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Desde las ruinas de Troya y las pirmides de Egipto vienen evidencias del uso de levaduras como
agentes esponjantes para la fabricacin del pan y, por otra parte, tambin en Babilonia y Egipto se
saba cmo aplicar la levadura para hacer fermentar la cerveza.
La ilustracin que encabeza estas lneas corresponde a un tallado en madera sobre una sepultura
egipcia de 2.300 aos a.C., precisamente sobre estos dos productos, en cuya elaboracin
intervienen procesos enzimticos.
Por otra parte, las palabras en alemn e ingls para pan (Brot-bread) y cerveza (Bier-beer) derivan,
segn algunos, etimolgicamente, de una misma antigua raz germnica, que tendra su origen en
el proceso de la fermentacin. Esto coincidira, adems, con el hecho de que hasta fines del siglo
pasado el desarrollo de ambas tecnologas corra de cierto modo en forma pareja, no siendo raro el
caso que un maestro en panificacin entenda tambin en cervecera y al revs.
En nuestro continente una primera informacin sobre la aplicacin de enzimas en tecnologa de
alimentos proviene de Hernn Corts, al sealar que los indios mexicanos ablandaban sus carnes
dejndolas envueltas durante la noche en hojas de papaya (ricas en papana).
Durante siglos la fermentacin, la putrefaccin y la digestin fueron consideradas como procesos
idnticos. La palabra fermento con que se design en un principio a estas sustancias proviene del
trmino latn "fermentum" = levadura o (segn otros) de "fervere" = hervir, debido al
desprendimiento gaseoso que acompaa a procesos enzimticos, como la fermentacin alcohlica.
Sin embargo, desde hace algo ms de 100 aos el trmino de fermento se ha ido substituyendo,
tambin a nivel internacional, por el de "enzima" (aplicado por Khne, en 1878), proveniente del
griego "en zyme" = en levadura o, segn otros, del trmino griego: "zymos" = zumo. Esta ltima
acepcin de la palabra "enzima" confirma la inexactitud de la antigua clasificacin que se haba
hecho entre "fermentos figurados o celulares" y "no figurados, solubles o enzimas". En efecto, fue
Eduard Buchner quien comprob mediante su brillante experiencia (que le vali el Premio Nobel de
1907) que la fermentacin alcohlica lograda por el zumo de expresin de la levadura se realizaba
por la "zimasa" independientemente de toda clula viva. La portada de este libro ilustra la prensa
hidrulica usada por Buchner para exprimir el contenido celular de la levadura. Actualmente se han
aislado doce enzimas que se encuentran involucradas en el complejo proceso de la fermentacin
alcohlica.
Etapas que constituyen verdaderos hitos en la evolucin progresiva de la investigacin sobre
enzimas fueron, sin duda, las siguientes:
- descripcin, ya en 1526, de fenmenos relacionados con la fermentacin por el famoso
yatroquimico Paracelso, que se adelantara a su poca por sus mltiples y reformadoras ideas
cientficas;
- observacin hecha en 1783 por el naturalista y fisilogo L. Spallanzani de que la carne era
digerida por el jugo gstrico de animales;
- descripcin por J. Liebig y F. Whler, en 1837, de la emulsina de las almendras (9 b);
- aislamiento, a partir de races vegetales de una primera enzima -peroxidasa- capaz de azulear la
tintura de guayaco, realizado por Planche a comienzos del siglo 19;
- estudio de la invertasa de la miel, hecho por H. Erlenmeyer, en 1874;
- elaboracin de un primer preparado enzimtico aminolitico de origen microbiano, patentado
por Takamine en Japn, en 1884;
- obtencin de una primera enzima en forma cristalina: la ureasa, a partir de la soya, lograda
por Sumner en 1926;
- mejoramiento de las tcnicas de purificacin y caracterizacin de un centenar de enzimas, lo que
condujo a una verdadera "ingeniera enzimtica" en los 30 aos siguientes;
- reconocimiento de la secuencia aminoacdica en una serie de enzimas importantes en la dcada
del 60.
- comprobacin de la estructura tridimensional de la lisozima por anlisis de rayos X, en 1965;
- sntesis qumica completa de una enzima con actividad de ribonucleasa, realizada por Merrifield,
a fines de la dcada del 60.
Con este acontecimiento se ha logrado, en cierto modo, la meta final en la evolucin histrica de la
investigacin enzimtica.
La importancia actual de las enzimas en la tecnologa alimentara queda de manifiesto por el hecho
que, segn las estadsticas de 1976, del volumen del mercado mundial de las enzimas, las dos
terceras partes son consumidas para la elaboracin y el control de los alimentos (I).
Por otra parte, segn la invitacin al Simposio Internacional sobre la utilizacin de enzimas en
Tecnologa Alimentara, que tuvo lugar en Versailles, en mayo de 1982, las biotecnologas
enzimticas estn adquiriendo un inters considerable, debido a la especificidad de su accin, la
limitacin de sus riesgos de polucin y la posible economa de energa que a veces involucra su
aplicacin (2).
El carcter biocataltico de las enzimas, al cual hace alusin la frase inicial de este libro, se justifica
por el hecho de que estos agentes posibilitan, en las condiciones moderadas de su medio
ambiente natural, la realizacin de mltiples reacciones que en el laboratorio o en la industria se
logran, a velocidad equivalente, slo por aplicacin de agentes fsicos (temperatura, presin) el
qumicos (cidos, lcalis) ms o menos violentos.
mol) de
tirosina.
mol) de tirosina.
(El R. de Folin - Ciocalteu para fenoles contiene tungstato y molibdato de sodio, sulfato de litio,
HC1,
Se usan para medir la actividad cataltica de las enzimas y, secundariamente, tambin para
determinar el carcter especifico de una accin enzimtica.
Para que una sustancia sea apropiada como substrato de una enzima debe reunir los siguientes
requisitos:
a) Que experimente una transformacin bien definida por la accin cataltica de la enzima;
b) Que sea especfica para la enzima respectiva o el grupo muy restringido de enzimas. Ej.: el
almidn
para
las
alfay
betaamilasas;
c) Que segn las condiciones del ensayo, previamente fijadas, no sufra una descomposicin
espontnea
o
produzca otras
reacciones no
catalizadas
por
la
enzima;
d) Que la transformacin del substrato que es catalizada por la enzima. Sea fcilmente medible.
Ejemplos son los siguientes:
formacin
estequiomtrica
de
un
producto
coloreado;
- una modificacin definida en la absorcin al ultravioleta (ej.:
NADH;
- liberacin de un cido o de un lcali que sean medibles por titulacin (ej.: liberacin de carboxilos
en
la
pectina
por
la
pectino-estearasa);
- si no se dan estas posibilidades, por acoplamiento con otras reacciones qumicas o enzimticas,
llamadas reacciones indicadoras (por ej.: la reaccin qumica (de fosfatasa en leche), del fenol
liberado con la dibromoquinon-clorimida para dar indofenol, de color azul).
Otro ejemplo de una segunda reaccin enzimtica acoplada es la transformacin especfica de la
glucosa por la glucosa-oxidasa en D-glucono-delta-lactona y perxido de hidrgeno. Este ltimo es
desdoblado por adicin de peroxidasa con liberacin de oxgeno, reconocible por un reactivo
cromgeno, que acta como donador de hidrgeno, como la orto-toluidina o la paraanisidina;
midindose, finalmente, la intensidad de la coloracin resultante.
Los substratos enzimticos pueden tener dos orgenes:
- Substratos naturales de las respectivas enzimas, como por ej., El almidn (para amilasas) o el
etanol
(para
la
alcohol
dehidrogenasa);
- Derivados de substratos naturales, obtenidos por sntesis con una estructura qumica tal que an
son reconocidos y transformados por la respectiva enzima con formacin de productos, ya sea
coloreados o fcilmente medibles por otro mecanismo. Ejemplos son: 4-nitroanilidas de
aminocidos,
para
proteasas,
y
- nitrofenil-derivados de azcares, para glucosidasas.
suelen tener una considerable influencia. La temperatura ptima para la mayora de las reacciones
enzimticas est, con pocas excepciones, entre 30C y 40C, en que la actividad es mxima. Al
aumentar la temperatura, la velocidad de reaccin aumenta y, para casi todas las enzimas, un
incremento de 10C duplica e incluso triplica la velocidad de reaccin. Por otro lado, sin embargo,
ese mismo aumento de temperatura acelera tambin la inactivacin de la enzima por
desnaturalizacin trmica. Para muchas enzimas la regin de inactivacin trmica extensiva est
muy prxima de la temperatura ptima.
