11. CENTRIFUGACIÓN > 11.

1 FUNDAMENTOS DE LA TÉCNICA

El mejor método para separar un sólido insoluble de un líquido es la filtración. También se

puede utilizar la técnica de decantación si el sólido se deposita fácilmente por gravedad en el
fondo del recipiente (sedimentación), o si permanece en la superficie del líquido (flotación).
Un sólido sedimenta o flota dependiendo de su densidad respecto a la del líquido.

En otras palabras, el sólido experimenta una fuerza ascendente debida al empuje que el
líquido ejerce sobre éste, cuya magnitud es igual a la del peso del líquido desplazado por el
sólido (principio de Arquímedes). El sólido sedimentará si esta fuerza es inferior a la fuerza
que la gravedad ejerce sobre el sólido; en caso contrario, flotará. Si las partículas son muy
pequeñas, los procesos de sedimentación o flotación pueden ser extremadamente lentos
debido, por un lado, a la resistencia al avance de las partículas provocada por la fricción que
se establece entre éstas y las del líquido, y, por otro, a los movimientos aleatorios de las
partículas inducidos por las turbulencias térmicas que se generan en el seno del líquido
(difusión). En estos casos, hay que recurrir a la centrifugación para separarlas.

La centrifugación es una técnica de separación que se utiliza para aislar o concentrar

partículas suspendidas en un líquido aprovechando la diferente velocidad de desplazamiento
según su forma, tamaño o peso al ser sometidas a una fuerza centrífuga. La fuerza
centrífuga es la que se ejerce sobre un cuerpo cuando éste gira alrededor de un eje. Esta
fuerza, cuya magnitud es directamente proporcional a la masa del cuerpo, el radio de giro y
la velocidad de giro (o angular), es perpendicular al eje y tiende a alejar el cuerpo del
mismo. La fuerza centrífuga puede acelerar el proceso de sedimentación de partículas que
tienen tendencia a hacerlo espontáneamente (densidad superior a la del líquido), o provocar
este proceso en aquellas que tienden a flotar (densidad inferior a la del líquido). En este
sentido, la tecnología actual permite llegar a fuerzas de centenares de miles de veces la
fuerza de la gravedad (‘1g’ es aproximadamente la fuerza centrífuga generada por un rotor
de 25 cm de radio girando a una revolución por Segundo).

11. CENTRIFUGACIÓN > 11.2 TIPOS

La centrifugación se puede llevar a cabo a escala preparativa o escala analítica. La primera

se utiliza para aislar partículas y la segunda permite determinar propiedades físicas como la
velocidad de sedimentación o el peso molecular.

Las partículas se pueden separar en función de la velocidad de sedimentación (centrifugación

diferencial), la masa (centrifugación zonal) o la densidad (centrifugación isopícnica). La
centrifugación zonal y la centrifugación isopícnica constituyen ejemplos de centrifugación
mediante un gradiente de densidades.

Hay diferentes tipos de centrífugas según el rango de velocidades de giro:

A. Centrífugas de baja velocidad, de sobremesa o clínicas. De pequeño tamaño y

sin refrigeración. Alcanzan una velocidad máxima de 5000 rpm. Útiles para la
separación de partículas grandes como células o precipitados de sales insolubles.

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Las centrífugas micrófugas son una variante de las anteriores que permiten llegar a
velocidades de más de 10.000 rpm, siendo los volúmenes de trabajo muy pequeños.
Son útiles en el campo de la biología molecular.

B. Centrífugas de alta velocidad. Alcanzan velocidades de entre 18.000 y 25.000

rpm. Son refrigeradas y algunas tienen sistema de vacío para evitar el calentamiento
del rotor a causa del rozamiento con el aire. Son útiles en la separación de fracciones
celulares, pero insuficientes para la separación de ribosomas, virus o
macromoléculas en general.

C. Ultracentrífugas. Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares
de refrigeración i de alto vacío. Hay ultracentrífugas analíticas que permiten la
obtención de datos precisos de propiedades de sedimentación (coeficientes de

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 sedimentación, pesos moleculares), y preparativas, útiles para aislar partículas de
bajo coeficiente de sedimentación (microsomas, virus, macromoléculas).

11.2.1 Centrifugación diferencial

Es el proceso que tiene como resultado la obtención de un sobrenadante y un material

sedimentado.

