.
71
Introduccin
Suministrador
A. Lipoltica (U/mg)
(aceite de oliva)
Protena (%)
670
750
145
77
85
10.0
12.9
9.0
7.3
7.0
Biocatalyst
Meito-Sangyo
Amano
BDH
Sigma
Rendimiento de la
esterifcacin de
ibuprofeno
(u,mol/g de lipasa)
480
432
168
48
24
72
Introduccin
Ketoprofeno > ibuprofeno > cido 2-fenil-propinico > flurbiprofeno > naproxeno
Introduccin
73
Concentracin de la enzima
Fuente
Bibliogrfica
Mustranta (1992)
Arroyo y Sinisterra
(1994)
KimyLee(1996)
Goto et al. (1996)
Lpez-Belmonte et
al. (1997)
T sai et al. (1997)
Preparado enzimtico
C. rugosa (Biocatalyst)
Candida antrctica
Novozyme 43 5 (Novo)
C. rugosa (Sigma)
C. rugosa (Amano)
M. Javanicus (Amano)
Rhizomucor miehei
Lipozyme IM20 (Novo)
C. rugosa (Meito Sangyo)
Volumen de
reaccin (mi)
40
10
Cantidad utilizada
(mg)
100-500
100-500
10
-
300-500
0.2 g/1
10
300-700
25
250
74
Introduccin
75
Introduccin
La agitacin es un factor menos estudiado y que aparentemente entre 300 y 700 rpm
(con agitacin magntica) no parece afectar significativamente a las prestaciones de la
reaccin enzimtica.
Tipo de disolvente
El estudio de la naturaleza del disolvente ha sido fuente de muchos trabajos y se ha
demostrado la gran influencia que tiene sobre la actividad y estabilidad de la enzima
(Kvittingen, 1994; Carrea et al., 1995; Ducret ei al., 1998). Es un hecho que la actividad
cataltica de las lipasas microbianas en medios orgnicos es mayor en disolventes no polares
que en disolventes de naturaleza ms hidroflica, incluso miscibles en agua.
Disolvente
Acetona
Dietileter
Cloroformo
Tolueno
Pentano
Ciclohexano
n-Hexano
Heptano
Isooctano
Decano
Log P
-0.25
0.85
2.00
2.50
3.00
3.20
3.50
4.00
4.50
5.60
Tabla 1.16.: Valores de log P para distintos disolventes (Laane et al., 1987).
76
Introduccin
El valor de log P por debajo del cual no se observa actividad enzimtica depender del
tipo de lipasa microbiana. Por ejemplo, para Lipozyme BVI20 de Novo Nordisk (lipasa de
Rhizomucor miehe) slo aparece actividad por encima de valores de 2, mientras que para
Candida rugosa el valor mnimo es del orden de 3. Estas variaciones se justifican por el hecho
de que para disolventes por debajo del valor de 2 del log P, los disolventes son capaces de
separar el agua esencial de las enzimas, que juega un papel primordial en el mantenimiento de
la conformacin nativa de la enzima (Reslow e a/., 1992).
La relacin entre log P y la conversin parece clara, cuanto mayor es log P mayor es la
conversin. No obstante, esta correlacin es mucho ms difusa al compararse con la
enantioselectividad, en cuyo caso no existe una relacin clara. Estudios recientes (Ducret et
al., 1998) con lipasa B de Candida antrctica atribuyen diferencias de enantioselectividad y
conversin a la conjuncin de dos factores como son el log P y la actividad de agua del
medio, adems de sugerir el uso de otras caractersticas del disolvente, como la constante
dielctrica, el ndice normalizado de acotacin de electrones o la solubilidad de Hildebrand
como parmetros de comparacin.
Los disolventes ms utilizados son isooctano y n-hexano, este ltimo pese a tener un
log P menor y menores prestaciones (Vzquez-Lima et a/., 1995) es muy utilizado debido a su
amplio uso en procesos industriales (Mustranta, 1992).
Introduccin
77
Fig. 1.13: Sistema de control de actividad de agua diseado por Wehtje et al. (1997).
Otros autores disean diversos sistemas de control o eliminacin de agua, como son
evaporacin o pervaporacin (Van der Padt et al., 1993; Kwon et al., 1995) mediante el
acoplamiento de condensadores, la adicin de tamiz molecular (Vzquez-Lima et al., 1995;
Han y Rhee, 1998) o ajustando el medio de reaccin a una actividad de agua fijada por el
contacto con una sal de hidratacin conocida (Svensson et al., 1994; Dudal y Lortie, 1995).
78
Introduccin
Por otro lado, Ducret et al, (1998) hacen un estudio riguroso de la esterifcacin del
ibuprofeno con lipasa de Candida antrctica tipo B (Novozym 435) con distintas actividades
de agua y su influencia en la enantioselectividad obtenida. En este trabajo se constata como
cada enantimero presenta un comportamiento distinto a variaciones en el contenido de agua,
resultando as una dependencia entre la enantioselectividad y el contenido en agua. As, con
disolvente hidrofbicos con actividad de agua controlada se obtiene una mayor conversin,
pero los mejores resultados en trminos de enantioselectividad se obtiene con disolventes ms
hidroflicos.
Por ltimo, sealar que recientemente el empleo de las isotermas de adsorcin de agua
tanto de enzimas libres como inmovilizados se ha demostrado como una herramienta til para
predecir las necesidades de agua y el comportamiento de los preparados enzimticos en medio
orgnico (De la Casa et al., 1996).
