Oecologia aquatica, 5: 7-1 9.

1 981
El problema de la determi naci n de clorofila a en
el fi tomicrobentos: di scusi n sobre
la metodol oga
MANUEL VARELA
Instituto Espaol de Oceanografa. Muelle de Animas s/n. Aptdo. I3O. La Corua
INTRODUCCiN
Est demostrado que l os productos
de degradacin de la clorofi la represen
tan en el bentos una fraccin importante
del total de pigmentos verdes presentes .
Estas formas degradadas o inactivas ab
sorben luz en la parte roja del espectro
y esta abso.cin no es di stinguible de
la de l as formas activas . Las tcnicas
empleadas para la determinacin de pig
mentos deben por tanto tener en cuenta
esta c ircunstancia, porque de lo contra
rio los resul tados obtenidos seran poco
fiables .
El esquema de l a degradacin de
la clorofi la-a es el s iguiente ( YENTSCH ,
1 967 ) :
-Mg - r.o1
_
reor:t.oa-
_
c:oror.:a-_ Feof6rbido- .
c:oror.:.da-a
-r.o: -
Mg
La prdida del ncleo magnsico
y de la cadena fitol degrada la clorofi-
* \ \ 00 t

11Z00 c0n !0n008

del programa cooperativo hispao-americano "IN
VESTIGACIONES BIOLOGICAS DE LAS RIAS DE GALI-
CIA". n de proyecto OUZU.
l a-a a feofrbido-a, a travs de la
feofi tina-a o de la clorofi l i da-a , segn
el esquema sealado .
La clorofi lida y sus formas oxida
das presentan un espectro de absorcin
idntico al de la clorofila-a y , por
tanto , en los anl isis espectrofotom
tricos estas clorofilas degradadas se
valorarn como clorofi la activa . Por
otra parte , feofitina y feofrbido ( feo
pigmentos ) presentan un espectro l igera
mente diferente al de la cl orofi la acti
va . La absorcin en la parte roj a del
espectro se desplaza de 665 a 667 nm
y decrece aproximadamente en un 50 %
( fig. 1 ) . Sin embargo , esta diferencia
es tan escasa que no permite una clara
distincin entre los pigmentos , y por
tanto los feopigmentos pueden interferir
seriamente l as determinac iones especto
fotomtricas de clorofi la-a , ya que es
tos productos se incluirn como s i casi
la mi tad de la correspondiente cantidad
de clorofi la estuviese presente .
La clorofila-a puede ser transfor
mada en feofitina-a y l a cl orofilida
en feofrbido , acidificando los extrac
tos de pigmentos con cidos minerales
diluidos . Partiendo de esta base , se
8
han desarrollado procedimientos espec
trofotomtricos con los factores de co-
rreccin adecuados para permitir discri
minar entre clorofila-a (incluyendo clo
rofilida y formas oxidadas) y feopigmen
tos (suma de feofitina y feofrbido)
(LORENZEN , 1 967; TETT et al. , 1975).
La cantidad de pigmentos puede as obte-
nerse indirectamente de la relacin en-
tre las absorbancias antes y despus
de la acidificacin . Esta relacin puede
variar desde un mnimo de 1 , en el caso
de la existencia exc lusiva de feopigmen
tos , hasta un valor mximo si stos se
encuentran ausentes.
ELECCIN DEL SOLVENTE
Los criterios a tener en cuenta
para la eleccin de un sol vente estn
basados en la capacidad extractora , por
600 650
LONGITUD DE ONDA
700
|1g l. ESpeCIDOS de BOSODC1n de un exIDBCIO
de BCeIOnB B1 JUU % pDOCedenIe de1 B1gB veDde
SCenedeS0uS d10ODphuS IDBIBdO COn d1eDenIeS
MANUEL VARELA
TBDlB 1 - L1C1enC1B del 0e1BnOl BOBOJU1O y
de B BCeIOnB BJ BO % en JB eXIDBCC1n de C1O
DO1JB-B en d1BIO0eBS y C1BnOCeBS (de H0LN-
-HAYSLY & R1LMAXY, lBU;
URUP0 T)LMP0 (h
j ,
g `]0R0|41A-B/MUL
TRA
TA/0YDM1`0 L/TRA``JDY A`LTDYA BO" MLTAY0[
D1BIO0eBS 34Z_04 3U U
bJ_OU
lZ 3Z_U
ZU 3,U_0,
`1BnOCeBS ZU,_U,Z 341 U4
ZB4_U4
lZ ZB,U_UU
ZO 3U,0g0
un lado , y la estabilidad de los pigmen
tos en l durante los procesos de ex
traccin y acidificacin , por otro .
CAPACIDAD DE EXTRACCION
Los solventes ms ampliamente uti
lizados son , tanto en oceanografa como
en limnologa , el metanol absoluto y
la acetona al 90 . Como extractor , el
metanol es mucho ms rpido y eficaz
que la acetona , como puede verse en la
tabla r. Al cabo de una hora , la extrac
cin fue completa en metanol , pero in
completa en el caso de la acetona. Des-
pus de 20 h las muestras de diatomeas
se aproximan al 100 de extraccin ,
mientras que en cianofceas son slo
un 88 comparadas con las muestras de
metanol . Sin embargo , si l as muestras
