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Mad2 es un mediador crtico de la inestabilidad cromosmica observada en Rb y p53 Camino inhibicin

Resumen
Se han propuesto varios mecanismos para explicar cmo Rb y p53 supresor de tumores plomo prdida de la inestabilidad cromosmica (CIN). Se ha demostrado recientemente que la inhibicin va Rb provoca la sobreexpresin del gen mittico puesto de control Mad2 pero si se requiere Mad2 sobreexpresin para generar CIN en este contexto es desconocido. Aqu mostramos que la NIC en clulas cultivadas que carecen de protenas de la familia Rb requiere Mad2 regulacin al alza y que esta regulacin al alza tambin es necesario para la NIC y la progresin del tumor in vivo . Mad2 tambin es reprimida por p53 y se requiere la regulacin al alza de CIN en un modelo de tumor p53 mutante. Estos resultados demuestran que Mad2 sobreexpresin es un mediador crtico de la CIN observada tras la inactivacin de dos importantes vas de supresores de tumores.

Significado
Inestabilidad cromosmica (CIN) se cree que es el principal motor evolutivo para la progresin tumoral. Aqu nos muestran que la sobreexpresin del gen mittico puesto de control Mad2 se requiere para el CIN observada tras la inhibicin de las rutas Rb y p53, dos vas con frecuencia inactivan en el cncer humano. Nuestros resultados demuestran que la adquisicin de CIN es conectado mediante cable a la prdida de las principales vas de supresores de tumores a travs de la hiperactivacin de la va de punto de control mittico. La inhibicin de estas vas supresores de tumores en las primeras etapas de la progresin del cncer puede dar cuenta de la presencia generalizada de la NIC en tumores en ausencia de otros eventos genticos y pone de relieve el valor teraputico de dirigirse a las clulas aneuploides. Ir a:

Introduccin
Inicio y la progresin del tumor son procesos de varios pasos asociados a mltiples alteraciones genticas y epigenticas ( Hanahan y Weinberg, 2011 ). Una alteracin comn fuertemente asociado con el cncer humano es el nmero de cromosomas anormales o aneuploida. Desde la dcada de 1800, los investigadores han observado que las clulas cancerosas missegregate sus cromosomas durante la mitosis y que tales eventos missegregation son ms frecuentes en las etapas avanzadas de la enfermedad. No es hasta hace poco, sin embargo, que el papel causal de la aneuploida en la iniciacin del tumor se ha establecido en modelos animales: al menos 24 lesiones genticas independientes que dan lugar a aneuploida tambin iniciar o mejorar la progresin de la tumorignesis en ratones ( Schvartzman et al,. 2010 ). La aneuploida probablemente conduce a la prdida de supresores de tumor o de ganancia de las seales oncognicas y de hecho en un modelo de ratn, la mejora de aneuploida conduce a la prdida acelerada de heterocigosidad del locus supresor de tumores p53 ( Baker et al., 2009 ). Cmo surge la aneuploida de los tumores es todava un tema de debate. Se ha postulado que esto se produce por la prdida de control mittico o debilidad. De hecho, la prdida de un nmero de genes clave mittico de control conduce a aneuploida y la tumorignesis en ratones (Schvartzman et al., 2010 ). Sin embargo, los datos de los tumores humanos no apoyan esta hiptesis como la prdida o debilidad del checkpoint mittico es poco frecuente en muestras clnicas ( Rhodes et al., 2007 ). Una conexin insospechada entre una va supresora de tumores y la adquisicin de aneuploida es el hecho de que la inhibicin de la va de supresor de tumor Rb y la activacin de E2F conduce directamente a una mayor expresin del gen de puesto de control mittico Mad2 ( Hernando et al., 2004 ). Mad2 sobreexpresin es suficiente para causar la no disyuncin, aneuploida y la iniciacin del tumor en ratones ( Sotillo et al., 2007 ). Por lo tanto, la prdida de al menos una de las principales vas de supresores de tumores es difcil-por cable a una va que conduce directamente a CIN durante la mitosis. Tres informes recientes proponen un mecanismo alternativo por el cual la inhibicin va Rb conduce a CIN a travs de descondensacin de la cromatina centromrica pero si esto es necesario para el establecimiento de CIN sigue siendo desconocido ( Coschi et al, 2010. ;Manning et al, 2010. ; . Van Harn et al, 2010 ) (vase tambin la discusin). La va de p53 es una segunda va que durante mucho tiempo ha sido reconocido como un supresor primaria de la NIC. In vitro , p53 prdida o mutacin resulta en la prdida de control del ciclo celular y aneuploida ( Negrini et al., 2010 ). Alteracin gentica de la funcin de p53 en el ratn se ha demostrado que causa CIN y acelerar el desarrollo de tumores en modelos de diversos tipos de cncer ( Donehower y Lozano, 2009 ). Adems, fuertes correlaciones entre anormal de p53 estado y aneuploida se han observado en los tumores humanos ( Junttila y Evan, 2009 ). La diseccin del mecanismo por el cual p53 previene la inestabilidad genmica se complica por el hecho de que la p53 ejecuta otras funciones celulares que estn estrechamente vinculados, incluyendo la induccin de la detencin del ciclo celular, la apoptosis y senescencia ( Junttila y Evan, 2009 ). A pesar de esto, la evidencia de un papel crucial de p21 Waf1/Cip1/Sdi1 (p21), cuya expresin es inducida directamente por p53, se ha acumulado. Por ejemplo, los ratones que llevan mutante p53 R172P knock-in alelos, que mantienen la capacidad de inducir p21 todava no son capaces de desencadenar la apoptosis, el desarrollo de tumores estables, con genomas diploides, sin embargo, los tumores que se desarrollan en ratones portadores de la misma mutacin en un p21 - / - fondo son siempre aneuploides ( Barboza et al, 2006. ). Esto sugiere que parte, si no todos, de la funcin de p53 para mantener la estabilidad genmica es ejecutado por p21.

