Qumica Biolgica I TP 10 DNA: extraccin, identificacin y reconocimiento

OBJETIVO:
-Utilizar tcnicas sencillas para extraer ADN de tejido vegetal.
-Extraer ARN de levadura
-Reconocer los componentes estructurales del ARN y ADN.
FUNDAMENTO:
Los cidos nucleicos son compuestos nitrogenados de elevado peso molecular que se pueden
encontrar en las clulas asociados a protenas formando complejos llamados ncleo-protenas.
Estas protenas tienen carcter bsico mientras que los cidos nucleicos son cidos. Se
conocen dos grupos de cidos nucleicos: RNA (cido ribonucleico) y el DNA (cido
desoxirribonucleico). La hidrlisis controlada de RNA y DNA produce nucletidos. Si la
hidrlisis contina se producen nuclesidos y finalmente fosfatos, azcares y bases pricas y
pirimidnicas.
La funcin biolgica de los cidos nucleicos es fundamental: el DNA est asociado con el
material gentico de las clulas, pudiendo encontrarse como una sola cadena en algunos
microorganismos o formando parte de ncleo-protenas de los cromosomas en organismos
superiores. Almacena informacin gentica y sirve de molde para la sntesis de protenas. Se
encuentra mayoritariamente en el ncleo y en muy poca cantidad en mitocondria y
cloroplastos. El RNA participa en la sntesis de protenas y se distribuye en toda la clula,
mayormente en citoplasma en forma soluble o formando parte de los ribosomas.
El protocolo bsico de extraccin de DNA consiste en el tratamiento del homogeneizado con
disolventes orgnicos (fenol, cloroformo o ambos)
Para evidenciar la presencia de cidos nucleicos en extractos celulares vegetales se requiere
clulas en cantidad suficiente y en medio libre de interferencias que puedan causar lisis celular
o hidrlisis de los cidos nucleicos por nucleasas. Una completa extraccin de cidos nucleicos
es fundamental para la determinacin indirecta.
Una hidrlisis cida remueve todas las bases pricas (hidrlisis de uniones N-glicosdicas entre
pentosa y las bases pricas) sin afectar las uniones fosfodiester del esqueleto nucleotdico, por
lo tanto obtenemos como producto cidos nucleicos sin bases pricas.
Las desoxipentosas debido a la hidrlisis cida sufren deshidratacin dando aldehdos hidroxi-levulnicos. Estos reaccionan con difenilamina dando un producto de color azul. As, la
reaccin de difenilamina servir para caracterizar, indirectamente, la presencia de DNA en
clulas de cebolla.

La pentosa del DNA y RNA puede evidenciarse por la reaccin con orcinol. El cido sulfrico
hidroliza las uniones fosfodiester y N-glicosdicas, liberando ribosa, bases pricas,
pirimidnicas y acido fosfrico.
La pentosa en medio cido se deshidrata originando furfural que reacciona con el orcinol
dando un producto verde que demuestra la presencia de DNA y RNA.

El grupo fosfato se identifica por la reaccin para fsforo inorgnico, en medio cido, con el
molibdato (reactivo 1) da fosfomolibdato, color amarillo, que es reducido luego por el cido
ascrbico (reactivo 2) a azul de molibdeno, color azul verdoso. El reactivo 3 (arsenito/citrato)
se combina con el exceso de molibdato impidiendo su reaccin posterior con otros fosfatos.

Parte experimental:
EXTRACCIN Y CARACTERIZACIN DE DNA DE CELULAS VEGETALES.
Reactivos
Solucin de lisis: 0,1 % de SDS en 25 mM EDTA pH 8,0
Alcohol etilico 95%
Rvo difenilamina: 0,2 g en 20 ml de cido actico glacial y adicionar 0,5 ml de cido sulfrico.
(Preparar en el momento)
Rvo Bial: 1,5 g de orcinol en 500 ml de HCl cc y 20 gotas de cloruro frrico 100 g/l

Pelar y rallar una cebolla mediana con rallador o procesador hasta picarla finamente. Pesar 10
g de cebolla rallada y adicionar 25 ml de solucin de lisis y dejar 20 min. a t amb. Filtrar en
gasa y recoger en probeta. Transferir 4 ml de filtrado a un tubo de ensayo. Adicionar 2
volmenes de etanol 95% procurando no mezclar las dos soluciones. En la interfase observar la
formacin de una fina hebra. Aspirar la interfase con pipeta Pasteur y separarla en un tubo.
Precipitar el DNA por calentamiento suave. Observar. Homogeneizar para realizar reacciones.

Reaccin para caracterizacin de DNA (desoxipentosa)

Tubo A

Tubo B

Agua destilada

0,1 ml

Extracto

0,1 ml

Rvo difenilamina

2 ml

2 ml

Hervir 10 minutos, enfriar y observar.

Reaccin para identificacin de pentosa (ribosa o desoxirribosa)

Tubo A

Tubo B

Agua destilada

0,1 ml

Extracto

0,1 ml

Rvo orcinol

2 ml

2 ml

Hervir 10 minutos, enfriar y observar.

Reaccin para identificacin de grupo fosfato.

Blanco

Problema

Agua Destilada

0,1 ml

Extracto

0,1 ml

Rvo 1

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,75 ml

0,75 ml

Mezclar y esperar 30 seg.

Rvo 2
Mezclar y esperar 30 seg.
Rvo 3

Mezclar, incubar 15 minutos a 37 y observar.

AISLAMIENTO DE ARN DE LEVADURA

Fundamento:
El ARN de levadura se obtiene extrayendo un homogeneizado de clulas con fenol. La
solucin concentrada de fenol rompe los enlaces de hidrgeno en las macromolculas,
causando desnaturalizacin de las protenas. La suspensin turbia se centrifuga y aparecen dos
fases: la fase inferior de fenol contiene ADN y la fase superior acuosa contiene glcidos y
ARN. La protena desnaturalizada se halla presente en ambas fases y puede removerse por
centrifugacin. El ARN precipita luego con etanol. El producto obtenido no contiene ADN
pero generalmente est contaminado con polisacrido que se puede tratar con amilasa para
mejorar la purificacin.

Materiales:

Levadura seca

2g

Solucin de fenol (900 g/l) 10 ml

Acetato de potasio (200 g/l pH 5 ) 20 ml
Etanol absoluto 30 ml
Eter etlico 5 ml
Bao de agua a 37

Parte Experimental:

Suspender 2 g de levadura seca en 8 ml de agua a 37. Dejar por 15 min. a 37 y agregar 10

ml de fenol. Agitar mecnicamente la suspensin durante 30 min. a temperatura ambiente.
Centrifugar en fro a 4000 rpm durante 15 min. para romper la emulsion. Con pipeta Pasteur
remover cuidadosamente la capa superior acuosa y centrifugar a 10000 rpm durante 15 min en
una centrifuga refrigerada para separar la proteina desnaturalizada. Agregar acetato de potasio
al sobrenadante hasta obtener concentracin final de 20 g/l y precipitar el ARN aadiendo 2
volmenes de etanol. Enfriar la solucin en hielo y dejar all por 1 h. Recoger el precipitado
por centrifugacin en fro a 3000 rpm por 5 min. Lavar el ARN con una mezcla de etanolagua (3:1), luego con etanol y finalmente con ter. Dejar secar al aire y pesar. El contenido de
ARN en levadura es alrededor de 4% de su peso seco.
Evidenciar la presencia de ribosa mediante la reaccin de Bial con orcinol.