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Ames
Ames
DE LA PRUEBA DE AMES.
OBJETIVO ACADMICO
Determinar la presencia de compuestos mutagnicos en muestras de inters o de impacto
ambiental empleando la prueba de Ames
PROBLEMA
Que el alumno obtenga a partir de muestras de inters ambiental, la fraccin que contiene
los compuestos de naturaleza orgnica y realice la prueba de Ames para determinar si las
fracciones contienen compuestos con potencial mutagnico.
MATERIAL BIOLGICO.
Cultivo nutritivo de 16 horas a 37C de Salmonella typhimurium, cepas TA98, cuyos
marcadores genticos son: requerimiento de histidina (His-), sensibilidad al cristal violeta
(mutacin en rfa), presencia del plsmido R (resistencia a ampilicina), sensibilidad a la luz
U.V. (mutacin en uvrB) y frecuencia de reversin espontanea.
Prueba de Ames
Anillo metlico
Agitador vortex
Mechero Bunsen
Embudo de separacin
Mechero Fisher
Micropipeta 10-100L
Probeta de 100 mL
Micropipeta 100-1000L
vidrio de reloj
Parrilla de calentamiento
10
Tubos
de
ensayo
de
plstico
Lmpara
Lupa
Termmetro
Hielo
10
Tubo Eppendorf
REACTIVOS
Extraccin
Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)
Diclorometano (CH2Cl2)
Dimetilsulfxido (DMSO)
Prueba de Ames
Hipoclorito de sodio
Solucin L-histidina 0.5mM / biotina 0.5mM
Mezcla fraccin S9:
Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4
Solucin de MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M
Glucosa 6-fosfato
NADP+
Medio mnimo de Vogel-Bonner (en cajas Petri)
Agar de superficie (15mL en tubos de ensayo 16x150mm)
EQUIPO
Incubadora
Refrigerador
Rotaevaporador
Lmparas
3.
4.
5.
6.
PRUEBA DE AMES.
NOTA 3. Antes de montar el rea de trabajo es importante asegurarse que ya no haya
disolventes orgnicos en las mesas.
1.
2.
3.
4.
6.
7.
8.
NOTA 4: Los pasos del 7 al 12 deben hacerse lo ms rpido posible para evitar riesgos de
contaminacin.
9.
Tomar uno o dos tubos de ensaye de plstico estriles, segn el tratamiento que se
est realizando, quitarles la tapa por presin sin tocar los bordes y aadir a cada
tubo 2mL de agar de superficie previamente tratado en el paso 4. Mantenerlos a 45C
como los muestra la Figura 2.
10.
11.
Tratamientos
Reversin
espontnea
Control negativo
(por duplicado)
CDIGO
C-
RE1
RE2
Sin S9
(por duplicado)
S/S91
S/S92
Reactivo
2mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
100 L
100 L
100 L
100 L
25L
25L
CDIGO
C-
M1
M2
Con S9
(por duplicado)
C/S91
C/S92
Reactivo
1.- Agar de superficie*
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
100 L
100 L
25L
25L
25L
25L
500 L
500 L
Sacar de la incubadora dos cajas petri, etiquetar las cajas en la tapa segn el cdigo
indicado en las tablas 1 y 2, para cada tratamiento agregando el numero de grupo y
equipo.
13.
14.
Verter el contenido de cada tubo en la caja de Petri con medio mnimo de VogelBonner correspondiente.
15.
Desechar los tubos de plstico en la bolsa de residuos colocada en un costado del rea
de trabajo y etiquetada como R2.
16.
17.
Dejar solidificar las cajas a temperatura ambiente en una superficie plana durante 10
minutos.
18.
NOTA 5: Recordar en todo momento que se est trabajando con compuestos con posible
actividad mutagnica y con un cultivo bacteriano que no es incuo.
19.
20.
Fijar las tapas de las cajas petri a su contraparte con cinta adhesiva e introducirlas de
manera invertida a la incubadora a 37C por 48 horas.
21.
Una vez terminado el tiempo de incubacin, guardar las cajas de Petri invertidas en el
refrigerador a 4C.
23.
Identificar si existe algn tipo de contaminacin por hongos u otras bacterias. En caso
de que las cajas presenten estas condiciones, informar al profesor para rechazarlas.
24.
Contar el nmero de colonias revertantes que crecieron en la caja con ayuda de una
lmpara y una lupa, marcndolas con un plumn indeleble de punto fino.
25.
26.
Una vez terminada la cuenta, recolectar las cajas de Petri y sujetarlas con cinta
adhesiva, colocarlas en la bolsa para RPBI roja y etiquetarlas como R4
CUESTIONARIO
1. Anote el nmero de revertantes encontradas en la Tabla 2
Tabla 3. Resultados con la cepa TA98
Equipo
Muestra:
Repeticin
Control
negativo
Reversin
espontnea
Sin
fraccin
S9
Con
fraccin
S9
Slo
mutgeno
1
2
Promedio
1
2
Promedio
1
2
Promedio
1
2
Promedio
1
2
Promedio
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Maron, D. & Bruce, A. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation
Research 113 (1980)173-215.