son trituradas y extradas durante unas
COnCenIFBC1OnS de `1H (M0LD & H(]]LR(L[[ pocas horas , los resultados son compara-
JBU,.
Fig. l. Abso:tior. spectra of 100 % acetone ex-ract
of the green alga Scenedesmus dimorphus, treated
wi th successi vely increasing molari ty of C1H
(MOEr & HALLEGRAEFF, 1978).
bIes en ambos solventes . Por tanto ,
cuando se emplea acetona, s i se desea
una extraccin completa , l as muestras
deben triturarse o bien extraerse duran-
DETERMI NACI N DE CLOROFI LA a EN EL FI TOMI CROBENTOS 9
te al menos 24 h , aunque en es te caso
la extraccin no sea completa en algunos
grupos , especialmente clorofceas y c ia
nofceas . Como se comprobar posterior
mente , la acetona presenta durante los
procesos de acidificacin numerosas ven
taj as comparada con el metanol , haciendo
que su uso sea preferible al de ste .
Adems , dado que las diatomeas constitu
yen en general el grupo ms abundante
del fitomicrobentos , el empleo de aceto
na no conduce a grandes subestimaciones
de la cantidad de clorofi la . I ncluso
en el caso de la presencia de organi smos
en los que la extraccin sea incompleta
con acetona , puede incrementarse la efi
cacia de sta, hasta el nivel de la del
metanol , util izando una mezcla de dime
tilsulfxido ( DMSO ) y acetona a partes
iguales ( V/v ) ( tabla IJ}. Por otra par
te , el DMSO ro modifica el espectro de
absorcin de I.. clorofi la-a .
ESTABILIDAD DE LOS PIGMENTOS
EN DISTINTOS SOLVENTES
Como ya se ha sealado , el cambio
en la absorbancia de una soluc in de
pigmentos despus de la acidificacin ,
es la base de los mtodos espectrofoto
mtricos para la estimacin de clorofi la
en presencia de feofi tina. Los mtodos
estn basados en la suposicin de que
el coeficiente de absorcin de la feofi-
tina, prximo a 665 nm , no vara con
la acidi ficacin . Esta supos ic in es
s in embargo incorrecta, y el coefici ente
de absorc in puede vari ar ampl iamente
dependi endo del tipo de solvente , su
contenido en agua y la molaridad del
cido en el extracto y por tanto del
pH .
La figura 1 muestra claramente la
influencia en el espectro de distintas
concentraciones de cido . Si la molari-
dad final del c ido se mantiene por de
baj o de ci ertos valores , la degradacin
de la clorofi la-a a feofitina-a provoca
el desplazami ento del mximo de absor
cin , en la parte roj a del espectro ,
de 665 a 667 nm . Un incremento en la
concentracin de cido origina un corri
miento del mximo a 657 nm . Por la ob-
servac in de la figura , resulta evidente
que la apl icacin de baj as concentracio
nes de cido , j unto con cortos ti empos
de reaccin , es insuficiente para asegu
rar la conversin de toda la clorofi la
Tabla II - Comparacin de la eficacia extracto
ra de acetona al 90 % Y dimetilsulfxido ( DMSO
+ acetona 90 %, v/v) ( de SHOAF & LIUM , 1976 ) .
mg/l
GRUPO TAXONOMICO EXTRACTOR CLOROFILA-a
Diatomeas
Nitzschia sp . DMO 1 , 32
Acetona 1 , 31
Clclotella sp . DMSO 0 , 86
Acetona 0 , 86
C1orofceas
Chlorella prenoidosa DMSO 2 , 66
Acetona 0 , 64
Selenastrum caEricornutum DMSO 1 , 18
Acetona 0 , 02
Ankistrodesmus braunii DMSO 1 , 05
Acetona 0 , 21
Ciaofceas
Anaclstis nidulans DMSO 0 , 40
Acetona 0 , 40
Anabaena flos-aquae DMSO 2 , 45
Acetona 2 , 45
Fremlella diplosiphon DMSO 3 , 28
Acetona 3 , 16
!0
presente en feofi tina , y en este caso
se obtendran valores de feofi tina muy
elevados , y valores de la relacin entre
las absorbancias antes y despus de la
ac idificac in (R) muy baj os . De otro
lado , una fuerte ac idificacin hace que
el pi co de absorcin se desplace de 667
a 657 nm. Esto se debe ( USACHEVA , 1 971 )
a .a exi stenc ia de un equi l ibrio , depen
di el,te del pH, entre la forma neutra
de l a feofitina, su monocatin y su di
catin. La aparicin del pi co de absor
ci n a 7 nm sera indi cativa de la
formac in de dicationes de feofitina-
a . En aquell os casos en que estas trans
formac iones no hayan sido detectadas ,
es to llevara a 1& obtenc in de valores
de feopigmentos muy baj os , i ncluso nega
t ivos , y valores de n al ts. Una concen
trac in de c ido elevada puede incluso
<
L
2
<