Las enzimas muestran, a menudo, una marcada fragilidad trmica. Cuando se calientan a
temperaturas superiores a los 50C la mayora de las enzimas, pero no todas, se denaturan, y
unas pocas muestran desnaturalizacin cuando se enfran aproximadamente a 5C. A
temperaturas bajas, aunque la actividad enzimtica procede muy lentamente, ella no se detiene del
todo, hecho que debe tenerse en cuenta en la industria congeladora de alimentos. A menos que se
inactiven previamente las enzimas objetables, la mayora de los alimentos congelados
experimentan un considerable deterioro despus de un almacenamiento prolongado, porque a
temperaturas tan bajas como -18C algunas reacciones enzimticas siguen teniendo lugar.
Habitualmente la desnaturalizacin a alta temperatura es irreversible, debido a que se rompen las
fuerzas dbiles de enlace al aumentar la vibracin trmica de los tomos componentes, fenmeno
que daa la estructura tridimensional.
Es importante sealar que una misma enzima, aislada de tejidos diferentes, puede tener diferente
capacidad de resistencia a la desnaturalizacin suave por el calor, hecho que es til con fines de
identificacin o de diagnstico.
Otras aplicaciones de la desnaturalizacin por el calor son la esterilizacin de alimentos e
instrumentos y la pasteurizacin de la leche; ambos procesos dependen de la destruccin rpida
por calor de las enzimas esenciales de los microorganismos contaminantes.
La mayora de las enzimas son, pues, muy termolbiles y habitualmente es suficiente aplicar una
temperatura de 40 a 80C por 2 a 5 minutos, a fin de destruir su actividad.
Es este hecho de inactivacin completa de las enzimas el que se utiliza ampliamente en la industria
alimentara. En la mayor parte de los casos de preservacin de alimentos, es deseable que no
haya continuacin alguna de actividad enzimtica.
Si ello ocurriera se podra producir, por ejemplo, un cambio en el color de la clorifila o de los
carotenoides, o producirse el pardeamiento de varios alimentos; podra alterarse el sabor de los
hidratos de carbono, o producirse la rancidez de las grasas. Tambin la persistencia de actividad
enzimtica podra provocar cambios en el aroma o en el valor nutritivo de las protenas (o de las
vitaminas) y, finalmente, la presencia de enzimas pectinolticas puede producir un cambio total en
la textura de los alimentos.
El tratamiento con calor es, sin duda, un mtodo adecuado para la destruccin de microorganismos
que alteran los alimentos (esterilizacin por calor y pasteurizacin). De esta manera un
procesamiento trmico adecuado puede lograr simultneamente la preservacin microbiolgica y la
estabilizacin de los alimentos. A veces la actividad residual de una enzima (no necesariamente
objetable) se usa como prueba de la suficiencia de un proceso de tratamiento con calor.
En los alimentos, al igual que en cualquier sistema biolgico, el agua es uno de los componentes
ms importantes.
Por ser un solvente, el agua sirve para poner en contacto a las diversas molculas que interactan.
Adems, la reactividad de muchas sustancias depende de la disociacin inica y de la
configuracin molecular y, por lo tanto, de la hidratacin. El agua es a menudo uno de los
reactantes o uno de los productos de la reaccin.
Hoy se sabe que la influencia del agua sobre la reactivacin del sistema no est relacionada slo
con el contenido real de agua, sino tambin con el estado de las molculas de agua.
La disponibilidad de agua es una funcin tanto del contenido como del estado y se expresa
adecuadamente por el concepto denominado "actividad del agua" ( ) que equivale a la relacin
entre la presin de vapor de agua sobre el sistema (p) y la presin de vapor del agua pura (Po) a la
misma temperatura:
Si los alimentos fueran simples mezclas de agua con sustancias inertes que no interactan de
ninguna manera con las molculas de agua, la actividad del agua seria siempre 1, cualquiera sea
el contenido de agua.
Los alimentos son sistemas en los cuales parte del agua est fuertemente absorbida sobre la
superficie de sustancias polimricas (protenas, carbohidratos macromoleculares). Esto queda
claramente establecido por el hecho que la presin de vapor del agua sobre un alimento con un
contenido de humedad bajo o intermedio es considerablemente menor que el que predice la Ley de
Raoult. Esto se conoce como "agua ligada". En estos casos; la actividad del agua es inferior al
valor que le correspondera por su concentracin. Una de las razones para este efecto es el hecho
que el "agua libre" est parcialmente atrapada en la estructura porosa del alimento y, por lo tanto,
est sujeta a la accin depresora de los capilares sobre la presin de vapor. A niveles ms altos del
contenido de humedad el sistema se comporta en realidad como una solucin acuosa. De hecho la
concentracin molar de los solutos es habitualmente tan baja que la actividad del agua pronto
alcanza valores cercanos a la unidad.
La disponibilidad de agua, medida como actividad del agua, tiene una fuerte influencia sobre la
velocidad de las reacciones por enzimas, es decir, la actividad enzimtica aumenta al aumentar el
contenido de "agua libre" y ello ocurre no slo en las reacciones hidrolticas, en las que el agua es
uno de los reactantes obvios, sino tambin en las reacciones no-hidrolticas.
La velocidad de las reacciones enzimticas se ve fuertemente influida por la naturaleza y
concentracin de los solventes.
En la prctica es de gran importancia el efecto de la cantidad de humedad de los alimentos sobre
la velocidad de la reaccin enzimtica. Incluso en los alimentos denominados desecados la accin
enzimtica procede a una velocidad medible.
A niveles muy bajos de humedad, la actividad enzimtica puede ser afectada cualitativamente. Es
el caso de la -amilasa que a una humedad del 20 %o (o 4% de "agua libre") produce
principalmente glucosa y maltosa a partir de almidn. A niveles ms elevados de humedad se
forman tambin otros oligosacridos. Quizs lo que ocurre es que a niveles muy bajos de "agua
libre", la rigidez del medio impide la difusin de la enzima o del substrato, limitndose as la
hidrlisis a aquellas porciones del substrato que estn en contacto inmediato con la enzima.
En los cereales y harinas almacenados es posible detectar, fcilmente, actividad lipoltica y
proteoltica. A niveles de humedad superiores a 15% esta actividad es debida, generalmente, a las
enzimas de los hongos que crecen en el cereal y que pueden participar tambin en las reacciones
hidrolticas, desarrollndose amargor o rancidez por la accin enzimtica sobre la fraccin
proteoltica o lipdica durante el almacenamiento.
Los mtodos modernos de liofilizacin de carnes y verduras han introducido problemas similares a
estas industrias. La actividad enzimtica se determina generalmente en estos casos por mtodos
autolticos, ya que la velocidad de la reaccin enzimtica es baja. Por ejemplo, en el msculo de
cerdo liofilizado se usa la desaparicin del glicgeno muscular como un ndice de actividad
enzimtica a diferentes niveles de humedad.
2.4. Efecto del pH y del estado inico (3,6).
La actividad enzimtica guarda tambin relacin con el estado inico de la molcula y,
especialmente, de la parte proteica, puesto que las cadenas polipeptdicas contienen grupos que
pueden ionizarse (principalmente grupos carboxilos y aminos de los aminocidos constituyentes)
en un grado que depende del pH existente. Como ocurre con las protenas, las enzimas poseen un
punto isoelctrico al cual su carga libre neta es cero. El pH del punto isoelctrico, como regla, no es
igual al pH al cual se observa actividad mxima. El pH ptimo de las enzimas varia ampliamente; la
pepsina, que existe en el medio cido del estmago, tiene un pH ptimo de alrededor de 1,5,
mientras que la arginasa tiene un pH ptimo de 9,7. Sin embargo, la gran mayora de las enzimas
tienen un ptimo entre pH 4 y 8. Algunas enzimas muestran una amplia tolerancia a los cambios
del pH, pero otras trabajan bien slo en un rango estrecho. Cualquier enzima que se someta a
valores extremos de pH, se desnaturaliza. Esta sensibilidad de las enzimas a la alteracin del pH
es una de las razones por la que la regulacin del pH del organismo es controlada celosamente y
explica por qu las desviaciones de la normalidad pueden implicar graves consecuencias.
