El gnero Azospirillum

Jess Caballero-Mellado
Programa de Ecologa Molecular y Microbiana, Centro de Investigacin sobre
Fijacin de Nitrgeno, UNAM, Ap. P. 565-A, Cuernavaca, Mor., Mxico.
http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/Cap10/

Historia
An cuando Spirillum lipoferum fue descrito en 1925 por Beijerinck, esta
bacteria estuvo olvidada por varias dcadas. Son las observaciones de PeaCabriales y Dbereiner en 1973 (50) las que iniciaran la poca moderna de esta
bacteria. Estudios taxonmicos de S. lipoferum (88, 89) conducen a su
reclasificacin en un gnero nuevo, Azospirillum (166).
Actualmente son reconocidas seis especies en el gnero Azospirillum. Las dos
primeras en ser descritas fueron A. lipoferum y A. brasilense (166), siendo stas
las mas ampliamente estudiadas. Posteriormente fueron descritas las especies A.
amazonense (105), A.
halopraeferans (141), A.
irakense (85)
y A.
largomobile (26) siendo el nombre de esta especie corregido a A.
largimobile (158). Pocos aos antes sta especie fue considerada como un
sinnimo de la especie A. lipoferum (57). Recientemente, en honor de quien
impulsara los estudios con este gnero bacteriano y descubriera otros diaztrofos,
se ha propuesto la especie candidata A. doebereinerae (70).
Pocos aos despus del redescubrimiento de Azospirillum y hasta alrededor de
1993, este gnero fue el ms estudiado entre las bacterias asociadas a plantas. La
capacidad deAzospirillum para estimular el crecimiento de las plantas y de
aumentar el rendimiento de los cereales promovi numerosos estudios sobre la
ecologa, fisiologa y gentica de esta bacteria. En la actualidad su uso comercial
comienza a extenderse en diferentes pases, includo Mxico.
Aislamiento
El aislamiento de las bacterias del gnero Azospirillum resulta en lo general muy
simple, ya sea a partir de suelo rizosfrico o de la superficie de las races
(rizoplano) de numerosas plantas hospederas. Tambin se le aisla del interior de
las races o tallos de algunas plantas. El medio de cultivo usado por excelencia
para el enriquecimiento de las especies de Azospirillum ha sido el NFb

semigelificado "libre" de nitrgeno y con malato como fuente de carbono (52).

No obstante, en este medio de cultivo son aisladas predominantemente cepas de
las especies A. lipoferum y A. brasilense. El medio NFb con algunas
modificaciones en su composicin y pH permiten el aislamiento predominante de
otras especies de Azospirillum (51). Estos medios son usados frecuentemente
para evaluar la actividad reductora de acetileno, como indicativo de la fijacin de
nitrgeno. Tubos en los cuales se observa el crecimiento bacteriano en forma de
sombrilla, la cual se transforma en una pelcula blanca y densa abajo de la
superficie del medio de cultivo, y vire del indicador azl de bromotimol son
considerados tentativamente como positivos para el aislamiento en cultivo puro
de la bacteria.
El cultivo puro se logra en diferentes medios de laboratorio (126), siendo muy
comunmente usado un medio adicionado del colorante rojo Congo (146), en el
cual A. lipoferum y A. brasilense toman un color rojo escarlata que permite la
diferenciacin de otros gneros bacterianos. Aun cuando el medio BLCR fue
diseado para mejorar el aislamiento de cepas deAzospirillum brasilense (20), su
uso no fue aceptado por haberse demostrado que no era apropiado para el estudio
de poblaciones naturales de esta bacteria (73). Posteriormente se observ que la
concentracin de estreptomicina usada (200 mg/litro) en el medio BLRC era
inhibitoria del crecimiento de un gran nmero de cepas (103).
Adems de los medios y mtodos descritos, tambien existen reportados algunos
medios de cultivo y mtodos para el crecimiento de Azospirillum en cultivo puro
y en asociacin con plantas, as como para su conservacin (2, 126).
Identificacin
El gnero Azospirillum pertenece a la subclase alfa de las proteobacterias (181),
siendo A. lipoferum la especie tipo (166). Caractersticas tiles en la
identificacin rutinaria son la forma vibroide, el pleomorfismo y su movilidad en
espiral (51). Las clulas contienen cantidades elevadas de poli--hidroxibutirato
(PHB), hasta 50% del peso seco celular (124), observndose al microscopio las
clulas jvenes con abundantes granulos refringentes. En cultivos
semigelificados y gelificados con mas de 24 h de incubacin se presentan
frecuentemente clulas refringentes con forma ovoide y de paredes gruesas
similares a quistes (96). Una de las caractersticas fenotpicas ms ampliamente
usada como criterio para el reconocimiento tentativo del gnero Azospirillum es
el color rojo escarlata que toman las colonias (Fig. 1) al crecer en un medio
adicionado del colorante rojo Congo (146). No obstante, en este medio pueden
hallarse colonias mutantes de Azospirillum de color blanco debido a la
incapacidad de producir polisacridos no identificados (25).