0
C
v

<
,
''' -

o"
4U
..., ......
UU U
LLNLl1O OE NO^
MANUEl VARELA
l lega a incrementar de forma consi dera
ble la absorcin de fondo , uti lizada.
para corregir la turbidez de la solu
cin , introduc iendo de e sta forma nuevos
errores en el clculo de pi gmentos . Este
incremento de la absorcin a 760 nm se
debe a la escisin de la fucoxantina
en productos de tipo furano ( fig . 2).
El empteo de metanol como solvente
presenta prob lemas semejantes al de la
acetona , con desplazami entos de los m
ximos de absorcin hac ia l ongitudes de
onda menores de la esperada ( fi g. 3 ) .
Esta reaccin es mucho ms rp ida
en metanol acuoso que en acetona acuosa .
La tran
.
sformacin de monoca "iones de
feofitina en sus respectivos dicationes
ti ene lugar a un pH < 2 en me tanol acuo
so y slo a pH < 0, 6en acetona acuosa .
Este desplazamiento del espectro es com-
FucOxD!1D
UU U 7UO
Fi g. 2 . Espectros de absorcin de la fucoxant ina antes (- ) y despus (---) de ser acidi ficado
el extracto lJUU % de acetona) hasta una molaridad final de ClH de 4, 4XlO
-2
M (MOED & HALLEGRAEFY,
\9701
Fig. 2. Absortion spectra of fucoxantin befare ( -) and after (----) acidification with Clli. Final molar"ity
of the acid. 4. 4XIO
-2
M (MOED & IIIL['F.CRAEF"F. 1978).
o

z
"
m
a
O

"
DFTERMI NACI 6N DE CLOROFILA ' EN EL FITOMICROBENTOS
!1
anles acidificar
_ (664)
presente formacin de dicationes . HOLM
-HANSEN & RIEMANN ( 1978 ) aconsejan e l
empleo d e 25 mg d e C0
3
Mg por ml d e ex
tracto , para una concentrac in final
de c ido 3x10
-3
M, con un tiempo de reac
cin de 10 minutos y agitac in suave .
MEDIDAS DEL pH ANTES Y DESPUS
DE LA ACIDI FICACIN
MOED & HALLEGHAEFF ( 1978 ) han l l e-
600 650
LONGITUD DE ONDA (nml
vado a cabo un completo estudia acerca
700
de la influencia del pH del extracto
en la absorbancia de los pigmentos , que
Fig. 3 . Espectros
'
de absorcin de pigmentos
extrados en metaol de un cultivo de Dunalie
lla tertiolecta ( HOLM-HANSEN & RIEMNN , 1978 ) .
Fig. 3 . Absortion spectra _f pigments extracted
in methaol from a culture of Dunaliella tertiolecta
(HOLM-HANSEN & RIEMANN, 1978).
pletamente revers ible mediante neutral i
zacin con CI
3
Mg , lo cual indica la
exi stencia de un cambio fsico ms que
de uno qumico de transformacin en feo
frbido .
Estos cambios espectrales de l a
feofi tina en relac in con e l pH , han
si do sealados para metanol al 80 , 90 ,
95 y 100 % ( LIVINGSTONE et al . , 1 93 ;
MARKER , 1 972 ) y 100 % de acetona ( MOED
& HALLEGRAEFF , 1978 ) , y no fueron de-
tectados en acetona al 80 , 90 y 95 %.
Esto e s debido a que e n acetona acuosa
es necesario alcanzar un pH tan baj o
como 0 , 5 para que comience la formacin
de dicationes de feofitina , mientras
que en metanol acuoso esta transforma
c in tiene lugar ya a un pH de 2 . Por
tanto , cuando se emplee el metanol como
66 espu s de la acidi ficac in
es necesario neutral izar el extracto
hasta un nivel de pH en el cual no se
permite expl i car de forma cl ara numero
sos problemas que plantea la acidi fica
c in , en un intento de caracterizar l as
condiciones ptimas de l a misma en rela
c in con l a molari dad final del cido .
En este sentido , l a determinac in del
pH en los extractos parece ser un crite
rio ms adecuado que el clculo de la
molaridad del cido puesto que aqul
no depende nicamente de l a cantidad
de cido aadido s ino tambin del con-
tenido en agua del sol vente . De todas
formas l as medidaS de pH en solventes
acuosos orgnicos deberan ser interpre
tadas con grandes precauc iones , ya que
el concepto de pH ha si do definido ni
camente en relacin con el agua como
solvente .
La adicin de in