Muchas enzimas existen en el organismo a un pH ms bien alejado de su valor ptimo. Esto se
debe, en parte, a la diferencia del medio ambiente "in vivo" con respecto al "in vitro". Esto recalca
tambin que el control, del pH puede representar un importante medio para regular la actividad
enzimtica.
Las protenas sufren cambios en su solubilidad, presin osmtica y viscosidad a diferentes valores
de pH. Es probable que el cambio en la actividad enzimtica, al variar los valores de pH, se deba a
los cambios en la ionizacin ya sea de la enzima, del substrato o del complejo enzima-substrato.
A1 determinar la velocidad de reaccin de una enzima y para cierta concentracin de substrato, a
diferentes valores de pH, se observa que la curva resultante tiene forma de campana. Se le
denomina curva de pH: actividad. Esta curva no caracteriza, necesariamente, a una enzima, puesto
que el pH ptimo puede variar para diferentes substratos, ni tampoco son similares las curvas de
pH: actividad para dos enzimas que hidrolizan el mismo enlace en un substrato. Por ejemplo, las
pectinometilesterasas hidrolizan especficamente los enlaces ster de polimetilgalacturonatos. La
pectinometilesterasa obtenida de un hongo tiene un pH ptimo de 5,0; la de frjoles tiene su ptima
actividad a pH cercano a 8,5.
Estas diferencias sobre los pH ptimos de enzimas que actan sobre substratos similares es de la
mayor importancia en el procesamiento de alimentos. Una enzima tiene que tener buena actividad
proteoltica a un pH de 4,5 a fin de ser una enzima a prueba de congelacin, o a niveles de pH
superiores a 5,5 para ser un buen ablandador de carne. Para la mayora de las aplicaciones
prcticas, el pH del alimento no puede ser ajustado como para adecuarlo al pH ptimo de una
enzima determinada. La enzima debe escogerse en base a su actividad al pH natural del alimento.
Existen algunas excepciones notables en que es factible y prctico el ajuste del pH. Para la
produccin de glucosa, la pasta de almidn se ajusta a un pH entre 5 y 7 para la hidrlisis ptima
por la alfa-amilasa bacteriana. En cambio, el pH se ajusta entre 4 y 6 para la ptima sacarificacin
por la amilasa de hongos o de cereales.
La velocidad de inactivacin de las enzimas vara para los diferentes valores de pH y, por lo tanto,
un alza en la temperatura puede cambiar el pH ptimo. As, en la industria de cereales el aumento
de temperatura hace variar el pH ptimo de la beta-amilasa hacia valores ms altos de pH. Puede
aplicarse una variacin intencional del pH para destruir especficamente una enzima como, por
ejemplo, la inactivacin diferencial de alfa-amilasa y proteasas en preparaciones enzimticas de
hongos.
Es necesario recalcar, sin embargo, que el trmino "pH ptimo" no tiene una significacin fsicoqumica bien definida. Es mejor, en general, referirse a un rango de pH favorable para una reaccin
dada. Este rango depende no slo de la naturaleza de la enzima particular, sino tambin del
substrato y de la concentracin de ste, de la estabilidad de la enzima, de la temperatura y de la
extensin del periodo de reaccin.
2.5. Sitio activo y especificidad enzimtica (5,8).
Algunas enzimas tienen una especificidad prcticamente absoluta para un determinado substrato y
no atacarn ni siquiera a molculas muy relacionadas. Por ejemplo, la enzima aspartasa cataliza la
adicin reversible de amoniaco. Al doble enlace del cido fumrico, pero a ningn otro cido no
saturado.. La aspartasa tambin presenta una rgida estereoespecificidad y especificidad
geomtrica; por eso no desamina D-aspartato ni adiciona amonaco al maleato, que es el ismero
geomtrico-cis del fumarato. Otro ejemplo de especificidad absoluta es el de la maltasa verdadera,
que slo desdobla al azcar maltosa. En el otro extremo estn las enzimas que tienen una
especificidad relativamente amplia y actan sobre muchos compuestos que presentan una
caracterstica comn. Por ejemplo, la fosfatasa de rin cataliza la hidrlisis de muchos steres
diferentes del cido fosfrico, pero a velocidades variables. Otro ejemplo lo constituyen las lipasas,
que pueden romper la unin entre el cido y el alcohol en el lpido, en tanto sta sea una unin
ster (desdoblan igual etilbutirato que un triglicrido).
Del estudio de la especificidad de las enzimas por el substrato surgi la idea de que existe una
relacin complementaria tipo llave-cerradura entre la molcula de substrato y un rea especfica
sobre la superficie de la molcula de la enzima, denominada el sitio activo o sitio cataltico, al cual
se une la molcula del substrato, mientras experimenta la reaccin cataltica.
de la cerina
grupo coordinado de genes (lo que se llama unopern) puede reprimirse al unirse una sustancia
represora a un gen operador que forma parte del opern.
Puede des-reprimirse (o sea, producir induccin) por la presencia de ciertos metabolitos
reguladores (molculas inductoras), que puede ser un substrato de la enzima codificada por el gen
reprimido.
Este tipo de mecanismos reguladores que implica alteracin en la velocidad de sntesis de una
enzima conlleva una apreciable cantidad de tiempo (desde una hora hasta varios das).
4.2 Importancia de la induccin y represin enzimticas para mejorar la calidad de los
alimentos: Los biorreguladores (12).
Actualmente es posible mejorar la calidad nutritiva y las caractersticas fsicas de las cosechas de
alimentos mediante el uso de biorreguladores, los cuales permiten manipular la expresin gentica
de las plantas individuales. El uso de biorreguladores en los frutos ctricos des-reprime genes
especficos de los frutos, induciendo la produccin de cantidades adicionales de componentes que
aumentan su color, sabor, aroma y calidad nutricional (provitamina A). Hay varias clases de
biorreguladores que inducen la formacin de carotenoides (carotenos, licopeno), cuando se aplican
en bajas concentraciones a la superficie del fruto ctrico maduro. Entre ellos estn los derivados de
las chalconas de la trietilamina y de la dietilnonilamina.
Importancia de los biorreguladores.
a) La induccin de la sntesis de carotenoides puede lograrse, en teora, en cualquier especie que
porte los genes que codifican para las enzimas que sintetizan dichos carotenoides (todas las frutas
ctricas, damascos, duraznos, tomates, zanahorias). Esta universalidad de efecto sugiere que los
biorreguladores actan a travs de una va comn. La des-represin de un gen especifico, pues,
puede revertir los efectos de aquellas sustancias qumicas que se sabe reprimen los genes que
codifican la formacin de carotenoides en Ficomices.
El nico proceso ligeramente comparable es el del uso del etileno para promover la maduracin de
frutas ctricas y tomates; Sin embargo, el etileno es un estimulador amplio, que acelera toda la
actividad metablica en la fruta no madura (77). Los biorreguladores, en cambio, estimulan slo
vas metablicas especificas en frutas completamente maduras.
b) Podra ser posible encontrar otros biorreguladores para aumentar el contenido de un
determinado aminocido en el maz o aumentar la concentracin de protenas en el arroz, etc.
c) Los biorreguladores pueden aportar una nueva arma para aprender ms acerca de los
mecanismos que controlan los genes. Su futuro es muy promisorio, como lo demuestran los
recientes trabajos de Yokoyama y su grupo en el laboratorio del Depto. de Agricultura en California
(12). Ellos han identificado, adems de los biorreguladores ya mencionados, otros que aumentan el
aroma, como, por ejemplo, uno que induce 3,5 veces el contenido en citral de los limones maduros,
un constituyente de la esencia que contribuye en forma importante al aroma del limn.