Cortinas, C. & Ostrosky, P. (Editoras) Manual de mtodos para la identificacin de
mutgenos y carcingenos qumicos ambientales, Volumen 1. Instituto de
Investigaciones Biomdicas, UNAM. Mxico, 1980. Pgs. 31-50.
Caldern-Segura, M. E., Gmez-Arroyo, S., Villalobos-Pietrini, R., Butterworth, F. M.,
Amador-Muoz, O. The effects of seasonal weather on the genotoxicity, cytokinetic
properties, cytotoxicity and organochemical content of extracts of airborne
particulates in Mexico City. Mutation Research 558 (2004) 717.
Villalobos-Pietrini, R., Hernndez-Mena, L., Amador-Muoz, O., Munive-Coln, Z.,
Bravo-Cabrera, J. L., Gmez-Arroy, S., Fras-Villegas, A., Waliszewski, S., RamrezPulido, J., Ortiz-Muiz, R. Biodirected mutagenic chemical assay of PM10
extractable organic matter in Southwest Mexico City. Mutation Research 634 (2007)
192204.
APENDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
10 g
cido ctricoH2O
100 g
K2HPO4 anhdro
500 g
NaHPO44 H2O
175 g
c)
d)
e)
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f)
Pesar 0.0077 g de L-histidina, 0.0122 g de D-biotina, disolver con agua destilada y con
calentamiento, aforar a 100 mL. Esterilizar por filtacin o autoclave. Almacenar a 4C en
oscuridad.
g)
Agar de Superficie
Pesar 0.6 g de Bacto Agar y 0.5 g de NaCl, agregar 100 mL de agua destilada. Alicuotar
15mL de la mezcla en tubos de 16x150 mm, cubrirlos con algodn, esterilizar en
autoclave y almacenar a temperatura ambiente
h)
Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4
Solucin A. Disolver 2.84 g de Na2HPO4 en 100 L de agua destilada.
Solucin B. Disolver 2.76g de NaH2PO4H2O en 100 L de agua destilada.
Para el amortiguador pH 7.4, tomar 81 mL de la Solucin A y 19 mL de la Solucin B.
Almacenar a 4C. Esterilizar la solucin final en autoclave.
j)Mezcla fraccin S9
Para preparar esta mezcla se requieren dos tubos estriles de 16 x 150 mm y descongelar
previamente el S9 en bao de agua con hielos (4C). Tomar las alcuotas indicadas en la
Tabla 4 y mezclar siguiendo las instrucciones posteriores. Pesar la glucosa 6P y el NADP+,
usando aplicadores de madera para poder pesar los reactivos, (con una navaja, una de las
puntas del aplicador de madera se plana para poder tomar el reactivo y pesarlo), vaciarlos
cada uno a tubos eppendorf de 1.5ml.
12
ml de mezcla S9
recomendada para
7.2 mL
0.16 mL
0.0104 g
0.024 g
0.8 mL
*Antes de iniciar pedir al profesor que proporcione los tubos eppendorf de 1.5 mL con la
glucosa 6P y el NADP+ pesados en la cantidad correspondiente, empleando para ello
aplicadores de madera desechables.
En un tubo estril de 16x 150mm, aadir el amortiguador de fosfatos y la solucin de
cloruros, mezclar en vortex, tomar una alcuota de 500 l (con micropipeta) y aadirla en el
tubo eppendorf que contiene a la glucosa 6P para disolverla y agregarla al resto del tubo de
16 x 150 mm, mezclar nuevamente en el vortex. Tomar nuevamente otra alcuota de 0.5mL
y aadirla al tubo eppendorf que contiene el NADP para disolverlo, agregar al resto del
tubo de 16 x 150 mm. Mezclar el S9 y tomar la alcuota correspondiente para aadirla al
tubo de 16 x 150 mm, mezclar en vortex perfectamente y filtrar utilizando una unidad
Swinex (Millipore, 0.45 m), obteniendo el filtrado en otro tubo de 16x150mm ESTRIL.
Alicuotar 1.3 ml de la mezcla para cada equipo en tubos eppendorf.
NOTA 6: Tomar en cuenta que la mezcla siempre debe estar en hielo.
APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS
R1: Sobre boble con muestra ambiental y disolvente CH2Cl2.
R2: puntas para micropipeta y tubos de plstico.
R3: Concentrado de muestra ambiental en DMSO, este extracto puede contener
hidrocarburos aromticos policclicos y otros compuestos mutagnicos.
R4: Cajas de Petri con cultivo bacteriano de Salmonella typhimurium, cepas TA98.
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