Resultados Prctica 2.

Anabel Milln Leiva

Prctica 2: Mutagnesis de DNA mediante luz ultravioleta

La radiacin ultravioleta se corresponde con las radiaciones entre 15 nm y 400 nm del
espectro electromagntico, son radiaciones de longitud corta, y por tanto con alta energa asociado.
Esto las convierte en un importante agente mutagnico del DNA. Las bases del DNA, por su
estructura cclica de dobles enlaces, absorben radiacin ultravioleta, alrededor de 260 nm de
longitud de onda. No obstante, su principal efecto perjudicial reside en la formacin de dmeros
entre bases prximas de Timina, de la misma cadena o de la cadena antiparela (la radiacin UV
causa la resonancia de estas bases, que se unen entre ellas incorrectamente). Estos dmeros de
timina son enlaces covalentes difciles de hidrolizar, por tanto, si la maquinaria celular no los repara
se generan errores y mutaciones en el DNA.
El problema es mayor cuando la clula se encuentra replicando su material gentico, ya que
pueden dar lugar a celular hijas con el genoma mutado.
En Escherichia coli se conocen 2 mecanismos de reparacin, que pueden actuar in situ
durante la replicacin. Uno es la fotoreactivacin, dependiente de luz y llevada a cabo por la
fotoliasa Phr; y el otro es el sistema de reparacin Uvr, en el que participan las endonucleasas uvrA,
uvrB, uvrC y la helicasa uvrD.
Someteremos clulas de E. coli en crecimiento exponencial a radiacin UV en diferentes
dosis (diferentes tiempos de exposicin). Utilizaremos 2 cepas de E. coli:
Cepa GY752: Fenotipo salvaje (Wild type)
Cepa GY753: Mutante UvrAAmbas cepas presentan el gen phr normal, responsable de la reparacin por fotoreactivacin
(dependiente de luz); sin embargo, la cepa uvrA- presenta una deleccin en el gen codificante para
la subunidad ATPasa del sistema de reparacin Uvr (mutacin en uvrA), haciendo que este sistema
no sea funcional.
En bacterias, al presentar un genoma pequeo, y codificante en su mayor proporcin, es muy
elevada la probabilidad de que estas mutaciones afecten a gentes esenciales y sean deletreas, as
analizaremos el efecto mutacional de la radiacin UV cuantificando la proporcin de clulas que
mueren.
Despus de someter las clulas a la radiacin UV se dejaran crecer una parte en luz y otra en
oscuridad, para observar y cuantificar la reparacin por fotoreactivacin.

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Anabel Milln Leiva

No podemos saber la dosis de radiacin en Julios/m2 porqu no conocemos la potencia de la

lampara ultravioleta. Utilizaremos como medida de dosis irradiada el tiempo que han estado las
clulas expuestas a la radiacin UV, asumiendo que la radiacin se ha mantenido constante lo largo
del tiempo de exposicin.
Previo a los anlisis se ha estandarizado la concentracin de clulas mediante la OD600 del
cultivo para que todos los grupos partan de la misma cantidad de clulas, y estas se encuentren en
su fase exponencial (DO600 ~ 0,5 cultivo en crecimiento exponencial).
N cls. = conc x Vol (mL)
Und. DO 600 = DO600 x Vol (mL

DO600 = 0.5 ~ 10 x106 cl/mL

Cogemos 1,5 unidades de DO600 : Vol. cultivo= 1,5/05 = 3 mL

Resultados y discusin
Tabla 2.1: Resultados del recuento de UFC en placas.
Cepa

UvrA-

Wt

Dosis (seg.)

Luz

Oscuridad

Luz

Oscuridad

3,9 x108

3,1 x108

1,9 x108

1,9 x108

2,1 x108

1,1 x108

2,5 x107

2,3 x108 ?

5,7 x106

2,2 x106

15

3,6 x105

6 x105

4,2 x104

1,3 x104

30

4,3 x108 ?

1,8 x107

7,5 x103

4,5 x104

7,7 x103

1 x102 *

60

6,9 x106

1,5 x106

90

4,3 x105

1,6 x108 ?

120

1,6 x103

9,5 x103

A tiempo inicial, o 0 segundos de radiacin, se espera que la concentracin sea similar en

todos los grupos, ya que se corrigieron los volmenes segn la OD600 del cultivo de cada grupo,
para que se partiera de la misma cantidad de clulas. Todos los grupos presentan una concentracin
celular del mismo orden de magnitud, y las variaciones son consecuencia del error experimental.
Para los posteriores clculos no tendremos en cuenta los resultados tachados:
* No se tendr en cuenta esta medida para evitar errores, ya que el grupo slo contabilizo
1 colonia.
? Error en el recuento, no pueden haber ms clulas de las iniciales.

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Anabel Milln Leiva

Con los valores de concentracin de clulas viables calcularemos los porcentajes de

supervivencia.
Tabla 2.2: Tabla de valores promedio de UFCs y porcentaje de supervivencia.
Cepa
Dosis (seg.)