Catalizan reacciones que implican la ruptura hidroltica de enlaces qumicos, tales como C=O, C-N,
C-C. Sus nombres comunes se forman aadiendo el sufijo -asa al nombre de substrato. Ejs.:
lipasas, peptidasas, amilasa, maltasa, pectinoesterasa, fosfatasa, ureasa. Tambin pertenecen a
este grupo la pepsina, tripsina y quimotripsina.
4. Liasas:
Tambin catalizan la ruptura de enlaces (C-C, C-S y algunos C-N, excluyendo enlaces peptdicos),
pero no por hidrlisis. Ejs.: decarboxilasas, citrato-liasa, deshidratasas y aldolasas.
5. Isomerasas:
Transforman sus substratos de una forma isomrica en otra. Ejs.: Epimerasas, racemasas y
mutaras.
6. Ligaras:
Catalizan la formacin de enlace entre C y O, S, N y otros tomos. Generalmente, la energa
requerida para la formacin de enlace deriva de la hidrlisis del ATP. Las sintetasas y carboxilasas
estn en este grupo.
1.1. El desarrollo de fuentes para producir enzimas de uso en la industria alimentara, de mtodos
de aislamiento y purificacin y el diseo de reactores enzimticos, que permiten su aplicacin en
diversos procesos, ha evolucionado en forma considerable y ha dado origen a un rea
interdisciplinaria conocida hoy da como "ingeniera enzimtica", como nuevo enfoque de la
biotecnologa (13, 15).
Hoy se ha logrado obtener enzimas ms puras, que tienen las siguientes ventajas sobre los
productos de fermentacin:
- accin ms especifica en su funcin cataltica;
- actividad predecible y controlable, y
- es posible utilizar concentraciones ms elevadas del substrato.
1.2. Las principales fuentes de enzimas usadas en la industria de alimentos son de diferente
origen:
a) Vegetal: Lipasas y pectinoesterasa se elaboran a partir de soya, ricino y frutas ctricas; del
germen de trigo se extrae la alfa-amilasa. Las proteasas se obtienen de la papaya, del higo, de la
pia y la peroxidasa, del rbano picante;
b) Animal: La renina, pepsina, tripsina, quimotripsina, catalasa y lipasa pancretica son de origen
animal;
c) Microbiano: Las enzimas de los hongos: Aspergillus flavus, orycae y niger y del Bacillus subtilis
han demostrado ser de gran uso en la industria alimentara.
2. ELABORACIN DE ENZIMAS (19).
2.1. Elaboracin de enzimas de origen animal o vegetal.
Si se trata de enzimas de origen animal la simple trituracin de algunos tejidos especializados,
como el pncreas o el hgado, permite formar una papilla, la cual se extrae a continuacin con un
solvente adecuado como agua, acetona fra
(-20C ), glicerina o una solucin salina. En forma parecida se procede con los tejidos vegetales,
previamente sometidos a trituracin o disrupcin (rotura). Tambin puede partirse de los jugos de
expresin de los respectivos tejidos, cuya estructura celular se destruye por autolisis, plasmolisis
(18) o por congelacin, la cual revienta las paredes celulares.
2.2. Elaboracin de enzimas de origen microbiano (16,17).
Actualmente la tendencia industrial es el reemplazo de muchas enzimas provenientes de tejidos
por aquellas que resultan de la aplicacin de cultivos de microorganismos seleccionados, que
generan la enzima especifica. La produccin de enzimas por microorganismos tiene la ventaja de
su costo, generalmente menor, y por realizarse en un periodo relativamente breve: Por ejemplo, 1 a
5 das en el caso de una fermentacin discontinua por lotes ("batch"). Adems, se puede
incrementar el rendimiento de una enzima especifica por un determinado organismo, recurriendo a
modificar sus condiciones ambientales, o bien, a formar por va gentica cepas mutantes, en las
cuales la produccin de la enzima puede ser varias veces superior que en la cepa original (15,74).
3.1. Sin perjuicio que un preparado enzimtico puede consistir en el mismo extracto o caldo
fermentado que slo se somete a una clarificacin y concentracin (preparado liquido) o
desecacin (preparado slido) se recurre tambin a mtodos de aislamiento y purificacin de
enzimas en gran escala, lo cual se logra principalmente por los siguientes procesos:
3.2. Adsorcin selectiva con hidrxidos de hierro o aluminio coloidales, a cierto pH, pues no todas
las protenas son adsorbidas en iguales condiciones. Una vez adsorbida se lava con agua o
solucin salina y luego s eluye a pH diferente, generalmente alcalino mediante otra solucin
salina, por ejemplo, de fosfato.
3.3. Por precipitacin, en que las enzimas son fraccionadas al reducirse su solubilidad hasta el
punto en que precipitan. Esto se logra por adicin de sales a cierto pH y a elevada concentracin
inica o por solventes orgnicos (alcohol, acetona, isopropanol) a baja temperatura. La sal ms
usada es el sulfato de amonio por su alta solubilidad, bajo costo, alta atoxicidad para la enzima y
por no afectar mayormente la viscosidad de la solucin.
3.4. Dilisis por gradientes de concentracin a travs de membranas semipermeables.
3.5. Ultrafiltracin por aspiracin o presin a travs de membranas de porosidad fina como tamiz
molecular. Presenta una alternativa interesante para separar enzimas, pues no hay cambio de
fases, ni altos gradientes de temperatura (15).
3.6. Electroforesis sobre soportes de papel, gel de almidn, agar o dextrano.
3.7. Fraccionamiento cromatografico Pico de tipo preparativo, tanto en cada fina, como en columna
con intercambiadores inicos, geles o tamices moleculares.
Combinando estos procedimientos con otros a base de electroforesis de alta tensin, cataforesis y
electrodilisis se logran actualmente separaciones de mezclas complejas de enzimas.
4. El control de todas estas etapas en su forma ms rigurosa, es necesario para asegurar el
mximo de rendimiento y reproducibilidad, seguridad y calidad de los productos enzimticos
obtenidos.
5. ENZIMAS INMOVILIZADAS (1, 20, 21).
El enorme nmero de reacciones catalizadas por enzimas y la especificidad de las enzimas
individuales significa que stas son potencialmente de gran valor industrial. Sin embargo, su costo
se agudiza al aplicarlas como reactivos en forma soluble, pues se produce su prdida, una vez
utilizadas. Aunque la enzima por regenerarse en el proceso podra usarse muchas veces, su
separacin a partir de la mezcla de reaccin no es econmicamente factible. De all que ha
significado un avance importante la posibilidad de inmovilizar las enzimas sobre soportes inertes,
reteniendo as gran parte de su actividad cataltica original. Como las reacciones enzimticas se
desarrollan en medio acuoso, la matriz del soporte debe ser insoluble en agua, pero tan hidrfila
que garantice un buen contacto con el medio de la reaccin.
Su aplicacin se basa en sus interesantes propiedades:
e) Por recubrimiento en que las enzimas mismas no se inmovilizan, sino que se limita su espacio
de reaccin, recubrindolas con una membrana polmera, natural o sinttica, que sea
semipermeable; es decir, permeable para el substrato y el producto de la reaccin, pero
impermeable para las molculas enzimticas. El recubrimiento puede suceder por una envoltura
con una matriz, por ejemplo, de
, una separacin por ultrafiltro o por una inclusin de la
enzima en microcpsulas, permeables al substrato, de bajo peso molecular (73).
Factores como dimetro de poro del soporte de adsorcin y carga del soporte y del substrato son
parmetros que influyen, segn el procedimiento elegido, en la cintica de las enzimas
inmovilizadas.
