Enrique Iez Pareja

Instituto de Biotecnologa
Universidad de Granada
Este ensayo viene acompaado por una sesin de diapositivas on line, provistas de imgenes y
pginas de notas. Vistelas!
NDICE:
1.

Manipulacin de la expresin gnica en bacterias

1.1

Promotores fuertes y regulables

1.1.1

Ejemplos de promotores regulables

1.1.2

Un ejemplo de plsmido de expresin de alta eficiencia

1.1.3

Otros sistemas

1.1.4

Sistemas de expresin adaptados a la gran escala

1.2

Protenas de fusin

1.3

Manipulacin de factores que afectan a la traduccin

1.4

Mejora de la estabilidad de la protena

1.5

Resolucin de los problemas de los vectores multicopia

1.5.1

Plsmidos de mediano nmero de copias

1.5.2

Plsmidos de bajo nmero de copias

1.5.3

Integracin cromosmica

1.6
2.

Carga metablica
Ingeniera gentica de levaduras

2.1

Aspectos generales

2.2

Sistemas de expresin en Saccharomyces cerevisiae

2.2.1

Expresin directa (sin secrecin)

2.2.2

Expresin y secrecin

2.3

Sistemas de expresin en otras levaduras

3.

Sistemas de expresin de baculovirus

4.

Ingeniera de protenas

1. Manipulacin de la expresin gnica en bacterias

El objetivo principal de la ingeniera gentica con fines industriales es lograr la correcta expresin a
altos niveles del gen clonado en el microorganismo husped elegido. Sin embargo, la clonacin
directa (sin manipulacin adicional) de un gen en un vector normal (como el pBR322) no suele
asegurar que nuestro gen de inters se vaya a expresar bien, sobre todo cuando procede de especies
alejadas filogenticamente. Por esta razn hay que proceder al diseo de vectores especializados y
a menudo a modificaciones del gen de inters, con objeto de que este pueda transcribirse y
traducirse bien en el microorganismo husped. He aqu algunos de los elementos que conviene
manipular para este fin:

Naturaleza de las secuencias de inicio y final de la transcripcin (promotores-operadores,

terminadores)
Seales para el comienzo de la traduccin, especialmente sitios de unin del ribosoma y codn
de inicio de la traduccin
Eficiciencia de la traduccin, lo que puede obligar a utilizar codones sinnimos adaptados a la
abundancia de los correspondientes ARNt del husped
Estabilidad de la protena en la clula husped
Localizacin celular de la protena a expresar: en muchos casos interesa que la protena se
secrete, por lo que el diseo gentico debe incluir seales de procesamiento postraduccional
adecuadas. Otras veces interesa que la protena se quede en el espacio periplsmico de la bacteria
Gram-negativa husped, o que se retenga en el citoplasma
Nmero de copias del gen clonado. Cuando se pretende que el gen se exprese a alto nivel, se
suele escoger un plsmido de control relajado, es decir, con gran nmero de copias, mientras que
si interesa un nivel bajo de expresin se escoge un plsmido de control estricto (poco nmero de
copias) o se recurre a integrar el gen de inters en el cromosoma
Cada vez que queramos clonar y expresar un gen, debemos ajustar especficamente muchos de
estos parmetros, construyendo vectores de expresin ad hoc, escogiendo las cepas huspedes,
etc. Se trata de una labor que frecuentemente es bastante ardua, y que pone en juego una gran
cantidad de conocimiento de biologa molecular y de pericias tcnicas.
Uno de los microorganismos huspedes ms usados es nuestro viejo amigo, el colibacilo Escherichia
coli, probablemente el ser vivo ms estudiado a nivel molecular, y del que se dispone de una vasta
batera de mtodos de manipulacin gentica in vitro. Pero para muchos experimentos se debe
recurrir a otros huspedes, como Bacillus subtilis, la levaduraSaccharomyces cerevisiae, o incluso
clulas de insectos o de mamfero.
Antes de entrar en detalles, hagamos un retrato rpido de lo que debe tener un vector de expresin
en E. coli (se citan los elementos genticos siguiendo el orden desde el lado 5 al lado 3):
Un promotor eficiente, dotado de las regiones conservadas 35 (TTGACA o parecida) y 10
(TATAAT o parecida)
A corta distancia del promotor, una regin que al transcribirse suministre el sitio de entrada al
ribosoma: la denominada secuencia de Shine-Dalgarno, que es complementaria del extremo 3
del ARNr 16S
A unos 3-11 pb aguas abajo de la secuencia de Shine-Dalgarno, debera situarse el codn ATG que
seala el comienzo de la traducccin del ARNm. Este codn lo puede suministrar el gen a clonar,
o bien el vector puede disponer de ese codn, seguido de alguna diana que permita la insercin
del gen a expresar
Finalmente, y situado al lado 3 de todo lo anterior, una secuencia que funcione como terminador
de la transcripcin (que en su forma de ARN constituye la tpica horquilla por emparejamiento
intracatenario, donde la ARN polimerasa se desliga del ARN recin formado).
A continuacin abordaremos algunos ejemplos de estrategias usadas en la manipulacin de la
expresin gentica en bacterias (sobre todo E. coli).
1.1

Promotores fuertes y regulables

En principio, uno podra pensar que si queremos expresar un gen a alto nivel, deberamos escoger
un promotor fuerte y constitutivo. Sin embargo, la mayor parte de las veces no conviene usar tal
tipo de promotores, porque al estar expresando permanentemente el gen de inters a alto nivel,
pueden sustraerse recursos para el normal crecimiento de las clulas. Esto es especialmente
delicado si la protena fornea tiene efectos negativos para el huped. Por lo tanto, lo normal es
emplear promotores regulables, que el investigador puede conectar y desconectar a voluntad. Una
estrategia habitual es aquella en la que se cultiva la bacteria recombinante hasta que se logran
grandes densidades, momento en que se suministra la seal para que el promotor se active y
transcriba el gen insertado.
1.1.1

