LABORATORIO N 3

DETERMINACIN DE GLUCOSA POR MTODOS CUALITATIVOS Y

CUANTITATIVOS
1. Aspectos tericos.
En estado de post-absorcin la concentracin de glucosa sangunea en el hombre
vara entre 70 -110 mg/100mL. La mantencin de valores estables de glucosa en
la sangre es uno de los mecanismos ms finamente regulado. En esta regulacin
participan el hgado y varias hormonas.
Cuando la glucosa sangunea alcanza valores relativamente altos, el rin tambin
ejerce un efecto regulador. La glucosa filtrada continuamente por los glomrulos
es habitualmente reintegrada por completo a la sangre por el sistema de resorcin
de los tbulos renales. La resorcin de glucosa est enlazada con el
aprovisionamiento de ATP en las clulas tubulares. La capacidad del sistema
tubular para absorber glucosa est limitada a una tasa aproximada de 350 mg/min.
Cuando la cantidad de glucosa en la sangre sobrepasa la que puede ser
reabsorbida el exceso pasa a la orina producindose glucosuria.
En los individuos normales la glucosuria ocurre cuando la concentracin de
glucosa en la sangre venosa es superior a 170 180 mg/100 mL.
[glucosa]normal en sangre
[glucosa]normal en orina

70 110 mg/dL
1 15 mg/dL

( 3,9 6,1 mmol/L).

( 0,06 0,8 mmol/L).

Mtodo cualitativo: tiras colorimtricas.

La glucosa puede ensayarse cualitativamente con el uso de tiras colorimtricas.
Este test usa glucosa oxidasa que cataliza la oxidacin de D-glucosa a cido
glucnico con formacin de H 2O2. En presencia de loa enzima peroxidasa, el
H2O2 generado oxida un cromgeno (orto-dianicidina), produciendo un cambio de
color, que indica la presencia de glucosa. Este mtodo es especifico para la
glucosa y la detecta cuando su concentracin est sobre el rango normal.
Mtodos cuantitativos.
Mtodo qumico: o-toluidina.
La o-toluidina se condensa inicialmente con el grupo aldehdo de la glucosa para
formar una mezcla en equilibrio de la glucosilamina y la base de Schiff
correspondiente. Las reacciones que tienen lugar despus de la condensacin
original producen una mezcla de cromgenos verdes con una longitud de onda
analtica a 630 nm.

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Mtodo enzimtico: Trinder 100 (Sigma).

El mtodo enzimtico se basa en la especificidad de la enzima glucosa oxidasa
(GOD) por la -D-glucosa. La enzima cataliza la oxidacin de la glucosa por
oxgeno molecular dando el D-gluconato y perxido de hidrgeno (H 2O2, agua
oxigenada) (Rxn. 3.1). Para detectar y cuantificar esta oxidacin se ocupa una
reaccin acoplada (Rxn. 3.2). En forma cuantitativa el H 2O2 es oxidado por un
reactivo comercial (4-aminofenazona (4-AF) y 4-hidroxibenzoato), reaccin
catalizada por la enzima peroxidasa, para dar como producto un compuesto
coloreado rojo (quinonimina) que se cuantifica midiendo la absorbancia a 505 nm.
D glu cos a enzima FAD D gluconolactona enzima FADH 2
enzima FADH 2 O 2 enzima FAD H 2 O 2
D gluconolactona H 2 O
D glu cos a O 2 H 2 O

D gluconato H

GOD

D gluconato H H 2 O 2

Reaccin 3.1
H2 O 2 4 - AF 4 - hidroxibenzoato

peroxidasa
quinonimina (roja)

Reaccin 3.2
2. Objetivos.
Detectar glucosa en una muestra biolgica mediante tiras colorimtricas.
Cuantificar glucosa en una muestra mediante un mtodo qumico (o-toluidina) y un
mtodo enzimtico (Trinder-100).
3. Parte experimental.
3.1 Materiales

espectrofotmetro/ celdas
trpode/ rejilla / mechero
bao termostatizado
cronmetro
15 tubos de ensayo
2 gradillas
2 pipetas graduadas de 1 mL
1 pipeta graduada de 5mL
1 pipeta graduada de 2 mL
1 pizeta
1 matraz de aforo de 100 mL
1 vaso precipitado de 250 mL
1 vaso precipitado de 500 mL
termmetro
micropipeta de 20 L, puntas
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tira colorimtrica
3.2 Reactivos

glucosa 16 mg/dL
o-toluidina
glucosa estndar (ensayo enzimtico Trinder)
reactivo de trabajo Trinder-100