Mientras que las vas de p53 y Rb se estudian a menudo de forma independiente, la relevancia de la diafona entre estas vas principales supresores de tumores se reconoce cada vez ms ( Polager y Ginsberg, 2009 ). p21 representa una conexin obvia entre las dos vas como su expresin es inducida directamente por p53 y, como un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, p21 conserva la familia Rb de protenas de bolsillo en un estado hipofosforilado, evitando de este modo no programada de activacin de E2F y la entrada del ciclo celular. La nocin de que p53 mantiene la estabilidad genmica en gran medida, si no exclusivamente, por la induccin de p21 sugiere que la p53 puede prevenir CIN a travs de una va de la represin p21cyclin/Cdk-Rb-E2F. Debido a que el aumento de expresin Mad2, una causa primaria de la NIC, es un resultado directo de la va de sealizacin aberrante Rb, la alteracin de la funcin de p53 tambin puede causar CIN a travs de niveles elevados de Mad2. Mientras Mad2 sobreexpresin es suficiente para iniciar la tumorignesis, si es necesario para los efectos tumorignicos de Rb o inhibicin ruta de p53 y de la naturaleza de estos efectos no se han explorado previamente. Los experimentos presentados aqu frente a esta hiptesis. Ir a:

Resultados
p53 reprime Mad2 Expresin por la induccin de p21
Rb inactivacin resulta en la regulacin positiva de Mad2 ( Hernando et al., 2004 ), un objetivo directo de E2F, y Mad2 sobreexpresin conduce a CIN tanto in vitro y in vivo ( Sotillo et al., 2007 ). La interrupcin de la va de p53, directa o indirectamente, conduce a y mantiene CIN ( Donehower et al, 1995. ; Thompson y Compton, 2010 ; . Tomasini et al, 2008 ). Para determinar si la sobreexpresin Mad2 juega un papel en la adquisicin de CIN observada tras la inactivacin de p53, primero analiza Mad2 los niveles de protena en fibroblastos embrionarios primarios de ratn (MEFs) a partir de derivados de tipo salvaje, p53 + / - y p53 - / - . ratones p53 + / - y p53 - / - MEFs expresaron mayores niveles de Mad2 que las clulas de tipo salvaje ( Figura 1A ). De acuerdo con estudios anteriores que muestran que p53 o p21 prdida no conduce a cambios en la distribucin de clulas en G 1 , S, G 2 o la fase M del ciclo celular ( Deng et al., 1995 ), los niveles de fosfo-histona H3 (Ser 10 ), un marcador mittico, fueron similares para los tres genotipos. Adems, Mad2 niveles estaban elevados en mittico, as como en clulas no mitticas ( Figura S1 A ). Esto indica que el aumento de los niveles de Mad2 no es simplemente un resultado de un aumento en la fraccin de clulas mitticas. Los niveles de BubR1, otra protena de control mittico, eran igualmente elevada, lo que implica que BubR1 expresin est controlada por p53 de una manera similar (vase tambin la discusin).

Figura 1 P53 reprime Mad2 Expresin por induccin de p21 Con el fin de probar si p53 es capaz de reprimir directamente Mad2 la actividad del promotor, un vector de expresin de p53 y un vector en el que la expresin de luciferasa es conducida por 235 pares de bases de la Mad2 promotor fueron co-transfectadas en clulas HCT116. En comparacin con el vector de control, la actividad del promotor p53 efectivamente reprimida vaco de una manera dependiente de la dosis. Por el contrario, p53 mutante V143A , que no se une a los elementos de unin al ADN de p53 ( Zambetti y Levine, 1993 ), no fue capaz de hacerlo ( Figura 1B ). Se obtuvieron resultados similares utilizando SAOS2 clulas (datos no mostrados). El anlisis de secuencia de laMad2 promotor revel la presencia de un supuesto sitio de unin a p53 de aproximadamente 160 pares de bases aguas arriba del sitio de inicio de la transcripcin. Sin embargo, la mutacin de este sitio no afect a la represin mediada por p53 (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la p53 mediada por Mad2 la represin es dependiente de su capacidad de unirse al ADN, pero que este efecto est mediado a travs de otros objetivos transcripcional de p53. Debido a que p21 es una diana transcripcional de p53 primaria, nos preguntamos si Mad2 los niveles de protena tambin fueron elevados en MEFs carecen de una o ambas copias de la CDKN1A gen, que codifica p21. De hecho, tanto p21 + / - y p21 - / - clulas expresaron mayores niveles de Mad2 que de tipo salvaje MEFs ( Figura 1C ). Al igual que en nuestras observaciones enp53 + / y p53 - / - MEFs, BubR1 niveles eran tambin elevada, mientras que los niveles de fosfo-histona H3 no cambiaron en p21 + / o p21 - / - clulas, confirmando de nuevo que Mad2 no fue elevado como consecuencia de un aumento en la fraccin de clulas mitticas ( Deng et al., 1995 ).Adems, como se ha visto con p53 de tipo salvaje, p21 reprimida Mad2 promotor de la actividad en los ensayos de reportero que contenan 235 pares de bases de la Mad2 promotor ( Figura 1D, 1E ).Prdida de cualquiera de ambos p53 o ambos alelos p21 alelos por medio de recombinacin homloga en clulas HCT116 humanos conduce a un aumento de 2,5 a 3 veces en Mad2 la actividad del promotor ( Figura S1B ) y un aumento de 1,5 veces en los niveles de mRNA endgenos Mad2 ( Figura S1C ). Dado que la induccin de p21 por p53 es dependiente de su actividad de unin a ADN, estos resultados sugieren que la p53 reprime Mad2 expresin a travs de la induccin de p21. Consistente con esto, la capacidad de p53 para reprimir Mad2 actividad promotora en HCT116-p21 + / + clulas fue significativamente disminuido en un p21 - / - de fondo ( Figura 1F ). La actividad represiva residual fue el resultado de la capacidad de p53 para inducir la apoptosis como un mutante p53 que es capaz de inducir la expresin de p21, pero incapaz de inducir la apoptosis (p53 R175P ) ( Liu et al., 2004 ) perdi

completamente la actividad represiva en la ausencia de p21 ( Figura 1F ). Por lo tanto, llegamos a la conclusin de que p53 reprime Mad2 expresin mediante la induccin de p21.

p53 reprime Mad2 Expresin a travs Crosstalk a la va Rb


Dado que p21 acta como un inhibidor de la CDK, el prximo pregunt si su efecto sobre la Mad2promotor era dependiente de protenas de bolsillo por sobreexpresin de p21 en Rb triples knockout (KO tcnico) MEFs, en la que se eliminan los tres genes de la protena de bolsillo (Dannenberg et al., 2000 ; Sage et al, 2003. ). TKO MEFs fueron transducidas con un vector lentiviral que contiene el transactivador de la tetraciclina inverso (rtTA) cDNA bajo el control de un promotor ubicuo y un ADNc de p21 cuya expresin est controlada por un promotor de respuesta a la tetraciclina. Despus de la seleccin de las clulas transducidas, se aadi doxiciclina al medio de cultivo y las clulas se recogieron a diferentes puntos de tiempo a partir de entonces. Si bien la expresin de p21 aument con el tiempo, Mad2 niveles de protena no cambi significativamente en las clulas TKO ( Figura 2A y S2A ). Como era de esperar, Mad2 niveles disminuyeron despus de la induccin de la expresin de p21 exgeno en el de tipo salvaje MEFs de control ( Figura 2A y S2A). Anlisis de citometra de flujo de las clulas TKO en cada punto de tiempo no mostr cambios significativos en los perfiles del ciclo celular, lo que indica que las clulas TKO no haban detenido o ha entrado senescencia ( Figura S2 ). Por lo tanto, la represin mediada por p21 de Mad2 bolsillo es dependiente de la protena.

