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PARA EL MANEJO DE
HONGOS ENTOMOPATGENOS
VERNICA CAEDO
TERESA AMES
MANUAL DE LABORATORIO
PARA EL MANEJO DE
HONGOS ENTOMOPATGENOS
VERNICA CAEDO
TERESA AMES
CONTENIDO
Presentacin ........................................................................................................................................... 1
Introduccin ............................................................................................................................................ 3
Generalidades de los hongos entomopatgenos .................................................... 5
Asepsia ......................................................................................................................................................... 14
Fitolevadura .............................................................................................................................. 21
Sabouraud .................................................................................................................................. 21
iii
PRESENTACIN
En los primeros aos del Siglo XXI, las proyecciones sobre el incremento
poblacional indican que en las dcadas venideras habr necesidad de
producir ms y mejores alimentos para satisfacer la demanda mundial. Sin
embargo, este reto es amenazado por las plagas, que representan un serio
problema para los agricultores, reduciendo su rentabilidad y
competitividad. Por otro lado, actualmente existe evidencia de que un uso
irracional de plaguicidas para controlar las plagas puede generar serios
problemas relacionados con el medio ambiente o la salud de las personas.
Por esta razn, instituciones como el Centro Internacional de la Papa (CIP),
realizan trabajos de investigacin para encontrar mtodos alternativos para
el control de plagas. Entre estos mtodos innovadores se incluye el uso de
enemigos naturales, como los hongos entomopatgenos, una de cuyas
ventajas es reducir el riesgo de causar efectos negativos en el ambiente o
en las personas. Sin embargo, hay an mucho trabajo por hacer para tener
bioplaguicidas eficientes basados en hongos, siendo el primer paso la
coleccin, aislamiento, caracterizacin y multiplicacin de estos
microorganismos. Esta etapa de la investigacin debe realizarse
correctamente, para establecer bases slidas para el futuro desarrollo de
bioplaguicidas, ya que se requiere conocer muy bien al agente
INTRODUCCIN
La mayor parte de los insectos que atacan a las plantas cultivadas tienen
enemigos naturales que los parasitan y matan, produciendo as una
reduccin considerable en su poblacin. El uso de hongos
entomopatgenos para la exterminacin de tales insectos constituye, por
lo tanto, un componente importante de control, siendo muchos los hongos
mencionados en diversos estudios que se usan para este propsito.
En el cultivo de la papa, tanto la planta como los tubrculos son infestados
por diversos insectos que destruyen la planta, durante su permanencia en
el campo, y el tubrculo, una vez cosechado. A su vez, hongos como
Uno de los factores que limita la produccin de los cultivos son las plagas
agrcolas. El uso indiscriminado de insecticidas orgnicos sintticos ha
trado como consecuencia la seleccin de individuos resistentes, la
resurgencia de nuevas plagas y la contaminacin ambiental y del hombre.
Estos factores han hecho posible el surgimiento de sistemas nuevos de
produccin agrcola, como la produccin orgnica; han creado la necesidad
de obtener productos inofensivos para otros organismos no perjudiciales
(entomfagos) y han obligado a legislar ms estrictamente sobre la
presencia de residuos en los productos agropecuarios.
El manejo integrado de plagas (MIP), que se basa en principios totalmente
ecolgicos, considera todo el agroecosistema en su conjunto. Como tal,
comprende la aplicacin armnica de diferentes mtodos de control, como
la lucha biolgica y las prcticas culturales que requiere el cultivo, teniendo
en cuenta los niveles poblacionales de las plagas y enfermedades a
controlar, la presencia de los biorreguladores naturales, las etapas
fenolgicas del cultivo y las condiciones ambientales presentes.
