Apuntes del

CURSO DE EVALUACION Y CONGELACION DE SEMEN BOVINO

Dr. Decuadro-Hansen
Director Tcnico de IMV Cassou Francia

Colaboradores:

Dr. Rumelio Spiazzi

Director Tcnico de CLIA

Dr. Andrs Garca Riva

SENASA

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1 y 2 de mayo de 1997

Centro de Inseminacin Artificial

CLIA S.A.
Urdinarrain, Entre Rios Argentina

Criterios de calidad en un Centro de Inseminacin Artificial

El semen bovino destinado a la inseminacin artificial debe responder a los siguientes criterios de calidad: 1) Calidad sanitaria: Debe estar libre de todo agente patgeno transmisible por semen. 2) Calidad biolgica: 2.a. Un mnimo de 8 millones de espermatozoides con motilidad progresiva rectilnea (MPR) por pajuela despus de la congelacin y > 25 % de espermatozoides con MPR. 2.b. Entre 6 y 8 millones de espermatozoides con MPR si el semen posee >30% de espermatozoides con MPR y una tasa de anormalidades <25%. 2.c. Entre 6 y 8 millones de espermatozoides con MPR si el semen posee >30% de espermatozoides con MPR y datos de fertilidad (si sobre 300 primoinseminaciones el porcentaje de no retorno 60/90 es equivalente al obtenido con ms de 8 millones de espermatozoides con MPR). La concentracin ptima de espermatozoides por dosis es toro dependiente. En el 20% de los toros no existe correlacin significativa entre la concentracin por dosis y la tasa de no retorno.
El nmero de espermatozoides con MPR de una pajuela se obtiene multiplicando el porcentaje de espermatozoides con MPR por el nmero de espermatozoides totales en la pajuela.

3) Calidad bacteriolgica: Es testigo indirecto de la calidad higinica del CIA. El objetivo es lograr que el 95% de las pajuelas contengan menos de 500 UFC totales. 4) Identificacin correcta: La pajuela debe estar correctamente identificada. En primer lugar la identificacin debe corresponder al semen contenido en la pajuela, en segundo lugar la identificacin puede presentar exigencias reglamentarias (ej. en la CEE se identifica es status sanitario del toro para IBR). ISO 9002 da las normas de calidad para un CIA. El primer CIA en adoptarlas fue el de Quebec.

Criterios de evaluacin de un eyaculado

Un eyaculado puede ser congelado si responde a:

Criterios Aspecto Concentracin Motilidad masal Motilidad individual % espermatozoides anormales

Frecuencia de control c/eyaculado c/eyaculado c/eyaculado c/eyaculado Sobre los 2dos eyaculados de las 3 primeras colectas cuando comienza a producir semen, luego sobre el 2do eyaculado 1 vez por mes

Lmite de utilizacin Ausencia de alteraciones 0.3 x 109/ml(1) 3 70% 25%

% espermatozoides con anormalidades mayores

15%

(1) no acepta menos porque se producira un shock osmtico por el glicerol.

Evaluacin de semen
Volumen
Se estima en base al peso, ya que es ms exacto que por lectura directa. Se utiliza la frmula siguiente: Volumen= Peso seminal/densidad promedio del semen (1.05) Dos factores falsean la exactitud de la medida directa del volumen: 1) la espuma y 2) la imprecisin de las graduaciones. Se utilizan tubos de recoleccin descartables y se pesa con balanza de precisin.

Motilidad masal
Se evala en la periferia de una gota gruesa de 5 l, sobre portaobjetos sin cubre en platina trmica a 37-38C. Se califica de 0 a 5.

Motilidad individual
Diluir 7 l de semen en 700 l de diluyente precalentado a 32C. De la dilucin tomar una gota de 10-12 l y colocarla entre porta y cubreobjetos precalentados. Se califica el porcentaje de espermatozoides con MPR y el vigor.

Concentracin Pueden realizarse 4 tipos de determinaciones:

a) subjetiva por observacin macroscpica del aspecto del eyaculado o al evaluar la motilidad masal. b) por hemocitometra. c) por fotometra. d) por coulter counter.