La figura 2 P53 reprime Mad2 Expresin a travs Crosstalk a la va Rb A fin de evaluar la contribucin de bolsillo efectos protenas independientes de p21, hemos hecho uso de una serie de mutantes de p21. Tres dominios en p21 se han implicado en su unin a ciclina / CDK complejos, un requisito para la inhibicin de p21 mediada por la actividad de CDK. Cy1 y Cy2 son dominios de unin a ciclina y la media de dominio K CDK vinculante. Las mutaciones en cada uno de estos dominios individualmente o combinaciones de los mismos conducen a diversos grados de disminucin en la actividad de unin de ciclina / Cdk hacia diferentes complejos de ciclina / Cdk (ciclina A/Cdk2, ciclina D1/CDK4, ciclina E/Cdk2) ( Chen et al., 1996 ). Sin embargo, si tales p21 mutantes son capaces de reprimir Mad2 promotor de la actividad, esto sugerira que la p21 es capaz de reprimir de una manera independiente de la va Rb. Reportero ensayos utilizando HCT116p21 - / - y-HCT116 p21 + / + y las clulas p21 variantes que contienen mutaciones en el Cy1, Cy2 K o dominios, individualmente o en combinacin, mostraron que seis mutantes diferentes en los que la afinidad de unin de Cdk se redujo 3,5 hasta ms de 300 veces no mostr capacidad para reprimir la Mad2 promotor ( Figura 2B , S2C ). Un mutante p21 mCy2 , conserva su capacidad de reprimir Mad2 . Sin embargo, este mutante slo mostr una reduccin del 29% en Cdk afinidad de unin ( Chen et al., 1996 ). Si bien es posible que cualquier mutacin dado que interrumpe la capacidad de p21 para unirse a o inhibir las Cdk tambin podra afectar a su capacidad de seal a travs de una va Rb-independiente, esto parece remoto dado el hecho de que mltiples mutaciones p21 muestran el mismo fenotipo. En conjunto, los resultados anteriores sugieren que la p21 reprime Mad2 expresin a travs de la sealizacin cannica, es decir, la inhibicin de la fosforilacin mediada por CDK de Rb y la consiguiente estabilizacin de la compleja Rb/E2F. Adems de mltiples sitios de unin a E2F, el anlisis de la Mad2 promotor revelaron la presencia de una regin de homologa del gen del ciclo celular (CHR) y un elemento dependiente del ciclo celular (CDE) cerca del sitio de inicio de la transcripcin ( Figura S2F, G ). CDH y elementos CDE tambin estn presentes y conservado en un nmero de clulas genes regulada por el ciclo. Un complejo de protenas denominado CDF1 (factor de clula dependiente del ciclo 1) es reclutado para CHR y elementos CDE y, al menos por un promotor, p21 se ha demostrado que ser reclutados para estos elementos en donde media la represin de la transcripcin del gen aguas abajo ( Fung y Poon, 2005 ; Liu et al, 1997. ; Vigneron et al, 2006. ). Nos referimos a esto como la no cannica p21 va de la represin. La alteracin de cualquiera de CHR o elementos CDE llev a desrepresin de la Mad2 promotor (Figura S2D superior) ( Liu et al., 1997 ) lo que sugiere que estos elementos tambin juegan un papel inhibitorio. Sin embargo, esta derepression dependa de un sitio de unin a E2F aguas arriba, ya que un reportero construir ms pequea que careca de este elemento aguas arriba no se present derepression cuando la Comisin de Derechos Humanos o en los sitios de CDE fueron mutados ( Figura S2D inferior). El apoyo a la hiptesis de que la expresin de p21 reprime Mad2 a travs de la Comisin de Derechos Humanos y de los elementos del CDE, la represin mediada por p21 se pierde por completo cuando se mut cualquiera de los sitios ( Figura S2E ). Sin embargo, el elemento CHR adyacente al sitio de CDE/E2F podra ser necesario para estabilizar complejos inhibitorios E2F/Rb.Por ello, pregunta si la mutacin del sitio CHR afectada E2F vinculante, cuyo sitio de unin se superpone slo con el sitio de CDE. En primer lugar, el uso de una protena de protocolo de purificacin por afinidad imparcial seguido de la identificacin de protenas por espectrometra de masas, se encontr que ninguno de los activadores de E2F (E2F1, 2, 3a) y slo E2Fs represor E2F4 y E2F5 obligados a repeticiones de secuencias de ADN CHR-CDE de tipo salvaje . Adems, la unin de estos E2Fs se enriqueci para la secuencia de cebo CHR-E2F/CDE de tipo salvaje en comparacin con la secuencia de mCHR-E2F/CDE en el

que se mut el sitio CHR ( Figura S2H ).Tambin se identificaron pareja de unin E2F DP-1, miembro de la familia Rb p107, que se sabe que se unen preferentemente a E2F4 y E2F5 ( Ikeda et al, 1996. ; . Moberg et al, 1996 ), ciclina B1, ciclina-quinasa dependiente-1 (Cdk1), Cdk2 y la HDAC1 represor transcripcional ( Figura S2H ).Estas observaciones fueron confirmadas por E2F4 y p107 por Chip anlisis ( Figura S2I ). En contraste con el anlisis de espectrometra de masas, este ensayo no es cuantitativo y probablemente tambin incluye E2F4, p107 y / o p130 precipit a partir de los sitios E2F ms aguas arriba. Ciclina unin al sitio CHR-CDE/E2F B1 tambin se confirm mediante ensayo de cambio de movilidad electrofortica (EMSA) utilizando un anticuerpo sper-desplazamiento (datos no mostrados). EMSA utilizando un tipo salvaje y un mutante CHR (MCHR) sonda tambin mostraron que un complejo de protenas de alto peso molecular que contiene E2F4 une a la de tipo salvaje, pero no a la sonda de MCHR ( Figura 2C ). Estos datos sugieren que se requiere un sitio CHR intacta para la formacin estable de represor complejos de E2F-y p107 que contienen que pueden inhibir la expresin de los sitios activadoras aguas arriba. Esto proporciona un mayor apoyo para nuestras observaciones indican que Mad2 expresin es reprimida por Rb cannica va de sealizacin.