Introduccin
79
Tiempo de reaccin
Este es un factor muy variable y que depender en gran medida de la carga enzimtica
utilizada, y de otros factores clave como lipasa utilizada, contenido de agua, disolvente,
temperatura, etc. pero recopilando los trabajos sobre el tema se puede generalizar a que un
tiempo mnimo de reaccin estar entre las 24 y las 48 h, mientras que la mayora de casos se
sita entre las 100 y 200 horas, pudiendo llegar hasta 500 horas de reaccin.
Modificacin de la enzima
En este captulo tambin se puede incluir las modificaciones originadas al utilizar las
lipasas inmovilizadas covalentemente. En este tipo de inmovilizacin se produce siempre una
modificacin qumica en alguno o algunos aminocidos de la protena, lo que puede provocar
cambios en la actividad y enantioselectividad de la enzima (Snchez et al., 1996; Moreno et
al, 1997).
Otro tipo de modificaciones son las originadas por el hecho de tratar la enzima con
disolventes polares de cadena corta. As, Chamorro et al. (1998) describen como el
tratamiento del crudo de lipasa de Candida rugosa proporcionado por Sigma con disolventes
80
Introduccin
Introduccin
81
3. Estimacin del capital circulante: referido el capital que entra en el ciclo de produccin
pero que es retornado incluye valor de materias primas en existencia, de productos an no
cobrados, en almacn o en ciclo de produccin as como repuestos y existencias en caja,
bancos o valores. Suele estimarse como un porcentaje del inmovilizado (Vin, 1991).
4. Estimacin de costes: los costes se dividen en dos tipos que a su vez se dividen en varios
subtipos:
a) Costes de fabricacin: que se dividen en:
Costes directos: asociados directamente a la fabricacin del producto:
- Materia prima
- Mano de obra directa
82
Introduccin
- Patentes
Costes indirectos: no asociados al producto:
- Mano de obra indirecta
- Servicios generales
- Suministros
- Conservacin
- Servicios generales
- Mantenimiento
- Laboratorio
- Envasado
- Expedicin
- Directivos y tcnicos
- Amortizacin
- Alquileres
- Impuestos
- Seguros
b) Costes generales:
- Gastos comerciales
- Gerencia
- Gastos financieros
- Investigacin y servicios tcnicos
83
Introduccin
1 .8.2. Clculo de Net Cash Flow CNCF) y Rent Discounted Cash Flow (RDCF)
Una vez conocidas las distintas partidas necesarias para la evaluacin del proceso, la
rentabilidad de un proceso se suele evaluar por el valor del KDCF ("Rent Discounted Cash
Flow") que es el valor del inters para el cual el valor actual neto (VAN) de todos los ingresos
y desembolsos es nulo para la inversin propuesta. En funcin de este valor se decidir si la
inversin es lo suficientemente atractiva.
ai)
donde i es el valor del RDCF que queremos calcular, t es el valor en aos que dura el proceso
(su vida esperada) y NCF ("Net Cash Flow") el movimiento neto de caja para cada ao que se
puede calcular de forma simple como:
NCF = Beneficios netos - Capital Inmovilizado ^ Capital Circulante (**}
* Suele aplicarse el ao O
** De signo negativo en el ao 1 y de signo positivo en el ao t
84
Introduccin
84
Introduccin
Objetivos
85
2. OBJETIVOS
El objetivo principal del trabajo es la utilizacin de las lipasas producidas por Candida rugosa
mediante fermentacin a escala piloto en la resolucin de compuesto quirales con
aplicabilidad en la industria farmacutica.
5. Diseo de una biocatalizador con lipasas UAB inmovilizadas en algn soporte que
permita su uso en medio orgnico y su recuperacin del medio. Comparacin con lipasas
comerciales inmovilizadas.
Objetivos
86
orgnico.
Determinacin de
las
Materiales y Mtodos
87
Un fermentador Braun Biolab de 1.5 litros de capacidad mxima, con 0.5 litros de
volumen de trabajo.
pH: 6.3.
Control de la velocidad de agitacin: 500 rpm para todos los casos excepto en el Braun
Biostat UD donde se trabaj a 400 rpm.
Materiales y Mtodos
88
Agua desionizada
Extracto de malta
Adsa-Micro
Extracto de levadura
Pronadisa
Triptona
Adsa-Micro
Agar bacteriolgico
Adsa-Micro
KH2PO4
K2HP04
Na2HP04.12H20
(NH4)2SO4
MgS04-7H2O
Panreac pursimo
NH4OH30%
FeCl3-6H2O
Panreac pursimo
Inositol
Biotina
Tiamina-HCl
Antiespumante
Braun Biotech
cido oleico
Sigma pursimo
El medio de cultivo est formado por una solucin bsica de composicin por litro: KH2PO4, 15
g; K2HPO4, 5.5 g; (NH4)2SO4, 4 g; MgS04.7H20, 1 g; biotina, 0.008 mg; tiamina.HCl, 0.2 mg;
inositol, 0.004 mg y FeCl3, 10 mg.
Materiales y Mtodos
89
90
Materiales y Mtodos
3.1.2. Separacin
Para la separacin de la lipasa del medio de cultivo se utiliz la siguiente instrumentacin:
1) Centrifugacin: centrfuga en continuo Westfalia Separator AG (CSA 1-06-475)
trabajando a SOOOg y 20 1/h. Para volmenes menores de 5 litros se utilizaron las
siguientes centrfugas:
-
2) Microfltracin 0.45 |am: Minitan Millipore con 4 membranas PVDF 0.45 um de corte.