Uno de los componentes del MIP es el control biolgico de las plagas
agrcolas mediante parasitoides, predadores (entomfagos) y organismos
entomopatgenos que pueden ser hongos, bacterias, virus, nematodos y
protozoarios. Los hongos entomopatgenos son los que han recibido mayor
atencin por la gran variedad de especies y amplio rango de hospedantes
as como por su crecimiento microscpico sobre la superficie de su
husped. Todos los insectos son susceptibles de ser afectados por algn
hongo.
Ciertos hongos poseen caractersticas muy especiales que les permiten
sobrevivir en forma parastica sobre los insectos y en forma saprofita sobre
material vegetal en descomposicin. El crecimiento saprofito puede dar
como resultado la produccin de conidiforos, conidias y desarrollo
miceliano. Esta caracterstica permite que el hongo pueda ser cultivado en
el laboratorio utilizando tcnicas de produccin en masa de bajo costo.
Los hongos tienen un gran potencial para ser empleados como
biocontroladores. Entre los principales hongos que presentan estas
caractersticas estn: Beauveria, Metarhizium y Paecilomyces.
Las principales ventajas de estos hongos son:
1.
2.
3.
4.
5.
2.
3.
Clase
Orden
Gnero
Mastigomycotina
Chytridiomycetes
Chytridiales
Coelomycidium
Myiophagus
Chytridiomycetes
Oomycetes
Blastocladiales
Lagenidiales
Coelomomyces
Lagenidium
Oomycetes
Saprolegniales
Leptolegnia
Couchia
Zygomycetes
Mucorales
Sporodiniella
Entomophthorales
Conidiobolus
Entomophaga
Entomophthora
Erynia
Massospora
Meristacrum
Neozygites
Hemiascomycetes
Endomycetales
Plectomycetes
Pyrenomycetes
Ascosphaerales
Sphaeriales
Blastodendrion
Metschnikowia
Mycoderma
Saccharomyces
Ascosphaera
Cordyceps
Torrubiella
Zygomycotina
Ascomycotina
Nectria
Hypocrella
Calonectria
Filariomyces
Deuteromycotina
Laboulbeniomycetes
Laboulbeniales
Hesperomyces
Trenomyces
Loculoascomycetes
Myriangiales
Myriangium
Loculoascomycetes
Pleosporales
Podonectria
Hyphomycetes
Akanthomyces
Aschersonia
Aspergillus
Beauveria
Culicinomyces
Engyodontium
Fusarium
Gibellula
Hirsutella
Hymenostilbe
Metarhizium
Nomuraea
Paecilomyces
Paraisaria
Pleurodesmospora
Polycephalomuces
Pseudogibellula
Sorosporella
Sporothrix
Stilbella
Tetranacrium
Tilachlidium
Tolypocladium
Verticillium
Mycelia sterilia
Basidiomycotina
Aegerita
Phragmobasidiomycetes
Septobasidiales
Filobasidiella
Septobasidium
Uredinella
2.
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ASEPSIA
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Figura 2: Autoclave.
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10 g
Agua destilada
1 litro
19
20
200 g
10 g
18 g
1 litro
Lavar las papas, cortarlas y hacerlas hervir en un litro de agua destilada por
20 minutos, colar y disolver en el lquido la dextrosa y el agar. Esterilizar en
autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presin.
FITOLEVADURA
Este medio se usa para aislar hongos a partir de animales. Los hongos
aislados de insectos crecen exuberantemente con micelio bien algodonoso
y buena produccin de esporas.
Dextrosa
Extracto de levadura
Peptona
Agar
Agua destilada
20 g
5g
5g
18 g
1 litro
SABOURAUD
Es un medio de cultivo muy utilizado para aislar hongos de animales. Sirve
para el aislamiento y mantenimiento de hongos en tubo inclinado. Debido a
su composicin, los hongos crecen exuberantemente y esporulan bien.
Es el medio estndar para observar la morfologa tpica de los hongos, pero
no es el medio ideal de crecimiento o para estudiar la esporulacin.