Ejemplos de promotores regulables

Los promotores regulables de E. coli que se emplean en los vectores de expresin ms habituales
son promotores fuertes pero que bajo ciertas condiciones estn reprimidos por las
correspondientes protenas represoras, lo que suministra la base para inducir o desreprimir el gen
adyacente a voluntad.
1.1.1.1 Derivados del promotor lac
El promotor del opern de la lactosa (lac) ha servido para disear elementos de control de expresin
en numerosos vectores. Mientras en el medio no exista lactosa (o un inductor apropiado), el
promotor est reprimido por el represor (producto del gen lacI). En el laboratorio, la induccin se
suele lograr aadiendo al medio un inductor gratuito (que a diferencia de la lactosa, no se
metaboliza, pero se une al represor, inactivndolo). Ejemplo de inductor gratuito es el IPTG
(isopropil-b-D-tiogalactsido). Para que el promotor lac se exprese a alto nivel, tenemos que evitar
la represin catablica: en ausencia de glucosa la protena CAP se une con AMPc, y el complejo se
une cerca del promotor, ayudando a la ARN polimerasa a comenzar la transcripcin.
En los vectores de expresin se suele emplear un promotor lac mutante, conocido
como lacUV5 (con una sustitucin en la regin 10), que es ms potente que el promotor silvestre.
Por supuesto, esta variante es reprimible por LacI e inducible por IPTG.
1.1.1.2 Derivados del promotor trp
El opern trp contiene los genes estructurales que determinan las enzimas para la sntesis del
triptfano. Su promotor se ve reprimido, en presencia del triptfano en el medio, por el complejo
represor-triptfano. Si no hay triptfano disponible, el represor queda inactivo, y por lo tanto el
opern trp se transcribe. En los vectores basados en el promotor trp, la expresin se logra en medio
sin triptfano, mientras que se reprime en presencia del aminocido, o aadiendo el compuesto
cido 3-indol-acrlico.
1.1.1.3 Promotor hbrido artificial tac
En los aos 80 se dise un promotor artificial combinando la regin 35 del promotor trp y la
10 del promotor lac, ponindole de nombre promotor tac. Dicho promotor result ser 5 veces ms
potente que el de trp y 10 veces ms que el de lac. A semejanza del promotor de lac, el tac es
inducible por IPTG y reprimible por glucosa. Se ha usado mucho en vectores de expresin de alto
rendimiento. Se llegan a alcanzar niveles de protena recombinante del 10-30% de la total.
1.1.1.4 Promotores derivados del fago l
Se puede usar un sistema de expresin regulable consistente en el promotor PL del fago l y su
represor cI. En la prctica se recurre al represor mutante cI857, que es un mutante termosensible
(ts). De esta manera, podemos cultivar la bacteria recombinante a una temperatura moderada
(30C) a la que el represor impide la transcripcin del gen de inters. Cuando el cultivo alcanza la
densidad deseada, subimos la temperatura hasta 42C, lo que inactiva al represor, y se logra la
expresin a alto nivel de nuestro gen desde el promotor PL
1.1.1.5 Promotor del fago T7
El promotor del fago T7 necesita la ARN polimerasa especfica del mismo fago, por lo que si
queremos expresar genes bajo ese promotor, hay que clonar simultneamente el gen de la
polimerasa de T7. Normalmente este gen de la polimerasa se inserta en el cromosoma de E. coli o
en el profago l (la versin insertada del cromosoma del l en las clulas lisognicas) y bajo el control
del promotor de lac. Entonces se procede a transformar las clulas con la construccin gentica
dotada del gen de inters aguas abajo del promotor del T7. Cuando aadimos el inductor IPTG, se
induce el gen de la polimerasa de T7, protena que transcribe a gran nivel el gen que hemos clonado.
1.1.2

Un ejemplo de plsmido de expresin de alta eficiencia

El plsmido pPLc2833 era ya un buen plsmido de expresin, pero vamos a ver cmo, a partir de l,
se construy otro an mejor.
El pPLc2833 cuenta con un mdulo pensado para clonar genes bajo el control del promotor PL del
fago l: tras el PL existe un polilinker, es decir, un trecho de ADN dotado de mltiples dianas nicas
para las respectivas enzimas de restriccin (lo que permite usar cada vez la enzima ms adecuada a
nuestro experimento). Este plsmido presenta unas 40 copias por cromosoma. Para lograr una
expresin a mayor nivel, se sustituy su origen de replicacin por el origen de replicacin de otro

plsmido, llamado pKN402, de modo que el nmero de copias se puede aumentar unas 8 veces
incubando la bacteria a 42C. De esta forma se obtuvo el plsmido mejorado pCP3. Para su uso
correcto, las clulas que albergan derivados de pCP3 con genes clonados bajo el promotor P L se
cultivan primero a 28C, y una vez alcanzada una buena densidad, la temperatura se sube hasta
42C, con lo que el nmero de copias sube hasta unas 700. A esa temperatura, el represor
termosensible cI(ts) se inactiva, por lo que el promotor PL funciona a su mximo rendimiento, y se
logran altos niveles de la protena codificada por el gen clonado.
Para hacerse una idea de la eficiencia de este sistema de expresin, baste decir que cuando se clon
el gen de la ligasa de T4 en el pCP3, nada menos que el 20% de la protena total a 42C era ligasa de
T4. (A ttulo comparativo, la protena natural ms abundante de E. coli supone el 2% de la protena
total).
1.1.3

Otros sistemas

El uso de promotores que se activan al bajar la temperatura presenta la ventaja de que la protena
se pliega mejor, con lo que se evitan los problemas de la formacin de cuerpos de inclusin. El
promotor mejor caracterizado es el de cspA, aunque tiene el incoveniente de que se inactiva al cabo
de 1-2 horas, tiempo demasiado corto para los fermentadores.
Recientemente ha recibido atencin el sistema de la arabinosa, que ha sido comercializado por
Invitrogen. Usa el azcar arabinosa, que es barato, siendo la fuerza del promotor dearaBAD ms
dbil que la de los lac.
1.1.4