Para volmenes menores a 5 1 se puede utilizar un sistema tradicional de filtracin al vaco
mediante filtros de fibra de vidrio (Whatman GF/F) de 0.45 un de tamao de poro.
3) Ultrafltracin 10 kDa: Centrasette Pali Filtren con 1 membrana OMEGA 10K de corte.
Otros sistemas alternativos para volmenes menores son los siguientes:
-
Sistema Minitan Millipore equipado con 4 membranas PMNL de 10 kDa de corte para
volmenes no superiores a 5 1.
Sistema Prep/Scale TTF Millipore con un PTGC 10 K 2.5 ft2 Cartridge hasta 15 1.
4) Precipitacin de la protena:
-
Precipitacin con etanol: la muestra se trata con 2 volmenes de etanol a 0C. La solucin se
mantiene constantemente agitada a 0C durante la adicin y se deja agitando durante 1 h. La
protena precipitada se separa por centrifugacin a SOOOg y el pellet se seca a temperatura
ambiente.
5) Lioflizacin: las muestras se congelan previamente con nitrgeno lquido o una mezcla de
nieve carbnica/acetona y se liofilizan durante 24 h en un liofilizador Virtis Sentry 5L.
Materiales y Mtodos
91
Materiales y Mtodos
92
1.0 -
Mtodo en escaln
Mtodo en gradiente
0.4 -
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Tiempo (min)
Columna Pharmacia HR 10/30 (24 mi) con relleno Pharmacia Superdex 75 (separacin
entre 3 y 70 kDa).
Columna Pharmacia HiLoad 26/60 (325 mi) con relleno Pharmacia Superdex 200
(separacin entre 10 y 600 kDa).
Materiales y Mtodos
93
La descripcin del mtodo empleado tal y como se program con el software empleado se
halla en el captulo 8.13.
3.1.4. Electroforesis
SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) se llev a
cabo en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con los protocolos descritos por Laemmli
(1970), en geles al 12 y 15 % de poliacrilamida. Las electroforesis se realizaron en un Mini
Protean II cell de Biorad.
Las protenas fueron visualizadas con tincin de Coomassie Brilliant Blue o Nitrato de
Plata dependiendo de la concentracin de protena y de acuerdo con los protocolos estndar.
Los polisacridos (y glicoprotenas) fueron teidos con reactivo de Schiff de acuerdo con el
protocolo descrito por Jay et al. (1990).
94
Materiales y Mtodos
3.1.6. Inmovilizacin
3.1.6.1. Inmovilizacin sobre Celita y Poliamida
Se disuelve la cantidad necesaria de preparado liofilizado para obtener 15000 U de
actividad lipoltica en 1 mi tampn Tris-HCl 20 mM a pH=7.40. Sobre este volumen se
aaden 1 g de celita 545 (Fluka) y poliamida 11 (Merck) respectivamente, homogeneizando
continuamente la mezcla slido-lquido. En este mezcla, una proporcin ptima es la de 1 g
de soporte/mi de enzima disuelto. Una vez aadida la cantidad total de soporte se liofiliz
hasta peso constante. La enzima inmovilizada se guarda a -20C.
Materiales y Mtodos
95
(^ester + Ur H~ C-
(JclOO)
Materiales y Mtodos
96
el exceso enantiomrico siempre se refiere a uno de los dos enantimeros, y puede referirse al
producto o al reactivo. En el caso estudiado, se referir al exceso enantiomrico del reactivo.
El exceso enantiomrico tomar valores entre el O y el 100 %.
Pureza (PV.
Pr =
Cr
-(xlOO)
Cr + C
G
0100)
G+G
la pureza, al igual que el exceso enantiomrico, tambin se refiere a uno de los dos
enantimeros. En el caso estudiado, se referir a la pureza del reactivo. La pureza tomar
valores entre el O y el 100 %.
Enantioselectividad (E):
este valor relaciona la conversin total con el exceso enantiomrico para dar un valor entre O
para reaccin no enantioselectiva e infinito para una reaccin perfectamente enantioselectiva.
En trminos generales, se considera una reaccin enantioselectiva a partir de valores de E
superiores a 25.
Materiales y Mtodos
97
98
Materiales y Mtodos
Materiales y Mtodos
99
Acetonitrilo.
Procedimiento
Se prepara una solucin que contenga un 80 % de tampn fosfato 0.05 M a pH=7.0 y un 20 %
de acetonitrilo. Se diluye el PNPP 200 mM 500 veces con la solucin anterior. Se lee a 348
nm y a 25 C en cubetas de ultravioleta a doble haz y siempre comparando con blancos de
hidrlisis. Se emple un Espectrofotmetro UV-VIS Varan Cary 3.
El volumen del ensayo es de 1 mi, 750 \i\ de substrato y 250 ul de muestra, se lee la
absorbancia durante 6 minutos cada 30 segundos. La pendiente obtenida se correlaciona con
la actividad estersica dentro del rango de 0.005 a 0.030 U/ml (ver Apndices 8.2).
Reactivos
A. Solucin acuosa NaaCCb al 5 %.
B. Solucin acuosa de tartrato sdico potsico al 1 % en la que se disuelve CuS04.5H2O al
0.5 %.