Uso del fotmetro

Encender el fotmetro 30 minutos antes de realizar la lectura. Calibrar con 4 ml de SF(1) (blanco). SF: Cl Na 9 o 7 . Pajuela mediana: vol. til 0.49 ml, vol. total tomado 0.52 ml Pajuela fina: vol. til 0.21 ml, vol. total tomado 0.23 ml. Diluir 20 l de semen en 4 ml de SF (tasa de dilucin 1/200). La muestra de semen se saca de la mitad del tubo. Homogeneizar y colocar en la cubeta del fotmetro. Esperar 3 segundos la estabilizacin de las turbulencias formadas luego de homogeneizar la cubeta (mezcla suero fisiolgico-semen), ya que las mismas pueden modificar la lectura. En el modelo de fotmetro IMV Aiglon estos 3 segundos estn includos en el programa informtico, por lo tanto es suficiente apretar la tecla "measure" para que el fotmetro comience a realizar la lectura a los 3 segundos. Establecer el nmero de espermatozoides por pajuela(2). Realizar la lectura de los ml de diluyentes necesarios y el nmero de dosis finales.
(1) Puede utilizarse citrato de sodio al 2.92%. No utilizar suero formolado porque

modifica la concentracin. (2) El nmero de espermatozoides por pajuela debe asignarse en funcin de la calidad original del semen, la edad del toro y de su ritmo de colecta. Con toros muy frtiles pueden utilizarse concentraciones extremadamente bajas de 5-8 millones de espermatozoides totales/pajuela, siempre que el toro tenga un ritmo de colecta continuo (ej. 2 eyaculados 2 veces por semana). En Francia utilizan: 15 millones de espermatozoides totales en toros de elite 20 millones de espermatozoides totales en toros estandar 23 millones de espermatozoides totales en toros de testaje (fertilidad desconocida). Cambiar el filtro del fotmetro cada 3 aos y la lmpara cada 1.5 aos. La precisin del fotmetro es del 95%.

Test de Schalm
0.5 ml de semen + 2.5 ml de reactivo (el mismo que CMT). Mezclar por rotacin de la paleta CMT durante 30 segundos. Es conveniente realizar este test cada 15 das de rutina o si se constatan problemas de calidad (ej. disminucin de la concentracin o de la motilidad sin causas aparentes, eyaculados "grises" o ms de 30% de anormalidades). Si el resultado es Schalm+ realizar examen clnico. Frente a sospecha de seminovesiculitis subclnica, recolectar lquido de vesculas seminales con sonda uretral humana nro. 8 y realizar test de Schalm y control microbiolgico al lquido vesicular. Tambin se puede enviar semen para realizar control microbiolgico y antibiograma. Se administra como tratamiento preventivo. florfenicol hasta obtener el resultado del antibiograma y poder utilizar el antibitico recomendado.
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Frotis
Se realiza en semen fresco y descongelado. Se realiza 1 vez por mes a los 2dos eyaculados. Se evala: % de espermatozoides vivos y muertos y anormalidades mayores y menores. La congelacin no modifica en forma significativa el % de anormalidades. Diluir 20 l de semen puro en 4 ml de SF precalentado (1/200). Colocar una gota de 10 l de semen diluido y una gota de 10 l de colorante (Eosina/Nigrosina o Eosina/Azul de anilina) sobre porta precalentado. Mezclar durante 10 segundos y esperar 30 segundos sin tocar la gota para que el colorante penetre en los espermatozoides. Realizar el frotis. Secar a temperatura ambiente y examinar a 400 x o ms. El azul de anilina da un mejor contraste que la nigrosina.

Anormalidades mayores Gota citoplasmtica proximal Cabezas anormales, ej. piriformes Colas fracturadas o enrolladas Deformacin de la pieza intermedia Espermatozoides mal desarrollados, cabezas dobles o triples Crteres Acrosoma en botn Anormalidades menores Gota citoplasmtica distal Colas sueltas Cola replegada Cabezas estrechas o gigantes Ruptura parcial del cuello.

Si la evaluacin se realiza por contraste de interferencia diferencial (DIC) a 1250 x se puede permitir un mayor porcentaje de anormalidades totales (ej. 30%). Es el nico que permite visualizar los crteres. El frotis clsico (E/N o E/AN) no permite diagnosticar este problema. Se encuentran 2 tipos de crteres: aislados y en diadema o collar de perlas. Se considera una de las
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primeras manifestaciones clnicas frente a la degeneracin testicular. La dexametasona a altas dosis puede provocar este defecto. Que el eyaculado tenga anormalidades no indica necesariamente que no se pueda congelar, en algunos casos se puede compensar aumentando las dosis inseminante. Preparacin de Eosina/Nigrosina 1 g eosina + 2 g nigrosina + 3.57 g trisodiocitrato + agua bidest. tibia csp 100ml. Homogeneizar bien y filtrar con gasa de 4 espesores. Esta solucin se puede guardar a 4C chequeando mensualmente el pH. Se le puede disminuir el pH agregando una solucin de cido ctrico concentrada hasta pH 6.7 Preparacin de Eosina//Azul de Anilina 1g eosina + 8 g azul de anilina + 2 g trisodiocitrato + agua bidest. tibia csp 100 ml. Los colorantes puros pueden adquirirse en IMV. En el frotis se evala: a) Integridad de la membrana Frotis de Eosina/Nigrosina Frotis de Eosina/Azul de Anilina Colorantes fluorescentes: SyBR14+PI (SyBR14 marca espermatozoides vivos de verde y PI marca espermatozoides muertos de rojo) Colorante fluorescente Hoechst 3358 El test de resistencia osmtica (realizado entre porta y cubre, no en frotis) evala tambin la integridad de la membrana. b)Acrosoma Frotis en inmersin a 1250 x en contraste de fase para ver anormalidades de acrosoma (una de las ms comunes es el acrosoma en botn) Colorantes fluorescentes