11.2.2 Centrifugación mediante un gradiente de densidades:

Este tipo de centrifugación es un proceso mediante el cual las partículas se distribuyen en

fracciones de diferentes densidades de un fluido líquido. El método es un poco más elaborado
que la centrifugación diferencial, no obstante presenta ventajas que compensan el trabajo
añadido. La técnica permite la separación de varios o todos los componentes de la muestra y
la realización de medidas analíticas. El método de gradiente de densidades implica la
utilización de un soporte fluido cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El
gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular, de tal manera
que la muestra a analizar pueda ser suspendida en la solución resultante. Como solutos se
utilizan la sacarosa, polisacáridos sintéticos, derivados yodados del ácido benzoico, o sales
de metales alcalinos pesados como el rubidio o el cesio, entre otros. La muestra se deposita
en la parte superior del gradiente como una fina banda y, tras centrifugar, la separación de
los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas que pueden ser
separadas (o fraccionadas).

Hay dos variantes de este método, la centrifugación zonal y la centrifugación isopícnica:

11.2.2.1 Centrifugación zonal

En la centrifugación zonal la muestra a analizar se deposita en la parte superior de un

gradiente de densidades previamente formado. A causa de la fuerza centrífuga las partículas
se mueven a velocidades que dependen de la masa y sedimentan en diferentes zonas del
gradiente. La densidad máxima del gradiente no ha de exceder a la de las partículas a
separar.

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11.2.2.2 Centrifugación isopícnica

La centrifugación isopícnica separa les partículas en un gradiente de densidades en función

de la densidad de las mismas. Las partículas se mueven en el gradiente hasta que llegan a
un punto donde la densidad de éstas i la del gradiente son idénticas (de aquí el nombre de
‘isopícnico’). En este caso, es condición fundamental que la densidad máxima del gradiente
final ha de exceder siempre a la densidad de las partículas. Por este motivo la sedimentación
final no se produce si se controlan las condiciones de centrifugación, ya que las partículas
flotan sobre un "colchón" de material que posee una densidad superior a la de éstas. Esta
técnica se utiliza, por ejemplo, para separar partículas similares en tamaño pero de diferente
densidad. En este sentido, la centrifugación isopícnica es un método adecuado para separar
ácidos nucleicos o diferentes orgánulos celulares.

11. CENTRIFUGACIÓN > 11.3 APLICACIÓN

La centrifugación se utiliza para separar partículas en suspensión en el seno de un líquido o

partículas en disolución, siendo éste el caso donde se encuentran más aplicaciones. Así, se
utiliza habitualmente en biología ya que permite separar células, orgánulos subcelulares o
macromoléculas.

11. CENTRIFUGACIÓN > 11.4 UTILLAJE / MATERIAL

Independientemente del tipo de centrifugación que se vaya a utilizar, el elemento básico

necesario es la centrífuga. Una centrífuga consta de un motor, un rotor adaptado
especialmente para poner tubos de muestra y un compartimento donde está alojado el
motor para aislarlo del exterior. Cuando la velocidad de giro es muy elevada, este
compartimento es totalmente estanco y se refrigera para poder trabajar al vacío y evitar el
calentamiento del rotor. Por otro lado, este recinto suele estar blindado para evitar
accidentes en caso de rotura del rotor

11. CENTRIFUGACIÓN > 11.5 MONTAJE

Sólo se requiere que la centrífuga esté sobre una base sólida exenta de vibraciones y en un
espacio suficientemente amplio para que pueda ser manipulada sin problemas.

11. CENTRIFUGACIÓN > 11.6 PROCEDIMIENTO

a) Colocar el tubo de muestra (suspensión o disolución) en uno de los receptáculos del

rotor.

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 b) Compensar el tubo de muestra colocando en el receptáculo diametralmente opuesto
otro tubo con un volumen de líquido de peso idéntico al de la muestra.

c) Cerrar herméticamente el compartimento del rotor y poner en funcionamiento la

centrífuga. Una vez acabada la centrifugación (normalmente las centrífugas tienen
un temporizador que desconecta automáticamente el motor una vez transcurrido el
tiempo programado), esperar a que se detenga el rotor para abrir la tapa del
compartimento donde está alojado y sacar el tubo de muestra y el de compensación.

11. CENTRIFUGACIÓN > 11.7 RIESGOS Y NORMAS DE SEGURIDAD

 La centrífuga ha de estar sobre una base sólida y fija.

 El rotor ha de ser compatible con la centrífuga que se quiere utilizar y ha de estar

perfectamente fijado al motor.

 La distribución de los tubos en el rotor ha de ser tal que éste esté perfectamente
equilibrado (compensado) para evitar vibraciones durante el giro y, por lo tanto, su rotura.
Si es necesario, se utilizan tubos adicionales con volúmenes de líquido de pesos idénticos a
los de las muestras.

 Los tubos han de ser compatibles con la centrífuga para evitar roturas durante el
funcionamiento de la misma.

 La tapa que aísla el rotor del exterior ha de estar bien cerrada y asegurada.

 Nunca se ha de dejar la centrífuga sin atención hasta llegar a la velocidad máxima de

giro.

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