Diversas pruebas bioqumicas y fisiolgicas son utilizadas rutinariamente para el

reconocimiento de las especies de Azospirillum. En la Tabla 1 se presentan
algunas caractersticas fenotpicas que contribuyen a diferenciar las especies
de Azospirillum. Adicionalmente, la diferenciacin de especies del
gnero Azospirillum se logra evaluando la capacidad de usar diversos
aminocidos y su efecto sobre la fijacin de nitrgeno (68), recomendndose el
uso de la histidina para la caracterizacin y aislamiento selectivo de la especie A.
lipoferum.
Los patrones de protenas de membrana (8, 48), as como los patrones de
protenas celulares (141), determinados mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida-dodecilsulfato (SDS-PAGE), permiten una clara diferenciacin de
las especies A. lipoferum, A. brasilense, A. amazonense y A. halopraeferens.
En forma complementaria para la identificacin fenotpica de las especies
de Azospirillum pueden ser usadas diversas tcnicas inmunolgicas. La
aglutinacin en tubo, tcnicas de precipitacin en capilar, inmunoelectroforesis
(44, 46), inmunofluoresencia e inmunodifusin (44, 93) fueron mtodos usados
exitosamente en la identificacin y numeracin deAzospirillum spp. El uso de la
tcnica de ELISA (Enzyme-Linked Immnunosorbent Assay) permite la
identificacin y numeracin especfica de cepas de Azospirillum, como fue
demostrado con la cepa Cd de A. brasilense (99) permitiendo evaluar la
capacidad de colonizacin de esta cepa en plantas inoculadas.
La identificacin genotpica especfica al nivel de gnero y especies
de Azospirillum se logra en forma reproducible mediante el uso de sondas
basadas en secuencias de los genes 23S rRNA (86). Con los oligonuclotidos
reportados
se
logra
tanto
la
identificacin
especfica
del
gnero Azospirillum como de las especies A. lipoferum, A. brasilense, A.
amazonense, A. halopraeferens y A. irakense, mediante experimentos tipo "dot
blot". Estas sondas tambin pueden ser usadas para la deteccin in situ de las
especies de Azospirillum.
Alternativamente, la identificacin genotpica rutinaria de las especies
de Azospirillum, as como su deteccin, se logra fcilmente y en forma
reproducible amplificando mediante el uso de la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) los genes 16S rDNA [p. ej. usando las secuencias de los
oligonuclotidos 27f (5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG) y 1495r (5'CTACGGCTACCTTGTTACGA)] y cortando los productos amplificados con la
enzima de restriccin AluI (63, 66). Con esta estrategia se obtienen fragmentos de
tamaos especficos para cada especie de Azospirillum, distinguibles fcilmente
en geles de agarosa