Mad2 Upregulation es necesario que el CIN visto en Rb Camino inhibicin


Los resultados anteriores sugieren que p53 mantiene la represin adecuada de la Mad2 gen a travs de la va Rb. Todos los tres miembros de la familia Rb (Rb, p107, p130) juegan un papel en la inhibicin de la expresin Mad2, ya que ninguno de los agujeros ciegos de doble o individual mostr un nivel tan alto como se ve en las clulas TKO ( Figura 3A ). Mad2 los niveles de protena en TKO MEFs fueron mayores tanto en mittica y en clulas no mitticas ( Figura S3A ) que indican que el aumento de los niveles de Mad2 no eran simplemente el resultado de una fraccin mittico superior. Para determinar si esta regulacin al alza observada de Mad2 era necesario que el CIN visto anteriormente en TKO MEFs ( Gonzalo et al., 2005 ), hemos tratado de reducir los niveles de Mad2 a aquellos que se acercan de tipo salvaje. Es importante destacar que la regulacin negativa parcial de Mad2 es en s mismo conduce a aneuploida ( Michel et al., 2001 ) y la cada completa es celular letal, por lo que nuestra intencin era alcanzar niveles cercanos a los observados en las clulas de tipo salvaje. Utilizando un panel de vectores lentivirales que expresan ARN corto horquilla, dos constructos (shMad2 # 1 y # 2 shMad2) se encontraron para normalizar los niveles de Mad2 a la gama deseada de tipo salvaje, como se determina por anlisis de transferencia Western cuantitativa ( Figura 3B ).

Figura 3 La normalizacin de los niveles en Mad2 TKO MEFs La normalizacin de Mad2 no tuvo efecto sobre los altos niveles de BubR1 ya presentes en TKO MEFs ( Figura S3 ), de nuevo argumentar en contra de disminuciones marcadas en el nmero de clulas mitticas. Como lectura funcional del efecto de Mad2 normalizacin de la funcin de control mittico, que desafa las diferentes lneas MEF TKO y WT MEFs con nocodazole, un agente de despolimerizacin de los microtbulos. Como era de esperar, TKO MEFs transducidas con vectores revueltos horquilla corta detenidas en la mitosis durante un perodo prolongado de tiempo (mediana de 500 minutos) y la normalizacin de Mad2 dado lugar a una disminucin de la mediana de tiempo de detencin ( Figura S3C ). Estas clulas eran an SAC competente, sin embargo, ya que los estudios anteriores han demostrado que Mad2 nulo MEFs fallan en mantener una detencin nocodazol durante ms de 60 minutos ( Burds et al., 2005 ), muy por debajo de los 310 o 260 minutos observados en la Mad2 normalizado TKO MEFs. La normalizacin de Mad2 en TKO MEFs no tuvo efecto significativo sobre la proliferacin en comparacin con TKO MEFs transducidas con un vector de control mezclado segn lo evaluado por un ensayo de inmortalizacin 3T3 ( Figura 3C ). Adems, un ensayo de proliferacin estndar (Figura S3D ) y un ensayo de eficiencia de siembra de baja densidad ( Figura 3D ) no mostraron efectos significativos de Mad2 normalizacin en TKO tasas de crecimiento o viabilidad MEF. De acuerdo con los informes anteriores, cerca de cada completa de Mad2 (shMad2 # 3) ( Figura 3B ) dio lugar a disminuciones marcadas en tanto la viabilidad y la eficiencia de la siembra ( Figuras 3C y 3D ) ( Michel et al., 2004 ). Si Mad2 regulacin positiva era responsable de la NIC en TKO MEFs, se esperara que su normalizacin para dar como resultado un rescate de este fenotipo. Los cariotipos de paso 25 clulas TKO con niveles normalizados de Mad2 fueron significativamente menos variables que los de las clulas TKO control ( Figura 4A ). De veinte metafsica analizados en cada estado, la distribucin de conteo de cromosomas en las clulas de control TKO revueltos-SH fue significativamente mayor que el de las clulas TKO Mad2 normalizados. Por otra parte, ninguna de las clulas de control TKO revueltos-SH tena el mismo complemento cromosmico mientras que ms de la mitad de las clulas normalizadas Mad2 TKO lo hicieron ( Tabla S1 ). Sin embargo, esta disminucin de la variabilidad podra ser el resultado de diferencias sutiles en la tasa de proliferacin o la consecuencia de un clon de clulas con un cariotipo fijo. Para el control de estas posibilidades, que mide directamente la tasa de CIN mediante el control de cromosoma 12 y 17 de interfase FISH especfica (hibridacin fluorescente in situ) en colonias de clulas 150-500 derivadas de una sola clula. En este ensayo, el nmero modal de las seales de FISH en una colonia refleja el cariotipo de la clula de la iniciacin y la desviacin de modo es una medida de las tasas de CIN.El anlisis de distribucin de frecuencia de las seales de FISH para cada colonia (0 a 6 o ms seales para cada sonda de cromosoma) revel una disminucin significativa en la desviacin desde el modo de TKO en clulas con niveles normalizados Mad2 comparacin con los controles revueltos-SH TKO ( Figura 4B ) ; 15,2% para shMad2 TKO colonias (SEM = 1,630) y 39,5% para el TKO colonias shCtrl (SEM = 3,079) (valor p <0,005). Esta diferencia se observ en tres experimentos independientes con dos vectores de

horquilla corta (shMad2 # 1 y # 2 shMad2) que haban sido mostrados para normalizar los niveles de Mad2. Es poco probable que estamos seleccionando para los clones genmicamente estables en Mad2 normalizacin ya que la eficiencia de formacin de colonias se mantuvo sin cambios en el normalizado Mad2 TKO colonias ( Figura 3D ) y todos los TKO colonias revueltos-SH analizados mostraron altos desviaciones desde el modo. Estos resultados proporcionan evidencia directa de que Mad2 regulacin positiva es necesaria para la CIN observado en clulas que carecen de la funcin de familia de la protena Rb.

Figura 4 Mad2 Upregulation se requiere para Rb prdida inducida CIN y acelera la transformacin de TKO MEFs