Dextrosa
Peptona
Agar
Agua destilada
20 g
10 g
18 g
1000 ml
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60 g
Peptona
10 g
Agar
18 g
Agua destilada
1000 ml
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B
Figura 7: A) materiales utilizados para el montaje de cmara hmeda;
B) muestras colocadas en cmara hmeda.
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B
Figura 8: Crecimiento del hongo en cmara hmeda, A) vista general y
B) crecimiento del hongo sobre el insecto.
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Una vez en el laboratorio, las muestras son procesadas como sigue (Figura 7):
1. Remojar el insecto en hipoclorito de sodio (0.5% del producto
activo) durante 5 minutos.
2. Enjuagar tres a cuatro veces con agua destilada estril.
3. Colocar papel de filtro estril en una caja Petri esterilizada y
agregar agua destilada estril.
4. Colocar el insecto sobre el papel de filtro dentro de la caja.
5. Sellar la placa con parafilm.
6. Incubar a 20 oC durante 7 das (Figura 8).
7. Con una aguja de siembra, en la cmara de flujo laminar, tocar
levemente el cuerpo del insecto donde se vea crecimiento
fungoso y transferir su contenido a medio de cultivo (Figura 9).
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CULTIVOS MONOSPRICOS
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B
Figura 10: Procesamiento de cultivos monospricos, A) materiales
utilizados y B) crecimiento de algunas conidias por placa.
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CARACTERIZACIN MORFOLGICA
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cido lctico
25 ml
Glicerina
50 ml
Agua destilada
25 ml
Azul de algodn
0.05 g
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(Figura 13).
(Blsamo) Vuillemin.
alargada de 4 a 18 en la base x
1.5 a 4 en el pice.
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Metarhizium anisopliae
(Metschnikoff) Sorokin
Colonia: pegada al medio,
completamente redonda, de
colores olivceo, amarillento,
verdoso, marrn oscuro,
dependiendo del aislamiento.
Revs incoloro a marrn, a veces
verdoso citrino.
de dimetro.
Conidias: unicelulares, cilndricas y truncadas, formadas en cadenas muy
largas, hialinas a verde olivceo. Miden 3.5 a 9 de longitud x 1.5 a 3.5 de
dimetro (Figura 17).
Otras especies: M. flavoviridae
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Procedimiento
1. Preparar una suspensin de conidias en agua destilada con Tween
80 al 0.1%.
2. Con una pipeta Pasteur llenar la cmara con la suspensin de
conidias y cubrirla con el cubreobjeto.
3. Observar al microscopio utilizando el aumento conveniente de
acuerdo al tamao de la estructura (40x es un aumento adecuado)
(Figura 18).
4. Contar las conidias presentes en los cuadrados elegidos
(generalmente se cuentan en los cuadrados de los cuatro ngulos y
el centro, o en forma diagonal empezando por el primero de la
parte superior izquierda. Tambin se deben contar las conidias que
estn ubicadas tocando la primera de las tres lneas que se
encuentran circundando el cuadrado, las que se encuentran en la
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CARACTERIZACIN FISIOLGICA
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CONSERVACIN DE HONGOS
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El procedimiento es el siguiente:
1. Esterilizar en autoclave los tubos de vidrio con tapa rosca de 4 ml
de capacidad, con la respectiva identificacin incluida dentro del
tubo.
2. Colocar slica gel (6 22 mesh, sin indicador) en tres cuartas partes
del tubo de vidrio y esterilizar con aire caliente en un horno a
180 oC durante 3 horas.
3. Mantener los tubos en congelacin hasta su uso.
4. A un tubo de vidrio conteniendo medio PDA y el hongo en
crecimiento, agregar 3 ml de agua destilada estril.
5. Con la ayuda de un ansa de siembra, retirar todo el desarrollo
miceliano del hongo y luego agitarlo en el vortex durante 15
segundos.
6. En una cmara de flujo laminar, utilizando una micropipeta, agregar
500 l de la suspensin de conidias al tubo con slica gel,
previamente identificado.
