VI Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniera

Habana 2005
ISBN 959-212-158-3, Copyright 2005, Sociedad Cubana de Bioingeniera, artculo T073


PRODUCCIN DE LA ENZIMA LACASA POR EL HONGO
Cladosporium cladosporioides EN PRESENCIA DE FENANTRENO

C. Chvez-Lpez, J. F. Esparza-Garca, Ma. E. Hidalgo-Lara, O. Loera-Corral, R. Rodrguez-Vzquez

Departamento de Biotecnologa y Bioingeniera, CINVESTAV-Zacatenco
Av. Instituto Politcnico Nacional 2508, Col. Zacatenco, Mxico D.F., C.P. 07360. Claudiurix_7@yahoo.com.mx




RESUMEN
El hongo deuteromiceto Cladosporium cladosporioides
tuvo la capacidad de producir la enzima lacasa
(EC:1.10.3.2, benzenodiol: oxgeno reductasa) en medio
lquido sin y con fenantreno (172 mg/l). ste hongo, sin
fenantreno, mostr una actividad enzimtica de lacasa
mxima a los 3.5 das de incubacin (1.01 U/g biomasa en
peso seco), y con fenantreno la mxima actividad fue al da
3 de incubacin (3.09 U/g biomasa en peso seco). La
presencia de fenantreno fue significativa (p>0.01) para la
actividad especfica de la enzima lacasa y present una
correlacin positiva (p>0.01), es decir la presencia del
fenantreno aument la actividad especfica de la enzima.
Hubo una remocin mxima de fenantreno de 54 % en el
da 4 de incubacin (de 172 a 125 mg/l), sin embargo
ninguna de las variables dependientes e independientes
tuvo un efecto significativo en la remocin del fenantreno
en el medio de cultivo.


Palabras clave: Cladosporium cladosporioides, lacasa,
fenantreno.

1. INTRODUCCIN
Los hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) se
encuentran en suelo, aire y agua; son de origen natural y
antropognico [1], Por sus efectos negativos a la salud
humana, la Environmental Protection Agency en Estados
Unidos de Norteamrica (EPA), ha considerado a 16 de
ellos de alta importancia, entre los que se encuentra el
fenantreno, ya que son txicos y/o cancergenos [2]. Los
hongos de la divisin basidiomicota (Pleurotus ostreatus,
Trametes versicolor, entre otros) pueden degradar tales
compuestos [3], [4]. Lo anterior se debe a su produccin de
enzimas ligninolticas, las cuales son extracelulares y poco
especficas [5]. Dentro de dichas enzimas se encuentra la
lacasa (EC:1.10.3.2, benzenodiol:oxgeno reductasa) quien
reduce el oxgeno molecular a agua [6]. Sin embargo
existen hongos deuteromicetos que pueden biotransformar
HAP, como Cladosporium cladosporioides, quien degrad
sustancias hmicas en agua y una de las enzimas que
estuvo involucrada fue la lacasa [7]. Una cepa de C.
cladosporioides encontrada en suelo de humedales,
contaminado con fluoranteno, fue inoculada en medio
lquido sinttico, y observaron que hubo una reduccin del
26% de antraceno (de 0.01 a 0.0023 g/l) y 78% de
fluorantreno (de 0.01 a 0.0078 g/l) [8]. En medio slido de
agar C. cladosporioides, aislado de suelo contaminado con
hidrocarburos, tuvo la capacidad de producir la enzima
lacasa [9], [10].
Existen pocos estudios sobre la intervencin de la
enzima lacasa en la degradacin de HAP por el hongo C.
cladosporioides, en medio lquido. El objetivo de ste
trabajo fue medir la actividad de la enzima lacasa producida
por C. cladosporioides, en presencia (172 mg/l) y ausencia
de fenantreno, en medio lquido.

2. METODOLOGA
Microorganismo: La cepa del hongo Cladosporium
cladosporioides pertenece al laboratorio de Xenobiticos
del Depto. de Biotecnologa y Bioingeniera,
CINVESTAV-Zacatenco, Ciudad de Mxico. Fue aislada
de suelo con hidrocarburos y bagacillo de caa. El hongo se
creci en medio slido agar-papa-dextrosa (DIFCO,
Mxico) a 28C por 6 das antes de ser transferido al medio
Wunder modificado.
Medio de cultivo: Composicin del medio lquido de
cultivo Wunder modificado para crecer el inculo: Glucosa
10.0 g/l, extracto de malta 1.0 g/l, NaNO
3
1.33 g/l, MgSO
4