Caractersticas genmicas
El genoma de cinco de las 6 especies de Azospirillum, excepto el de A.
largimobile el cual no fue analizado, es constitudo por varios megareplicones
algunos de los cuales son aparentemente lineares (107). El tamao global del
genoma en las especies de Azospirillum vara de un mnimo de 4800-kb en A.
irakense a practicamente el doble, 9600-kb en A. lipoferum. En A. brasilense y A.
amazonenze el tamao es alrededor de 7000-kb. El nmero de replicones vara
entre cepas de A. brasilense, encontrndose comunmente 7-8 replicones
(33, 107) (Fig. 2) e incluso hasta 10 en A. lipoferum (107). Sera de esperarse que
uno de los replicones de gran tamao correspondiera al cromosoma, pero
interesantemente, en A. brasilense se mostr por primera vez que el genoma de
esta especie est constituda por mltiples cromosomas (33), correspondiendo
stos a replicones de alrededor de 600-kb, 1000-kb y 1700-kb. La existencia de
cromosomas mltiples en A. brasilense ha sido corroborada, pero se reporta la
existencia de un cromosoma extra de alrededor de 2500-kb (107). En las otras
especies de Azospirillum tambin se encontr que el genoma est constitudo por
varios cromosomas (107), confirmndose la hipotesis sugerida previamente (33)
sobre la multiplicidad de cromosomas en el gnero Azospirillum. Asi, el
gnero Azospirillum se suma al reducido grupo de bacterias [Agrobacterium
tumefaciens (4), Brucella spp. (79),Burkholderia cepacia (36), Rhodobacter
spheroides (163), Vibrio parahaemolyticus (180)] que presentan varios
cromosomas en lugar de un solo cromosoma circular.
Aspectos de la gentica de Azospirillum y de los genes que participan en la
interaccin con las races de las plantas, as como los involucrados en la fijacin,
asimilacin y regulacin de nitrgeno han sido revisados recientemente por
Steenhoudt y Vanderleyden (161).
La presencia de plsmidos es comn en A. lipoferum y A. brasilense, siendo sta
una de las primeras caractersticas genmicas reportadas para el
gnero Azospirillum (Fig. 2). En general cada cepa muestra un perfil plasmdico
nico conformado por 1 a 6 plsmidos, con tamaos en el rango de 6- a 550-kb
(59, 62, 136). Aun cuando se reportaron algunas discrepancias en el perfil de
plsmidos, analizando incluso la misma cepa (p. ej. Sp 7), la presencia de un
plsmido de 90-Mda (llamado p90; aprox. 135-kb) es comn entre las cepas deA.
brasilense. Debido a que el p90 no ha podido ser curado en A. brasilense, se
considera que ste plsmido codifica funciones celulares esenciales (41, 131).
Adems de la presencia de plsmidos en cepas de Azospirillum, tambin fue
reportada la presencia de minicromosomas (179), y aunque su designacin fue
hecha solamente sobre la base de su gran tamao, 2775-kb aproximadamente, su
presencia fue confirmada solo recientemente (33, 107).

Con excepcin del p90, involucrado en la biosntesis de cido indol actico (84)
y en la adherencia a las races (41, 111) no se conoce la funcin de los otros
plsmidos en las especies deAzospirillum. No obstante, algunes genes como
los nodPQ o exoB y exoC han sido identificados en el p90 mediante ensayos de
hibridacin o complementacin gentica (113, 175). Recientemente ha sido
identificado el gen repA (origen de replicacin del plsmido) en el p90 de A.
brasilense (173). El mapa fsico del p90 fue constuido a partir del plsmido
obtenido de la cepa tipo de Azospirillum brasilense Sp7 (131).
Distribucin
Los azospirilla muestran una muy amplia distribucin geogrfica alrededor del
mundo. An cuando son mas abundantes en las regiones tropicales, tambin se
les encuentra en las regiones templadas, fras y desrticas (45, 52, 65, 169). En
las regiones templadas del sur de Brasil, los Estados Unidos y Kenia la presencia
de Azospirillum es menor al 10% en las muestras analizadas (52). El pH del suelo
juega un papel importante en la presencia de las especies del
gnero Azospirillum. Las especies de A. brasilense y A. lipoferum se encuentran
en mayor abundancia en suelos con valores de pH cercanos a la neutralidad, an
cuando a pH abajo de 5 se les encuentra en forma esporadica y no logrndose su
aislamiento de suelos con pH menor a 4.5 (52, 49, 120). Un estudio en el que se
evaluaron 23 tipos de suelos con caractersticas diferentes mostr que algunos
factores abiticos tales como porcentaje de arcilla, contenido de materia
orgnica, capacidad de retencin de agua y contenido de nitrgeno afectan
positivamente la sobrevivencia de A. brasilense (24), en tanto que el tamao de
las partculas de arena y especialmente la alta concentracin de carbonato de
calcio afectan negativamente la sobrevivencia de esta especie en ausencia de
plantas. No obstante, la sobrevivencia de A. brasilense en la rizosfera es
independiente de la aridez del suelo.
Las bacterias del gnero Azospirillum han sido aisladas de la superficie de la raz
de una muy amplia variedad de plantas y de su rizosfera, incluyendo cereales
como maz, trigo, arroz, sorgo, avena (85, 91, 135, 94, 151, 156, 178), pastos
forrajeros
como Cynodon
dactylon (34, 121), Poa
pratensis, Festuca
arundinacea (162),
de
diferentes
especies
dePennisetum (87, 169)
y Panicum (34, 103, 104, 169). Especies de Azospirillum fueron aisladas incluso
del henequn [Agave fourcroydes (103)], y plantas cactceas que incluyen
diferentes especies de Opuntia y Stenocereus (109, 138). En algunos casos se
logr confirmar el aislamiento de A. brasilense y A. amazonense de semillas de
pastos esterilizadas superficialmente (162). Aun cuando no fueron identificados
al nivel de especie, algunas cepas de Azospirillum fueron aisladas de