Para evaluacin en "fase lquida" de anormalidades por DIC se utiliza la fijacin de Hancock: a) Semen fresco: Se diluye 50 l de semen puro (2 gotas) en 2 ml de suero fisiolgico formolado al 4% tibio y se homogeneiza. b) Semen congelado: b.1. en diluyente tris/yema de huevo 1 pajuela fina en 2 ml de suero fisiolgico formolado al 4% 1 pajuela mediana en 4 ml de suero fisiolgico formolado al 4%. Centrifugar a 300 g durante 10 minutos (no ms de 1.000 R.P.M.) Sacar el sobrenadante y agregar 2 o 4 ml de suero fisiolgico formolado. b.2. en diluyente Biociphos plus 1 pajuela fina en 2 ml de suero fisiolgico formolado al 4% 1 pajuela mediana en 4 ml de suero fisiolgico formolado al 4%. Luego homogeneizar. Cuando se utiliza leche se debe centrifugar 2 o 3 veces. Se deja caer 2-3 ml de la dilucin en un portaobjetos. Despus se pone vertical para que corra el lquido. Se deja secar vertical y luego se sumerge en agua destilada durante 5 minutos. Se seca y se coloca un cubreobjetos, poniendo previamente una gota de agua. Se observa a 1250 x en aceite de inmersin. Envo de muestras de semen al laboratorio a los efectos de diagnosticar anormalidades Preparacin de suero formolado para envo al laboratorio para frotis (cuando se colecta a campo): 40 g Cl Na + 10 ml formol + agua bidest. csp 1000 ml. Colocar 2 gotas de semen con pipeta pasteur (o 50 l) + 2 ml de suero formolado.

BIOCIPHOS PLUS
El BIOCIPHOS PLUS es un diluyente para semen bovino desarrollado por la Compaa IMV. Sus principales ventajas son: No contiene sustancias de origen animal Extremadamente fcil de preparar Gracias a su claridad facilita un mejor anlisis de los espermatozoides Est disponible esterilizado en frascos de 100 ml e incluye: una solucin salina concentrada con glicerol (6.4%), sustituto de yema de huevo y antibiticos gentamicina, tilosina, lincomicina y espectinomicina (de acuerdo a la legislacin europea).

Preparacin del BIOCIPHOS PLUS

Homogeneizar el frasco B+ y colocarlo en bao mara a 32C durante 1015 minutos. Preparar 400 ml de agua bidestilada estril apirgena y colocarla en bao mara a 32C durante 10-15 minutos.

Evitar que el nivel de agua sea muy alto. Secar el frasco B+ y el recipiente con 400 ml de agua bidestilada. Dejar caer el B+ en un recipiente seco, estril sin tocar los bordes. Agregar los 400 ml de agua bidestilada. Homogeneizar bien. Enjuagar el frasco B+ 2 o 3 veces con la solucin reconstituida. Homogeneizar la mezcla por rotacin y no sacudiendo, lo cual evita la oxigenacin del producto.

El producto est listo para ser utilizado. Debe utilizarse dentro de las 6 hs de reconstituido para evitar la contaminacin microbiana. Si se quiere congelar la solucin reconstituida: homogeneizar, hacer alicuotas y congelar en freezer. No dejar pasar mucho tiempo antes de congelarlo. No recongelar. La decongelacin del B+ debe ser realizada de la siguiente manera: Sacar el frasco B+ reconstituido del freezer Colocarlo en bao mara a 32C Una vez descongelado, secar el recipiente y homogeneizar el producto ya que el glicerol tiende a sedimentar (densidad 1.257).