Sistemas de expresin adaptados a la gran escala

Los sistemas de expresin que hemos estudiado hasta ahora son muy buenos ... a escala de
laboratorio de investigacin, pero presentan el problema de que resultan caros y complicados si los
queremos usar a escala industrial (donde manejamos volmenes de cientos de litros de cultivo):
Los sistemas basados en protenas termosensibles plantean el problema de que cuando
queremos aumentar la temperatura en un gran fermentador, esto requiere bastante tiempo
(hasta 1 hora), y sobre todo, un gasto de energa importante.
En los sistemas que se inducen con inductores como el IPTG, el problema es econmico: no sera
rentable aadir la cantidad adecuada de este tipo de sustancias a un gran fermentador.
Para solucionar estos inconvenientes, se dise un sistema de expresin ms barato, con dos
plsmidos:
Uno de los plsmidos es de bajo nmero de copias, y lleva la parte codificadora del gen del
represor cI bajo el control del promotor trp. (El uso de un plsmido de control estricto del nmero
de copias garantiza que no se va a producir un exceso de molculas de represor.
El segundo plsmido lleva el gen a expresar bajo el control del promotor pL.
Sabiendo cmo funcionan los elementos genticos implicados, es fcil deducir el comportamiento
del sistema:
En ausencia de triptfano en el medio, el promotor del trp est activo, y se producen molculas
de represor cI. Este represor se une al promotor pL del otro plsmido, y reprime la transcripcin
de nuestro gen, por lo que no se produce protena.
En presencia de triptfano, se reprime la transcripcin del gen cI desde el promotor trp. Al no
producirse represor cI, el gen clonado en el segundo plsmido se puede expresar (desrepresin).
En la situacin real de un fermentador, las cosas ocurren de la siguiente manera:
Al principio, la bacteria se cultiva en un medio barato a base de melazas e hidrolizados de
casena, que contiene poco triptfano libre, de modo que nuestro gen clonado no se expresa,
porque est reprimido por cI.
Una vez que el cultivo se hace denso, se aade al medio triptona (un hidrolizado de protena
rico en triptfano). Entonces, al bloquearse el gen cI, queda desreprimido el gen clonado, con
lo que se pueden producir grandes cantidades de la correspondiente protena. (Se han logrado
niveles de 20% de protena recombinante respecto de protena total).

Para la produccin a gran escala lo ideal sera un promotor que no requiera induccin externa, y que
por lo tanto haga el sistema ms barato y automtico. El del gen pho (fosfatasa alcalina) puede ser
bueno, ya que se induce cuando se produce limitacin de fosfatos, al final del crecimiento. Los
rendimientos mejoran cuando al mismo tiempo se muta la protena sensora de fosfato PhoS (PtsS),
con lo que se logra la induccin del promotor a una mayor concentracin de fosfato, y prolonga el
periodo de produccin. Por lo tanto, se puede adaptar a un fermentador con alimentacin continua
de fosfato sin que se reprima el promotor de phoA.
1.2

Protenas de fusin

Cuando uno intenta expresar genes en huspedes heterlogos es frecuente encontrarse con el
hecho de que la protena buscada se degrade, con lo que se obtienen bajos niveles tiles. Para
solventar este problema, uno de los trucos consiste en lograr protenas hbridas, de fusin, en las
que nuestra protena heterloga (o la parte funcional que nos interesa) est unida covalentemente
con una protena estable del propio husped, lo que la protege del ataque de proteasas de ste.
Para conseguir estas protenas de fusin, hay que hacer una construccin gentica en la que unimos,
en la adecuada fase de lectura, un gen del husped con el gen que queremos expresar. Veamos
brevemente los elementos importantes de un vector especializado para obtener protenas de fusin
en E. coli que queden expuestas al exterior desde la membrana externa:
Porcin terminal 5 del gen ompF que codifica una protena de membrana externa. Este segmento
suministra las seales de comienzo de la transcripcin y de la traduccin, as como las seales
para que la protena viaje hasta la membrana externa.
Inmediantamente despus, una versin truncada del gen lacZ, desprovista no solo del promotor,
sino carente de los codones correspondientes a los ocho primeros aminocidos. A pesar de ello,
se podra sintetizar b-galactosidasa funcional en el caso de estar en fase la secuencia que
acabamos de describir. Otra caracterstica de este lacZ es que su protena es capaz de funcionar
incluso cuando va fusionada en su extremo amino-terminal con otra protena.
La situacin relativa entre el extremo 5 del ompF y el gen modificado de lacZ en el vector original
es tal que este ltimo no est en fase correcta. Por lo tanto, el vector no codifica b-galactosidasa.
Ahora bien, si clonamos un gen entre ompF y lacZ de modo que todos queden en fase, se
producir una protena tri-hbrida consistente en el extremo de OmpF fusionado con nuestra
protena, que a su vez va fusionada con la b-galactosidasa. Los clones recombinantes que
sinteticen esta protena tri-hbrida se pueden identificar fcilmente porque tienen actividad bgalactosidasa, detectable como colonias azules en placas provistas de galactsido artificial
cromognico X-gal.
La protena tri-hbrida se puede usar para dos fines:
Como antgeno para producir anticuerpos frente a la porcin proteica que hemos expresado
con el gen clonado
Como medio para aislar pequeas porciones importantes de nuestra protena.
El elemento Flag se compra a una empresa en forma del vector, previsto para su uso en la
levadura Saccharomyces cerevisiae. Este elemento determina un pptido de ocho aminocidos,
cuya secuencia es Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys. Imaginemos que queremos expresar en
levadura el gen de la interleucina 2 (IL-2), una citoquina de gran valor teraputico. Pues bien,
insertamos dicho gen a continuacin del elemento gentico de Flag. La levadura recombinante
produce y secreta la protena hbrida, que no se degrada. Por otro lado, el pptido Flag nos va a
facilitar la tarea de purificar en un solo paso nuestra protena de inters, por cromatografa de
afinidad:
Se prepara una columna cromatogrfica a base de un soporte sinttico (como polipropileno) al
que se une anticuerpo monoclonal especfico frente al pptido Flag
Se hace pasar el extracto o sobrenadante de la cepa recombinante por la columna. La protena
hbrida que nos interesa queda retenida (al engarzarse con el anticuerpo), mientras que las
restantes pasan de largo.
Para eluir la protena recombinante, se lava la columna con un tampn bajo en calcio.