5.2. La enzima as inmovilizada presenta las ventajas de un catalizador slido y es separada
fcilmente de la mezcla de reaccin. En algunos casos, especialmente cuando la matriz de soporte
es de carcter inico, las propiedades de la enzima inmovilizada pueden ser diferentes de aquellas
que presenta la forma soluble. No cabe duda que estas tcnicas de inmovilizacin de enzimas,
iniciadas a comienzos de la dcada del 60, conducirn a exitosos procesos industriales en el
campo de la catlisis industrial por enzimas. Una de las posibilidades ms prometedoras en esta
rea es la de crear sistemas multienzimticos inmovilizados al unir ms de un tipo de enzima en la
matriz, como glucoamilasa y glucosa-isomerasa para transformar almidn en fructosa. Es
interesante hacer notar, al respecto, que en la naturaleza las endoenzimas, es decir aquellas que
operan dentro de las clulas, estn habitualmente inmovilizadas por fijacin sobre membranas o
sobre partculas slidas en suspensin (20).
La lactasa fngica para desdoblar la lactosa de leche y suero y la glucosa isomerasa para la
obtencin de fructosa, son buenos ejemplos del empleo actual de enzimas inmovilizadas en
tecnologa de alimentos
vapor o por ebullicin. La aplicacin de vapor tiene la ventaja sobre el agua de que reduce la
prdida de las sustancias solubles en ella como las vitaminas y sales hidrosolubles.
2.2. Inhibicin por aditivos (no permitidos).
Algunos estn prohibidos precisamente por su accin sobre enzimas importantes:
-Acido frmico: por su poder complejante que inhibe enzimas que contienen Fe +++.
-Acidos monocloro- y monobromoactico: por su accin tiolopriva en el sentido de bloquear los
grupos sulfhidrlicos de las enzimas.
-Acido brico: inactiva descarboxilasas, fuera de acumularse en la grasa del organismo.
-Base de amonio cuaternario: que activan la citocromo-oxidasa y enzimas digestivas.
-Acido nordihidro-guayartico: (NDHA-antioxidante), inhibe las catalanas, peroxidasas, alcoholdehidrogenasa, fuera de tener una accin alergizante.
2.3. Inhibicin de enzimas por componentes de alimentos:
-Factor antitrptico, que se encuentra en el poroto de soya, clara de huevo (ovomucoide) y zumo de
papa cruda.
-Solanina o solanidina (aglucn) de la papa, que inhibe la colino-esterasa; lo que tiene relacin con
el control de la conduccin de los impulsos nerviosos (23).
3. ENZIMAS DE ALIMENTOS QUE DESTRUYEN NUTRIENTES.
-Lipoxidasa, destruye los carotenos y la vitamina A de frutas y hortalizas, al actuar sobre los dobles
enlaces de compuestos insaturados.
-Tiaminasa, destruye la tiamina y se la encuentra en mariscos (ostras) y algunos peces crudos.
4. REGENERACIN ENZIMTICA.
En la tecnologa alimentara moderna se deben tener presentes los cambios que pueden ocurrir en
los procesos tecnolgicos. As, cuando las enzimas se han inactivado, algunas pueden
regenerarse, como es el caso de la peroxidasa, de la fosfatasa y otras. El mtodo de Hightemperature-Short-time (HTST) como lo dice su nombre, es la aplicacin de calor (a alta
temperatura), pero por corto tiempo; antes se usaban 115C por tiempo prolongado, hoy se usan
125C por corto tiempo. Con ello puede suceder que la enzima no se inactive en su totalidad, no
sufre el despliegue total de su estructura proteica helicoidal y as recupera parcialmente su
estructura nativa despus de las 24 horas de elaborado el producto. Con esto regenera su
actividad, en parte, lo suficiente como para que durante el almacenaje resulten efectos dainos en
los alimentos conservados, produciendo mal olor y sabor.
Pero la regeneracin de la actividad no est limitada a la desnaturalizacin por calor de la enzimaprotena. Algunas, como la alfa-amilasa obtenida del Bacillus subtilis, pueden denaturarse por
adicin de la urea a la solucin de enzima. Alrededor del 80% de su actividad original se regenera
colocando la solucin en tampn de pH 8,5. Si se elimina el resto de urea por dilisis, se regenera
slo el 40% de la actividad. La regeneracin ha sido explicada por algunos autores (24, 25, 26, 27)
como la capacidad de la enzima de recuperar su estructura terciaria, por recombinacin de las
uniones H.
Entre las diversas reacciones intermedias tenemos la formacin de glicosilamina que es incolora,
luego una isomerizacin conocida como reordenamiento de Amadori y posteriormente la llamada
degradacin de Strecker, con prdida de una molcula de
y formacin de hidroximetil-furfural.
Este fenmeno es deseable en algunos productos, como cerveza, corteza del pan, caf, pero en
otros alimentos no es conveniente, ya que involucra aparte del cambio de color, cambios en el
sabor, olor y en la disminucin del valor nutritivo, ya que estn comprometidos algunos
aminocidos esenciales como la lisina (32). Este pardeamiento se puede evitar mediante bajas
temperaturas, bajo pH, descomponiendo la mitad de glucosa que puede estar presente, y el
mtodo ms usado, que es bloquear el grupo -CO mediante el sulfito de sodio (29).
Anhdrido sulfuroso: Es uno de los ms efectivos y econmicos inhibidores qumicos hoy usados
en la industria alimentara, aunque su olor y sabor desagradables pueden comunicarse al alimento
cuando se emplea en grandes cantidades. Su uso no es aconsejable en alimentos ricos en tiamina
y vitamina C, pues las destruye. En el caso de la tiamina, el
es capaz de romper el anillo
tiazlico de la vitamina, separando el anillo de pirimidina, con lo que pierde su carcter vitamnico.
La polifenoloxidasa es muy sensible al
Acidos: Bajo un pH 2,5 cesa la actividad enzimtica, que es ptima entre 5 y 7. Aunque luego se
vuelva al pH original de la fruta, la enzima no se recupera, impidindose as el pardeamiento. Entre
los cidos ms usados est el mlico, que se agrega al prensar la fruta: caso de la manzana, de la
cual es uno de sus componentes naturales (30); tambin se usa, pero en menor proporcin, el
cido ctrico.
Acido ascrbico: Este cido es el ms recomendado para evitar o minimizar el pardeamiento
enzimtico, por su carcter vitamnico inofensivo. El cido ascrbico por s mismo no es un
inhibidor de la enzima: acta sobre el substrato, de modo que puede adicionarse despus de
haberse formado las quinonas; Tiene la propiedad de oxidarse a cido dehi-hidroascrbico,
reduciendo la quinona a fenol (35).
Esto lo hace el cido ascrbico hasta que se haya transformado totalmente en dehidroascrbico
que ya no puede reducir las quinonas, de manera que stas continan, entonces, su oxidacin
hasta la formacin de melanoides. El cido dehidroascrbico an puede ser perjudicial al formar,
en la esterilizacin posterior, melanoides con los aminocidos presentes; por eso la adicin de
cido ascrbico no es eficaz en cerezas, ciruelas y frutillas. Sin embargo, si se agrega a otras
frutas exceso de cido ascrbico para inactivas totalmente la enzima, se logra prevenir el
pardeamiento en forma efectiva y permanente.
Productos especialmente propensos a empardecer por oxidacin qumica, cmo manzanas, peras,
duraznos, damascos, ciruelas y pltanos entre las frutas, y papas, esprragos, zanahorias entre las
hortalizas, deben mantenerse, inmediatamente despus de cortadas o peladas, en agua
adicionada de 0,1-0,2 % de cido ascrbico y de 0,2% de cido ctrico.
Adems, para evitar alteraciones de color por oxidacin qumica en las conservas enlatadas, es
conveniente agregar por cada litro de liquido de relleno 0,5-1 g de cido ascrbico (y 0,25-0,50 g
de cido ctrico, segn lo admita el producto en cuanto al sabor). Para mantener el color de
conservas de championes y otros hongos es conveniente una adicin de 0,15-0,20 g por litro y
para el choucroute se agrega a la salmuera 1-2 g/kg de cido ascrbico, poco antes del envase.
Otros inhibidores qumicos: Entre las sales propuestas para controlar el pardeamiento la ms
usada es NaCl, cuya accin impide la actividad de la polifenol-oxidasa frente al cido clorognico.