Protocolo de dilucin con BIOCIPHOS PLUS

Utilizar protocolo DILUCION UNICA A 32C Semen en pajuelas a 4C

Puntos importantes Conservar el frasco B+ a 4C (el producto puede transportarse a

temperatura ambiente y al resguardo de la luz). Es recomendable trabajar con baos mara a 32C. En efecto, el principio de la congelacin de semen es bajar el metabolismo celular, hacerlo desde la colecta sin realizar un shock trmico. Al llegar el semen se hace el tamponado con igual cantidad de diluyente. Se homogeneiza. Se deja 10 minutos a 32C en bao mara. Calcular la dilucin final directamente por fotometra o en base a la siguiente frmula: V1 x C1 = V2 x C2
V1= volumen recolectado, C1= concentracin del eyaculado, V2=valor a calcular del semen diluido y C2= concentracin final de la pajuela.

Ej.

Volumen del eyaculado= 5 ml Concentracin= 1.700 x 106 esp/ml Esp. totales/pajuela=30 x 106 esp/pajuela

V1 (ml) x C1 (esp/ml) = V2 (ml) x C2 (esp/ml) 5 x 1.700 x 106 = V2 x 60 x 106 V2= 5 ml x 1.700 x 106 esp/ml =141.6 ml = Volumen final diluido(VFD) 60 x 106 esp/ml

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VFD- eyaculado= Volumen de diluyente a agregar 141.6 ml - 5 ml = 136.6 ml 136.6 - 5 ml (diluyente tampn) = 131.6 ml Total de pajuelas = Vol. de diluyente + Vol. eyaculado Vol. pajuela Total de pajuelas = 136.6 ml + 5 ml = 283 0.5 ml Dejar caer el eyaculado tamponado sobre el diluyente y no homogeneizar. Es muy prctico utilizar mamaderas (vende IMV) por diferentes razones: a) espesor de vidrio que permite un descenso correcto de la temperatura, b) calidad del vidrio que permite la esterilizacin por calor seco (180C 1 h), c) forma tubular. Dejar 10 minutos a temperatura de laboratorio (20C). Homogeneizar y realizar el llenado de pajuelas a temperatura ambiente. El sistema integrado imprime las pajuelas llenas. Debe aislar las pajuelas del fro de la vitrina. Las pajuelas se colocan verticalmente con el tapn hacia abajo en un gobelet (no ms de 300 pajuelas finas ni ms de 150 pajuelas medianas/gobelet). Colocar el gobelet en una vitrina refrigerada y ventilada a 4C. Debe pasar de 32C a 4C en no ms de 1-1.50 h. Tambin puede realizarse un enfriamiento horizontal sobre racks, colocando 4 racks en una caja de cartn fina a 4C. Acostumbrarse a agregar hielo en el agua del recipiente pero slo a partir del momento en que la temperatura lleg a 20C. Esto es importante si la vitrina refrigerada no es ventilada. Hacer el equilibramiento (3-7 hs).

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LAICIPHOS 488
Preparacin del diluyente
Seguir las instrucciones de preparacin al pie de la letra. Abrir el sachet del Laiciphos y retirar el sobre con el desecante. Colocar el contenido en un recipiente y agregar 400 ml de agua bidestilada estril calentada a 40C en bao mara.

Agitar enrgicamente por rotacin, evitando la oxigenacin del diluyente. Colocar 50 ml de yema de huevo fresco en 100 ml de agua bidestilada a 50C. Homogeneizar la mezcla. Utilizar jeringas para medir la yema de huevo (no urilizar jeringas con mbolo de goma).

Mezclar la yema de huevo/agua con el Laiciphos/agua. Con la solucin obtenida, "enjuagar" varias veces el frasco que se utiliz para preparar la mezcla de yema de huevo/agua.

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 A partir de este momento fraccionar a los efectos de preparar los 2 diluyentes: 1. El diluyente "caliente" a 32-34C al cual se le agrega 3% de glicerol. 2. El diluyente "fro" a 4C al cual se le agrega 11% de glicerol. A los efectos de fluidificar el glicerol, calentarlo en bao mara aproximadamente a 45-50C durante 10 a 15 minutos. Esto permitir ser ms exacto en la medicin de cantidades (3 y 11%), ya que al ser ms fluido se adhiere menos y se aspira mejor con las jeringas. Hacer caer el glicerol en el medio de la mezcla Laiciphos/yema/agua evitando que toque las paredes del frasco ya que resulta difcil "despegarlo". Protocolo de dilucin del LAICIPHOS