Mad2 mediada CIN acelera la transformacin de fibroblastos sin afectar a la proliferacin de Cambio
A continuacin trat de investigar si la normalizacin de los niveles de clulas Mad2 TKO tuvo ningn efecto sobre la transformacin celular. Fibroblastos murinos transformados forman fcilmente colonias cuando se sembraron a baja densidad, muestran crecimiento independiente del anclaje en agar blando y forman aloinjertos de tumores cuando se implantan por va intradrmica en ratones desnudos ( Flint, 2000 ). Adems de mostrar deterioro de la eficiencia de la siembra, la normalizacin de Mad2 en TKO MEFs transducidas con un vector retroviral que expresa la Hras V12 oncogn dado lugar a disminuciones significativas en el crecimiento en agar blando y formacin de focos ( Figuras 4C y 4D ), los ensayos estndar de crecimiento independiente de anclaje y escapar de la inhibicin por contacto, respectivamente. Por otra parte, Hras V12 transform TKO MEFs implanta por va intradrmica en animales inmunodeficientes formar proliferacin rpida fibrosarcomas ( Sage et al., 2003 ) y Mad2 normalizacin dado lugar a un retraso significativo en el crecimiento de estos tumores en comparacin con controles revueltos horquilla ( Figura 4E ). Esta diferencia probablemente refleja una subestimacin del efecto de CIN en el crecimiento del tumor aloinjerto ya que la presin selectiva para mantener la expresin de horquilla corta (resistencia a la puromicina) es ya no est presente in vivo . De hecho, Mad2 niveles en las muestras tumorales de aloinjertos normalizados fueron ms similares a los controles que en los pre-implantados lneas parentales ( Figura S4A ). Esta disminucin en la proliferacin in vivo no se observ in vitro despus de Hras V12 de transduccin ( Figura S4B ), argumentando que CIN inducida por Mad2 regulacin positiva juega un papel en la aceleracin de la progresin del tumor a travs de eventos-supresores que son independientes de la proliferacin per se y son slo se manifiesta en ensayos de independencia de anclaje, contacto con la inhibicin o la implantacin en los animales receptores.

Mad2 mediada CIN se requiere para el desarrollo de tumores anaplsicos en un modelo murino de adenocarcinoma mamario
Con el fin de determinar qu papel juega Mad2 regulacin positiva (como resultado de la inhibicin de la va Rb) en un entorno ms similar a tumores malignos humanos comunes, nos centramos en la descrita anteriormente -T121 WAP modelo de cncer mamario ( Simin et al., 2004 ). Estos animales expresan T121, un fragmento de antgeno T grande de SV40 que se une e inhibe miembros de la familia Rb, bajo el control del promotor de suero de leche cida-Protena mamaria-especfica. WAPT121 hembras desarrollar adenocarcinomas mamarios con una latencia mediana de 12 meses . Glndulas mamarias Pretumorigenic de WAP-T121 ratones hembras mostraron altos niveles de Mad2 relacin con sus homlogos de tipo salvaje ( Figura 5A ) y se trat de determinar si la normalizacin de los niveles a travs de Mad2 Mad2 heterocigosidad tendra un efecto sobre las caractersticas y el CIN en estos tumores . Glndulas mamarias Pretumorigenic deMad2 + / - ; WAP-T121 hembras mostraron Mad2 niveles ligeramente ms altos que los de los animales de tipo salvaje, pero significativamente inferiores a los de Mad2 + / + ; WAP-T121 ratones ( Figura 5A ). Mad2 heterocigosidad en WAP- T121 hembras dieron lugar a un retraso en el inicio del tumor ( Figura 5B ; latencia mediana de 362 das para Mad2 + / + frente a 407 das para Mad2 + / - , p = 0,0214) y una disminucin de la carga tumoral en comparacin con los controles de tipo salvaje ( Figura 5C ; 2,2 frente a 1,3 tumores por animal, p = 0,0003), ambos de los cuales fueron estadsticamente significativas. . El fenotipo ms notable se observ en el anlisis de la histologa del tumor Mad2 + / + ; WAP-T121 hembras desarrollaron tres tipos histolgicos de tumores ( Figura 5D y 5E ): adenoescamoso, tumores bien diferenciados (28% de todos los tumores), menos diferenciados, adenocarcinomas papilares o glandulares ms basophillic (54% de todos los tumores) y los tumores anaplsicos pobremente diferenciados (18% de todos los tumores) con clulas fusiformes que recuerdan a una transicin epitelial a mesenquimal (EMT) ( Figura 5E ). Los tumores anaplsicos tenan un aspecto similar a los tumores mamarios anaplsicos visto en los seres humanos, que estn asociadas con el estado de triple negativo (el estrgeno, la progesterona y el receptor de EGF negativo) y tienen un pronstico clnico particularmente pobres (Reis-Filho y Tutt, 2008 ).

La figura 5 Mad2 Upregulation se requiere para el desarrollo de tumores mamarios anaplsico en WAPT121 ratones transgnicos La naturaleza de nuestro estudio se opone a la determinacin de si los tres tipos de tumores reflejan una progresin de adenoescamoso al adenocarcinoma a los tumores anaplsicos, aunque en muchos casos se observaron dos de estos patrones histolgicos en la misma lesin.Sorprendentemente, Mad2 heterocigosidad result en un cambio a un espectro tumoral ms diferenciado, con tumores adenoescamosos 48%, 51% adenocarcinomas y slo el 1,4% (1/65) anaplsico ( Figura 5D ). Esto representa una reduccin de 12 veces en las lesiones anaplsicas que resulta de la prdida de una copia de la Mad2 gen. Por otra parte, independientemente del genotipo, tumores adenoescamosos y adenocarcinomas mostraron niveles moderados de referencia de aneuploida tal como se detecta por el cromosoma pez por tres cromosomas separados, mientras que los tumores anaplsicos visto en el Mad2 de tipo salvaje de fondo fueron ms marcadamente aneuploides ( Figura 6A y 6B ). Este aumento en la aneuploida total refleja tanto un aumento de casi tetraploide, as como de clulas aneuploides cerca-diploides dentro de los tumores anaplsicos ( Figura S5 ). Todos los Mad2 + / + tumores tenan niveles medios Mad2 expresin ms o menos de dos veces la de Mad2 + / - tumores ( Figura S5 B , izquierda), mientras que los niveles de BubR1, otro componente del puesto de control mittico, se mantuvo equivalente entre los dos genotipos ( Figura S5 B , a la derecha). Por lo tanto, mientras que hay una unidad de Mad2 inducida por equivalente hacia la aneuploida en todos los subtipos de tumores en el Mad2 + / + fondo, es probable que slo las lesiones anaplsicos han perdido el mecanismo de vigilancia aneuploida propuesto ( Torres et al, 2010. ; Torres et al, 2007. ; Williams et al, 2008. ) que facilite su supervivencia y reproduccin. Alternativamente, Mad2 niveles pueden ser ms altos slo transitoriamente en los tumores anaplsicos durante las primeras etapas de la progresin del tumor, que podra mejorar la adquisicin de la NIC. Esto es coherente con nuestra observacin anterior de que los impulsos transitorios de Mad2 sobreexpresin pueden conferir inestabilidad significativa en las etapas posteriores de la enfermedad ( Sotillo et al., 2010 ).