100
Materiales
Mtodos
C. Reactivo de Folin-Ciocalteau 1 N en
D. Solucin estndar de albmina de suero bovino 400 |ig/ml.
E. Solucin de NaOH 1 N.
Procedimiento
1 . Se aaden 2 ml de B en 48 ml de A inmediatamente antes de la realizacin del anlisis.
2. Se prepara una curva de calibrado (ver Apndices 8.3) a partir de la solucin D con las
siguientes concentraciones de albmina: O, 20, 40, 80, 120, 160, 240 ug/ml.
3. A un volumen final de muestra de 0.5 mi se aaden 0.5 mi de E.
4. Aadir 2.5 mi de la mezcla de reactivos preparada en 1, agitar y esperar 10 minutos.
5. Aadir rpidamente 0.5 mi de reactivo C y esperar 30 min (mximo 60 min).
6. Leer la absorbancia a 750 nm.
Materiales y Mtodos
101
Materiales y Mtodos
102
8.6).
Materiales y Mtodos
103
Instrumentacin:
- Cromatgrafo de gases Hewlett Packard 5890.
- Inyector automtico Hewlett Packard 7673 A.
- Detector de ionizacin de llama.
- Integracin Millenium 2.15.01.
Condiciones cromatogrficas:
- Columna: HP-INNOWax (Crosslinked Polyethylene Glycol) 30 m x 0.25 mm x 0.25 \im f.
- Portador: He.
- Inyeccin: 1 ui, split 50:1.
- Tiempo de anlisis: 10 minutos.
- Temperatura horno: isoterma 40 C.
- Temperatura inyector: 250 C.
- Temperatura detector: 275 C.
- Presin de retroceso: 24 psi.
- Flujo purga del septum: 4.9 ml/mi n.
- Flujo divisin con venteo: 52 ml/min.
Materiales y Mtodos
104
Instrumentacin:
- Cromatgrafo de gases Hewlett Packard 5890.
- Inyector automtico Hewlett Packard 7673 A.
- Detector de ionizacin de llama.
- Integracin Millenium 2.15.01.
Condiciones cromatogrfcas:
- Columna: HP-INNOWax (Crosslinked Polyethylene Glycol) 30 m x 0.25 mm x 0.25 um f.
- Portador: He.
- Inyeccin: 1 ui, split 50:1.
- Tiempo de anlisis: 10 minutos.
- Temperatura horno: isoterma 40 C.
- Temperatura inyector: 250 C.
- Temperatura detector: 275 C.
- Presin de retroceso: 24 psi.
- Flujo purga del septum: 4.9 ml/min.
- Flujo divisin con venteo: 52 ml/min.
Materiales y Mtodos
105
Instrumentacin:
- HPLC Hewlett Packard 1050.
- Detector de ndice de refraccin Hewlett Packard 1047A
- Integracin Millenium 2.15.01.
Eluyente:
Como fase mvil se utiliza cido sulfrico 0.015 M disuelto en aguaMilliQ (resistencia<18.2
Q) a pH=3.0. El eluyente es filtrado a travs de 0.45 um y desgasificado mediante vaco.
Condiciones cromatogrficas:
- Columna: Aminex HPX-87H de Biorad.
- Caudal: isocrtico 0.6 ml/min.
-Inyeccin: 15 ul,
- Tiempo de anlisis: 30 minutos.
- Temperatura: 65 C.
106
Materiales y Mtodos
Instrumentacin:
- Cromatgrafo de lquidos Hewlett Packard 1090.
- Detector DAD a 226 nm.
Eluyente:
Como fase mvil se utiliza Hexano, Isopropanol, cido trifluoroactico (1000:10:1).
Condiciones cromatogrficas:
- Columna: fase normal Chiracel OD, de Daicel Chemical Industries LTD.
- Caudal: socrtico de 1.0 mi por minuto.
- Volumen de inyeccin: 5 ul.
- Tiempo de anlisis: 20 minutos.
- Temperatura: Ambiente.
Materiales y Mtodos
107
Eluyente:
Como fase mvil se utiliza Hexano, Isopropanol, cido trifluoroactico (1000:10:1).
Condiciones cromatogrfcas:
- Columna: fase normal Chiracel OD, de Daicel Chemical Industries LTD.
- Caudal: isocrtico de 1.0 mi por minuto.
- Volumen de inyeccin: 5 |il.
- Tiempo de anlisis: 15 minutos.
- Temperatura: Ambiente.
108
Materiales y Mtodos
Instrumentacin:
- Cromatgrafo de lquidos Hewlett Packard 1090.
- Detector DAD a 215 nm.
Eluyente:
Como fase mvil se utiliza Hexano, Isopropanol (100:2).
Condiciones cromatogrfcas:
- Columna: fase normal Chiracel OD, de Daicel Chemical Industries LTD.
- Caudal: socrtico de 1.0 mi por minuto.
- Volumen de inyeccin: 10 ul.
- Tiempo de anlisis: 15 minutos.
- Temperatura: Ambiente.
Resultados
109
Braun Biostat UD
(50 1) Discontinuo
So=2 g/1
Xf=2.6 g/1
Lf=10.5 U/ml
Fed-batch
q=0.2 g/(h-l ferm.)