luso pequeas can

tidades de CIH di luido a sol Ventes org
nicos con un bajo contenido en agua
( " 5 %) hace descender el pH , en slo
un minuto , a val ores comprendidos entre
0 , 5 y 2 , 0 ; mi entras que la misma canti
dad de cido en solventes con un mayor
contenido en agua ( 10-20 % ) , da 1 ugar
a valores de pH que osci lan entre 2 , 5
y 3 , dependi endo de la natural eza del
solvente ( fi g. 4). El consumo de cido
12
es , pues , mayor cuanto mayor sea l a can-
tidad de agua , y es superior en metanol
que en acetona para la misma cantidad
de agua. En so luciones acuosas de meta
nol y acetona la completa degradacin
de c l orofila en feofi tina tiene lugar
a un pH comprendido entre 2 , 6 y 2 , 8 .
L a rotura d e l a fucoxantina e n furanos
y e l incremento subsiguiente de la ab
sorcin a 750 nm es dependiente del
tiempo y comienza a un pH 2-2,G, veri-
6
4
3
5
10 15
n' gotas
Metanol
095 '
80 '
10 15
n' gotas
Fig. 4. Variacin del pH en relacin con la
cantidad de cido ( CIH 0.4 M ) aadido a 25 mI
de diferentes extractos de acetona y metanol
con distintas, concantraciones de agua ( MOED
& HALLEGRAEFF. 1978 ) .
Fig. 4. Effect of the addition of an increasing
amount of acid (0,4 C1H) 0: the pH of extracts
(2' r1 ) of acetone ano methanol wi th different
water conten's (MOEO & HALLEGRAEFF, 1978).
MANUEL VARELA
ficndose de forma muy lenta y siendo
mucho ms rpida a un pH comprendido,
entre l y l,G.
Dado que el pH final del extracto
no es nicamente funcin de la molaridad
del cido sino del contenido en agua
del mismo. los clculos del pH del ex
tracto. a partir de l a c oncentracin
del cido en'el mismo, no corresponden
al valor real. Por esta razn. aun cuan
do tericamente' una concentracin de
cido en e I extracto entre 2 y 3xl0-
3
dara e l rango de pH sealado como id
neo ( 2,6-2.8 ) , en la prctica esto no
es cierto. La figura 4 representa la
disminucin del pH en relacin con la
cantidad de cido aadido a distintos
solventes con diferentes concentraciones
de agua. A partir de la misma se puede
deducir el volumen de cido a aadir
a distintos volmenes de extracto . Mu-
chos autores acidifican directamente
en la cubeta del espectrofotmetro aun
que sera preferible utilizar extractos
de mayor volumen con objeto de poder
aadir cantidades exactas de cido . Ade
ms. dado que numerosos investigadores
usan acetona, metanol e incluso etanol
con variadas concentraciones de agua.
sera conveniente que. en cada c aso ,
se establ eciese el volumen de cido re-
querido para al canzar el pH sealado:
2.6-2.8 .
CLCULO DE LA CONCENTRACI N
DE PIGMENTOS
Una vez obtenidos los extractos
en acetona del 90 , l as l ecturas se
realizan en e l especrofotmetro a 665
nm, antes y despus de l a acidificacin
con CIH , corregidas por la l ectura a
DETERMI NACI N DE CLOROFILA a EN EL FITOMI CROBENTOS
13
750 nm y con l as precauciones anterior
mente sealadas en relacin con la can-
tidad de c ido aadido.
El clculo de la concentracin de
clorofi la-a se obtiene a partir de las
siguientes ecuaciones ( LOSNZEN , 1967):
Clorofila'a (mg/m
2
) AxKx(6650-665a)xvxl0
LxS
Feofitina a (mg/m
2
)= AxKx(Rx665a-6650)xvxl0
LxS
( A , coeficiente de absorc in d l a c lo
rofi la a = 1 1 , 0; ,K , factor para igual ar
la reduccin en la absorbancia a la con
centracin inicial de c lorofila = 2 , 43;
6650 , absorbancia antes de la acidi fica
cin , corregida; 665a , absorbancia des
pus de la acidificacin , corregida;
v , volumen de extracto acetnico en mi;
10 , factor de conversin a m
2
; L , longi
tud de paso d' l a cubeta en cm; S , su
perficie de la muestra , en :m
2
; R , mxi
ma relacin de 6650/665a en ausencia
de feopigmentos = 1,7).
LIMITACIONES DE LOS MTODOS
NORMALMENTE UTILIZADOS
Los mtodos espectrofotomtricos
empl eados para la determinacin de pig
mentos , tal como e l descrito anterior
mente ( LORENZEN , 1967) u otros similares
( HOLM-HANSEN & R IEMANN , 1978; T ETT e t
al., 1975), as como los de fluorescen
cia ( YENTSCH & MENZEL , 1 963; HOLM
-HANSEN et al . , 1965 ) , proporcionan es
timaciones poco vl idas ya que la medida
de clorofi la-a corresponde a l a suma
e clorofi la-a y cl orofi l ida-a y la de
feofi tina-a a la suma de feofi tina-a
y feofrbido-a . Esto supone un serio
inconveniente , especialmente en muestras
bentnicas , en donde estos productos
de degradacin pueden representar un
elevado porcentaj e de la cantidad total
de pigmentos . Por otra parte , si la clo
rofi la-b est presente , se obti ene un
valor de feofi tina-a muy al to , ya que
el espectro de absorcin de la feofi tina
-a y de la feofitina-b en los extractos
acidificados