Una sumersin en solucin acuosa diluida de NaCl (0,3%) se usa mucho cuando se quiere evitar
por corto tiempo el obscurecimiento de frutas peladas, como rodajas de manzanas, antes de ser
sometidas al procesamiento; Su contenido en cido ascrbico s mantiene, entonces, constante
durante varias horas.
Se aplica el bloqueo de los hidrxilos fenlicos por adicin de complejantes con el cobre de la
enzima, como el cido ctrico (0,2%) y boratos
(0,2% + 0,01%
). Tambin la cistena y otros dadores de SH se unen a los fenoles, dando
complejos incoloros, previa reduccin de las quinonas.
El uso de jugos de pia o de limn para evitar el pardeamiento en preparaciones caseras, se basa
en el contenido de compuestos sulfhidrlicos del primero y en cidos ctrico y ascrbico del
segundo.
c) Eliminacin del oxgeno: La exclusin o limitacin de la influencia del
del aire al trabajar y
envasar rpidamente el material y en caso necesario con ayuda del vaco o en atmsfera inerte
representan medidas satisfactorias para mantener ciertas frutas al estado lo ms natural posible,
especialmente en lo que se refiere a textura y sabor. Para frutas destinadas a la congelacin, se
usa tambin azcar y jarabe para cubrir la superficie, retardando as la entrada del oxigeno
atmosfrico.
5.6. Fuera de estos fenmenos de pardeamiento enzimtico existen tambin otras reacciones
enzimticas que pueden conducir a un deterioro en los alimentos. Durante el procesamiento de
productos tanto animales (matanza) como- vegetales (frutas, hortalizas, molienda de cereales), la
destruccin de los tejidos por accin generalmente mecnica, puede liberar enzimas de sus
estructuras tisulares. Las consiguientes transformaciones metablicas no controladas pueden
conducir entonces, a veces, a reacciones enzimticas que van en desmedro de la calidad del
alimento. Es as que la ya mencionada lipoxidasa puede dar origen a productos de oxidacin de
sabor rancio o amargo en derivados de cereales y destruir los carotenos (55). Tambin una
excesiva proteolisis enzimtica puede conducir a un deterioro del tejido, como sucede en la
putrefaccin de productos crneos y marinos.
Por otra parte, el reblandecimiento exagerado o la prdida de consistencia de frutas y hortalizas
que han sobrepasado su estado de madurez tienen su origen en una pectinolisis no controlada por
pectinasas. En el fruto fresco e intacto estas enzimas se encuentran separadas de su substrato, las
pectinas; Pero al producirse la ruptura celular en el fruto alterado se genera entonces su reaccin
de deterioro (28).
contienen ambas enzimas, muchas harinas de trigo son deficientes en alfa-amilasa, siendo
entonces conveniente su adicin.
La alfa-amilasa de origen fngico (como es la que se obtiene por crecimiento del micelio del
Aspergillus oryzae en fermentadores de cultivo sumergido que permiten una agitacin y una
aereacin intensas), aunque puede ser menos potente que la de bacterias o de cereales, se puede
obtener con baja actividad de proteasa (desdobladora del gluten) y de maltasa, conservndose as
la maltosa, esencial para la fermentacin. La presencia de una cantidad suficiente de alfa-amilasa
durante el esponjamiento y fermentacin de la masa, tiene las siguientes ventajas:
- mayor contenido de azcares fermentescibles en la masa;
- aceleracin de la fermentacin;
- desprendimiento gaseoso, mayor y uniformemente mantenido;
- aumento del volumen y textura del pan con una miga de porosidad ms fina y de costra ms
uniforme y ms coloreada.
La alfa-amilasa de origen bacteriano es ms estable al calor que la de hongos y de cereales, de
manera que no se inactiva totalmente en el horno panificador. Por este motivo, su adicin debe ser
bastante cuidadosa para evitar una sobreproduccin de dextrina residual y con ello una miga
gomosa y pegajosa (38, 40). Por otra parte, una actividad residual de la alfa-amilasa bacteriana en
el pan tiene la ventaja de suministrarle una mejor conservacin, al restringir durante el
almacenamiento del pan la retrogradacin de su almidn, causante del envejecimiento. Al sustituir
la adicin, de la amilasa por extracto, jarabe o harina malteados, debe tenerse presente la relativa
termo-resistencia de su alfa-amilana y su considerable actividad proteoltica, cuyas desventajas se
han sealado anteriormente.
2.2. PROTEASAS.
Origen: Fngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (Bacillus, Streptococcus) y vegetal (Canica
papaya L: Papana).
Accin. Desdoblamiento hidroltico de protenas y pptidos hasta aminocidos.
Aplicaciones: Como la adicin de amilana y/o proteasa depende de la harina y otros ingredientes
de la masa, la conveniencia de agregar proteasa queda generalmente restringida a harinas de trigo
duro, ricas en gluten (como las de Canad y Rusia), mientras que en harinas pobres o
medianamente ricas en gluten puede originar un reblandecimiento exagerado de la masa.
En los casos en que la adicin de proteasa es conveniente, se produce una mayor extensibilidad y
elasticidad de la masa, acortndose el tiempo de amasijo y facilitando el amasijo mecnico
(maquinofilia). El pan resultante adquiere mayor volumen por una mejor retencin de gas,
mejorando su textura y simetra, como tambin sus condiciones de conservacin y aun de aroma
(40); esto ltimo, sobre todo si se asocia a una adicin de amilasa.
Como la protelisis en la masa puede ser inhibida por la sal, conviene agregar sta slo durante el
amasijo.
En algunos productos de panadera, como barquillos y galletas secas duras, las masas deben
elaborarse con una menor adicin de agua; por otra parte, deben ser blandas y plsticas y poco
elsticas para que se puedan moldear fcilmente. Por este motivo se prefiere el uso de una harina
"floja", es decir, pobre en protenas totales (no ms de 11 %) y en gluten hmedo (mx. 22%), pues
con contenidos ms elevados se necesita ms lquido para preparar la masa. Esto tiene el
inconveniente de la formacin de una miga de, poros ms gruesos y un excesivo levantamiento del
producto, formndose a menudo una superficie spera, irregular o con ampollas, grietas o fisuras
en las galletas.
Si no se dispone de una harina apropiada para estos fines, puede regularse, la plasticidad de la
masa frenando su desarrollo. Esto se puede conseguir en forma adecuada por medio de una
enzima proteoltica como la papana, que desdobla parte del gluten y permite obtener una masa
blanda, suave y extensible, y con menor tiempo de horneo. La cantidad por usar depende del
contenido de gluten de la harina que se usa; pero, en general, un 0,5%; o, relacionando con 100
kilos de harina, 50-100 ml de Auxillase (un concentrado liquido de Merck) son suficientes.
Como toda enzima, la papana se destruye con la temperatura del horno de panificacin, por lo
cual su accin debe tener lugar durante el tiempo de reposo de la masa, de unos 15-20 minutos
despus de su adicin. La dosificacin depende, en todo caso, de la humedad, tratamiento
mecnico en el amasijo, pH, composicin y tiempo de reposo de la masa. Para asegurar una
distribucin homognea es conveniente agregar la enzima al agua del amasijo.
Su actividad comprende un margen de pH de 3 hasta 9 y alcanza un ptimo entre 40 y 70C.
fondants, mazapanes y pasteles adquieren entonces una consistencia suave, cremosa y blanda,
an despus de un almacenamiento prolongado.
La actividad enzimtica de la invertasa depende del pH, siendo su ptimo de 4,5 a 5,0, y de la
temperatura que puede variar de 25 a 55C; no debe agregarse a productos con ms de 65C
ni a aquellos con ms de 20% de alcohol (bombones con relleno), pues la enzima es inactivada.
Como la invertasa produce una hidrlisis, exige la presencia de agua (por lo menos 5% del peso
del azcar). De un preparado lquido de invertasa se agregan normalmente 100-125 ml para 100 kg
de masa; dicha cantidad puede aumentarse si no se puede llevar al pH ptimo mediante la adicin
de cido ctrico, por razones de sabor.