Xf=6.3 g/1
Lf=143.4 U/ml
Fig. 4.I.I.: Evolucin de los parmetros claves de fermentacin en el sistema de inocules para
la produccin en planta piloto de lipasas por Candida rugosa.
no
Resultados
200 -|
7-
r 200
BATCH
180 6-
J: 80 1
60-
,*
5S3
- 180
- 140
A'''
Xx
A
A _
w ^
- 160
y''
f 140"1
f
"
g 100 -
FED-BATCH
160 -
12
/
/
/
/'""v
" 12 1
cido olecio
r 100 S
-80
/
:
2-
r~i
LJ
iX jjyj
t-^-r
ii
rh
)'
V/
i^-\
1
- 80
"o
OH
- 60
'
- 40
- 20
n .N
20 n
- 120 "cs
i i
LJ
- 60 ^
- 40
40 -
- 140
1- - 100
;g
KM
/'
- 160
- 20
A
Tiempo (h)
Los valores obtenidos para esta estrategia de operacin suponen una elevada
productividad comparando con experimentos en discontinuo tanto en trminos de actividad
lipoltica/g
de
biomasa
como
en
el
caso
de
actividad
lipoltica/(volumen
de
Resultados
111
Tambin es importante destacar que la parada de la adicin del cido oleico se realiza
en un momento en el cual todava no se ha detenido la produccin y el crecimiento de la
biomasa es prcticamente lineal, lo que indica que dicho crecimiento del microorganismo
todava no se encuentra limitado por la escasez o falta de substrato. El motivo de detener en
este punto la fermentacin es el de evitar la aparicin en concentraciones elevadas de
productos finales como polisacridos u otras protenas que suelen producirse en fases
avanzadas del crecimiento cuando empieza a haber limitacin de substrato. Estos compuestos
interfieren fuertemente en la separacin, purificacin y utilizacin posterior de las lipasas, por
lo que se prefiri detener la fermentacin en un momento en el cual todava no eran
importantes. En particular, es notable la interferencia que tienen los polisacridos en
operaciones de cromatografa y filtracin, como se comentar en el apartado 4.3.
Resultados
112
K
1 + Kl Lpaq
(1)
'aq
(2)
La expresin del rea interfacial para unas condiciones de trabajo y para unos valores
constantes de densidad, viscosidad y tensin interfacial que se mantienen para cada tipo de
substrato viene dada por:
A=
K'-S
K'j+S
(3)
Lptot = Lipaq + L
(4)
Resultados
113
1
Lipa, _
Lip 1+ Ka-S
(5)
K'j+S
0.0
\
i
i
r
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
Acido oleico (g/1)
Resultados
114
Liptot (U/ml)
35.4
26.2
13.6
Kd
63
41
3.6+0.4
K'd
148
6+2
l.OdbO.3
Tabla 4.1.1.: Valores de Kd y K'd obtenidos mediante el ajuste de los valores de la Fig. 4.1.3.
Si la ecuacin (5) describiese correctamente el fenmeno, los valores de Kd y K'd
tendran que ser iguales para cualquier valor de Lip!0, y el cociente Lipaq/Liptot tendra que ser
constante si se mantiene constante la concentracin de cido oleico. La figura 4.1.4 recoge un
experimento en el que se vari la actividad lipoltica total manteniendo constante la
concentracin de cido oleico. En ella se observa como la relacin Lipaq/Liptot vara con la
actividad lipoltica introducida en el fermentador para una concentracin de cido oleico
constante (0.5 g/1).
"
0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 O
10
12
14
Lip
(U/ml)
F
tot v
Fig. 4.I.4.: Evolucin del cociente Lipaq/LipM para una concentracin constante de cido
oleico de 0.5 g/1.
Resultados
115
Lip
Lip*>
1
1+
Ki-S
K'd+S
(6)
Esta ecuacin representa la ley de Langmuir completa para este sistema. Hay que
sealar que en esta ecuacin, l porcentaje de lipasa adsorbida depende de dos variables: la
concentracin de cido oleico y la concentracin de lipasa total, tal y como se deduce de los
valores variables de las constantes de la tabla 4.1.1. Por consiguiente, las grficas que
representarn los perfiles de adsorcin sern tridimensionales. En la Figura 4.1.5 se muestra la
representacin de los puntos experimentales as como la superficie de ajuste de dichos puntos
mediante la ecuacin (6). En la grfica queda manifiesta la dependencia de la ley de adsorcin
de la concentracin de cido oleico y de la lipasa acuosa.
El ajuste de los valores experimentales a la ecuacin (6) gener tres nuevos
parmetros, Kj, KS y K'd, que sern los que definan la ley de adsorcin para este sistema y
cuyos valores fueron los siguientes:
K\ = 8.0 1.0
3 = 0.28 0.05 ml/U
Resultados
116
1.0
Fig. 4.I.5.: Representacin de los puntos experimentales y ajuste de los mismos mediante la
ecuacin (6) que representa la ecuacin de adsorcin de Langmuir completa para este sistema.
La bondad del ajuste se refleja claramente en la importante disminucin del error de
ajuste de los parmetros con respecto a los determinados mediante la ecuacin simplificada,
situndose en valores inferiores al 20% para todos los casos. Por tanto, parece claro que una
ecuacin de Langmuir completa describe el sistema de una manera satisfactoria y que estos
parmetros pueden ser introducidos en el modelo matemtico de descripcin del proceso.
Es conocido el hecho de que las enzimas o las protenas en general tienden a generar
fenmenos de adsorcin en multicapa (Lee y Park, 1996). Se llega a un punto de saturacin a
partir del cual las protenas se siguen adsorbiendo sobre si mismas, una vez ocupados todos
los puntos de adsorcin sobre el soluto. En nuestro caso, este fenmeno se tendra que traducir
en que el sistema respondiera mejor a un ajuste del tipo multicapa como describe la ecuacin
(7) propuesta por Brunauer et al, (1938) y conocida como ley de B.E.T.