s muy semejante ( fig. 5 ) .

J EFFREY (1974) comenta estas l imitac io-
nes y seala que cualquier mtodo que
no impl ique la separac in fsica de los
pigmentos porporciona resul tados poco
precisos y est comprometido por la pre
sencia de productos de degradacin nue
vos , resul tantes de la acidificacin
de l as muestras . Este autor propone la
uti l i zacin de tcni cas de cromatograf a
en capa fina , l as cuales permi ten la
separacin de l as formas principales
de clorofi la ( a , b y c ) y carotenoides ,
as como feofitinas , feofrbidos y cl o
rofi l i das . Sin embargo , en l a estimac in
de la biomasa de la microflora bentni
ca , en la que el problema de la patchi
ness exige l a toma de numerosas mues
tras son quiz preferibles a aqul los
ms exactos pero lentos .
UNA APROXIMACI N AL PROBLEMA
El empleo de tcnicas de separacin
de fase es sugerido por J EFFREY (1974)
como una opcin para mej orar la metodo
loga normalmente uti l i zada . WHITNEY
& DARLE Y (1979) desarrol lan en este sen-
tido un procedimiento para la determina
cin precisa de c lorofila-a en muestras
que contienen grandes cantidades de pro
ductos de degradacin. La partic in con
1 4
hexano de un extracto acetni co da lugar
a un si stema de dos fases . La hiperfase
contiene los carotenos , c l orofi las a
y b Y feofi tinas a y b , debido a que
estos componentes retienen la cadena
no polar ( fi tol ) . La h ipofase conti ene
la c lorofila-c , parte de carotenos y
los productos de degradacin de l a c lo
rofi la que carecen del grupo fitol , clo
rofi l i das a y b Y feofrbi dos a y b .
De esta forma , l a parti c in con hexano
separa las formas degradadas de la clo
rofi la activa . La c lorofi la a puede en
tonces ser calculada en la capa de he
xano , en presenc ia de feofi tina-a por
una ligera modi ficacin de l as ecuac io-
A
Feofitina a
(655)
600 650
Clorofila a
(665)
700
c
(
z
c
a
a
O
e
a
c
MANUEL VARELA
nes de LORENZEN ( 1 967 ) . Dado que este
procedimiento supone una importante me-,
j ora en l a metodologa , es ms s imple
y rpido que l as tcni cas cromatogrfi
cas en uso , y no requi ere equipo espe
c ial , ser descri to en detalle .
La particin con hexano es como
s igue : 10 ml de un extracto acetnico
( 90 % de acetona ) se aaden a 3 , 5 ml
de C1Na al 0 , 05% Y 1 3 , 5 ml de hexano
( de grado espectroscpico , rango de ebu
l l icin : 68, 0-68, 8) en un embudo de de
cantacin de 60 ml . El embudo es agi tado
fuertemente durante 5 minutos en una
agi tadora recproca a 60 vibraciones
por minuto , para alcanzar una mxima
B
600 650
Clorofila b
(655)
_Feofitina b
( 653)
700
LONGITUD DE ONDA
Fig. 5. Espectros de absorcin de las clorofilas a y b Y feofitinas a y b en metanol. Acidifica
cin hasta una molaridad de 3X10
-
2
M (HOLM
-
HANSEN & RIEMANN, 1978).
Fig. 5. Absortion spectra for chlorophylls a and b and phaeophytins a and b in methanol. Molarity 01' thc
acid in the extract. 3Xl0-2M (HOLM-IIANSEN & RIEMANN. 1978).
DHERMINACION DE CLOROFILA. EN EL FITOMICROBENTOS
I5
separacin. Despus de e l iminar l a hipo
fase acetnica , dos al cuotas de la hi
perfase , de 5 ml cada una , se recogen
en vi ales d vidrio de 20 mI de capaci
dad . Una godel CIH al 50 % se afade
a un de l o