A veces se agrega la invertasa al producto previamente mezclado con sorbitol, que tambin posee
un gran poder higrosttico o estabilizador de la humedad, en el sentido de retenerla frente a
variaciones en la humedad ambiente. Mientras que el sorbitol reblandece de inmediato y su accin
contina durante el almacenamiento, la invertasa acta de preferencia en el transcurso del
almacenamiento.
Otra aplicacin importante de la invertasa est en la elaboracin de azcar invertido a partir de
sacarosa por va enzimtica, la cual aventaja a la hidrlisis cida, por ser ms fcil de controlar.
Adems, el jarabe resulta de mayor concentracin, presenta mejores caracteres de color y sabor y
no contiene indicios de productos secundarios como el furfural. Una vez elaborado el jarabe por
inversin enzimtica, se calienta a 80C para inactivar la enzima, teniendo aplicacin en
diferentes productos azucarados y licores.
Por otra parte, desechos de frutas ricas en sacarosa pueden ser hidrolizados por invertasa en
glucosa y fructosa y stas fermentadas por levaduras para producir etanol y/o protenas
unicelulares (74, 11).
Es interesante que la accin cariognica del azcar invertido es bastante inferior ala causada por la
sacarosa. La propiedad de no producir caries es an mucho ms manifiesta en el xilitol, alcohol
pentavalente, de poder edulcorante, semejante al de la sacarosa.
3.2. GLUCOAMILASA O AMILOGLUCOSIDASA.
Origen: Fngico (Aspergillus niger, Rhizopus, Endomyces).
Accin: Hidroliza los enlaces 1,4 y 1,6 del almidn (tanto amilosa como amilopectina) desde los
extremos no reductores de las cadenas con separacin de unidades sucesivas de glucosa.
pH ptimo: 4-6.
Aplicacin: Se usa para la elaboracin enzimtica de jarabe de glucosa y de glucosa a partir de
almidn (40). En el campo analtico tiene aplicacin en la determinacin cuantitativa del almidn y
alfa-oligo y poliglucsidos en alimentos.
3.3. GLUCOSA-ISOMERASA.
Origen: Bacteriano (Streptomyces, Aerobacter, Lactobacillus).
proteasas naturales del tejido muscular de la carne, las cuales desdoblaran entonces las fibras
musculares con efecto de tenderizacin de la carne (72).
En la carne liofilizada la aplicacin de estas proteasas tiene el efecto de facilitar la rehidratacin, al
aumentar, por la protelisis, la capacidad de fijacin de agua.
4.5. Tambin en los pescados tiene lugar, despus de la pesca, una cierta maduracin natural que
influye en su sabor y textura. Como en la protelisis de esta maduracin intervienen, fuera de las
enzimas del tejido muscular (catepsinas), tambin otras de origen gastrointestinal, stas no podrn
actuar si el pescado es eviscerado antes del salado, p. ej., en la preparacin de preservas. En
estos casos una adicin de proteasas fngicas al liquido del curado de los trozos fileteados puede
ser til, como tambin en la elaboracin de condensados solubles de pescado.
Si ya se desea una hidrlisis ms intensa, como sucede en la preparacin de hidrolizados
proteicos, de valor condimenticio a base de pescado, cereales, soya o protenas lcteas,-el uso de
proteasas vegetales, animales (pepsina) o microbianas presenta ventajas sobre el sistema clsico
de hidrlisis en medio cido bajo presin, pues no produce la destruccin de ciertos aminocidos
como el triptfano, ni su racemizacin (10).
Debido a la mayor demanda mundial de carne como alimento, no resulta actualmente muy
econmico matar terneros an no destetados para obtener el cuajo. Fuera de la pepsina, a veces
en mezcla con la renina, se estn aplicando en quesera, cada vez en mayor escala, enzimas
coagulantes de origen microbiano. De aplicacin ya industrial son las de
la Endothia parastica, Mucor pusillus L. y Mucor miehei, cuya enzima es la renilasa; stas se
caracterizan por tener poca actividad de proteasa. Esto es importante para evitar la formacin de
pptidos de sabor amargo durante la maduracin posterior del queso (16, 41).
5.3. ENZIMAS AUXILIARES DE LA MADURACIN DE QUESOS.
Para abreviar el proceso de maduracin y mejorar la calidad de los quesos se recurre a la
aplicacin adicional de lipasas de origen vacuno, ovino, caprino o fngico y de proteasa de
Streptomyces, por ej., en quesos Gouda. En la elaboracin de algunos tipos de quesos la adicin
de lipasa se hace a la leche de partida ya pasteurizada, junto al cuajo, pues la pasteurizacin la
inactiva (es inhibida a 57C por 30 minutos); por otra parte, la lipasa participa tambin en el
aroma de queso, crema y mantequilla.
Un ejemplo de la accin de un microorganismo en la maduracin de quesos es la adicin de un
cultivo de Penicillium camemberti como fuente de una proteasa extracelular, la cual, al hidrolizar
lentamente las protenas del queso Camembert, produce la textura suave y mantecosa que lo
caracteriza. En cambio, el Penicillium roqueforti es responsable de la formacin de vetas de color
verde-azulado y de metilcetona, caractersticas de los quesos Roquefort, Gorgonzola y Stilton.
Proteasas de Streptomyces se usan para acortar la maduracin del queso Gouda, y
de Aspergillus flavus para mejorar los caracteres sensoriales del queso Cheddar (10). Para mejorar
la textura y aroma del queso Cheddar se suele agregar tambin un cultivo
de Streptococcus diacetilactis, pero debe agregarse slo en pequea cantidad a la cuajada, para
evitar un hinchamiento del queso por desprendimiento de CO 2 (72).
5.4. LACTASA.
Origen: Levaduras (Saccharomyces lactis, S. fragilis, Torula cremoris) y Fngico (Aspergillus niger,
Streptomyces coelicor, ms termorresistente).
Accin: Cataliza la hidrlisis de la lactosa en glucosa y galactosa, desde los extremos de los
restos de galactosa; siendo los dos monosacridos resultantes ms dulces y ms fcilmente
asimilables.
pH ptimo: 4-7.
Aplicaciones: Como la lactosa es de menor solubilidad que los otros azcares, tiene tendencia a
cristalizar en concentrados de leche y de suero lcteo. Esta cristalizacin va acompaada de una
desestabilizacin del complejo de caseinato de calcio, lo que conduce fcilmente en el
almacenamiento fro de leches condensadas, helados de leche y de crema y concentrados de
suero lcteo a floculaciones, con formacin de sedimentos granulosos o arenosos. Esto se puede
evitar -obteniendo productos suaves al paladar- si se hidroliza por lo menos el 20% y hasta el 50%
de la lactosa presente mediante la adicin de lactasa. En condensados lcteos que se elaboran
con adicin de sacarosa conviene agregar sta slo despus de su tratamiento con lactara, pues la
presencia de sacarosa retarda considerablemente la velocidad de hidrlisis por la lactasa.
Como se describe en Enzimas de accin mltiple (vase Pg. 60), los daos que puede causar en
derivados de frutas y de hortalizas la presencia de oxgeno se pueden evitar por la adicin de esta
enzima; acompaada, eso s, de catalasa para impedir la destruccin de aromas y de pigmentos
antocinicos por el perxido libre que forma la glucosa-oxidasa. Lgicamente, la adicin debe
hacerse una vez enfriado el producto despus de su procesamiento trmico (pasteurizacin o
esterilizacin). Existen tambin preparados enzimticos, recubiertos de una envoltura resistente al
calor y la acidez, que actan slo despus del enfriamiento rpido. En nctares y jugos pulposos
es importante que los preparados enzimticos que se apliquen estn exentos de celulasas y
pectinasas (que desdoblan las cadenas glucosdicas del cido poligalacturnico en la pectina) para
evitar el desdoblamiento de los coloides protectores que estabilizan la turbidez.
Para lograr este mismo efecto se suele recurrir tambin a preparados enzimticos a base de
proteasas de origen fngico (Aspergillus), a veces unidos a un tratamiento sinrgico con tanino
(72).
