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TÉCNICAS
RESUMEN
Se ensayó una nueva técnica macrocromatográfica en carboximetilcelulosa y amortiguador
imidazol-HCl-KCN-NaCl a pH 6,7. La técnica es confiable y exacta para la separación y
cuantificación de hemoglobina A2 en individuos portadores de hemoglobina AC, Cβ
talasemia, hemoglobina AS y hemoglobina SC, lo cual es en muchos casos de interés
clínico. También se detectó una variante de hemoglobina A2 en una embarazada portadora
de hemoglobina AC y un gen β talasémico en Cis con el gen para la hemoglobina C.
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MÉTODOS Se aplicó un gradiente lineal de NaCl
formado al mezclarse 700 mL de amorti-
Se determinó la concentración porcen- guador inicial y 700 mL de amortiguador
tual de HbA2 a 20 muestras de sangre, pro- limitante (imidazol-HCl 0,02 mol/L KCN
venientes de las embarazadas heterocigó- 0,01 % (p/v) -NaCl 0,08 mol/L pH 6,7),
ticas con HbA y C detectadas en el con una velocidad de flujo de 0,5 mL/min
pesquisaje que se realiza en nuestro labo- durante 36 h.
ratorio, para la prevención de la anemia Se colectaron fracciones de 5 mL y la
por hematíes falciformes. De estas mues- densidad óptica se determinó a 415 nm.
tras, una resultó ser portadora de β Las fracciones correspondientes a cada pico
talasemia y otra tuvo una β talasemia más fueron reunidas y conservadas a -20 °C en
una variante de HbA 2. frascos plásticos para comprobar su iden-
Todos nuestros resultados fueron co- tidad fenotípica mediante otras técnicas.5,6
rroborados por cromatografía en CM-ce- La obtención del hemolizado y la
lulosa CM-52, con un gradiente de pH se- centrifugación se realizó según el método
gún Abraham y otros.4 descrito por Schroeder y otros.7
Nuestra cromatografía se ensayó tam-
bién con un hemolizado de un heterocigó-
tico para la HbS y C y con otro que conte- RESULTADOS
nía HbAS.
Para la cromatografía se preparó un La tabla muestra los resultados al apli-
amortiguador inicial que consistió en car la prueba t de Student para muestras
imidazol-HCl 0,02 mol/L, al que se le apareadas. Al parecer, dado el pequeño
añadió KCN al 0,01 % (p/v) y se le ajustó número de muestras, no hay diferencia sig-
el pH a 6,7. nificativa entre las 2 técnicas cromatográ-
Se pesaron 80 g de carboximetilcelulo- ficas.
sa (CM-52) (Whatman) y la resina se sus-
pendió en el amortiguador sólo en canti-
dad suficiente para formar una solución
TABLA. Resultados de la cromatografía con amortiguador
semipastosa, ésta se vertió completamente imidazol HCl-KCN-NaCl y con amortiguador fosfato4
en una columna cromatográfica de vidrio
de 1,6 x 50 cm, se empaquetó bajo pre- Sistema n Media % Σ2 tc t 180,05
sión y se ajustó a una altura de 25 cm.
Gradiente salino 20 3,40 240,32 0,98 2,10
Entonces se equilibró con el amortiguador Gradiente pH 20 3,48 242,82
inicial de pH 6,7 a una velocidad de flujo
de 0,5 mL/min. Se diluyeron 40 mg de
hemolizado en 1 mL de amortiguador ini- En la figura 1 se presenta el croma-
cial y se colocó en una bolsa de diálisis. tograma de una muestra de sangre de una
La diálisis se realizó a 4 °C en 250 mL de embarazada heterocigótica para el gen βc
amortiguador durante toda la noche. y un gen β talasémico, con un valor por-
La solución dializada del hemolizado centual de HbA 2 de 5,04 %; esto se co-
fue aplicada a la superficie superior de la rroboró mediante la técnica de Abraham.
resina equilibrada y se dejó penetrar por Las concentraciones de HbC y HbA fue-
gravedad. ron 50(C1 + C0) y 43 % respectivamente.
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Las fracciones obtenidas en ésta y las si- que el de la HbA2 normal. La concentra-
guientes cromatografías fueron concentra- ción de Hb(C1 + C0)fue 26,7 %.
das y comprobadas por electroforesis en La cromatografía del hemolizado de
gel de almidón5 y por electroenfoque.6 una embarazada con fenotipo SC dio una
El cromatograma que aparece en la buena separación para las HbA2, HbS,
HbC1 y HbC0 (fig. 3).
figura 2 mostró que además de la HbA,
La separación óptima de la HbA2 en
HbC1, HbC0 y la HbA2 (2,1 %) hay una un hemolizado con fenotipo AS requirió
variante de HbA2 (3,3 %) que eluyó a una un amortiguador limitante con una concen-
concentración salina más alta, lo que indi- tración salina menor, la cual fue 0,065 mol/L
ca que tiene un punto isoeléctrico mayor de NaCl (fig. 4).