7. Poner los tubos con inculo y sellados con parafilm en una
incubadora a 20 oC por 15 das.
8. Luego de ese lapso, colocar los tubos a 4 oC por el tiempo que se
quiera almacenar.
Para la reactivacin de los hongos:
1. Tomar unos cuantos cristales de slica gel, en un ambiente estril y
colocarlos sobre medio de cultivo.
2. Sellar la placa, colocarla a 20 oC y esperar su desarrollo.
CONSERVACIN DE HONGOS POR LIOFILIZACIN
La liofilizacin es otro de los mtodos de conservacin de hongos por
tiempo prolongado. Si bien es muy recomendado, requiere contar con un
liofilizador, lo que no siempre est al alcance de todos los investigadores.
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Preparacin:
Un litro de agua destilada con 6 gramos de glucosa.
Un litro de agua destilada con 6 gramos de agar.
Se esterilizan en autoclave a 15 libras de presin por 20 minutos.
3. Aadir al tubo 1 ml de cada preparacin.
4. Con un ansa de siembra separar el cultivo del medio.
5. Aadir 200 l de la suspensin de hongos en el tubo estril.
6. Cerrar los tubos y llevarlos a 80 oC de 10 a 15 minutos y luego
liofilizarlos por 48 horas.
7. Retirar los tubos del liofilizador, cerrarlos bien y sellarlos con
parafilm y mantenerlos a 4 oC.
Para la reactivacin de los hongos:
1. Abrir el tubo, bajo un ambiente estril, aadir 1 ml de agua estril
y dejar reposar durante 30 minutos (rehidratacin).
2. Tomar una pequea cantidad de la suspensin y sembrarla en
placas de petri con medio de cultivo.
Es conveniente realizar la reactivacin de la cepa almacenada antes de
empezar a trabajar con cualquier mtodo, pasndola por un insecto
hospedante con la finalidad de comprobar su viabilidad y pureza.
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Inoculacin al sustrato
1. Agregar en cada bolsa 20 ml del inculo, en la cmara de flujo
laminar.
2. Sellar las bolsas.
3. Incubar a 20 oC durante siete das.
4. A los siete das, realizar el primer conteo de nmero de conidias.
Conteo del nmero de estructuras propagativas
1. Agregar en un vaso de precipitados o en un tubo de ensayo un
gramo del sustrato y 10 ml de agua destilada estril.
2. Agitar enrgicamente, o con un agitador, por espacio de un
minuto, para que las conidias se desprendan.
3. Tomar 100 l de la suspensin y completar a 1 ml con agua
destilada ms Tween al 0.1%.
4. Hacer las diluciones necesarias hasta poder contar las conidias en
la cmara de Neubauer.
5. Realizar el clculo correspondiente al peso de la bolsa.
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BIOENSAYOS
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x 100
100 - % mortalidad testigo
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GLOSARIO
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LITERATURA CONSULTADA
Ainsworth, G. 1973. Introduction and keys to higher taxa. In: The fungi: An
advanced treatise. Ainsworth, G., F. Sparrow and A. Sussman. Academic
Press, New York (IVA): 1-7
Butt, T.M. and M.S. Goettel. 2000. Bioassays of entomogenous fungi. In: CAB
International 2000. Bioassays of entompathogenic microbes and
nematodes (eds A.Navon and K.R.S. Ascher), p 141-195.
Charnley, A. 1984. Physiological aspects of destructive patognesis in
insects by fungi: A speculative review. In: Invertebrate-microbial
interactions. Anderson, J., A. Rayner and D. Walton. Cambridge
University Press. Cambridge. Pp 229-270.
Commonwealth Mycological Institute. 1979.CMI Descriptions of pathogenic
fungi and bacteria. Kew, Surrey, England. Beauveria bassiana No. 602; B.
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F U T U R E
HAR EST