7.4. En cuanto a los enturbiamientos y floculaciones de origen biolgico, stos son causados por la
presencia de levaduras y otros grmenes aerobios en la cerveza. En estos casos la adicin, antes
de la pasteurizacin, de glucosa-oxidasa (vase sta) asociada a catalasa permite eliminar el
oxgeno necesario para la actividad de estos microorganismos. De esta manera es posible mejorar
el sabor y la estabilidad de la cerveza frente a este fenmeno y tambin frente a una posible
contaminacin metlica de las cervezas enlatadas (50).
Para estos fines suele usarse tambin la mezcla de 5 mg/1 de glucosa-oxidasa y 25 mg/1 de
metabisulfito de sodio
(
).
7.5. Tambin puede recurrirse a una adicin de glucoamilasa (vase sta) a la cerveza para
mejorar su estabilidad y lograr a la vez un desdoblamiento mayor de las dextrinas (10).
Si a la vez est presente o se agrega catalasa, los productos finales son cido glucnico, agua y
oxigeno.
pH ptimo: 3-7.
Aplicaciones: En jugos y otros derivados de frutas y verduras, vinos y cervezas, la glucosaoxidasa (10-30 mg/1) en mezcla con catalasa permite eliminar el oxgeno, causante de cambios de
color, prdidas de aroma y de vitamina C y de turbideces y floculaciones debidas a
microorganismos aerobios.
Por su adicin a conservas y bebidas enlatadas se puede reducir tambin la migracin de metales
a su contenido, al disminuir fenmenos de corrosin, Si el producto no contiene suficiente glucosa
es conveniente agregar un 0,1%.
La mezcla de ambas enzimas puede usarse tambin para la proteccin superficial contra la
oxidacin por impregnacin del material de empaque de quesos, carnes y alimentos deshidratados.
Tambin se puede aplicar la glucosa-oxidara en mezcla con glucosa y con un tampn para
neutralizar el cido glucnico que se va formando. Al colocar una bolsita impermeable al agua, pero
permeable al oxigeno con esta mezcla, dentro del envase del producto, el oxgeno de la atmsfera
del envase es rpidamente captado; protegiendo de este modo productos deshidratados con alto
contenido de grasa y otros componentes sensibles a la oxidacin.
Por otra parte, se usan tambin estas dos enzimas en la desecacin de clara y huevo entero (unos
120 mg/kg) para eliminar los indicios de glucosa, que contienen; lo que causa pardeamiento segn
Maillard, con cambios de color, sabor y olor. A la vez aumenta la estabilidad y el poder espumante
por batido de la clara. A menudo conviene agregar perxido de hidrgeno, necesario para el
de
la reaccin (a pH7 y 30C) (50).
En el caso de que la clara de huevo est acompaada de un poco de yema, tan rica en grasa,
puede suceder que sta impida la formacin de espuma, evitando el debido esponjamiento. En
este caso la adicin de otra enzima, la lipasa (proveniente del ricino) desdobla la grasa,
permitiendo as una mayor incorporacin de aire y formando ms espuma.
8.2. CATALASA O HIDRGENO-PERXIDO-OXIDO-REDUCTASA.
Origen: Fngico (Aspergillus niger), bacteriano (Micrococcus sp.) y animal (hgado, eritrocitos de
origen vacuno y porcino).
Accin: Cataliza el desdoblamiento de perxido de hidrgeno en agua y oxigeno.
pH ptimo: 4-9.
Aplicaciones: Preparados enzimticos que contienen glucosa-oxidara junto con catalasa se
emplean (fuera de los usos recin mencionados) como antioxidantes de productos lquidos y
pastosos, como mantequilla, mayonesa y grasa animal, eventualmente con adicin de glucosa
(0,5%). Aqu debe evitarse que el lpido tenga exceso de acidez, la cual puede inactivar la catalasa.
Suelen aplicarse del preparado enzimtico 20-25 mg/kg.
En la elaboracin de vinos la adicin de ambas enzimas (ms 0,1 % de glucosa) impide el
crecimiento de microorganismos aerobios y la formacin de exceso de acidez voltil. Sin embargo,
debe evitarse la inhibicin de la catalasa por el pH cido del vino (su inactivacin se produce a pH
de 3-3,5),
CUADRO RESUMEN DE ALGUNAS APLICACIONES INDUSTRIALES DE ENZIMAS
MICROBIANAS, SEGUN REED (3)
Preparacin
enzimtica a
base de:
Bacillus
subtilis
--
Tipo de
enzima
Carbohidrasa
-
Usos tpicos
Nivel
mximo
en ppm
(sin
diluyente).
500
Fermentacin de cerveza
100
100
Aspergillus
oryzae
*
Aspergillus
niger
-
Proteasa
-
10
40
Hidrolizados proteicos
Pescado (curado de filetes y condensados
solubles)
Jarabes hidrolizados de almidn
Carbohidrasa
-
500
1000
250
1000
10
400
200
-+
Ablandadora de carne
Carbohidrasa
Celulasa
Glucosaoxidasa y
Catalasa
50
500
100
750
-
Pectinasa
Pectinest.
200
Lipasa
100
La catalasa sola tiene tambin aplicacin para eliminar exceso de agua oxigenada de alimentos
(por ej., de leche) y para la produccin de oxigeno, a partir de agua oxigenada en la preparacin de
baos de oxigeno (43).
8.3. LIPASAS:
Origen: Animal (pancretica), vegetal (semillas de soya, ricino, algodn y cereales como trigo y
maz) y fngico (Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Gandida). En la leche hay una lipasa naturalmente
activa, adsorbida en los glbulos grasos y otra lipasa que se activa por tratamiento mecnico
(agitacin, homogeneizacin).
Accin: Cataliza la hidrlisis de triglicridos a diglicridos, monoglicridos y cidos grasos, ms
glicerina, liberando de preferencia los cidos grasos de las posiciones 1 y 3 de los glicridos.
Rangos de pH: 8-9 (animal), 4-5 (vegetal) y 2-9 (fngica).
Aplicaciones: Se usa en el desdoblamiento de lpidos, en la produccin de aroma de quesos
(vase Aplicacin de enzimas en la industria lechera), crema, mantequilla, margarina y productos
de chocolatera. Tambin se usa en el desgrasado de protena.
El valor de las enzimas para ablandar las carnes por inyeccin de la enzima antes de la muerte, es
pequeo, comparado con otros mtodos. El valor de la enzima para ablandar 100 libras de carne
puede ser del orden de 0,5 a 2 . E1 uso culinario de polvos ablandadores es ms caro, a causa
del diluyente, del envase y de su distribucin.
9.5. PAN Y HARINA.
Agregar enzima proteoltica a la masa de pan tiene un costo de 2,5 por cada 100 libras de
harina empleada. Esto incluye, tambin, el gasto del diluyente o el costo de tabletear. Aunque el
uso de la enzima reduce notablemente el tiempo de amasijo, hay un real ahorro en la energa
requerida en las mezcladoras de masa.
El gasto que significa agregar alfa-amilasa de origen fngico ala harina es de 0,5 a 10 por cada
100 libras de harina (para la suplementacin en el molino).
9.6. GLUCOSA.
El costo de la enzima para convertir 100 libras de almidn de maz (del almidn mismo o de harina
de maz) en glucosa es de 40-60 . Este es un porcentaje sustancial del valor que tiene al final la
glucosa.
La comparacin de costos entre el proceso enzimtico y el proceso hidroltico mediante cido,
debe considerar muchas variables. Entre ellas s pueden mencionar; costo del agente de
conversin; cido versus enzima; valor del equipo (equipo resistente a la corrosin, equipo
prensador, tamao de los equipos); rendimiento de glucosa; periodo de hidrlisis; valor del liquido
madre despus de la cristalizacin de la glucosa.
En las plantas productoras de glucosa, el costo de las enzimas es apreciablemente ms bajo, su
valor es de 40 por 100 libras de almidn. si estn capacitadas para producir su propia enzima
(3).
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/
schmidth02/parte01/01.html