Tamponar el eyaculado con igual volumen de Laiciphos a 32C y 3% de glicerol. Dejar caer el diluyente sobre las paredes del tubo de colecta (ej. 5 ml de semen + 5 ml de diluyente). Colocar el tubo de eyaculado tamponado en bao mara a 32C durante 5 a 10 minutos. Practicar la dilucin 1 a 32C y 3% de glicerol dejando caer el eyaculado tamponado sobre el diluyente. La cantidad de diluyente 1 debe ser el 50% del volumen total de diluyente. Si hay que emplear 40 ml de diluyente 3% de glicerol, considerar que ya se utiliz 5 ml para tamponar, por lo tanto utilizar 35 ml. Tomar agua del bao mara a 32C y colocarla en un recipiente plstico. Luego colocar la mamadera en dicho recipiente. Colocar un termmetro de alcohol en el agua. Llevar el conjunto a una vitrina refrigerada a 4C. Si la temperatura no desciende rpidamente es recomendable colocar cubitos de hielo en el agua pero a partir de que el termmetro indique 20C. Cuando llega a 4C practicar la dilucin 2 con el Laiciphos 11% glicerol a 4C en 2 veces con 15 a 20 minutos de intervalo entre ellas. Ej. 20 ml, esperar 20 minutos y agregar los ltimos 20 ml. Equilibramiento a 4C durante 5 hs. Llenado de pajuelas. No olvidar enfriar las pajuelas y los racks a 4C antes de cargar las pajuelas y los racks. Congelar.
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Puntos importantes El diluyente Laiciphos contiene leche descremada 100% de alta calidad seleccionada por estudios de eficacia biolgica as como 2 tampones salinos, 2 sustratos energticos, 1 estabilizador de la membrana espermtica y 4 antibiticos. Es recomendable conservar los sachets en heladera pero dentro de una bolsa de plstico a los efectos de evitar la humedad. No obstante es posible la conservacin a temperatura ambiente sin alteracin de la calidad biolgica del producto. Utilizar yemas de huevos frescos. Lavar previamente la cscara y desinfectar con alcohol 70. Separar bien la yema de la clara, perforar la membrana vitelina con una aguja estril. Preparar el diluyente 1 hora antes de utilizarlo, homogeneizar antes de practicar la dilucin. Utilizar agua de alta calidad: bidestilada, estril, apirgena o calidad equivalente. El agua es el principal constituyente de un diluyente, su calidad debe ser excelente (pH 5-7, baja resistividad elctrica, etc.). Medir el glicerol a agregar con jeringas de plstico sin mbolo de goma (ej. Laiciphos I 32C (97 ml + 3 ml de glicerol).

Protocolo de dilucin de USA (CSS)

1. Agregar antibiticos al eyaculado, sin el diluyente y dejar 3 a 5 minutos antes de la dilucin. 2. Dilucin: se realiza a 32C con base salina yema de huevo antibiticos sin glicerol (USA sostiene que los ATB no actan en presencia de glicerol) 3. Vitrina o heladera a 4C: se lleva de 32C a 4C. 4. Dilucin: se realiza a 4C con base salina yema de huevo glicerol sin antibiticos 5. Equilibramiento 6. Llenado de pajuelas 7. Congelacin.
Nota: el disertante considera que el protocolo europeo es superior en eficacia biolgica y similar en eficacia microbiolgica.

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La pajuela Puntos importantes

IMV ha desarrollado una pajuela por especie animal o uso. As existe una pajuela para semen fresco de toro diferente a la de semen congelado, una pajuela para semen de conejo, etc. Las pajuelas son: transparentes transparentes coloreadas o pastel coloreadas (24 colores) finas (0.25 ml) o medianas (0.50 ml)

Cmo llenar y sellar las pajuelas Existen 2 sistemas de llenado: a) Llenado y sellado por ultrasonido automtico con mquinas MRS I, MRS III, sistema integrado (llena, imprime y sella 13.000 pajuelas/h). b) llenado y sellado manual con polvo alcohol polivinlico: Preparar los sujetadores con suficiente antelacin para lo cual tomar un pequeo puado de pajuelas y colocarlas en el ngulo del sujetador.

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 Cerrar suavemente sosteniendo al mismo tiempo las pajuelas. Las mismas se deslizarn. Luego cerrar el sujetador. Cada sujetador contendr un nmero exacto de pajuelas (ej. 15 pajuelas de 0.5 ml). Alinear las pajuelas por golpeteo del lado opuesto al de llenado (evitar siempre la contaminacin). Preparar el soporte de cubetas (Ref. IMV GC 003) y las cubetas de plstico (Ref. IMV GC 000) as como el junquillo (Ref. IMV EA 101) y los dientes que vienen con las cubetas. Preparar el polvo sellador (Ref. IMV segn colores, hay 6 ej. verde EA 581) y la bomba de aspiracin con su pedal. Conectar el peine de aspiracin 15 brocas (Ref. IMV B 103) en el cao que sale de la bomba y enchufar la misma. A los efectos de realizar el llenado de las pajuelas, tomar las primeras 15 pajuelas (por el sujetador) e introducir los dientes del peine en la abertura de la pajuela del lado del tapn usina. Para ello, y a los efectos de agilizar es conveniente: acercar en diagonal el peine y las pajuelas e introducir las dos primeras del lado ms cercano al cao, a posteriori elevar el sujetador y todas las pajuelas ingresarn en los dientes.