Aunque la IL-2 recombinante provista de los 8 aminocidos de Flag en su extremo N-terminal es

funcional, las autoridades sanitarias obligan a eliminar ese pptido, cosa que se hace tratando el
hbrido con una proteasa especfica (enteroquinasa intestinal bovina).
Esto ltimo nos ilustra el principio de que para satisfacer los estndares de seguridad y calidad, las
protenas recombinantes logradas como hbridos deben ser despojadas de las porciones del
elemento de fusin. Por ello, los elementos de fusin suelen ser secuencias reconocidas por
proteasas especficas que cortan en la juntura entre dicho elemento y la protena de inters, sin
atacar a esta.
1.3

Manipulacin de factores que afectan a la traduccin

Como se sabe, no todos los ARNm se traducen con la misma eficiencia. Uno de los factores que
condicionan esta eficacia diferencial es la presencia, al comienzo del ARNm, de una secuencia (de 6
a 8 bases) que se puede emparejar con otra secuencia complementaria situada en el extremo 3 del
ARNr 16S. As pues, el ARNm, para que sea traducido bien debe contar con este sitio de unin al
ribosoma (RBS en siglas inglesas, tambin conocido como secuencia de Shine-Dalgarno), que suele
consistir en 5-UAAGGAGG-3. Por esta razn, muchos vectores de expresin en E. coli se han
diseado para dotar al gen clonado de una secuencia de este tipo, con objeto de que su ARNm se
traduzca eficientemente. Aparte de esto, hay que tener presente otras consideraciones:
Debe existir una cierta distancia (en torno a 8 bases) entre la secuencia de Shine-Dalgarno y el
codn AUG que seala el comienzo de la traduccin
El segmento inicial del ADN que contiene la secuencia de Shine-Dalgarno y los primeros codones
del gen clonado debe ser tal que, una vez transcrito, el ARN no forme emparejamientos
intracatenarios. Es decir, a nivel de ARN ese segmento debe de carecer de la capacidad de formar
estructuras secundarias en horquillas, que dificultan el acceso de los ribosomas.
Otro factor que puede condicionar la eficiencia de traduccin deriva del hecho de que nuestro gen
de eleccin tenga un sesgo de codones diferente al del organismo husped, es decir, tenga
abundantes codones para los que el anfitrin no disponga de suficiente nivel de los
correspondientes ARNt. (Por ejemplo, de los cuatro codones para Gly, el GGA se usa poco en E. coli,
pero mucho en humanos; por lo tanto, si queremos expresar un gen humano con abundantes
codones GGA en esta bacteria, nos podemos encontrar que la traduccin es poco eficiente, debido
a la escasez de ARNt que reconozca este triplete). Cuando se nos presenta un problema de este tipo
de sesgo de uso de codones, lo nico que podemos hacer (aunque suele ser complicado) es
sintetizar en laboratorio una versin sinnima de nuestro gen en la que los codones estn
optimizados al uso del husped.
1.4

Mejora de la estabilidad de la protena

Cada protena tiene una vida media tpica, que puede ser de unos pocos minutos o de varias horas.
A tal estabilidad colabora la presencia de puentes disulfuro y de ciertos aminocidos en el extremo
N-terminal. A menudo la simple modificacin que aade un determinado aminocido a ese extremo
de una protena a expresar es suficiente para conferirle una mayor estabilidad. Por supuesto, las
protenas de gran vida media se acumulan en la clula, y por lo tanto aumentan los rendimientos
del producto recuperado.
1.5

Resolucin de los problemas de los vectores multicopia

Muchos vectores derivan de plsmidos de control relajado: los derivados de ColE1 tienen de 15 a
60 copias. La serie pUC llega a presentar varios cientos de copias por clula. Los derivados p15A
estn en unas 15 copias. En ausencia de presin selectiva se pierden (10-5-10-6 por generacin) como
resultado de multimerizacin. Pero cuando se clonan genes cuyos productos son txicos u originan
una gran carga metablica, o cuando las clulas se cultivan en continuo a altas densidades, las
prdidas son mucho mayores. El uso de antibiticos para mantener la presin selectiva presenta
desventajas, entre ellas la contaminacin del producto o la biomasa con el antibitico. Se han
diseado alternativas a esto, entre ellas el uso de plsmidos que ocasionan la muerte celular al
perderese. Pero tienen el inconveniente de que introducen restricciones en el diseo de los medios
de cultivo e introducen carga metablica adicional. Para saltar estas desventajas, se ha diseado el
siguiente sistema:

Cepa husped con un gen cromosmico condicionalmente esencial bajo el control del promotoroperador de lac
Un plsmido acompaante multicopia que lleva el operador de lac
La titulacin (secuestro mayoritario) del represor LacI por los numerosos operadores
de lac origina la expresin del gen cromosmico (de resistencia a kanamicina) y el crecimiento
selectivo de clulas portadoras del plsmido en medio con el antibitico.
En muchos casos es deseable y ms rentable una produccin no demasiado alto, aunque estable.
Para elo se puede intentar recurrir a vectores con menos copias o a integracin cromosmica.
1.5.1

Plsmidos de mediano nmero de copias

Los plsmidos de medio nmero de copias tienen entre 5 y 20 por clula. Se han construido vectores
a partir de varios plsmidos naturales:
RK2 (del grupo IncP). De amplio espectro, son de control estricto, autotransmisibles y presentan
entre 10-15 copias por cromosoma. Los miniplsmidos derivados de RK2 se han mostrado
estables durante 200 generaciones en algunos pseudomonas en ausencia de presin selectiva,
pero pueden ser mucho menos estables en otras bacterias.
RSF1010 (grupo IncQ). De amplio espectro, autotransmisibles, presentan unas 20 copias por
clula.
1.5.2

Plsmidos de bajo nmero de copias

Tienen entre 1-5 copias por clula. Se ha construido un vector derivado de F, que presenta las
siguientes caractersticas:
9 kb de F con elementos necesarios para la replicacin y la estabilidad segregacional:
Los orgenes oriV, oriS aseguran replicacin especfica del ciclo celular,
el locus de reparto permite ese reparto equitativo a clulas hijas,
el gen repD recombina los dmeros hasta monmeros
los genes ccd matan cualquier segregante que pierda el plsmido.
Mdulo de clonacin para la expresin:
Promotor de araBAD y gen araC para una expresin inducible por arabinosa
Sitio de clonacin mltiple
Terminadores de transcripcin
Este plsmido es estable en ausencia de presin selectiva, tiene una expresin gnica bien
controlada e impone una pequea carga metablica.
1.5.3