7H
2
O 0.66 g/l, FeSO
4
0.013 g/l, CuSO
4
0.005 g/l, MnSO
4

0.667 g/l, CaCl
2
2H
2
O 0.1334 g/l, NaCl 0.1334 g/l,
K
2
HPO
4
0.1667 g/l, KH
2
PO
4
1.159 g/l. La composicin del
medio lquido de cultivo Wunder modificado para realizar
la cintica vari en la cantidad de glucosa (6 g/l) sin
embargo la composicin de macro y micro nutrientes es la
misma.
Qumico: Fenantreno Aldrich P11425-1006. Se
disolvi en acetona HPLC, cat. 010-4, Burdick & Jackson.
Condiciones de cultivo: 8 fragmentos (0.8mm ) del
hongo crecido en agar-papa-dextrosa se colocaron en
matraces Erlenmeyer de 250 ml con 80 ml de medio de
cultivo lquido Wunder modificado a 28C, 125 rpm
durante 4 das. Del hongo que creci se tomaron 0.4g en
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base hmeda y se agregaron a matraces Erlenmeyer de 125
ml con 40 ml de medio Wunder modificado, a 28C, 125
rpm durante 4 das. Se manejaron dos condiciones sin y con
200mg/l de fenantreno. A los matraces se les adicion el
fenantreno disuelto en acetona, y se dej que esta se
evaporara, antes de adicionar el medio de cultivo y el
inculo. Se manejaron controles negativos (sin inculo)
para las dos condiciones.
Filtracin y pH: La biomasa de cada matraz se separ por
filtracin con vaco. El medio filtrado (40 ml) se concentr
hasta obtener 5 ml del medio, se us un ultrafiltro Amicon
8050 con una membrana de 10 kDa a 55psi (3.9 kg/cm
2
) de
presin. El pH del medio de cultivo filtrado se midi en un
potencimetro Jenway 3020 pH Meter.
Actividad de la enzima lacasa (U/l): Para determinar la
actividad de la enzima lacasa, en un volumen de reaccin
de un mililitro, se agreg la muestra, 2,2azino-3-etil
benzatalino-6-sulfonato (ABTS) 1mM, y solucin
amortiguadora de acetato de sodio 0.1M, pH 5. Se ley a
420 nm en un espectrofotmetro Lambda 3A UV-VIS. El
coeficiente de extincin () fue de 36 000 l/mol cm [11].
Actividad especfica de la enzima lacasa (U/g): La
actividad especfica se calcul obteniendo el cociente de la
actividad enzimtica de la lacasa (U) y la biomasa en base
seca (g) [12].
Azcares reductores: Para determinar los azcares
reductores del medio se utiliz 1 ml de muestra y 3 ml de
reactivo c. 3,5 dinitrosaliclico (DNS), se colocaron en
bao mara por 5 min. Despus de enfriarse se les
agregaron 16 ml de agua destilada. Se ley a 550 nm en un
espectrofotmetro Lambda 3A UV-VIS [13].
Fenantreno residual: A un matraz de separacin se le
agregaron 40 ml del medio de cultivo filtrado y 30 ml de
diclorometano HPLC (Burdick & Jackson), agitndose por
3 min purgando 5 veces. El embudo se dej reposar para
que se separaran las fases, y se recuper la fase inferior en
un frasco mbar de 60 ml. Lo anterior se repiti 3 veces. A
los extractos se les evapor el diclorometano, el precipitado
fue resuspendido en 10 ml de acetona HPLC, y se filtr con
membrana de nylon Gl de 0.2 m. El fenantreno se
cuantific por Cromatografa de Lquidos de Alta
Resolucin (HPLC) marca Varian 9050 con una columna
Waters Spherisorb S5ODS2 4.6 250 mm Analytical
Cartridge Part No. PSS 839540, utilizando como fases
acetonitrilo:agua (75:25), con una velocidad de flujo de 1.0
mL/min, a 254 nm.

Anlisis estadstico: Los resultados se analizaron
empleando un programa de anlisis estadstico Disegn
Expert 6.06.

3. RESULTADOS
3.1 Produccin de biomasa
La biomasa del hongo creci en forma de pellets, siendo
ms grandes sin fenantreno (7-9 mm ) y ms pequeos
con fenantreno (3-5 mm ). El tiempo de incubacin tuvo
un efecto altamente significativo en la produccin de la
biomasa de C. cladosporioides (p>0.01) y una correlacin
positiva (p>0.01), lo cual nos indica que al aumentar el
tiempo de incubacin la produccin de la biomasa se
comporta de igual manera. La concentracin de fenantreno
present un efecto significativo (p<0.01) figura 1.














Figura 1 Produccin de biomasa del hongo C. cladosporioides en
presencia y ausencia de fenantreno durante el tiempo de incubacin

El incremento en la produccin de biomasa provoc que la
concentracin de azcares del medio de cultivo
disminuyera, ya que stas dos variables se correlacionaron
negativamente (p>0.01) (figura 2).













Figura 2 Produccin de biomasa del hongo C. cladosporioides y
concentracin de azcares reductores en el medio de cultivo, en ausencia y
presencia de fenantreno

3.2 pH
En el pH del medio de cultivo el tiempo de incubacin tuvo
un efecto altamente significativo (p>0.01), y una
correlacin positiva (p>0.001) ya que al aumentar el tiempo
de incubacin el pH del medio se comport de la misma
manera, figura 3. El pH del medio de cultivo se
correlacion negativamente (p>0.01) con la concentracin
de azcares en el medio, es decir al aumentar el pH del
medio la concentracin de azcares del medio disminuy.