Accionar el pedal de la bomba 15 segundos antes de aspirar. Descender las pajuelas en la cubeta y al observar que el semen sube, cerrar el "orificio" superior con el dedo. Desactivar la bomba y golpear las pajuelas 3 o 4 veces en los dientes para que se forme la burbuja de aire. El tapn usina debe ser humidificado de la siguiente manera: Humidificar el primer algodn El alcohol polivinlico y el inicio del segundo algodn.

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Por lo tanto la bomba o la mquina selladora debe ser regulada en funcin de esto. La burbuja de aire debe ser grande. Las agujas de llenado o los dientes del peine de llenado manual le confieren el tamao ideal. La pajuela puede sellarse por ultrasonido (mquinas IMV) o por alcohol polivinlico. El sellado por calor es menos eficaz y puede originar la explosin de la pajuela. Al sellar con alcohol polivinlico recordar: Preparar el polvo en una caja de Petri. Achatar la superficie con la tapa de la caja de Petri. Colocar el conjunto a 4C al practicar esta forma de llenado. Golpear repetidamente el conjunto de pajuelas sobre el polvo sellador. No tocar las pajuelas con la mano. Verificar que todas las pajuelas hayan sido selladas correctamente. Retirar el exceso de polvo sellador suavemente con papel. Colocar las pajuelas verticalmente en un recipiente de agua a 4C a los efectos de polimerizar el alcohol polivinlico.

Secar la extremidad de la pajuela y colocar en racks. El polvo sellador debe abarcar aproximadamente 1/3 de la burbuja de aire. La explosin de la pajuela se evita por: buena humidificacin del tapn, buen sellado, presencia de burbuja de aire.

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Congelacin
Puede realizarse de diferentes formas: a) Vapores de nitrgeno: el rack debe colocarse a una temperatura entre -90C a -110C. La altura del rack con respecto al nivel de nitrgeno puede variar enormemente segn el recipiente utilizado. Debe permanecer en vapores de nitrgeno durante un mnimo de 9 minutos. b) Congeladora programable. Puntos importantes Atencin con la manipulacin de las pajuelas. Trabajar rpidamente. Una vez que pasaron los 9-10 minutos llenar un gobelet con nitrgeno lquido, introducirlo en la congeladora, tomar rpidamente las pajuelas en el sentido de los dientes del rack y sumergirlas de inmediato en el nitrgeno lquido. Curva de congelamiento El pasaje de lquido a slido se produce a -10C. Hasta -10C la velocidad de enfriamiento es de 5C/minuto, a los -10C se realiza el seeding, desde -10C hasta -100C es de 40C/minuto y desde -100C hasta -140C es de 20C/minuto. Luego va al termo de nitrgeno lquido.

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Descongelado y armado de la pistola

Puntos importantes Pajuela fina: mnimo 34C por 21 segundos (pasa de -196C a 34C en 21 segundos). Se puede realizar a 37C por 1 minuto. Pajuela mediana: mnimo 35C por 30 segundos. Se puede realizar 37C por 1 minuto. Calentar el pistolete antes de introducir la pajuela. Secar bien la pajuela. Verificar su sellado e identificacin. Sacudir la pajuela y colocarla en la pistola. Cortar la pajuela sobre la burbuja de aire. Armar la pistola con la vaina y llevarla en la espalda (lugar del cuerpo con 34C). Se admite que en todo el proceso (dilucin, enfriado, congelacin y descongelacin) muere aproximadamente entre el 40-50% de los espermatozoides.

Evaluacin de semen descongelado

1 evaluacin Se realiza 48 hs postcongelacin. Tomar 3 pajuelas de cada eyaculado al azar. Descongelar a 37C por 1 minuto. Se junta el contenido de las 3 pajuelas en un tubo y de all se toman 3 gotas (10-12 ul c/u) y se colocan sobre un portaobjetos precalentado, colocando un cubre sobre cada una (colocar el cubre rpido para que no se seque la gota). Existe un "efecto pajuela" y un "efecto gota", por eso se evalan 3 pajuelas y se toman 3 gotas.