Resultados
117
Lip,'org
K-Lip,'aq
LeydeB.E.T. (7)
Lips
donde Lips representa el valor de saturacin a partir del cual se produce el fenmeno
multicapa. Sin embargo, en el sistema estudiado, y para el rango de actividades lipolticas y
concentraciones de cido oleico estudiadas, no se observ dicho comportamiento como se
observa en la Figura 4.1.6. En dicha figura se representa en lneas discontinuas el
comportamiento terico tpico para un fenmeno multicapa descrito por la ley de BET.
Punios experimentales
Prediccin Langmuir
Prediccin multicapa
^ 6
t'~N
4-1
o 3o.
2-
1
10
15
i
20
l
25
I
30
35
Lipaq (U/ml)
Fig. 4.I.6.: Prediccin de ley de adsorcin con fenmeno multicapa con respecto a ley de
Langmuir y comparacin con los puntos experimentales.
Resultados
118
Otra comprobacin realizada fue determinar la influencia que poda tener la propia
biomasa en la adsorcin. Dada la naturaleza lipdica de la membrana celular, podra
producirse el fenmeno de adsorcin de la enzima sobre las propias clulas. Para ello, se hizo
crecer Candida rugosa sobre galactosa, substrato en el que la produccin de lipasa es mnima,
recuperndose la biomasa por centrifugacin. La biomasa centrifugada se resuspendi en
medio :de cultivo sin fuente de carbono de manera que se obtuvieron concentraciones
variables de biomasa. Para cada una de estas concentraciones se aadi una solucin de
actividad lipoltica conocida, analizndose la actividad remanente en la solucin acuosa. Los
resultados se presentan en la figura 4.1.7.
Como se observa en dicha figura el fenmeno de la adsorcin de la lipasa sobre la
biomasa tiene lugar en el sistema pero con valores no superiores al 15 %. La adsorcin de la
lipasas en la interfase biomasa-acuosa es mucho menor que en la interfase orgnico-acuosa
formada por el cido oleico, en la que el % de adsorcin llegaba a alcanzar el 60 %. Debido a
estas marcadas diferencias no se consider este efecto en la expresin final de la ley de
adsorcin.
1.0 4
0.9 -
~ -- -- -,
* - ... ,
" -
0.8 0.7 -
.i
0.6 -
0.5 la
3 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 C
Biomasa (g/1)
Fig. 4.I.7.: Adsorcin de la lipasa sobre las clulas de Candida rugosa en ausencia de cido
oleico para distintas concentraciones de biomasa.
Resultados
119
Lipa,, _
Lip*
1
S'S
(8)
La ecuacin (8) fue validada eliminando del ajuste experimentos completos de distintos
valores de laLiptot (los correspondientes a las figuras 4.1.3 y 4.1.4). Al realizar esta operacin
se observ que los cambios en los parmetros eran mnimos, as como el error relativo medio
de estimacin (MRE). La variacin de estos parmetros se recoge en la tabla 4.1.2 y fue
marcadamente menor que en el caso de usar una ley de adsorcin lineal (Tabla 4.1.1).
Puntos considerados
Todos (48)
Todos excepto Liptot=35.4 U/ml (35)
Todos excepto Liptot=26.2 U/ml (32)
Todos excepto Liptot=13.6 U/ml (40)
Ki
K'd (g/1)
8.0 1.0
9.0 1.0
8.0 1.0
8.0 1.0
1.1 0.1
1.20.1
1.0 0.1
1.10.1
K3(ml/U)
0.28 0.05
0.29 + 0.05
0.28 0.05
0.25 0.05
M.R.E.
0.11
0.11
0.10
0.13
Tabla 4.1.2.: Variacin de las constantes de la ecuacin (8) y del error medio relativo de
ajuste (MRE) al eliminar experimentos completos de una actividad lipoltica determinada.
Como conclusin, la ley de adsorcin completa descrita por la ecuacin (8) se incluy
en el modelo matemtico del proceso para conocer la actividad lipoltica total extracelular
presente en el medio (acuosa + adsorbida). Esta ley est validada para las actividades
lipolticas y concentraciones de cido oleico habituales presentes en las fermentaciones en
fed-batch. El conocimiento de este valor permitir, por ejemplo, poder realizar balances de
actividad lipoltica total extracelular.
120
Resultados
4.1.3. Conclusiones
Como conclusiones a este apartado se pueden destacar:
121
Resultados
El diseo de las diferentes etapas para la separacin de la lipasa UAB extracelular del
medio de cultivo se representa en la Figura 4.2.1. Este proceso consta de una centrifugacin
previa a SOOOg (Westfalia Separator AG), en la que se elimina la mayora de la biomasa del
medio, seguido de una microfiltracin por 0.45u,m (Minitan Millipore) con objeto asegurar la
total eliminacin de la biomasa. Este lquido clarificado se esteriliz qumicamente mediante la
adicin de.azida sdica (0.02%), la adicin de la misma no supone ninguna prdida de actividad
por parte de la enzima. Teniendo en cuenta que la lipasa comercial de Candida rugosa (Sigma
1754,tipo VE) tiene un peso molecular aproximado de 60 kDa(Ra et al, 1993), resultado que
se confirma por electroforesis en nuestras fermentaciones (Gordillo et al, 1995), la siguiente
etapa consisti en una ultrafiltracin utilizando membranas de lOkDa de cut-off, en esta etapa se
concentraba el volumen de fermentacin 40 veces, este concentrado se dilua hasta su volumen
inicial mediante la adicin de tampon Tris-HCl 20 mM pH = 7.4, ptimo para la lipasa UAB
(Gordillo et al, 1995). Volvindose a ultrafiltrar por lOkDa con una reduccin del volumen de
40 veces obtenindose el concentrado final de lipasas. En esta ltima etapa, similar a una
122
Resultados
Diafiltracin
Tris-HCl
20 mM
pH=7.40
Sales
Protena<10000D
Fig. 4.2.I.: Separacin de la lipasa UAB desde el caldo de fermentacin hasta la obtencin de un
concentrado lquido dializado.