DO
1,50
HbCo
1,20
HbA
0,90
0,60 HbC 1
HbA
0,30
2
0,00
20 40 60 80 100 120 140 160
No. de fracciones
Fig. 1. Cromatograma de una muestra de sangre hemolizada heterocigótica para el gen β
talasémico. Amortiguador inicial: imidazol-HCl-0,02 mol/L-KCN 0,01 % (p/v) pH 6,7 amortigua-
dor limitante: imidazol-HCl 0,02, mol/L-KCN 0,01 % (p/v)-NaCl 0,08 mol/L pH 6,7.
DO 21,1%
1,50 HbCo
1,20
59,9%
HbA
0,90
5,6 %
0,60 HbC
3,3 %
1
Vo
2,1 % HbA
0,30
2
HbA 2
0,00
20 40 60 80 100 120 140 160
No. de fracciones
Fig. 2. Cromatograma de un hemolizado con HbAC y una variante de HbA2 . Amortiguador
inicial: imidazol-HCl 0,02 mol/L-KCN 0,01 % (p/v) pH 6,7. Amortiguador limitante: imidazol-HCl
0,02 mol/L-KCN 0,01 % (p/v)-NaCl 0,08 mol/L pH 6,7.
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DO
1,50
HbS
HbCo
1,20
0,90
0,60
HbA 2 HbC 1
0,30
0,00
80 100 120 140 160
No. de fracciones
DO
1,50
HbA
HbS
1,20
0,90
0,60 HbA 2
0,30
0,00
100 120 140 160 180 200 220
No. de fracciones
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El resultado mostrado en la figura 1 la HbA 2 en una muestra con fenotipo
indica que nuestra técnica es útil para la hemoglobínico AS requirió un gradiente
detección de las C/β talasemias, pues hay salino límite de 0,065 mol/L para una bue-
buena separación entre todas las fraccio- na separación entre las HbA, HbA2 y HbS.
nes hemoglobínicas. Esta paciente tuvo Según Perutz,8 todos los residuos de áci-
valores bajos de Hb, concentración de Hb do glutámico en las cadenas α y β están
corpuscular media (CHCM) y hematócrito en la superficie de la molécula. Por tan-
(Hto) que indican una ligera anemia (re- to, la sustitución GluLis (HbS) se
sultados no mostrados). adsorbe menos fuertemente a los gru-
La buena resolución obtenida con el pos carboxilatos de la resina que la sus-
fenotipo HbAC nos hace pensar que pro- titución GluLis (HbC), ya que la Lis
bablemente otras variantes con sustitución facilita el acceso del grupo ε amonio
de GluLis y movilidad electroforética cuaternario a los aniones carboxilatos de
análoga a la HbC a pH alcalino, puedan la CM celulosa.
ser separadas de la HbA por esta técnica. De acuerdo con lo anterior, hay ma-
Con nuestro sistema amortiguador yor diferencia eléctrica entre la HbA y HbC
pudimos detectar una variante de HbA 2 que entre la HbA y la HbS. Como que la
(fig. 2).
HbA2 en nuestro sistema cromatográfico
La fracción HbA2 + variante tuvo
eluye entre la HbA y la HbS o entre la
un valor porcentual total de 5,4 %. La
HbA y la HbC es preciso un gradiente sa-
CHCM en este paciente fue baja, lo que
lino más bajo para lograr una mayor reso-
indica la posible presencia de un gen β+tal.
lución en el caso de los heterocigóticos AS.
La concentración de HbC fue inferior
al 30 % por lo que consideramos que el gen Hemos comprobado que nuestro amorti-
β +tal se encuentra en Cis con el gen para la guador puede ser utilizado con éxito en la
HbC. Descartamos la posible presencia de cuantificación de HbA2 a individuos por-
α tal porque la concentración porcentual to- tadores de HbC por microcromatografía.9
tal de HbA2 en nuestro paciente fue alta. En conclusión, la macrocromatografía
Nuestro gradiente salino descrito en en carboximetilcelulosa con amortiguador
los métodos posibilitó la separación y imidazol-HCl-KCN-NaCl a pH 6,7 permite
cuantificación de la HbA2 en un individuo cuantificar la HbA2 a individuos portado-
portador de HbS y HbC, por lo que la res de HbAC y HbAS. La técnica posibili-
técnica es recomendable en estos casos ta detectar la presencia de β talasemia e
(fig. 3). En cambio, la cuantificación de incluso variantes de HbA2 con exactitud.
SUMMARY
A new macrochromatographic technique was assayed in carboxymethylcellulose and damperer iminazole-HCL-
-KCN-NaCL at 6,7 pH. This technique es reliable and exact for A2 hemoglobin separation and quantization in
individuals carrier of AC hemoglobin, C Beta-thalasseamia, AS hemoglobin, and SC hemoglobin, whick, in many
cases es of clinical interest. Also, a variant of A2 hemoglobin was detected in a pregnant woman carrier of AC
hemoglobin, and a Beta-thalassemic gen in Cis with the gen for C hemoglobin.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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