Siempre colocar el objetivo del microscopio en el centro de la gota porque cuando pasa el tiempo los espermatozoides van hacia los bordes. Siempre realizar la observacin rpidamente. De esta forma evaluar:
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1. Porcentaje de vivos y motilidad Es el estudio del porcentaje de reanimados y el vigor de los mismos. Dicho examen permite monitorear el trabajo de laboratorio y estimar la tasa de no retorno. Utiliza una clasificacin subjetiva del vigor. 1. no hay motilidad progresiva 2. hay motilidad progresiva y no hay rapidez 3. hay motilidad progresiva y hay rapidez 4. amplitud de movimiento progresivo con vibracin de cabeza (ALH) Se da mucha importancia al vigor, ms que al porcentaje de reactivados. La correlacin existente entre la motilidad a la descongelacin inmediata y la tasa de no retorno es del orden de 0.5. Sin embargo las misma es dependiente de la concentracin de espermatozoides por pajuela. 2. Test de termoresistencia (TTR) Consiste en poner el semen a determinada temperatura e ir haciendo evaluaciones a medida que pasa el tiempo. Existen variaciones de este test (ms de 10 protocolos en todo el mundo). Variaciones segn los CIA: -temperatura de 25 a 39C, -bao mara con o sin agua circulante, dejarlo prendido o apagarlo, -tiempos: puede ser T0, T1h, T2h, T3h, etc., -pajuelas directamente en el bao mara o se coloca el contenido dentro de un tubo, -oscuridad o luz. No esiste un lenguaje comn con respecto al TTR a nivel mundial lo que lo hace poco comparable. El problema es la armonizacin entre centros. En Francia menos de un 10% de los CIA practican el TTR, adems no encuentran correlacin entre este test y la fertilidad. Procedimiento: Tomar 3 tubos y colocar el contenido de 2 pajuelas en cada uno y llevarlos a bao mara a 35-36C a la oscuridad, con agua no circulante. Realizar las determinaciones a T0, T1h, T2h y T3h.

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A los efectos de calificar correctamente una pajuela cuya concentracin en espermatozoides sea alta, es altamente recomendable diluirla en citrato de sodio (1.4 g en 50 ml de agua bidestilada). Ej. 500 ul de citrato de sodio precalentado en tubo a 34C en el cual se diluye el contenido de una pajuela. No usar suero fisiolgico al 9 porque se produce un shock osmtico, usar al 7 .

3. Acrosomas
Se evala el porcentaje de espermatozoides con acrosoma alterado. Se puede realizar por: a) contraste de fase aumento 1250 x b) Fluorescencia.

4. Test de resistencia osmtica

Es una prueba de integridad de membrana. Se coloca el contenido de una pajuela en una solucin hipoosmtica de fructosa y citrato de sodio (100 mosm/kg de agua). Se utilizan 2 ml y 1 ml de sn hipoosmtica para pajuelas mediana y fina respectivamente. Se incuba en bao mara 60 minutos a 37-38C. Colocar 2 gotas de 6 l entre porta y cubreobjetos por cada tubo. Se cuentan 200 clulas a 400 x. Los espermatozoides con colas enrolladas estn vivos (reaccionantes). Cuanto ms colas enrolladas, mejor calidad. Debe haber un 40% de reaccionantes. Se realiza a diferentes tiempos: To, T1h, T2h. Solucin para test de termoresistencia Fructosa 9g Citrato trisdico 4.9 g csp 1.000 ml agua destilada De todas las evaluaciones, las de mayor importancia son las de motilidad y calidad de la misma y porcentaje de vivos. No existe ningn examen in vitro que est altamente correlacionado con la fertilidad. Luego de esta primera evaluacin se realiza un almacenamiento transitorio hasta que a los 30 das se hace el almacenamiento definitivo tras una nueva evaluacin.

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Combinaciones de antibiticos
1. Sistema CSS (Certified Service Semen) de NAAB (National Association of Animal Breeders): Gentamicina (Lab. Schering) 250 ug/ml Tilosina (Lab. Elanco) 50 ug/ml Lincomicina (Lab. Upjohn) 150 ug/ml Espectinomicina (Lab. Upjohn) 300 ug/ml