esporocarpos
de
los
hongos
ectomicorrzicos Hebeloma
crustuliniforme, Laccaria laccata and Rhizopogon vinicolor (100).
Ambiente rizosfrico
Aparentemente, una bacteria del suelo deber sobrevivir a las mltiples
interacciones que se presentan con la compleja comunidad microbiana que habita
el mismo microambiente, antes de que ocurra cualquier interaccin con las races
de la planta. En el inicio de una interaccin con las races de la planta hospedera,
el microorganismo especfico deber llegar a la superficie de las races, adherirse
y multiplicarse para colonizarla. Si la bacteria tiene la capacidad de invadir los
tejidos internos, se diseminar en el interior de la raz e incluso en otros rganos
de la planta.
La adaptacin de Azospirillum al futuro ambiente rizosfrico probablemente se
inicia con la germinacin de la semilla, la cual exuda infinidad de compuestos
orgnicos que forman parte fundamental de la espermosfera. Posteriormente, la
exudacin de compuestos ser a travs de las races durante el desarrollo de la
planta (43). Aun cuando las especies de Azospirillumdifieren en su capacidad
para utilizar diferentes compuestos como fuentes de carbono y nitrgeno, estas
bacterias usan para su crecimiento unos pocos mono y disacridos asi como
alcoholes polihidroxilados, y principalmente diversos cidos orgnicos tales
como mlico y succnico y algunos aminocidos (68, 166). Para el uso de
diferentes fuentes de carbono, tantoA. lipoferum como A. brasilense tienen todas
las enzimas de la via de Embden-Meyerhof-Parnas y de la va de EntnerDoudoroff (108, 177), as como todas las enzimas del ciclo de los cidos
tricarboxlicos (108). Tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen la capacidad
de crecer autotrficamente con H2 y CO2, proceso en el que participa la ribulosa1,5-difosfato carboxilasa (106, 168). A pesar de que el uso de cido
poligalacturnico y pectina fue reportado en A. brasilense Sp7 (170, 171) y que
se detect actividad pectato liasa (167), existen evidencias contradictorias en
cuanto al uso de polisacridos por esta especie. A. brasilense puede metabolizar
varios mono y disacridos constituyentes de la pared celular de las races
dePennisetum americanum (118). Sin embargo, estos autores no pudieron
confirmar que la cepa Sp7 fuera capaz de usar cidos poligalacturnicos, o
pectina, ni otros polisacridos tales como xilanos, polipectatos y celulosa.
La riqueza en compuestos orgnicos en la espermosfera/rizosfera conduce a
intensas actividades e interacciones microbianas. Algunos estudios indican que la
quimiotaxis a los exudados de raz es uno de los factores que influyen en la
llegada de los microorganismos a la rizosfera (154). Tanto en A. lipoferum como
en A. brasilense se demostr una fuerte actividad quimiotctica hacia diversos