'viales agitndose a conti

nuac iD para convertir la c lorofi la en
feofitina. Aproximadamente 0 , 5 g de
SO 4 N

anhidro se afade a cada vial con
objeto de secar e l hexano . Las absorban
ci as de las dos soluc iones de hexano
se miden contra un b l anco de hexano a
663 y 750 nm en un espectrofotmetro .
La concentracin de c lorofila-a puede
entonces ser calculada a partir de las
ecuac iones de LORENZEN ( 1967 ) , adaptn-
dolas a l as muestras de hexano .
Clorofila a (mg/m
2
) = AxKx( 6630-663a) xVxvxl0
LxS
Feofi tina a (mg/m
2
)= AxKx( Rx663a-6630) xVxvxl0
LxS
( A, coeficiente de absorcin de la cl o
rofi la-a en hexano = 1 1 , 05 ; K , factor
para igual ar la reducc in en la absor
bancia a la concentracin inic ial de
cl orofi l a = 1 , 82 ; 6630 , absorbanc ia del
extracto original corregida ; 663a , ab
sorbanc ia del extracto ac idificado ; V,
factor de correcc in para l a diferencia
de volumen entre l as capas de hexano
y acetona 1 , 6 ; v , volumen del extracto
acetnico original en ml ; 10 , factor
de conversin a m
2
L , l ongitud de paso
de cubeta en cm ; S , superficie de l a
muestra e n cm
2
; R , relacin 6630/663a
para cl orofi la-a pura = 2 , 23 ) .
La transferencia de c lorofi la-a
a la capa de hexano es independiente
U COuC6uIC1u U6 COIO11 en
el rango estudi ado por l os autores ( has
ta 3 mg/l de acetona ) y es prcti camente
compl eta ( 100 , 3

0 , 8%), de acuerdo con

las determi nac iones de la absorbancia
de l a cl orofi la remanente en la hipofase
acetnica . Aunque la presencia de ex
tracto de sedimento interfiere algo la
transparencia , este probl ema se reduce
en gran parte agitando los sol ventes
durante 5 minutos .
Usando feofitina-a obtenida por
acidificacin y neutral izac in de c lo
rofi la-a pura , se ve que su espectro
de absorcin no vara con el pH ( MARKER ,
1 977 ) en hexano . Los valores de R prxi
mos a l , O de muestras fecales apoyan
esta conclusin ( tabla I I I}. La relacin
de l as absorbanc ias antes y despus de
la acidi ficacin , R , vara s i gnificati
vamente con pequefos cambios en la lon
gitud de onda para ambos solventes , pero
de manera especial en l os extractos de
hexano ( fig . 6 ) . El grado de hexano em
pl eado afecta tambin a esta re lac in .
Por esto es necesario cal ibrar cuidado-
samente el espectrofotmetro uti l izado ,
determinando l a l ongitud de onda a l a
cual se obtiene e l mxi mo de absorc in ,
o bi en establ eci endo el valor de R para
el aparato , usando cl orofi la pur ificada
por cromatograf a.
Los pares de muestras anal izadas
por ambos mtodos , acetona y hexano ,
son comparabl es , ya que proceden de l a
misma soluc in de acetona . Los valores
obtenidos para clorofi la-a y feofitina-a
pura son iguales . Para muestras con
productos de degradac in , el hexano pro
porc iona valores de cl orofi l a-a ms ba
j os . Las c l orofi l idas son retenidas en
la hipofase acetnica durante la parti
cin y por tanto no son medidas como
pigmento activo . Estas di ferenc ias en
porcentaj e de p igmento activo pueden
16
MANUEL VARElA
Tabla III - Comparacin de las cantidades de clorofila-a y feofitina-a obtenidas por los
mtodos de acetona y hexano, en varios tipos de muestras. Concentraciones en mg de pigmento
por litro de extl'acto acetnico (de WIUTNEY & DARI.EY, 1979).
Acetona
R
6640: 664a Cla
Clorofila- pura 1,802 23,896
Cllindrotheca fusiformis (cultivo)I,768 37,893
Fitoplancton 1,569 5,400
Fango 1,544 9,583
Heces 1,054 0,525
Feofitina pura 1 , 021 0,128
ser de hasta el 62 (tabla IV) . Incluso
en la fase logartmica de cultivo de
Cylindrotheca fusiformis, el porcentaj e
de productos degradados de la cl orofila
-a puede al canzar el lO (tabla TTT}.
o