Integracin cromosmica

A menudo es mejor intentar expresar el gen a clonar desde una localizacin estable en el
cromosoma del husped, evitando que se replique por medio de plsmidos. Una vez insertado en
el cromosoma, el gen puede quedar all de forma estable durante muchsimas generaciones sin
necesidad de recurrir a presin selectiva.
La integracin debe lograrse en un sitio del cromosoma que no sea esencial. Para que nuestro gen
se integre en determinado sitio del husped, debemos hacer una construccin gentica en la que el
gen vaya unido a secuencias homlogas del husped, con objeto de favorecer la recombinacin.
Veamos un resumen de mtodo para clonar genes por integracin en cromosoma:
1. Hay que identificar un sitio adecuado para la integracin (o sea, un lugar que sepamos que
al romperlo no vamos a afectar las funciones celulares normales).
2. Aislamos y clonamos todo o parte de ese sitio cromosmico.
3. Asociamos nuestro gen favorito (provisto de un promotor regulable) al sitio clonado para la
integracin. Esto lo podemos hacer de dos modos:

a. Nuestro gen lo hemos insertado dentro del sitio de integracin clonado, por lo
que tendremos un sandwich de dos trozos del sitio de integracin enmarcando a
nuestro gen
b. Insertamos nuestro gen de modo adyacente al ADN clonado de integracin
4. Transferimos nuestra construccin gentica a las clulas huspedes. Para ello la
construccin gentica va formando parte de un plsmido que no puede replicarse en el
husped (vector suicida).
5. Se aplica la presin selectiva que permita recuperar y multiplicar los transformantes
buscados. Obviamente, con estas condiciones, la propagacin del gen clonado slo tiene
lugar si se ha integrado en el ADN cromosmico de las clulas.
Si hemos hecho la transformacin usando un plsmido que lleva el gen interrumpiendo el sitio de
integracin clonado [caso a) de la fase 3) citada arriba], los dos segmentos separados de ADN del
sitio de integracin suministran sendos lugares de homologa respecto del cromosoma, con lo que
se puede producir un doble sobrecruzamiento que lleva a la integracin de nuestro gen.
Si hemos transformado con el plsmido en el que nuestro gen est adyacente al ADN clonado del
sitio de integracin (caso b), un simple sobrecruzamiento entre este y la regin homloga del
cromosoma conduce a la integracin de todo el plsmido, incluyendo nuestro gen de inters.
Otra manera de lograr inserciones en lugares cromosmicos predeterminados es mediante un
sistema en dos pasos que se ha ensayado con xito en Bacillus subtilis:
1. insertamos un gen marcador de resistencia a antibiticos en un lugar no esencial del
cromosoma (empleando la lgica que hemos descrito ms arriba, en la que el gen
interrumpe secuencias del husped previamente clonadas), seleccionando transformantes
resistentes a ese antibitico.
2. ahora transformamos con un segundo plsmido suicida en el que tenemos a nuestro gen
interrumpiendo las mismas secuencias clonadas del husped usadas en la fase 1). Un doble
entrecruzamiento entre dichas secuencias y las homlogas del husped nos elimina el gen
marcador mientras que nos inserta nuestro gen.
Si repetimos la anterior, pero usando en cada caso secuencias clonadas diferentes del hospedador,
lo que obtenemos es una cepa que lleva varias copias de nuestro gen insertadas en diferentes
lugares del cromosoma.
1.6

Carga metablica

Ya antes hemos aludido a los efectos negativos de carga metablica que suele acarrear la
introduccin y expresin de ADN forneo en el organismo husped. Esto se puede deber a una
variedad de factores:
Gran nmero de copias o gran tamao del vector
Limitacin de oxgeno disuelto en el medio
La gran produccin de la protena fornea puede agotar las reservas de ciertos aminoacil-ARNt (e
incluso de ciertos aminocidos) y drenar a la clula de su energa
Si la protena del gen clonado se expresa a alto nivel y se exporta desde el citoplasma hasta la
membrana o el periplasma, puede producir atascos en los sitios de exportacin, con lo que
dificulta la localizacin correcta de protenas del husped.
Las propias protenas forneas pueden tener efectos negativos interfiriendo con el husped,
generando efectos txicos, etc.
Con un buen diseo experimental, se pueden disminuir los efectos de la carga metablica,
mejorando los rendimientos de protena recombinante y mejorando la estabilidad de las clulas
transformadas. Por ejemplo:
Muchas veces es mejor usar un vector de bajo nmero de copias, e incluso no emplear plsmidos,
sino sistemas de integracin cromosmica de nuestro gen (vase la seccin que dedicamos a esta
cuestin)

Usar promotores fuertes pero regulables, de modo que durante la mayor parte del crecimiento
tengamos a nuestro gen desconectado, pero que lo induzcamos o desreprimamos al llegar el
cultivo a cierta densidad celular
Siempre que sea posible, adaptar los codones de nuestro gen al sesgo peculiar de uso de codones
de nuestro husped. Ello puede suponer tener que construir un gen sinttico que sea sinnimo
del original, pero adaptado al husped.
Para evitar los problemas de falta de disposicin de oxgeno, se ha diseado un sistema en el que se
expresa la hemoglobina de Vitreoscilla en E. coli, lo que incrementa la concentracin de ribosomas
y ARNt al final de una fermentacin de 30 horas.
Al final de cuentas, y de cara a la produccin industrial, es mejor el rendimiento que se logra con un
husped que produce un modesto 5% de protena fornea pero que puede alcanzar densidades en
el fermentador de 40 g de peso seco por litro, que el que se lograra con un 15% de eficiencia en
protena fornea pero con una densidad de solo 10 g de peso seco de biomasa por litro.
2. Ingeniera gentica de levaduras
2.1