0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
Tiempo de incubacin (das)
B
i
o
m
a
s
a

(
g
/
l
)
0 mg/l fenantreno
200 mg/l fenantreno 172
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
0.0 1.0 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
Tiempo de incubacin (das)
B
i
o
m
a
s
a

(
g
/
l
)
0
1
2
3
4
5
6
7
A
z

c
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c
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s

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n

e
l

e
m
d
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o

(
g
/
l
)
0 mg/l
fenantreno
200 mg/l
fenantreno
Azcares
sin
fenantreno
Azcares
con 200
mg/l
fenantreno
172
172
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Figura 3 Cambio de pH en el medio de cultivo durante la cintica, en
ausencia y presencia de fenantreno

3.3 Actividad especfica de la enzima lacasa
El hongo C. cladosporioides tuvo una produccin basal
mxima de la enzima lacasa a los 3.5 das (1.01 U/g
biomasa en peso seco). La presencia de fenantreno (172
mg/l) fue significativa (p>0.01) para la actividad especfica
de la enzima lacasa y present una correlacin positiva
(p>0.01), es decir que a 172 mg/l de fenantreno hubo un
aumento en la actividad especfica de la enzima. Lo anterior
nos muestra que la presencia de fenantreno indujo la
produccin de la lacasa, figura 4. La composicin del
medio lquido Wunder modificado que se emple tiene los
macronutrientes, micronutrientes y glucosa necesarios para
el crecimiento del hongo, descartando que en el medio haya
algn compuesto exgeno a parte del fenantreno que
pudiera estar aumentando la actividad de la lacasa. Los
valores de la actividad especfica de la lacasa (3.09 U/g
biomasa en peso seco) para este hongo son muy bajos
comparado al reportado para el hongo Trametes versicolor
(28.7 U/g de biomasa en peso seco) [12], sto se debe a que
en el medio de cultivo le agregaron paja de trigo el cual
sirve como inductor de las enzimas ligninolticas como la
lacasa.
















Figura 4. Actividad especfica de la enzima lacasa, en ausencia y presencia
de fenantreno
El tiempo de incubacin present una correlacin positiva
(p>0.01) con la actividad especfica de dicha enzima, al
incrementarse el tiempo de incubacin la actividad
especfica aument, figura 4.

3.4 Fenantreno
El fenantreno residual del medio de cultivo durante el
tiempo de incubacin se muestra en la figura 5. Despus de
realizar el anlisis de varianza y correlacin de variables a
los datos, se observ que ninguna de las variables tuvo un
efecto en la disminucin del fenantreno en el medio de
cultivo. Se parti de una concentracin de 172 mg/l de
fenantreno para el da cero, y se calcul la remocin para el
da 4 de incubacin (125 mg/l), la cual fue de 54 %. Es la
primera vez que se reporta la remocin de fenantreno por
C. cladosporioides aunque se sabe que dicho hongo puede
remover otros HAP en medio lquido sinttico siendo del
26% para antraceno (de 0.01 a 0.0023 g/l) y del 78% para
el fluorantreno (de 0.01 a 0.0078 g/l) [8].














Figura 5. Fenantreno residual en el medio de cultivo

Aunque hubo una mayor actividad de la enzima lacasa
en presencia de fenantreno (172 mg/l) no se obtuvo alguna
correlacin directa con la remocin del fenantreno en el
medio lquido. Lo anterior se ha observado en Pleurotus
ostreatus [5] y en T. versicolor, para ste hongo la
remocin de HAP, como el fenantreno, la lacasa est
involucrada de manera indirecta ya que existe un sistema
mediador para la lacasa (LMS). Los LMS pueden ser
compuestos secretados por los hongos como el c. 3-
hidroxiantranilico (Pycnoporus cinnabarinus), tirosina o
sus derivados [14].

4. CONCLUSIONES
El hongo deuteromiceto C. cladosporioides tiene una
produccin basal de la enzima lacasa en medio lquido
Wunder modificado (1.01 U/g base seca). La presencia de
172 mg/l de fenantreno en medio lquido Wunder
modificado provoc una mayor actividad especfica de la
enzima lacasa (3.01 U/g base seca). Hubo una remocin del
54% para el fenantreno en el medio de cultivo (de 172 mg/l
a 125 mg/l). No hubo una correlacin entre la actividad de
la enzima lacasa y la remocin del fenantreno en el medio
de cultivo.

0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
Tiempo de incubacin (das)
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)
0 mg/l fenantreno
200 mg/l fenantreno

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0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Tiempo de incubacin (das)
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0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
Tiempo de incubacin (das)
p
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Sin fenantreno
200 mg/l fenantreno 172
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AGRADECIMIENTOS
Agradezco todos los comentarios de la M. en C. Aura
Marina Pedroza de la Universidad Pontificia Javeriana de
Colombia.
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