azcares, cidos orgnicos y aminocidos (13, 15, 71, 140), as como hacia
compuestos aromticos (102) y exudados radicales (5, 61, 71). La respuesta
quimiotctica a diferentes fuentes de carbono es variable dependiendo de la
especie de Azospirillum e incluso es cepa-especfica (140). Tambin una
respuesta hacia el oxgeno (aerotaxia) fue observada en A. brasilense (14, 15).
Zonas de baja concentracin en oxgeno fueron las preferidas por las clulas
bacterianas para su crecimiento y multiplicacin, siendo repelidas por altas
concentraciones de oxgeno y condiciones anaerbicas (14, 139). La aerotaxia
parece ser especialmente importante bajo condiciones de fijacin de nitrgeno,
permitindole a las clulas de Azospirillum alcanzar concentraciones de oxgeno
lo suficientemente bajas para que se exprese la actividad nitrogenasa. Se sugiere
que tanto la respuesta quimio y aerotctica son caractersticas que contribuyen en
el proceso de colonizacin de las races de las plantas, ya que el consumo de
oxgeno durante el crecimiento activo de las races enriquece el ambiente con
sustratos orgnicos y genera gradientes de oxgeno al consumirse ste durante la
respiracin (112). No obstante, la colonizacin de la rizosfera y la superficie o el
interior de las races ser el resultado del enriquecimiento selectivo de los
microorganismos mejor adaptados a estos ambientes. Por ejemplo, la capacidad
para producir bacteriocinas por algunas cepas de A. brasilense y A.
lipoferum (129, 130, 157, 165) podra representar ventajas competitivas sobre las
cepas de estas especies o ntimamente relacionadas que sean sensibles a estas
biomolculas. Adems, la capacidad de producir siderforos (agentes quelantes
del hierro) por algunas cepas de A. brasilense (9, 155, 165) (Fig. 3) pudiera ser
de gran importancia durante la colonizacin del ambiente rizosfrico y de la
superficie de las races al ejercer efectos antagnicos contra otros miembros de la
comunidad microbiana, incluyendo a microorganismos deletreos o patgenos de
las plantas (Fig. 4). Es concebible que en el ambiente rizosfrico las especies
de Azospirillum puedan ser antagonizadas. Alrededor de la tercera parte de ms
de 400 actinomicetos aislados de la rizosfera del centeno fueron reportadas como
antagonistas de Azospirillum spp. y A. lipoferum(92). Esta actividad antagonista
correlaciona con la alta sensibilidad de A. brasilense a los antibiticos
estreptomicina, tetraciclina y cloranfenicol (103) producidos por actinomicetos
del suelo, en comparacin a la elevada resistencia a los antibiticos del tipo lactmicos producidos por hongos. La expresin constitutiva de la actividad lactamasa fue observada entre numerosas cepas de A. brasilense (103). Estos
resultados
sugieren que
el antagonismo
causado por hongos
contra Azospirillum es limitado. Tambin es concebible que se presenten efectos
sinrgicos entre Azospirillum y otros miembros de la comunidad rizosfrica. Por
ejemplo, el filtrado de un cultivo de Phialophora radicicola, hongo usado como
agente de biocontrol, promueve el crecimiento de A. lipoferum y A.
brasilense (58).
De
manera
similar,
la
interaccin
entre A.

brasilense y Azotobacter chrococcum o Streptomyces mutabilisconduce

incrementos de sus respectivas poblaciones en la rizosfera de trigo (53).

Diversas condiciones tales como el envejecimiento celular y la presencia de

metales pesados provocan que las clulas vibroides de Azospirillum cambien su
morfologa y tomen la forma de "quistes" (conocidos como formas C),
conduciendo a la agregacin celular y formando grumos visibles de gran tamao
(19). Aparentemente, residuos de arabinosa presentes en el exopolisacrido y en
el polisacrido capsular estan involucrados en la agregacin de A.
brasilense (31). La agregacin y la formacin de quistes mejora la sobreviviencia
de Azospirillum, situacin en la que la acumulacin de poli--hidroxibutirato
(PHB) parece desempear una funcin importante al servir como almacen de
carbono y energa (125). Adems, diversas funciones fisiolgicas son atribuidas
al PHB, destacndose la mayor resistencia a la desecacin (96, 147, 148), a la luz
ultravioleta y al choque osmtico (164). Se ha sugerido que la formacin de
quistes pudiera desempear una funcin importante en la sobreviviencia
de Azospirillum en el ambiente rizosfrico, e.g., cuando los nutrientes son
limitados, previo a la asociacin con las races de la planta (164, 127).
Recientemente, ha sido publicada una amplia revisin sobre las caractersticas
de A. brasilense en relacin con la agregacin celular (29).
Interaccin con la planta
Probablemente, una vez que las clulas de Azospirillum se han adaptado a las
condiciones del ambiente rizosfrico y han logrado llegar a la superficie de las
races, debido a sus caractersticas quimio y aerotcticas, se iniciar el
establecimiento de la asociacin. Diferentes estudios han mostrado que A.
brasilense tiene la capacidad para adherirse a las races de plantas gramneas
como el mijo (Pennsisetum purpureum) y Digitaria decumbens (171), trigo (77),
maz (61), as como a las races de plantas de otras familias que incluyen al
algodn y tomate (98), e incluso a superficies inhertes como poliestireno y arena
(22, 23, 98). La capacidad de Azospirillum para adherirse a las races, al menos a
las de mijo, es significativamente mayor que la mostrada por otras bacterias de la
comunidad rizosfrica como Rhizobium, Azotobacter, Klebsiella o Pseudomonas,
e incluso que E. coli (171). La asociacin de Azospirillum con las races de las
plantas se desarrolla en dos etapas completamente independientes (111). La
primera consiste en una adsorcin rpida, dbil y reversible, la cual es
dependiente de protenas de la superficie bacteriana del tipo de las adhesinas en
conjunto con la participacin del flagelo polar (40, 111). La segunda fase
consiste de un anclaje lento pero firme e irreversible que alcanza su mximo
nivel 16 h despus de la inoculacin, el cual parece ser dependiente de un
polisacrido extracelular de Azospirillum (111). Los resultados de un estudio