Concentraciones finales

USA solamente acepta esta combinacin de antibiticos para diluyentes y solamente de estos laboratorios. Protocolo I Agregar ATB y dejar 5 minutos a 32C, II Agregar primera fraccin s/glicerol y ATB. Enfriar de 32C a 4C >2hs III Agregar segunda fraccin s/ATB y todo el glicerol. 2. Sistema CEE (europeo). Protocolo 88/407. 2.1.Igual combinacin que CSS (GTLS). 6.5-7% glicerol. 2.2. Penicilina 500 UI/ml Estreptomicina 500 mg/ml Espectinomicina 300 ug/ml Lincomicina 150 ug/ml. Las finalidades del uso de ATB son : Controlar la flora banal: proteus, micrococos, estreptococos, etc. Controlar la flora patgena eventualmente presente en el semen: Campylobacter foetus, Haemophilus somnus, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovi genitali, Ureaplasma. Mejorar la resistencia osmtica del semen al descongelarlo. Hoy de dice que la combinacin GTLS subestima el control del mycoplasma. El componente del diluyente que ms contamina el semen es la yema de huevo. Normas OIE: <500 UFC/pajuela Clases UFC/ml I <500 II 500-5000 III >5000

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Limpieza e higiene de materiales

Vaginas artificiales Luego de colectar: Colocar en bao de agua tibia y sumergir 15 minutos con clorhexidina en concentraciones dbiles. Tambin se pueden utilizar amonios cuaternarios. Cepillar con jabn neutro, usar limpiatubos. Enjuagar bien con agua. Enjuagar con agua destilada. Rociar con alcohol 70 (no 90 porque altera la goma). Secar. No lavar a ms de 60C porque se altera la goma. Nunca utilizar una vagina hmeda ni recin rociada con alcohol. En caso de utilizacin inmediata, lavarla con suero fisiolgico antes de colectar. Material de vidrio Enjuagar con agua. Cepillar con detergente neutro (sin fosfatos). Enjuagar con agua. Enjuagar con agua destilada. Secar. Rociar con alcohol 70, que arrastra el agua y seca las gotitas. Tapar con papel de aluminio. Colocar en estufa a 180C por 1 hora.

Higiene de toros
Los toros se lavan 1 vez/mes. Se cortan los pelos periprepuciales. Utilizar lubricante KY de J&J y aceite de hgado de bacalao para los toros que tienen la mucosa lesionada. La cavidad prepucial no se lava excepto si la zona periprepucial est sucia o si hay lesiones en el orificio prepucial. Solo lavar la cavidad prepucial si se va a realizar electroeyaculacin, porque a veces eyaculan dentro del prepucio. Se realiza con suero fisiolgico luego de hacer orinar al toro por masaje circular del orificio prepucial externo.

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Exigencias sanitarias para los toros dadores en Francia

Establecimiento de origen: Rodeo libre de Brucelosis, Tuberculosis y Leucosis. Toro: libre de enfermedades infecciosas del bovino (listas A y B de la OIE) Madre del toro: libre de Brucelosis, Tuberculosis y Leucosis. Que no haya sntomas clnicos de IBR. Se hace el control de cuarentena al toro durante 60 das (pruebas oficialmente aceptadas).

Enfermedad TBC Brucelosis Leucosis BVD IBR Campylobact. Trichomoniasis

Primeros 30 das ID y comparada Wright 2ME y fij. de complemento ID o ELISA aislamiento viral SN o ELISA IFD o cultivo de lq. prepucial cultivo de lq. prepucial

Segundos 30 das

Wright 2ME y fij . de complemento

SN o ELISA

Se realiza cultivo bacteriolgico de semen (UFC) y examen clnico del toro. Estos controles los hace un servicio semioficila (UNCEIA). Luego se realizan controles bianuales (Brucelosis, Tuberculosis, Leptospirosis, Leucosis, IBR, BVD, Trichomoniasis y Campylobacteriosis) y clnico del toro.

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Sospecha de IBR Luego de obtener un examen serolgico negativo y con sospecha de animales infectados latentes practicarse el Test de LCR que permite el descubrimiento de estos casos. D0 (da 0): serologa IBR. D1 a 4: inyeccin de una cantidad equivalente a 12 mg del ester monofosfrico cido anhidro de dexametasona c/100 kg de PV. D5 a 10: hisopado nasal y prepucial. D20: serologa IBR. D30: serologa IBR. En el intercambio de semen entre pases de la CEE se tiene sumo cuidado con IBR. En caso de pases que tengan toros seropositivos (vacunacin o infeccin ?) en sus CIA se practica un control virolgico del semen importado (5 pajuelas en el laboratorio para el control de reproductores Maison, Alfort). A su vez en Europa se debe marcar en la pajuela el status sanitario del toro con respecto a IBR (IBR pos o IBR neg). Semen fresco En Francia, Holanda, Irlanda y Nueva Zelanda trabajan una proporcin con semen fresco. En Francia esa proporcin es el 2%. Conservan semen a 4C durante 4 das. El tercer da cae un poco la fertilidad. Se trabaja con una pajuela especial. Se obtienen 4-5 veces ms dosis (2.5 a 5 x 106 espermatozoides/dosis).

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