Resultados
123
b) Sistema Prep/Scale TTF Millipore con un PTGC 10 K 2.5 ft2 Cartridge hasta 15 1 de
volumen.
c) Sistema Centrasette Pali Filtren con una membrana Omega 10K hasta 1001 de volumen.
En todos estos sistemas el corte elegido de 10 kDa asegur la recuperacin total de la actividad
lipoltica como se puede observar en la Tabla 4.2.1.
Punto de proceso
Final Fermentacin
Caldo centrifugado
Filtracin 0.45 um
Primer retenido 10 kDa
Primer filtrado 10 kDa
Redisolucin en tampn
Segundo retenido 10 kDa
Segundo filtrado 10 kDa
....M/mD.....
__,
146
173
169
3547
53
113
3270
27
5.0
4.1
4.1
671
723
710
0.128
1074
4.0
4.0
0.100
3.900
100
104.6
100.4
99.5
_
088
1532
100.4
102.2
Tabla 4.2.1.: Balance de actividad lipoltica en los puntos del proceso de down-stream para la
obtencin de lipasas de Candida rugosa.
Al final del proceso de centrifugacin se observa un aumento de aproximadamente un
5% en la actividad lipoltica probablemente debido a la liberacin de la mayora de la enzima que
se encuentra adsorbida sobre la biomasa y que estudios previos haban estimado como mximo
en un 15% del total (Captulo 4.1). Por lo que respecta al balance de protena total en la Figura
4.2.2 se recoge el mismo.
Segundo
filtrado
(10 kDa)
15%
Prdida de
protena
7%
Segundo
retenido
(producto
final)
47%
Primer
filtrado
(10 kDa)
31%
Fig,:4.2.2,: Balance de protena total en las dos operaciones de ultrafltracin a travs de 10 kDa.
124
Resultados
Resultados
125
Muestra
Inicial
Pellet
Sobrenadante
Actividad
lipoltica (U/ml)
3500
1060
47
Volumen
(mi)
22
22
43
Actividad lipoltica
total (U)
77000
23320
2021
Rendimiento
(%)
30.3
2.6
Para la determinacin de los valores presentes en la tabla 4.2.2 y dada la interferencia del
etanol en los anlisis de protena total y de actividad lipoltica, se elimin el etanol de las
muestras mediante evaporacin en rotovapor y despus se resuspendieron los slidos en el
mismo volumen de tampn. La lipasa es estable a estas operaciones, por tanto, las importantes
prdidas de actividad lipoltica reflejadas en la tabla 4.2.2 tenan que ser debidas al etanol, con lo
que este sistema de recuperacin no era el idneo para la lipasa UAB.
El sulfato amnico es otro de los agentes precipitantes clsicos para protenas (Harris y
Angal, 1989). El sulfato amnico fue aadido en distintas proporciones con respecto al valor de
saturacin. La recuperacin de actividad lipoltica y protena total para dichos porcentajes de
saturacin se representa en la Figura 4.2.3. Las condiciones ptimas de separacin se
consiguieron para el 60 % de saturacin en sulfato amnico, en el que se produca una
recuperacin superior al 70 % con respecto a la actividad lipoltica, y del 55% con respecto a la
protena. Estos resultados aun siendo mejor que los obtenidos con la precipitacin con etanol se
encuentran lejos de los obtenidos con lipasas de Fusarium heterosporum, del orden del 93%
(Shimadae a/., 1993) pero mejores que los obtenidos con Pseudomonas aeruginosa IGB 83, del
orden del 15% en cuanto a recuperacin de la actividad lipoltica (Palmeros et al, 1993).
Resultados
126
En este sistema, la cantidad de sulfato amnico a aadir para conseguir una determinada
proporcin 82 de sulfato amnico respecto al valor de saturacin viene dada por la ecuacin (1):
100-0.3S
'
en este caso Si=0 y S2==60, por lo que la concentracin de sulfato amnico ptima para la
precipitacin de lipasas de Candida rugosa resulta ser de 390 g/1.
100
100
90 H
- 90
'S' 80 o
70 -
-70
13 60 -
- 60
50 H
- 50
40 H
- 40
I
20 t
30 -
- 30
10 -
- 10
*O
1
B.
-20
O
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Fig. 4.2.3.: Recuperacin de actividad lipoltica y protena total en la precipitacin con sulfato
amnico.
En este caso, los valores de recuperacin de actividad lipoltica ya eran parecidos a los
descritos por Ra et al. (1993) y este sistema poda ser una posibilidad para la recuperacin
ptima de la lipasa en forma de slido.