Aspectos generales

La clonacin en bacterias ha permitido obtener a escala industrial algunas protenas recombinantes,

especialmente de inters teraputico. Sin embargo, no siempre las protenas de origen eucaritico
se producen adecuadamente en huspedes procariticos, ya que a menudo son inestables o carecen
de actividad biolgica. Por otro lado las protenas recombinantes obtenidas en bacterias, a pesar de
haber sido cuidadosamente purificadas, pueden venir acompaadas de pequeas cantidades de
sustancias bacterianas contaminantes, que pueden tener efectos pirognicos (induccin de fiebre).
Por todas estas razones, la ingeniera gentica ha desarrollado otros sistemas, principalmente
eucariticos, que salven al menos algunos de estos obstculos. En este sentido, las levaduras
presentan una serie de ventajas:
Son eucariotas, y por lo tanto ms semejantes a las clulas de los organismos superiores que los
procariotas (por ejemplo, sus mecanismos de secrecin)
A diferencia de las bacterias, producen cierto tipo de modificaciones postraduccionales en las
protenas (glucosilaciones en ciertos aminocidos, eliminacin de la metionina inicial, rotura
proteoltica de un precursor inactivo, etc.), lo que puede hacer que las protenas heterlogas de
organismos superiores puedan alcanzar su actividad biolgica (aunque esto no siempre est
garantizado)
A semejanza de ciertas bacterias, la levadura Saccharomyces cerevisiae es muy fcil de manejar
con mtodos microbiolgicos
S. cerevisiae est muy bien estudiada al nivel gentico y molecular. No slo se puede realizar
gentica clsica (mutagnesis y recombinacin meitica, alternancia de ciclo haploide y diploide),
sino que cuenta con herramientas avanzadas de ingeniera gentica, y su genoma se secuenci
totalmente en 1996
Desde hace decenios, las levaduras se cultivan a escala industrial, y participan en multitud de
procesos biotecnolgicos. Adems, cuenta con la calificacin oficial de organismo reconocido
como seguro (GRAS), indispensable para poder usarlo en obtencin de sustancias para consumo
humano
Por todo ello, las levaduras son los huspedes eucariticos de clonacin ms fciles de usar, y una
buena alternativa para intentar la produccin industrial de protenas de inters. (Sin embargo,
debido a que las levaduras poseen un sistema de splicing diferente y menos efectivo que el de
eucariotas superiores, si queremos expresar estos genes, hay que recurrir no a la versin genmica,
sino al ADNc tras retrocopia del correspondiente ARNm maduro).
Existen varios mtodos artificiales para introducir ADN exgeno en levaduras:
Obteniendo protoplastos en medio hipertnico y mezclndolos con el ADN en presencia de una
sustancia fusognica como el polietilenglicol (PEG)

Tratando clulas completas con sales de litio, seguido de mezcla con PEG y ADN, con choque
trmico para estimular la transformacin
Por electroporacin: el ADN entra en las clulas tratadas con cortos pulsos de corriente elctrica.
Igualmente existe multitud de tipos diferentes de vectores, cada uno con una serie de caractersticas
apropiadas para fines concretos. En general, los vectores de levadura, aparte de secuencias de
levadura, contienen tambin secuencias de vectores bacterianos, previstas para su amplificacin y
manejo sobre todo en E. coli. Por esta razn se suelen calificar como vectores bifuncionales o
lanzadera (porque permiten pasar del husped bacteriano a la levadura, y viceversa). Daremos
solo una breve lista de las principales clases de vectores y sus rasgos ms notables:
Vectores integrativos (YIp): suelen contener un gen silvestre de levadura, lo que permite que el
vector se inserte, por recombinacin homloga, con secuencias homlogas de la levadura
husped. No se suelen emplear para la expresin de genes heterlogos
Vectores de replicacin autnoma basada en componentes cromosmicos (YRp)
Vectores con secuencias de replicacin autnoma (ARS): suelen ser vectores inestables, por lo
que no tienen inters industrial
Vectores YCp con ARS y secuencias centromricas (CEN): al disponer de secuencias de
centrmeros de levadura, se segregan mejor a las clulas hijas, por lo que son ms estables,
aunque se siguen perdiendo poco a poco, por lo que tampoco son demasiado tiles para la
expresin a escala industrial
Cromosomas artificiales de levadura (YAC): son vectores que cuentan con una secuencia ARS, una
secuencia CEN y dos secuencias telomricas (TEL). Estn previstos para insertar grandes trozos de
ADN (de ms de 100 kb). No se usan como vectores de expresin, sino como vectores de gran
capacidad a la hora de generar genotecas de organismos complejos y preparar la secuenciacin
(por ejemplo, los llamados megaYACs han sido muy tiles en el Proyecto Genoma Humano).
Vectores basados en el crculo de 2mm de levadura: se trata de vectores que se aprovechan de
un plsmido natural de S. cerevisiae, conocido simplemente como crculo de 2mm (por su
tamao). Es un plsmido crptico (no codifica funciones fenotpicas aparte de su propia
replicacin) existente en algunas cepas (cepas cir+) que se encuentra en unas 50 a 100 copias en
el ncleo, constituyendo una especie de minicromosoma estable. Los vectores incorporan
algunas de las secuencias del 2mm implicadas en su replicacin y mantenimiento.
La manipulacin gentica de S. cerevisiae ha permitido obtener molculas y procesos de gran
inters comercial, sobre todo en el mbito clnico.
2.2

Sistemas de expresin en Saccharomyces cerevisiae

2.2.1

Expresin directa (sin secrecin)

Veamos un ejemplo que ilustre algunos aspectos de cmo lograr expresin directa (sin excrecin al
medio) de un gen heterlogo eucaritico, el ADNc de la superxido dismutasa humana citoplsmica
que requiere cobre y zinc (Cu/Zn-SOD). Se fabric un plsmido lanzadera con las siguientes
caractersticas:
Secuencias para manejo en E. coli: un gen de resistencia a ampicilina (ApR) y un origen de
replicacin derivado de pBR322
Un gen para seleccionar transformantes en levadura: el gen LEU2, de modo que cuando el
plsmido entra en una determinada cepa auxotrofa leu2-, la convierte en prototrofa (crece en
medio mnimo carente de leucina)
Secuencias derivadas del crculo de 2mm, para la replicacin del plsmido en S. cerevisiae
El ADNc de nuestro gen (el de la Cu/Zn-SOD), emparedado entre secuencias para el comienzo y
el trmino de la transcripcin en levadura. En esta ocasin se escogieron secuencias sealizadoras
procedentes del gen GAPD (gliceraldehido-fosfato deshidrogenasa) de la propia levadura. Hay
que tener en cuenta que los promotores de levadura son diferentes a los procariticos, e
incluyen secuencias activadoras a cierta distancia de la porcin codificadora. Estas secuencias,