!

~
a

1
150
140
130
120
11
100
90 -
80
70
60

-
-
-
-
Q
--
--
-
-
-
Q ------- _____
-3 -2 -1
-
-- -g---
-
_ ACETONA

--:
0--__ _

-'(---
HEXANO

`
r 01 ofSVI"CION DE l' _, DE .aSO....NCI .. M"XIM4
Fig. S. Variacin del valor de R (relacin de
las abso!bancias a 663 nr antes y dfspus de
aCidi!icar) con la longitud de onda para la
clorofila-a pura, en acetona al 90 % Y hexano.
(WHITNEY & DARLE Y , 1979).
Hexano
R
feofitina 6630: 663a C1a feofitina
0,002 2,227 23,898 0,009
1,138 2,105 34,083 7,139
2,215 1,798 3,592 1,926
4,548 1,711 7,648 5,547
7,270 1,057 0,200 4,085
4,651 1,050 0, 164 3,958
Tabla IV - Comparacin de los valores de cloro
fila-a y feopigmentos obtenidos por los mtodos
de acetona y hexano. En el caso de la clorofi
la, los porcentajes corresponden a la relacin
entre los valores de hexano y acetona, conside-
'
rando que los primeros representa la forma
activa del pigmento y los segundos el total
(activa + degradada = clorofila + cloroflida).
En el caso de los feopigentos, los porcentajes
expresan la relacin entre los valores obteni
dos por uno y otro mtodo. Las muestras seala
das con un * representa cantidades de feopig-.
mentos ms elevados en acetona que en hexao.
Muestras procedentes de la ra de Arosa (VARELA
& PENAS , en preparacin). N , nmero de mues
tra .
% Cl-a activa
Clorofila-a FEOPIGMENTOS
(mg/m
2
) (mg/m
2
)
N acetona hexano % acetona hexano %
373 , 8 198,4 53 285,1 348 , 5 122
2 Z57,3 133,1 51 301,7 399 , 8 132
3 377,8 217 , 7 58 283 , 2 453 , 7 160
Fig, 6, Dependence af befare-ta-after acidificatian
' 4 133,4 52 , 3 39 365,8 628,5 171
ratic, E. wavelength faI' pure chlaIaphyl1-a
9:: ' % aceane an hexane (WHITNEY & DARLEY,
1979) ,
5 203,0
6 245,2
118 , 5 58 225,9 210,1 *107
123,4 50 226,7 204 , 9 *110
DETERMI NACI N DE CLOROFI LA a EN EL FI TOMI CROBENTOS
1 7
Las di ferenc ias entre las concen-
trac iones de feofitina no son consisten-
tes ; en algunos casos e l mtodo del he
xano :propopciona una mayor cantidad de
feofi tina . l de acetona ( tabl as TTT
y IV ) . E, el caso de muestras de sedi
mentos :procedentes de l a ra de Arosa
( VARELA
'
& PENAS , en preparacin ) , e l
hexano proporc ion e n l a mayora de l os
casos valores ms el evados que la aceto
na ( tabl a I V) , en ocasiones hasta un
170 % mayores . Esto resulta probabl emen
te de la di ferencia en el nivel de feo-
frb ido en l as muestras ( WHITNEY & DAR
LEY , 1979 ) o de algn t ipo de interfe-
renc ia no conocida , puesto que la aceto
na debera proporcionar valores de feo
pigmentos ms e l evados que e l hexano ,
pues en ste l os feofrbidos son e l imi
nados en l a hipofase acetnica durante
la partic in y no son medidos como feo
fi tina .
EL USO DE C03Mg DURANTE EL PROCESO
DE EXTRACCIN
El C0
3
Mg es ampl iamente util izado
durante la extracc in de p igmentos en
fi toplancton , macrfitos y fi tomi croben
tos , para pr