reciente sugieren la posibilidad de que una protena de la membrana externa

de Azospirillum participe en el proceso de adherencia a las races de las plantas
(31). El proceso de adherencia de Azospirillum a las races de las plantas ha sido
revisado recientemente (29). En diversos casos se ha reportado la aparicin de
material fibrilar que contribuye al anclaje de Azospirillum a las races de diversas
plantas (98, 171), describindose como esencial para el anclaje a las partculas de
arena (23). An en la actualidad, la naturaleza del material fibrilar no ha sido
elucidada (47, 161), aunque parece ser de origne bacteriano. Recientemente se ha
publicado una revisin sobre la capacidad de Azospirillum para adherirse a
superficies abiticas del suelo (18).
La inoculacin de diversas plantas con Azospirillum ha mostrado que los
principales sitios de colonizacin son las areas de elongacin celular y las bases
de los pelos radicales (98, 82). Slo algunas clulas de Azospirillum llegan a
adherirse a la cofia o a los pelos radicales (82). Sin embargo, fue observada la
presencia de Azospirillum dentro del mucigel que se acumula en la cofia (171).
La inoculacin de races de trigo con una cepa de Azospirillum que expresa
constitutivamente el gen reportero gusA mostr que en los primeros das de la
asociacin las clulas bacterianas colonizan especficamente los sitios de
emergencia de las races laterales y las regiones de los pelos radicales, tanto de la
raz primaria como de las races secundarias y posteriormente la superficie de la
raz (172). En plantas de trigo fue observado que la inoculacin
de Azospirillum induce cambios en la morfologa de los pelos radicales, siendo
stos cambios significativamente mayores que los causados por Rhizobium
leguminosarum o Azotobacter chrococcum, los cuales son mnimos (77, 80).
Adems, fue observado que la inoculacin con 105 a 106 clulas
de Azospirillum causa tanto la elongacin como el aumento de la superficie total
de la raz (Fig. 5), en tanto que la inoculacin de 108 a 109 clulas causan la
inhibicin del desarrollo de sta (82). Aparentemente, el incremento del tamao
del sistema radical se debe, al menos parcialmente, al aumento de la divisin
celular y al intenso crecimiento de la zona de elongacin de las races (97). Es de
inters sealar que los sitios que coloniza Azospirillum lipoferum son diferentes,
dependiendo de la variedad de la planta, al menos en el caso del arroz (116). La
capacidad de Azospirillum para colonizar las races de las plantas es variable
dependiendo de la cepa. Con el uso de microscopia confocal de rayos lasser y
sondas de oligonucletidos fluorescentes (6) y con el uso de anticuerpos
monoclonales cepa-especficos (153) ha sido mostrado que algunas cepas de A.
brasilense, incluyendo a la cepa tipo Sp7, se encuentran restringidas al ambiente
rizosfrico y son capaces de formar colonias solamente en la superficie de la raz
de plntulas de trigo, en tanto que otras cepas son encontradas frecuentemente en
altas densidades en los espacios intercelulares de la raz, as como en el interior