UvrA-

Wt
Luz

Oscuridad

Oscuridad
3,2 x108
100 %

2,5 x107
13,16 %

3,95 x106
1,23 %

15

4,8 x105
0,25 %

2,75 x104
0,0086 %

6 x104
0,03 %

7,7 x103
0,0024 %

3,9 x10
100 %

Luz
1,9 x10
100 %

3,1 x10
100 %

30

No datos

1,8 x107
5,81 %

60

6,9 x106
1,77 %

1,5 x106
0,48 %

90

4,3 x105
0,11 %

No datos

120

1,6 x103
0,00041 %

9,5 x103
0,0031 %

La dosis expuesta para cada cepa son diferentes por la elevada sensibilidad de la cepa uvrAa las lesiones en el DNA, debido a su vez a la deficiencia en el mecanismo de reparacin Uvr. Por
tanto, si se sometieran las 2 cepas a la misma dosis no se podran comparar los efectos entre las 2
cepas.
Para cada cepa y condicin de crecimiento se observa entre medidas una disminucin de un
orden de magnitud en el porcentaje de supervivencia. Pero hay que tener en cuenta que el tiempo
entre medidas para la cepa uvrA- es de 5 segundos, y para la cepa Wt son 30 segundos; 6 veces ms.
Para tiempo 30 segundos tenemos datos para las 2 cepas; comparando la supervivencia para
Wt-oscuridad y uvrA--oscuridad, hay una diferencia del orden de 104. Este dato representara la
reparacin de lesin en el DNA por la accin del mecanismo Uvr.
La comparacin de los valores de supervivencia entre los cultivos crecidos en luz y
oscuridad para cada cepa evidencian la accin del mecanismo de reparacin por fotoreactivacin. El
orden de reparacin de mutaciones para este mecanismo es alrededor de un orden de magnitud
(101), es decir, supondran alrededor del 10% de la reparacin del DNA en E. coli. La reparacin
por fotoreactivacin se observa mejor en la cepa uvrA-, porqu es el nico sistema que acta.

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El principal mecanismo de reparacin de lesin en el DNA en E. coli es el mecanismo Uvr,

que supone alrededor del 90% (104 105); mientras que la reparacin por fotoreactivacin supone el
sobre el 10% de las reparaciones (101).
Los datos de supervivencia se han representado en relacin a la dosis irradiada:
Grfica 2.1: Relacin entre porcentaje de supervivientes y dosis de radiacin UV.

* La representacin grfica se debera realizar enfrentando los valores de supervivencia con la

dosis de radiacin en J/m2. Como en nuestro caso desconocemos la potencia de la lmpara UV, se
ha estimado la dosis como tiempo de radiacin, asumiendo que la radiacin se ha mantenido
constante.
En la representacin grfica se puede observar que la relacin entre radiacin UV y nmero
de clulas viables responde a una ecuacin logartmica negativa. Esto evidencia que la mortalidad
aumenta exponencialmente con el nmero de mutaciones causadas por radiacin UV, ya que a
mayor tiempo de exposicin la probabilidad de que las clulas sufran varias mutacin es mayor.
La cepa GY753, deficiente en los sistemas de reparacin Uvr del DNA, presenta en general
una pendiente ms acusada que la cepa salvaje. Estos datos evidencian la accin sobre el DNA
daado de los mecanismos de correccin de daos Uvr. Mirando las representacin para cada cepa
se aprecia la una mayor supervivencia para las clulas crecidas en presencia de luz.

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Se han calculado los valores de pendiente para la zona inicial de la grfica.

Tabla 2.3: Valores pendiente inicial.
Valores pte inicial
wt
uvrA-

Luz

-1,637

Oscuridad

-3,14

Luz

-17,37

Oscuridad

-19,75

Los valores de pendiente inicial representan la mortalidad que supone los instantes iniciales
de radiacin. Estos valores no se pueden extrapolar para toda la lnea, ya que siguen una relacin
logartmica y no lineal. Sin embargo, los valores de pendiente iniciales muestran el factor de
mortalidad en los instantes iniciales. Con estos valores se puede suponer el porcentaje de
supervivencia para ambas cepas en los tiempos de radiacin tempranos al inici. En la tabla se
muestra un ejemplo a tiempo 1 y 5 segundos de dosis.
Tabla 2.4: Ejemplo, supervivencia a 1 y 5 segundos.
% supervivencia
dosis
wt
uvrA-

1 segundo

5 segundos

Luz

98,363

86,35

Oscuridad

96,86

84,25

Luz

82,67

13,15

Oscuridad

80,25

1,25

Para que los valores se ajusten a los reales se deberan realizar ms replicas y promediar los
valores obtenidos. En nuestro caso, disponemos de uno o dos datos para cada condicin, por tanto
nuestros valores tienen un error experimental asociado grande, en nuestra grfica los valores no se
ajusten bien a una logartmica. Por ejemplo, en la falta de datos para wt-luz a 30 segundos hace
disminuir la pendiente inicial.
Comparando con el resto de valores se ha estimado el valor de supervivencia para wt-luz a
30 segundos, para poder corregir la representacin grfica y la pendiente inicial. Este valor debera
estar sobre 17,7% (alrededor de un orden de magnitud mayor que la supervivencia para wt-luz a 60
segundos). Con la aproximacin de este dato, la pendiente inicial en la grfica para wt-luz cambia a

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-2,73; y los valores de supervivencia a 1 y 5 segundos son 97,27% y 86,35% respectivamente. En la

representacin grfica corregida se observa una mayor pendiente para los datos corregidos y un
mayor ajuste para las lneas de la cepa salvaje.
Grfica 2.2: Relacin entre % supervivencia y dosis irradiada corregida.

* En la tabla de supervivencia tambin faltaban datos para otros tiempos, no obstante estos
no se han tenido en cuenta porqu no intervienen en el valor de pendiente inicial.