venir la acidi ficacin de

los extractos . Sin embargo , su empleo
es discutido por HOLM-HANSEN & RIEMANN
( 1978 ) , qui enes encuentran poca o ningu
na di ferenc ia entre muestras de fi to
plancton con y s in tratamiento con
C0
3
Mg . Por otra parte , su uso en mues
tras destinadas al estudio de pigmentos
por los mtodos de acidificacin descri
tos puede causar serios problemas , ya
que hace que los valores de pH subsi
guientes a l a acidi ficacin sean mayores
que l os requeridos para una completa
feofi tinizac in . Adems , MOED & HALLE
GRAEFF ( 1978 ) sealan que nunca los va
lores de pH del extracto son tan bajos
como para permitir l a ms mnima feofi
tinizacin . Desde este punto de vi sta ,
por tanto , l a apl icacin de C0
3
Mg sera
innecesaria y slo debera ser empleado
en condic iones de acidez de muestras
procedentes de cuerpos de agua o sedi
mentos cidos .
Pero e l uso de C0
3
Mg pl antea adems
otro grave problema , como es su tenden
c ia a absorber cantidades s ignificativas
de c lorofi l i das y feofrbidos . Por todo
el l o , el empl eo de C0
3
Mg es desaconsej a
do , mientras no se presente una al terna
tiva adecuada .
CONCLUSIONES
Aunque la informacin existente
acerca de la determinac in de pigmentos
en muestras con gran cantidad de produc
tos de degradacin , como son l as proce
dentes del bentos , y que exigen la ac i
di ficacin de los extractos para distin
guir l as formas activas de l as degrada
das es abundante , numerosos autores si
guen anal izando sus muestras si n l as
debidas precauciones , l o cual hace que
los resul tados obtenidos sean poco fia
bles y en ocas iones difci lmente compa
rables . Est cl aro que es prec isa una
puesta a punto de la metodologa y una
estandarizacin de l a mi sma . En este
sentido se proponen l os siguientes pun
tos :
1 ) E l empleo de acetona con un con
tenido en agua del 10 al 20 % es aconse
j able sobre otros solventes , por propor
cionar una mayor estab i l idad a los p ig-
1 8
mentos durante l o s procesos d e aci di fi-
cac in , aunque su capac i dad extractora
sea i nferior a la del metanol .
2 ) La tri turac in , sonicaci n o
e l empleo de DMSO con acetona acuosa ,
permi ten una efi cac ia y una rapidez en
l a extracc in comparable a l a del meta
nol .
3 ) La acidi ficac in de los extrac-
tos debe permi tir al canzar un pH final
comprendido entre 2 , 6 y 2 , 8. Si se em-
MANUEL VARELA
pl ea metanol como solvente , e l extracto
debe neutral i zarse con C0
3
Mg.
4 ) E l mtodo del hexano se presen
ta como una al ternativa adecuada por
reunir efi cac i a y rap idez en la determi
nac in de c l orofi la-a ac ti va. El uso
conj unto del mtodo tradi cional de ace-
tona y el del hexano permi te conocer
la cantidad de productos de degradacin
existente en l as muestras .
G) E l uso de C0
3
Mg debe omitirse .
SUMMARY
T HE PROBLEM OF CLOROPHYLL a DETERMINATI ON IN T HE P HYTOMICROBENTHOS:
A METODOLOGICAL DISCUSSION
A geneDa1 d1SCuSS1On aOOul 1he deeD01na-
iOn O p1g0en1S in Sa0p.eS COnIa1n1ng h1gh
peDCen'ageS O degDada1On pDOduCS , aS 1hOSe
DO0 1he Oen1hOS , 1S pDeSen1ed. The Dad1 11Ona1
0e1hOdS OaSed On 1he SpeC1DOphO1G0e1D1C Dea-
d1ngS OeODe and a1eD aC1d11Ca11On O 1he
exL:aC1S aDe d1SCuSSeU 1n De1a11On w11h 1he
SO1ven1S , 1he1D wa1eD COn1en1 , 1he 0O1BD11y
O 1he a 1d 1n 1he aC1d11ed ex1DaC1 and 1he
uSe O `O
3
Mg The 0e1hOd O WH1TYLY & DARLLY
( 1979 ) , .. h1Ch 1nvO1veS paD1111On O aCe1On1C
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11On Oe1 ween aC11ve and nOn~aCLve OD0S O
Ch1ODOphy11~ w h1Ch 1S nO1 pOSS1O1e w11h U
CuDDen1 SpeC1DOphO1O0e1D1C pDOCeduDeS , and 1S
pDOpOSed aS a Su1 1aO1e a11eDna11ve
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