de los pelos radicales. Resultados similares, usando otras metodologias, habian

sido reportados con algunas de las mismas cepas de Azospirillum inoculadas en
trigo creciendas en condiciones de campo (11).
Experimentos de inoculacin
Considerando la capacidad de Azospirillum para asociarse con plantas de inters
agrcola, as como su capacidad para fijar N2 en medios de cultivo, se disearon
numerosos experimentos para evaluar el efecto de la inoculacin sobre el
crecimiento de las plantas. No existen reportes que indiquen efectos patognicos
en las plantas causadas por la inoculacin de Azospirillum. El nico reporte
existente en esta direccin indica que ninguna de las especies
de Azospirillum causa sintomas visibles de enfermedad sobre la raz o las hojas
de plantas de trigo, algodn o tomate (17). Con la inoculacin de Azospirillum se
observ frecuentemente un mayor desarrollo del sistema radical (Fig. 6)
(123, 133, 135, 174) el cual se traduce en mayor superficie de absorcin de
nutrientes, as como en mayor desarrollo de la parte area de las plantas (Figs.
7 y 8) (7, 117, 123, 133, 135, 150). Tambin fueron observados incrementos en el
contenido de nitrgeno, fsforo, potasio y otros minerales en las plantas
inoculadas (32, 101, 117, 133, 149, 160). Principalmente con A. brasilense y A.
lipoferum se llevaron a cabo gran cantidad de experimentos en muchos pases
para evaluar su efecto sobre el rendimiento de los cultivos
(3, 10, 11, 27, 32, 37, 56, 60, 80, 83, 110, 114, 119, 123,134, 145, 149, 159, 176).
Una amplia revisin sobre los resultados de los experimentos desarrollados entre
los aos 1974-1994 fue realizada por Okon y Labandera (128). Esta evaluacin
revel que el xito de la inoculacin fue en el rango del 60 al 70% de los
experimentos realizados en suelos y regiones climticas diferentes (Fig. 9), con
incrementos significativos, generalmente en el rango de 5 a 30%, en el
rendimiento de los cultivos (Fig. 10). Sin embargo, cuando se evalu el efecto de
la inoculacin en conjunto con la aplicacin de niveles intermedios de
fertilizacin con nitrgeno, fsforo y potasio, el xito de los experimentos se
incrementa hasta 90% (128). Frecuentemente se observ que la inoculacin de
los cultivos con Azospirillum permite reducir en 40-50% el nivel de los
fertilizantes sin que exista disminucin en el rendimiento de la cosecha.
Recientemente fueron observados incrementos en la biomasa de pastizales
naturales inoculados con A. brasilense aun bajo condiciones de crecimiento
subptimas (75).
Mecanismos de estimulacin del crecimiento de las plantas
La capacidad de Azospirillum para estimular el crecimiento de las plantas ha sido
demostrado en decenas de experimentos, tanto de campo como de invernadero.

Varios son los mecanismos que se han sugerido como responsables del efecto
estimulatorio observado en las plantas inoculadas.
En numerosos estudios de inoculacin con Azospirillum, adems del mejor
crecimiento de las plantas, fueron observados incrementos en el contenido de
nitrgeno total de las plantas inoculadas respecto a las testigo
(10, 37, 81, 80, 117, 122, 133, 152, 160) y en la incorporacin de 15N
(90, 142, 143). No obstante, en la mayora de estos estudios no fueron observadas
diferencias significativas en el porciento de nitrgeno o en el contenido de
protena entre plantas inoculadas y no inoculadas, razn que contribuy a
desechar la idea de que la fijacin biolgica de nitrgeno fuera el mecanismo
responsable de los efectos benficos observados. Debido a que los efectos de la
inoculacin con Azospirillum sobre el crecimiento de la raz y la parte area de
las plantas son similares a los que se presentan cuando las plantas son tratadas
con fitohormonas (144, 167) fue sugerido que estas sustancias podran ser
responsables del mejor crecimiento de las plantas, as como de los incrementos
observados en el contenido de minerales y en el rendimiento de los cultivos
(10, 27, 32, 80, 114, 119, 122,135, 160)
Recientemente ha sido revisada la funcin de las fitohormonas en las
asociaciones planta-microorganismo (72). Azospirillum tiene la capacidad de
producir auxinas, citocininas y giberelinas en medios de cultivo
(28, 55, 74, 109, 132, 144, 167). No obstante, el mecanismo analizado con mayor
amplitud ha sido la produccin de auxinas, especialmente la del cido indol
actico (AIA) (16, 67, 69, 78, 115, 182). El AIA producido por las bacterias
puede modificar el contenido de fitohormonas de las plantas conduciendo a la
estimulacin del crecimiento de las mismas (12).
En cultivos de Azospirillum, adems de AIA se han encontrado otros compuestos
indlicos y metabolitos relacionados tales como el cido indol pirvico (38),
indol lctico (39, 42), indol acetamida (12, 39, 69), indol acetaldehdo (38), indol
etanol e indol metanol (42), triptamina, antranilato y otros compuestos indlicos
no identificados (69). En diferentes estudios se ha tratado de obtener mutantes
incapaces de sintetizar AIA, sin embargo, en el mejor de los casos solamente se
logr obtener mutantes hipoproductoras de este compuesto. Esto sugiri la
existencia de ms de una va biosinttica del AIA en Azospirillum (1, 69).
Actualmente se conoce que Azospirillum puede sintetizar AIA a travs de tres
vas. En tanto que las vas del cido indol pirvico (38) y la del indol acetamida
(12) son dependientes del triptofano, la tercera es una va independiente de este
aminocido (137), desconocindose el precursor del AIA. Resultados recientes
permiten sugerir que la indol piruvato descarboxilasa es una enzima comn tanto
a la va del indol pirvico como a la va no dependiente de triptofano (95).