Resultados
127
Resultados
128
100
E3
~
95 -
a,
^
90 -
'
85 -
-g
80 -
I
U
75
10
20
30
40
r~
50
Lactosa (g/1)
En la Tabla 4.2.3 se recogen, a modo de resumen, los resultados obtenidos con los tres
sistemas en trminos de recuperacin. A la vista de los anteriores resultados y de la facilidad
operacional de un sistema de lioflizacin se eligi este mtodo para la obtencin de lipasas en
forma slida a partir del concentrado lquido.
% recuperacin
de act. lipoltica
% recuperacin
de protema
-30
-70
-90
-55
-100
-27
Factor de
purificacin
1.11
1.27
0.90
Tabla 4.2.3.: Resumen de mtodos de obtencin de lipasa slida de Candida rugosa a partir del
concentrado lquido.
Resultados
129
Sin embargo, hay que tener en cuenta que los factores de purificacin eran mejores en el
caso de la precipitacin con sulfato amnico, como se observa en la tabla 4.2.3, debido a que en
el proceso de liofilizacin no hay eliminacin de protena total, mientras que en los procesos de
precipitacin siempre se produce un fenmeno de selectividad hacia alguna de las protenas
presentes.
Respecto a la liofilizacin cabe decir que la inclusin de lactosa en la liofilizacin, pese a
tener un efecto beneficioso en la recuperacin de actividad lipoltica, no se incorpor al
protocolo general de separacin, debido a que en muchos casos interesaba determinar el grado de
glicosilacin de las protenas y la lactosa supona una interferencia importante difcil de eliminar
completamente, as pues, no fue incluida en la mayora de los casos.
4.2.3. Conclusiones
Como resumen al captulo, se lleg a las siguientes conclusiones:
Para conseguir un preparado slido se probaron tres tcnicas clsicas, precipitacin con
disolvente orgnico, con sulfato amnico y liofilizacin, siendo este ltimo el que origin
mejores resultados en recuperacin de actividad (90%).
La lactosa demostr ser un buen estabilizante para la lipasa UAB, aunque no se us por
generar interferencias en la caracterizacin de la lipasa UAB.
130
Resultados
Resultados
131
Equipos:
Sistema de inoculacin: 0.5 MM
-
Braun Biostat ED 15 1: 14 MM .
Resultados
132
Analtica:
-
pHstato = 0.8 MM
Microscopio = 0.7 MM
Espectrofotmetro = 0.5 MM
Instalacin: entre 0.35X y 0.50X, para aparatos pequeos como es el caso se coger el
valor mnimo, es decir: 0.35X = 21.5 MM.
-
Tuberas: entre 0.10X y 0.60X que corresponden a slidos y fluidos, en este caso,
cogeremos un valor intermedio: 0.35X = 21.5 MM.
Instrumentacin: entre 0.05X y 0.30X, de donde se tomar el mnimo dado que los
equipos comprados incorporan instrumentacin: 0.05X = 3.1 MM.
Aislamiento: entre 0.03X y 0.10X, el valor mnimo dado que no se tienen temperaturas
elevadas en estos procesos: 0.03X = 1.8 MM.
Instalacin elctrica: entre 0.10X y 0.20X, se tomar un valor intermedio, 0.15X = 9.2
MM.
Edificios: entre 0.20X y 0.30X para instalaciones interiores, se tomar el valor intermedio
0.25X=15.4MM.
Servicios auxiliares: entre 0.25X y 0.70X, el valor ms bajo para este tipo de empresa
que necesita pocos servicios tipo vapor o agua de refrigeracin: 0.25X = 15.4 MM.
Resultados
133
El proyecto y direccin de obra se calcula como 0.20Y =17.6 MM, sumando este valor al
capital fsico se obtiene el capital directo (Z):
Z = 105.5 MM
Con ello se obtiene un valor final para la partida de inmovilizado (I) de 181.8 MM.
Utilizando la regla de Lang descrita por Vin (1991) se puede obtener una estimacin directa
del capital inmovilizado a partir de la partida de maquinaria y aparatos:
I = Coeficiente de Lang factor de correccin X
Tomando los valores recomendados por Vin se obtiene:
I = 4.74 x 0.6 x 61.5 = 174.9 MM
4.3.1.3. Costes
El sistema de evaluacin de los costes tambin se basa en un clculo detallado de las
partidas que los componen. Los costes se suelen dividir en dos grandes bloques, los
denominados costes de fabricacin (M) que son los directamente asociados con la produccin
y los gastos generales (G) que no dependen de la produccin.
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Resultados
Compuesto
K2HPO4
KH2PO4
MgSC-4
(NH4)2SO4
NH3 30 %
Acido oleico
Cantidad (Kg/ao)
275
750
50
200
250 (I/ao)
400
Tabla 4.3.1.: Evaluacin del coste de las materias primas para la produccin de lipasa UAB.
3) Patentes (M3): entre 1 y 5 % de las ventas, en este caso, un valor medio del 3% originara
M3 = 0.03V = 8.5 MM.
4) Mano de obra indirecta (M4): entre 15 y 45 % del valor de la mano de obra directa, en
este caso se toma el valor mnimo por el tipo de empresa: M4 = 0.15M2 = 3 MM.
5) Servicios generales (M5): esta partida ser muy baja en nuestro caso, y slo habra que
tener en cuanta el vapor necesario en la esterilizacin. Se despreci en relacin con el
resto de trminos.