llamadas a menudo UAS (upstream activating sequences) se parecen funcionalmente a los

potenciadores o intensificadores (enhancers) de los eucariotas superiores.
Cuando se transform una levadura leu2- con este plsmido, se aislaron transformantes prototrofos
en medio mnimo. Como el promotor del gen GAPD es constitutivo, la protena humana de Cu/ZnSOD se expresaba continuamente, a grandes niveles. Adems, la levadura haba realizado una
modificacin similar a las de la protena nativa de humanos, la acetilacin en el grupo amino de la
alanina N-terminal.
La mayora de vectores de expresin actuales recurre, sin embargo, a promotores de genes
inducibles, como los de la respuesta al choque trmico, o el GAL1 y el GAL10 que se inducen 1000
veces en presencia de galactosa.
2.2.2

Expresin y secrecin

Si la protena que queremos expresar debe ir glucosilada, el gen debe clonarse de modo que el
producto se secrete, ya que en levaduras solamente las protenas secretadas son modificadas de
esta manera. Para ello, debemos unir al lado 5 de nuestro gen las secuencias responsables del
procesamiento y secrecin del factor a de la levadura (el factor a es una especie de feromona para
el cruce entre clulas haploides de sexos opuestos). De este modo, la protena de fusin es
reconocida por el sistema de transporte y secrecin de S. cerevisiae, de modo que se corta el pptido
seal del precursor del factor a (llamado pre-pro-a), y se excreta la protena recombinante al medio.
Este fue el sistema que permiti expresar y secretar en levadura la hirudina, protena anticoagulante
de inters clnico procedente de la sanguijuela Hirudo medicinalis.
2.3

Sistemas de expresin en otras levaduras

Aunque, como hemos visto, ha habido xitos en la expresin de protenas en Saccharomyces

cerevisiae, existe una serie de problemas a la hora de lograrlo a escala industrial:
En los grandes volmenes del fermentador, existe una gran frecuencia de prdida de los
plsmidos, incluso cuando usamos promotores inducibles que solo se activan al final
La protena heterloga excretada suele tener un patrn de glucosilacin diferente al de la original.
Concretamente, existen oligosacridos a base de ms de 100 manosas, mientras que las protenas
naturales no suelen pasar de las 10 manosa por cada aminocido modificado.
A veces, la protena, en vez de secretarse, se queda en el espacio periplsmico.
Por todo ello, se ha intentado desarrollar sistemas de expresin en otras levaduras,
como Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris y Hansenula polimorpha.
P. pastoris se ha usado desde 1984 para producir unas 300 protenas recombinantes. Es una
levadura metilotrfica ascomictica que se us durante un tiempo para producir protena unicelular
para piensos, en un proceso desarrollado por la empresa Phillips Petroleum. En los aos 80, esta
empresa transfiri a otra empresa californiana (SIBIA) su sistema de expresin gentica, sistema que
est disponible comercialmente para investigacin a travs de la compaa Invitrogen.
Las ventajas de este sistema son las siguientes:
Ventajas derivadas de las caractersticas metablicas de esta levadura:
Gran preferencia por el metabolismo respiratorio, lo que permite cultivos ms densos que otras
levaduras
Modificaciones postraduccionales mejores que los de S. cerevisiae: procesamiento proteoltico,
glucosilacin y formacin de puentes disulfuro
Altos rendimientos de protena, normalmente superiores a los sistemas de baculovirus y de
clulas de mamfero
Muy altos niveles de secrecin de protena heterloga, con apenas secrecin de protena nativa
Sistema fcilmente escalable a escala industrial
Sistema ms barato y ms rpido que los de eucariotas superiores

El sistema original de expresin en P. pastoris est basado en el promotor de uno de los genes de la
alcohol-oxidasa. La alcohol-oxidasa cataliza la primera reaccin de la ruta de degradacin del
metanol, al oxidarlo hasta formaldehido y perxido de hidrgeno. La reaccin tiene lugar en el
peroxima, orgnulo que secuestran el perxido del resto de la clula. La alcohol-oxidasa tiene poca
afinidad por el metanol, pero esto lo compensa esta levadura sintetizando grandes cantidades de la
enzima, determinada por dos genes, AOX1, AOX2. El producto del primero representa ms del 90%
de la actividad total. El promotor de AOX1 est fuertemente regulado e inducido por metanol, pero
est reprimido en otras condiciones, como hambre de carbono. La protena representa hasta el 5%
del total de protena soluble durante la induccin con metanol. Por lo tanto, el promotor era un
buen candidato para la expresin controlada de genes heterlogos: es posible cultivar la levadura
recombinante durante la mayor parte del tiempo en una fuente de carbono no inductora como la
glucosa o el glicerol; cuando se alcanza una densidad buena, se aade metanol para la induccin de
la expresin del gen clonado. Este sistema, disponible comercialmente y de fcil uso, ha permitido
expresar ms de 400 tipos de protenas, desde endostatina humana hasta protena de tela de araa.
Veamos un ejemplo concreto: la produccin de antgeno de superficie del virus de la hepatitis B:
Se clon el gen del antgeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) entre las seales de
inicio y trmino de transcripcin del gen AOX1 de P. pastoris.
Se dise un plsmido lanzadera previsto para la integracin cromosmica de la construccin
gentica, y cuya porcin de levadura consista (en este orden):
Mdulo de expresin promotor de AOX1-gen HBsAg-terminador de AOX1
Gen marcador HIS4 (para seleccionar transformantes en el auxotrofo his4-)
Secuencias del gen AOX1 correspondientes a la porcin no codificante distal (en 3)
Con este plsmido se transform una cepa auxotrofa his4-. El diseo del vector es tal que, al carecer
de secuencias de mantenimiento en la levadura, la nica manera de que se originen los
transformantes es por recombinacin. Un doble entrecruzamiento por recombinacin homloga en
el que, por un extremo participen las secuencias de promotor, y por el otro las secuencias en 3 del
gen AOX1 significa la integracin del mdulo levadura del plsmido, incluyendo el gen
silvestre HIS4 y la construccin de expresin con el gen de HBsAg, pero con ello interrumpimos el
gen AOX1 silvestre. La seleccin de este evento se hace en:
medio mnimo sin histidina, para seleccionar la integracin del gen HIS4
con metanol: las colonias que han integrado el mdulo y que inactivan el gen AOX1 endgeno
crecen lentamente en metanol (porque tienen otro el otro gen, menos efectivo,AOX2)
Estos transformantes, cuando se crecen en metanol, sintetizan grandes cantidades del antgeno del
virus de la hepatitis B, que se queda en el citoplasma. Un clon transformante lleg a producir el
equivalente a casi 10 millones de dosis de vacuna cuando se cultiv en un recipiente de 240 litros.
Adems, la construccin gentica era estable durante al menos varios das de cultivo.
A pesar de lo anterior, este sistema de expresin presenta ciertas limitaciones, algunas de las cuales
se estn resolviendo en los ltimos aos:
1. El metanol que se necesita para la induccin supone cierto riesgo de fuego y puede no ser
adecuado para producir protenas alimentarias. Por lo tanto, se necesitan promotores
fuertes que no necesiten metanol para su induccin. Ya se cuenta con algunos:
a. Promotor del gen de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAP). Suministra
un alto nivel constitutivo de expresin en glucosa o glicerol. El inconveniente es que
al ser constitutivo, puede no ser adecuado para expresar protenas que supongan
efectos negativos para el hospedador.
b. Promotor del gen FLD1 de P. pastoris, codificador de una glutatindeshidrogensasa dependiente de formaldehido. Se puede inducir por metanol o por
metilamina (una fuente inocua de N) en medios con glucosa. Los niveles inducidos
de expresin con este promotor son parecidos a los del gen AOX1 en metanol.
2. Se necesitan promotores de expresin moderada. Algunos ejemplos:

a. Del gen PEX8, que codifica una protena de biognesis del peroxisoma. Suministra
expresin a bajo nivel sobre glucosa, y se induce moderadamente (unas 10 veces)
cuando las clulas se pasan a metanol.
b. Del gen YPT1: confiere expresin baja pero constitutiva en glucosa, metanol o
manitol
3. Otra limitacin era la carencia de ms genes marcadores para seleccionar los
recombinantes. Hasta hace poco, solo se dispona de HIS4, ARG4 y Sh ble (resistencia al
antibitico zeocina). Ahora contamos con otros marcadores: ADE1, URA3.
Otros sistemas de expresin en otras levaduras:
Levaduras metilotrficas:
Candida boidinii
Hansenula polymorpha
Pichia methanolica
Levaduras que usan lactosa: Kluyveromyces lactis
Levaduras usadoras de alcanos y de cidos grasos: Yarrowia lipolytica
3. Sistemas de expresin de baculovirus
Los baculovirus son un tipo de virus que infectan artrpodos, especialmente insectos. Durante su
infeccin, las partculas virsicas se empaquetan en unos grupos llamados cuerpos polidricos, que
son cuerpos de inclusin localizados en el ncleo celular, compuestos mayoritariamente de la
protena poliedrina. La poliedrina se sintetiza en grandes cantidades al final del ciclo infectivo,
pudiendo llegar a suponer el 50% del total proteico de la clula.
El genoma de los baculovirus consta de una molcula circular de ADN de c.d., de un tamao de entre
88 y 200 kb. Aunque los poliedros se necesitan para la infeccin, no se requieren para mantener el
cultivo celular infectado. Por lo tanto, el gen de la poliedrina es dispensable y puede hacerse hueco
en esa parte del genoma para manipulacin gentica. Como el genoma es demasiado grande para
manupular directamente, se recurre a lo siguiente:
El ADN heterlogo se inserta en un vector intermedio llamado de transferencia, sin capacidad
infectiva, que es un vector con secuencias de E. coli (para hacer las manipulaciones fcilmente en
la bacteria), y que lleva el eficiente promotor de la poliedrina, tras el cual se inserta el gen de
inters.
Se co-transfectan clulas de insecto con el vector que lleva el ADN clonado y con ADN virsico no
recombinante.
Tiene lugar la recombinacin in vivo entre el vector de transferencia y secuencias del genoma
virsico, con lo que se generan genomas recombinantes que se pueden seleccionar y uar para
producir la protena de inters.
Presentan las ventajas de que las protenas forneas se expresan a alto nivel, experimentando
modificaciones postraduccionales similares a las de mamferos. El coste de produccin es superior
al de levaduras, pero menor al de usar clulas de mamferos
Se ha logrado adaptar lneas celulares de insectos a algunos de los requerimientos habituales de
la produccin a gran escala, incluyendo la resistencia a la agitacin de los fermentadores
Hoy da ya se pueden usar cultivos de clulas de insectos en biorreactores parecidos a los
empleados con los microorganismos
Se han hecho avances en diseo de medios de cultivo ms sencillos y baratos, que no necesitan
suero. Todo ello permite el escalado, esencial para la produccin de grandes cantidades de
protenas teraputicas recombinantes
Una de las aplicaciones ms importantes de los baculovirus derivados de cultivos de clulas de
insectos es su uso como insecticidas biolgicos selectivos y seguros, que se emplean sobre todo
en lucha biolgica e integrada frente a plagas que afectan a bosques

4. Ingeniera de protenas
La ingeniera de protenas es uno de los mbitos ms novedosos y prometedores de la ingeniera
gentica. Mediante este conjunto de tcnicas se alteran genes de modos racionales para modificar
la estructura de protenas. Una de las modalidades es realizar mutagnesis in vitro sobre el ADN
clonado, introduciendo mutaciones puntuales en sitios predeterminados, deleciones, etc. Si estas
tcnicas se unen al mayor conocimiento de la estructura y funcin de las protenas, se puede uno
dirigir a alterar aminocidos concretos que afectan a propiedades fisicoqumicas o alostricas. Se
puede, p. ej., lograr modificar el estatus nutricional de las protenas, o aumentar su estabilidad ante
condiciones de pH, temperatura, etc.