A pesar de que existe la tendencia de atribuir a las fitohormonas, especialmente

al AIA, los efectos benficos de la inoculacin con Azospirillum, tambin existe
la propuesta de que tales beneficios son el resultado de diversos mecanismos
(21, 101, 133, 135, 174). Se han sugerido otros mecanismos como responsables
de los efectos estimulatorios causados por la inoculacin de Azospirillum (183) y
algunos de stos han sido revisados por Bashan y Holguin (19).
Aplicacin
Algunas compaias en diferentes pases han registrado inoculantes
de Azospirillum para maz y otros cultivos (75, 128). Burdman y col. (30)
refieren que en Sudafrica se lleva a cabo la produccin de inoculantes a base
de Azospirillum para 150,000 hectreas de maz y 12,000 de trigo. Algunas
caractersticas de la produccin de inoculantes a base de Azospirillum han sido
discutidas (54, 76, 128).
Aun cuando el uso de Azospirillum como bioestimulante del crecimiento de las
plantas no se ha generalizado mundialmente, en Mxico la aplicacin de sta
bacteria en diferentes cultivos ha revasado con mucho lo hecho en otros pases.
En el ciclo agrcola primavera-verano (PV) del ao 1999 la Secretara de
Agricultura, a travs de su Instituto Nacional de Investigaciones Forestales
Agrcolas y Pecuarias (INIFAP) y de la Fundacin Mexicana para la
Investigacin Agropecuaria y Forestal, A.C., en colaboracin con el Centro de
Investigacin sobre Fijacin de Nitrgeno-UNAM, llev a cabo la inoculacin de
alrededor de 450,000 hectreas de maz y 150,000 hectreas de sorgo, cebada y
trigo, empleando cepas de Azospirillum seleccionadas por su capacidad para
promover el crecimiento de las plantas e incrementar el rendimiento de los
cultivos.
La evaluacin del rendimiento de grano en alrededor de 675 hectreas de los
diversos cultivos, que comprendieron cerca de 170 sitios de Mxico con
caractersticas edficas en regiones climticas diferentes mostr el xito de la
inoculacin en el rango de 62 a 95% de los casos analizados, con incrementos
que fluctuaron en el rango de 6 a 98%. En la Tabla 2 se presenta un resumen de
los resultados obtenidos en el ciclo agrcola PV-1999. El incremento promedio en
la produccin de los cultivos de maz, trigo, cebada y sorgo bajo las diferentes
condiciones evaluadas fue del 26%. Los resultados fueron dependientes de la
variedad y cultivo, tipo de suelo, uso y nivel de fertilizantes (35). La mejor
respuesta a la inoculacin se present en suelos de tipo ligero (arenosos), con
niveles intermedios de fertilizacin en el rango de 45-90 Kg N/ha, y con las
variedades "criollas" de maz. Considerando la cantidad de variedades, cultivos,
suelos y condiciones climticas evaluadas, los resultados de la inoculacin

con Azospirillum reflejan claramente la capacidad de la bacteria para promover el

desarrollo de las plantas y el impacto positivo sobre el rendimiento de los
cultivos de grano. El programa de "Biofertilizacin" se continu durante el ciclo
PV-2000, inoculndose alrededor de un milln y medio de hectreas.
El temor o las precauciones expresadas en algunas revisiones sobre el tema, por
cierto muy escasas, para extender el uso de Azospirillum a niveles comerciales
debido a la "inconsistencia de la inoculacin" tienen poco valor ante los
resultados de produccin obtenidos en decenas de experimentos, as como los
obtenidos en miles de hectreas con diferentes cultivos, variedades y condiciones
edficas y climticas.
An en la actualidad hacen falta muchos estudios de investigacin bsica, tanto
sobre la bacteria como en su interaccin con la planta, para un mejor
entendimiento de la asociacinAzospirillum-planta. No obstante, en mi opinin,
la aplicacin de Azospirillum como bioestimulante que incrementa la produccin
de los cultivos deberia extenderse a todos aqullos lugares donde la aplicacin de
fertilizantes es nula o escasa, como lamentablemente ocurre en no pocos pases
que tienen una agricultura subdesarrollada. En las regiones donde se practica una
agricultura moderna, la inoculacin con Azospirillum permitira reducir las
elevadas cantidades de fertilizantes que generalmente se aplican y con ello
disminuir tanto el costo de produccin como los problemas derivados de su uso,
principalmente la contaminacin, sin detrimento de la produccin.