La figura 6 Los tumores mamarios anaplsico en WAPT121; Mad2 + / +ratones se aneuploida, invasivas y ms metastsico Las clulas en forma de huso observados en los tumores anaplsicos sugirieron la presencia de una transicin epitelial a mesenquimal (EMT), un evento asociado con la capacidad de los tumores para invadir localmente y metstasis. De hecho, la induccin de EMT en clulas epiteliales mamarias se ha demostrado para impulsar la transformacin morfolgica, la migracin celular y la cooperacin mejorada tumorignico con oncogenes conocidos ( Yu et al., 2009 ). Los tumores anaplsicos en el WAP-T121 ajuste tieron positivo para los marcadores de EMT; prdida del marcador epitelial E-cadherina y la ganancia del marcador mesenquimal vimentina, como detectados por la co-inmunofluorescencia ( Figura 6C ). Por el contrario, los adenocarcinomas permanecieron E-cadherina positivo y negativo Vimentina independientemente del genotipo. Los tumores anaplsicos retuvieron el marcador especfico mamaria queratina 8 (TROMA) como se ve por inmunohistoqumica, excluyendo la posibilidad de que fueran reacciones de fibroblastos del estroma a una lesin epitelial ( Figura 6D ). No se observaron diferencias notables en la tasa de proliferacin ni T121 activacin transgn entre los tumores de diferente histologa o genotipo, segn lo determinado por inmunohistoqumica para Ki67 y CyclinD1, respectivamente ( Figura 6D ).Cuando se examinaron las secciones de pulmn de serie de todos los animales con el fin de determinar la frecuencia metastsica por rea total de pulmn, tumores anaplsicos en la Mad2 + / + fondo fueron significativamente ms propensos a la metstasis en comparacin con los adenocarcinomas y tumores adenoescamosos (p = 0,0342) ( Figuras 6E y 6F ). La inhibicin de la funcin de p53 por mutacin o prdida a menudo se correlaciona con la progresin tumoral y podra explicar la aparicin de las lesiones anaplsicas. Tres de cada 10WAP-T121; Mad2 + / + tumores mostraron mutaciones hotspot p53 (una adenocarcinoma y dos tumores anaplsicos), pero 10.7 no mostr evidencia de supresin de p53 o mutaciones sin sentido hotspot ( Figura S5C y S5D ) que podran dar cuenta de la distribucin de los diferentes subtipos de tumores. En general a continuacin, estos resultados muestran que en el contexto de la inhibicin de la va Rb en la glndula mamaria, Mad2 mediada por CIN acelera la progresin a los adenocarcinomas anaplsicos, una entidad clnica que se asocia con el estado triple negativo, mal pronstico y la progresin metastsica.

La normalizacin de los niveles elevados de Mad2 Rescates CIN en un p53 Ratones Mutantes Modelo
Dado que la p53 reprime Mad2 expresin en gran medida, si no exclusivamente, a travs de p21 y diafona a la va Rb, nos preguntamos si el fenotipo CIN en un modelo de ratn mutante p53 podra ser rescatado o aliviarse mediante la normalizacin de los niveles de Mad2. Se utiliz un p53 previamente desarrollado knock-in modelo en el que ambas copias de p53 se sustituyen por alelos que expresan el p53 R172P mutante ( p53 C / C ) ( Liu et al., 2004 ). Este mutante es defectuoso en la induccin de la apoptosis, sin embargo, conserva la capacidad de inducir la detencin del ciclo celular a travs de la induccin de la expresin de p21 ( Liu et al., 2004 ). En consonancia con esto, se encontr que p53 R175P , el ortlogo humano de p53 murino R172P , reprimida Mad2 la actividad del promotor en las clulas humanas ( Figuras 1F , , 7A7A y datos no mostrados). P53 C / C ratones desarrollan linfomas y sarcomas con estables , genomas diploides ( Liu et al., 2004 ).Curiosamente, cuando estos ratones se

cruzan en un p21 - / - de fondo, linfomas y sarcomas no slo desarrollan significativamente ms temprano, pero tambin son aneuploides ( Barbosa et al, 2006. ). La hiptesis de que este ltimo es una consecuencia de upregulated niveles Mad2, como habamos observado previamente en p21 - / - MEFs ( Figura 1C ). Western blot de lisados de MEF deriva de p53 de C / C y p53 C / C ; p21 - / - ratones confirmaron que Mad2 niveles estaban elevados en ausencia de p21 ( Figura 7B ). A fin de reducir estos niveles elevados de Mad2, cruzamos p53 C / C ; p21 - / - animales con Mad2 + / - ratones. En un Mad2 + / - fondo, p53 C / C , p21 - / - MEFs mostr reduccin Mad2 niveles comparables a los de los controles de tipo salvaje, mientras que los niveles de fosfato histona H3 fueron similares ( Figura 7B , S6A ).

La figura 7 La normalizacin de los niveles elevados de Mad2 Rescates CIN en un p53 Ratones Mutantes Modelo Para evaluar si la normalizacin de los niveles de Mad2 fue suficiente para rescatar el fenotipo CIN observados en p53 C / C , p21 /tumores, que supervis el desarrollo de tumores en p53 C / C , p53C / C , p21 - / - y p53 C / C ; p21 - / - ; Mad2 + / - ratones. Animales predominantemente desarrollaron sarcomas o linfomas histiocticos en el bazo, timo, hgado y sin diferencias significativas en la latencia global del tumor ( Figura S6B ). Observamos que esto puede ser debido al hecho de que en nuestro fondo gentico mixto una diferencia mucho menor entre latencias en p53 C / C y p53 C / Cp21 - / - los animales se observ en relacin con el estudio reportado en el que todos los animales estaban en un C57BL / 6 fondo puro ( Barbosa et al., 2006 ). Sin embargo, el 14% de p53 C / Cratones (2 de 14) desarrollaron linfomas, mientras que esta fraccin se increment a 40% en p53 C / C , p21 - / - ratones (8 sobre 20). En el p53 C / C , p21 - / - ; Mad2 + / - fondo significativamente menos animales eran propensos a lymphomagenesis (8%, 1 de cada 13 ratones, p = 0,0468, prueba exacta de un solo lado de Fisher) ( Figura 7C , S6C ), lo que sugiere que los niveles elevados Mad2 estimul el desarrollo de linfomas. Para determinar si los niveles elevados de Mad2 mediaban la NIC en p53 C / C ; p21 - / - tumores, se analiz el estado de ploida de los tumores mediante FISH en interfase especfica del locus en las secciones del tumor. De acuerdo con observaciones anteriores ( . Barboza et al, 2006 ), los tumores de p53 C / C ratones tenan tpicamente estables genomas diploides, mientras que en un p21 - / -tumores fondo eran altamente aneuploides ( Figura 7D ). La normalizacin de los niveles de Mad2 en p53 C / C ; p21 - / ; Mad2 + / - ratones condujo a una reduccin significativa en el nmero de tumores aneuploides (p = 0,0076; de un solo lado la prueba exacta de Fisher). Cuando hemos dividido el nmero total de clulas aneuploides en las clulas cerca de-diploides y las clulas tetraploides cerca-, nos dimos cuenta de que en p53 C / C ; p21 - / - tumores de los nmeros de clulas aneuploides cercadiploides y clulas aneuploides cerca-tetraploides fueron tanto ms alto que en los tumores que se haban desarrollado en p53 C / C o p53 C / C ; p21 - / - ; Mad2 + / - los animales ( Figura S6D ). Estos resultados indican que los niveles elevados Mad2 son en gran parte responsable de la CIN causado por la ausencia de p21 y sugieren que la sobreexpresin Mad2 es un mediador crucial de CIN en los tumores con la sealizacin defectuosa va de p53 ( Barbosa et al, 2006. ; . Liu et al, 2004 ). Ir a:

Discusin
Mientras CIN se ha observado en un gran porcentaje de tumores slidos humanos, la forma en que se plantea es ahora primero se estn explorando mecnicamente. Se ha sugerido que el puesto de control mittico, cuya funcin es la de mantener un complemento cromosmico normal, se pierde o se debilita por la mutacin de sus jugadores clave. Sin embargo, es difcil conciliar esto con la constatacin de que las mutaciones o deleciones de genes checkpoint mittico son extremadamente raros en los tumores humanos ( Prez de Castro et al, 2007. ; . Schvartzman et al, 2010 ). De hecho, las lneas celulares de cncer a menudo tienen un punto de control robusto (Tighe et al., 2001 ). Hemos argumentado que la sobreactivacin del puesto de control mittico es una causa mucho ms frecuente de CIN que la prdida o la prdida parcial de la funcin. Genes mittico puesto de control se sobreexpresa frecuentemente en tumores humanos ( Rhodes et al, 2007. ), un evento que se ha demostrado in vitro y en modelos murinos para llevar a CIN ( Hernando et al, 2004. ; Sotillo et al, 2007. ; Thompson y Compton, 2008 ). Aqu nos proporcionan evidencia directa de que la inhibicin de las vas de p53 o Rb, los eventos que se han generalizado en la malignidad humana, conduce a la regulacin positiva de Mad2 y que se requiere esta regulacin al alza para la generacin de CIN. Esto se demuestra directamente por el hecho de que Mad2 normalizacin rescata la inestabilidad observada en estos sistemas modelo. Tres estudios recientes muestran que la prdida de pRb conduce a defectos en el cromosoma condensacin y la cohesin, la estructura centrmero anormal y acumulacin de dao en el ADN in vitro ( Coschi et al, 2010. ; Manning et al, 2010. ; . van Harn et al, 2010 ) y sugieren que estas anormalidades cromosmicas conducen a la NIC observada. Estos resultados aparentemente contradictorios se pueden conciliar si, de hecho, puesto de control mittico sobreactivacin, como se ha visto con Mad2 regulacin positiva, conduce a estas anomalas, una hiptesis de que ahora se puede probar directamente. Manning et al. (2010) informaron que la sobreexpresin de E2F1 no dio lugar a defectos centromricas pero sigue siendo posible que este no condujo a niveles suficientemente altos Mad2 para inducir el efecto. Alternativamente, los cambios cromosmicos dinmicas observadas in vitro en realidad no puede ser causante de la inestabilidad observada.Tambin es importante tener en cuenta que la inactivacin de pRb solo conduce a slo un modesto incremento en Mad2 ( Figura 3A ) ( Hernando et al., 2004 ) y in vivo, esto podra no ser suficiente para conducir la inestabilidad. De hecho, tumores de la hipfisis que se desarrollan en Rb + / -ratones (y

han perdido la de tipo salvaje Rb alelo) tienen cariotipos normales en gran medida (Purdie et al, 1994. ). Decondensacin centromrica bien puede conducir a alteraciones mitticas independientes de Mad2 regulacin positiva y ser responsable de la inestabilidad residual que no fue rescatado por Mad2 normalizacin en las clulas TKO ( Figura 4B ). Hemos informado anteriormente de que la sobreexpresin de Mad2 tambin conduce a cromosoma se rompe y deleciones ( Sotillo et al., 2007 ). Sin embargo, todava no est claro cmo se forman. Los autores especulan que la estabilizacin de Securin conduce a discapacidad divisin Separase dependiente de Cohesin. Accesorios Amphitelic seran entonces resultar en estrs en los archivos adjuntos cinetocoro-microtbulo ya las regiones que albergan las cromtidas pericentromeric cohesins que no fueron retirados por desfosforilacin durante la profase. El exceso de fuerza en estos puntos presumiblemente provocar roturas en el ADN. Roturas en el ADN pericentromeric de este tipo han sido efectivamente observada en las clulas con defectos del huso ( Guerrero et al., 2010 ). La prdida homocigtica de los tres miembros de la familia Rb ( p107 , p130 y pRb ) conduce a los ms altos niveles de Mad2 ( Figura 3A ) y extensa CIN pero p130 - / - clulas tambin muestran una fuerte activacin Mad2. Ya sea p130 - / - tumores son genmicamente inestable no se ha estudiado ampliamente, pero puede haber un nivel de umbral de Mad2 requerido para la inestabilidad logrado slo a la inhibicin va completa. La inhibicin completa va se puede lograr en una variedad de maneras, incluyendo la prdida de p16 o la amplificacin de la ciclina D1, y esto puede explicar el alto porcentaje de tumores humanos que sobreexpresan Mad2 y pantalla CIN ( Wiedemeyer et al., 2010 ). CIN ha sido asociado con la progresin tumoral, la agresividad y la invasin pero la naturaleza causal del efecto primero est comenzando a ser establecido por una amplia gama de experimentos de modelizacin de ratn ( Schvartzman et al., 2010 ). El apoyo adicional es proporcionado por nuestra observacin aqu que el crecimiento de los fibrosarcomas aloinjertos derivados de Hras V12 -transformado TKO MEFs se retrasa por Mad2 normalizacin. Adems, que Mad2 heterocigosidad en el contexto de la inhibicin va Rb in vivo conduce a la desaparicin de las lesiones anaplsicas y una reduccin de puntos de capacidad metastsicos a un papel para CIN como el controlador de eventos ms tarde tumorales, entre ellos la invasin y metstasis.Recientemente hemos demostrado que la sobreexpresin Mad2 y CIN en un Kras G12D basado en modelos de tumorignesis de pulmn promueve la recurrencia del tumor despus de la retirada oncogn ( Sotillo et al., 2010 ). Curiosamente, los estudios recientes de la levadura tambin sugieren que las clulas aneuploides muestran ventajas de crecimiento en condiciones de crecimiento no ideales o condiciones de estrs ( Pavelka et al., 2010 ). Tambin mostramos aqu que la p53 reprime la expresin de la Mad2 gen a travs de la induccin de p21 y Rb cannica va de sealizacin. La evidencia ms fuerte para esto es proporcionado por la sobreexpresin de p21 en MEFs TKO, lo que demuestra un requisito de protenas de bolsillo Rb para Mad2 represin. Eso p21 mutantes que estn deteriorados en ciclina / Cdk vinculante tambin dejar de reprimir Mad2 actividad promotora apoya esta conclusin. Como se muestra en la Figura S2E , la sobreexpresin de p21 slo puede reprimir el promotor Mad2 cuando la CDH y sitios CDE/E2F estn intactas, lo que sugiere que los efectos del ciclo celular dependientes y / o independientes deben estar trabajando a travs de estos elementos promotores. Nuestra identificacin de E2Fs represor, protenas de bolsillo, ciclina B1 y ciclina-quinasa dependiente-1 (CDK-1) como protenas cuya unin es dependiente del sitio de CHR en el promotor Mad2 indica que una protena no identificada todava como estabiliza directamente bolsillo de protena-represor E2F unin a ADN a travs del sitio CHR. Por tanto, es tentador especular que estas protenas son parte del complejo CDF1 ( Figura 7E ). Este complejo represor multiproteicos tambin actuara para inhibir el potenciador transcripcional situado aguas arriba, como se sugiere por la observacin de que la prdida de la CDH y sitios E2F/CDE conduce a la activacin promotor constitutivo slo en la presencia de sitios E2F aguas arriba ( Figura S2D ). Dos observaciones sugieren, adems, que este mecanismo de regulacin de la transcripcin no es nica para Mad2 , pero es probable que tambin se aplica a otros genes de punto de control mittico. En primer lugar, los promotores de al menos tres genes de punto de control mittico, Mad2 , BubR1 y CENPE contienen sitios de unin a E2F, as como CHR y CDE sitios que son altamente conservados entre diferentes especies de vertebrados ( Figura S2F, G ) ( Hernando et al, 2004. ; Polager et al, 2002. ; Ren et al, 2002. ). En segundo lugar, la prdida de p53 o p21 en clulas primarias resulta en una regulacin al alza de tanto Mad2 y BubR1, independiente del ciclo celular ( Figuras 1A y 1C ). Dada la amplia prevalencia de CIN en tumores slidos humanos y su papel en la contribucin para escapar de la adiccin oncogn ( Sotillo et al., 2010 ), nuestros resultados proporcionan una relacin mecanicista entre los eventos de conduccin tumorales necesarias (inhibicin de la va de p53 o Rb), la progresin del tumor y escape de la intervencin teraputica. Por otra parte, nuestros resultados ponen de relieve la interconexin directa de la prdida de supresores de tumor y la inestabilidad genmica.Estrategias para atacar a las clulas aneuploides que probablemente bajo estrs ( Tang et al., 2011) pueden dar medicamentos que tendrn un impacto significativo en la progresin del cncer y la recada en los pacientes. Ir a:

Procedimientos Experimentales

Las clulas primarias, Lneas celulares y cultivo celular


TKO ( Rb - / - , p107 - / - , p130 - / - ) MEFs fueron derivados a partir de clulas ES como se describe TKO ( Sage et al, 2000. ) ( Procedimientos Experimentales Suplementarios ). El resto de MEFs se derivaron de 12,5 das de embriones. Las clulas primarias se hicieron crecer a principios de los pasajes menos que se indique. Mad2 desmontables se logr con lentiviral vectores de Open Biosystems. Mad2 derribo, 3T3, la eficiencia de la siembra, la independencia de anclaje y los ensayos de formacin focales se llevaron a cabo como se describe en los Procedimientos Experimentales suplementarios . Transformacin de TKO MEFs para la inyeccin del aloinjerto se llev a cabo con un pBabe-Hras V12 vector retroviral. Para los ensayos de CIN, TKO MEFs se sembraron a baja densidad en la cmara de diapositivas de vidrio, que se cultiva hasta que las colonias de clulas 100-500 eran visibles y se fijaron con metanol 03:01: Acetato aadi gota a gota.Anlisis FISH se realiz con dos sondas pericentromeric de cromosomas 12 y 17.

Reportero ensayos
HCT116 o clulas Saos-2 se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y la precipitacin con fosfato de calcio ( Sambrook y Russel, 2001 ), respectivamente. Luciferase construcciones contenan 235 o 204 pares de bases de la humanaMad2 promotor aguas arriba del indicador de la luciferasa de lucirnaga en el vector pGL3-Basic (Promega). P53 y p21 se expresaron a partir del vector pcDNA3 (Invitrogen). La PRL construccin (Promega), de la que Renilla se expresa constitutivamente luciferasa, fue co-transfectadas para corregir la eficiencia de transfeccin. Lucirnaga y de Renilla luciferase actividades se midieron utilizando el sistema de doble ensayo de indicador de luciferasa (Promega) y un luminmetro de microplacas Claridad Bio-Tek (Instrumentos de Bio-Tek).

El anlisis de protenas
Mad2 niveles se determinaron por Western blot de lisados RIPA. Los anticuerpos utilizados se describen en la informacin complementaria .

Ganadera
Todos los ratones estaban en una mezcla de antecedentes genticos 129/C57BL6 y se mantienen en la vivienda libre de patgenos conforme a las directrices aprobadas por el MSKCC Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisin y el Centro de Recursos de Investigacin de Animales.

Histopatologa
Los tejidos fueron fijados en formalina, embebidas en parafina y se seccionaron a 5 micras. Los anticuerpos primarios utilizados para inmunohistoqumica fueron Ki67 (Vector, 1:10000), CyclinD1 (Thermo Scientific, 1:500) y queratina 8 (TROMA). La inmunofluorescencia se llev a cabo utilizando el anticuerpo anti-cadherina E (BD Transduccin de 2,5 g / ml) y anti-vimentina (Progen 0,1 g / ml) anticuerpos. Hematoxilina y eosina tincin se utiliz para el anlisis de la histologa normal y los tumores evaluados sin conocimiento previo del genotipo.

Cromosoma Fluorescente In Situ hibridacin (FISH)


Las sondas fueron sintetizados a partir de tres clones BAC pericentromeric del cromosoma 12 (Car 12-RP23-54G4, RP23-RP23 y 41E22 16809 5a), el cromosoma 16 (Car 16-RP23-290E4, RP23-356A24 y RP24 258J4 4a) y el cromosoma 17 ( Chr. 17RP23-354J18-6c, RP23-73N16 y RP23-202G20) y marcada con SpectrumGreen-dUTP, SpectrumRed-dUTP y SpectrumOrangedUTP (Vysis), respectivamente. El BAC AND fueron etiquetados por desplazamiento de la mella de acuerdo con protocolos estndar. Se evalu el nmero de seales de hibridacin de estas sondas en un mnimo de 150 ncleos en interfase con contornos bien delineados.

http://europepmc.org/articles/PMC3120099