4. Procedimiento.
4.1

4.2

Tiras colorimtricas.
Introduzca una tira de prueba en el tubo que contiene la muestra.
Remueva inmediatamente el exceso de muestra de la tira.
Espere 10 minutos exactos para el desarrollo del color.
Compare el color de la tira con la escala de colores que indica el nivel de
glucosa.
Descarte cambios de colores despus del tiempo indicado.
Mtodo de la o-toluidina

De acuerdo a la tabla 3.1:

Prepare una batera de tubos rotulados.
Agregue el volumen indicado de la solucin estndar de glucosa (16 mg/dL) a
los tubos 2S 6S.
Agregue 0,5 ml de las diferentes muestras problemas a los tubos 7MP 9MP.
Complete el volumen de los tubos a 0,5 mL agregando el volumen indicado de
agua destilada.
Agregue 3,0 mL de la o-toluidina con una pipeta graduada de 5 mL. Tape los
tubos con bulbos de vidrio.
Homogenice y lleve los tubos a un bao de ebullicin por 10 minutos
Enfre y lea la absorbancia a 630 nm. El color es estable por 30 minutos.
TABLA 3.1

TUBO
1B
2S
3S
4S
5S
6S
7MP
8MP

Glucosa (ml)
16 mg/dL
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
-----

Glucosa
M. P. (mL)
------------0,5 MP1
0,5 MP2

Volumen H2O
(mL)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0,0
0,0

o-toluidina
(mL)
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
15

9MP

---

0,5 MP3

0,0

3,0

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De acuerdo a los datos:

Calcule la concentracin de glucosa en los tubos (2S 6S).
Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentracin.
Construya una grfica absorbancia versus concentracin de glucosa.
Obtenga la ecuacin de la recta por regresin lineal y el coeficiente de
regresin.
Calcule las concentraciones de las muestras problemas (tubos 7MP 9MP) en
la cubeta mediante la ecuacin 1.5.
Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones
originales considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuacin 1.6).
4.3 Mtodo enzimtico Trinder 100
De acuerdo a la tabla 3.2:
Prepare una batera de tubos de ensayo marcados, B (blanco), S (estndar),
MP1, MP2 y MP3.
Agregue con una micropipeta el volumen indicado de la solucin estndar de
glucosa (150 mg/dL) al tubo S.
Agregue con una micropipeta el volumen indicado de las diferentes muestras
problemas a los tubos correspondientes.
Agregue el reactivo de trabajo con una pipeta aforada de 2 mL.
Homogenice e incube los tubos por 5 minutos en un bao termostatizado a
37C.
Lea la absorbancia a 505 nm, llevando el equipo a absorbancia cero con el
blanco.
TABLA 3.2

Estndar ( 150 mg/mL) (L)

Muestra problema (L)
Reactivo de trabajo (mL)

B
-----2.0

S
20
--2.0

MP1

MP2

MP3

20
2.0

20
2.0

20
2.0

De acuerdo a los datos:

Calcule la concentracin de glucosa en las muestras problemas de acuerdo a
la ecuacin 3.1.
Glucosa (mg/dl) (D/S) estndar
Ecuacin
3.1
donde:
D y S son las absorbancias obtenidas de cada muestra problema y del estndar,
respectivamente.

5. Bibliografa
Robert Bohinski, 1991. Bioqumica, 5 Edicin, Addison-Wesley, Iberoamericana.
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Preguntas
1. Es el test cualitativo un mtodo adecuado para el control de glucosa urinaria
en pacientes diabticos?
2. Qu ventajas presenta el mtodo de la glucosa oxidasa con relacin al de
o-toluidina en la cuantificacin de glucosa en un fluido biolgico?
3. Calcule el coeficiente de extincin para el mtodo de o-toluidina considerando
las unidades de concentracin: mg/mL, mg/ dL, g/L, g/100 mL, M y mM.
Nota : PM Glucosa = 180 g/mol
1 dL = 0,1 L = 100 mL

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