Anticuerpos de llama de dominio nico como inhibidores intracelulares de una toxina bacteriana

Alzogaray, Vanina A. 2010

Tesis Doctoral

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires www.digital.bl.fcen.uba.ar Contacto: digital@bl.fcen.uba.ar
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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Qumica Biolgica

Anticuerpos de llama de dominio nico como inhibidores intracelulares de una toxina bacteriana
Tesis presentada para optar al ttulo de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el rea de Qumica Biolgica

Lic. Vanina A. Alzogaray

Director de tesis: Dr. Fernando A. Goldbaum

Consejero de Estudios: Dr. Luis Ielpi Lugar de trabajo: Fundacin Instituto Leloir

Buenos Aires, 2010

Amisviejos,NormayPato

AMaugeyMariano AIns Amisamigos

Quieroagradecerprofundamente: AmidirectordetesisFernandoGoldbaum,porhabermeabiertolaspuertasdel lab.304cuandonotenaideadeloqueeraunapipeta.Porlaenseanza,la paciencia,lalibertadenlosexperimentos,porlosviajesyporlaconfianza.Pero porsobretodo,porserunamuybuenapersona. AmigranamigaPaula,unapersonaincreble,quienlograhacermeverlavida desdeunlugarmaravilloso.Porestarsiempre,porcuidarme,porelaguantey pormuchoms.Graciastotalesporlainmensaayudaenlatesis. Atresgrandesamigos,Hernn,SebasyGastn,fenmenostotalesentodos sentidos!Graciasporestarsiempreyporelaguante!....algenioHernn,porla ayudaenlasfiguras!!! Amisamigasdelavida,Andre,Ceci,Fer,Adri,Milva,BrenyMarina!,gracias porestarsiempre.AndreyCeci,porbancarmeyacompaarmetandecercaen todoesto!.Atodosmissobrinos,aquienesadoromuchsimo:Roco,Lautaro, Agustn,Francisco,Santino,Agostina,JuanyMateo.Alquevieneencamino! Amifamilia,misviejosNormayPato,pormarcharamiladoyporestar siempreamilado.Amishermanos,MaugeyMariano,aquienesadoromucho! AMauge,porqueademsdeunahermanagenialesunagranamiga. AXime,porqueademsdecuadaesunagranamiga. AtodamifliaymsamigosdemiqueridoTresLomas. AgrandesamigosdeLaPlata.ACamu! AJulyMagginiyLu,porhacermesentirpartedesufamilia. July,graciasporaguante! Amireina,Victoria,porlofelizquemehace! AMarcos(pikipuky)poracompaarme,porestarsiempreyporelaguante. AJavi,graciasporestar! Amiscompaerosdellab304,gentemaravillosaquemeayudaymebanca todoslosdasdemivida:Naty,Pau,Jime,Mariela,Gise,Vane,Gaby,Ins, Ana,Marisol,Gastn,HernnyVictor. Alosquepasaronporel304:Pato,LauZ.,MarieU.,LauC.,SebasK.,GuilleC., MeliL.B.,JuancitoA.,DaianaN.ySergioV.

Alosvecinosdel303(d)ydel302.Aloschicosdellab.204 AMarianaH.,SabriM.dosgrandesamigas.Graciasporestar! Adosgrandespersonasdeltercertercerpiso,GuilleLanuzayCarlitosLabriola, porlascharlascompartidasyporesebuenhumorqueloscaracterizayquetan biennoshace!.AGuilleporlaayudaenlasfiguras! AtodoslaspersonasqueintegranlaFundacinInstitutoLeloir.Graciasporla ayuda,ylaporlabuenapredisposicindetodos. AlaFacultaddeCienciasExactasyNaturalesdelaUBA. AldepartamentodeQumicaBiolgicayalaComisindeDoctoradoquienes mesolucionaroninconvenientesdelamejormaneraposible. AlaFundacinYPFporfinanciargranpartedemidoctorado.AlaFundacin InstitutoLeloirporfinanciarunosmesesmidoctoradoparafinalizarlatesis. Alascolaboraciones:alDr.FritzKockNolteyalaDra.EleonoraGarca Vscovi.Aambosgruposdeinvestigacin,muchasgraciasporeltrato increblequetuvieronhaciaam. Alagentequecolaboroconesteproyecto:GuillermoVilaMeloyGonzalo PerezZabalaporlaayudaenlasinmunizaciones.AMarielaU,PauB.y AndrsAguirreporlaayudaconlosexperimentos. Aljurado,quinaceptoleeryevaluarestatesis:alaDra.AngelesZorreguieta, alDr.EmilioMalchiodiyalDr.AlbertoFossati.Muchasgracias!

Anticuerposdellamadedominionicocomoinhibidoresintracelularesdeuna toxinabacteriana Resumen Los camlidos poseen anticuerpos que carecen de cadena liviana y de una fraccin de la cadena pesada. El sitio de unin al antgeno est formado por el dominio variable de la cadena pesada, denominado VHH. Su largo CDR3 resulta especialmente apto para la unin a epitopes cncavos, como los sitios activos enzimticos.Salmonellatyhimuriumesunabacteriaintracelularpatgenaqueposee una ADPribosiltransferasa denominada SpvB, esencial para la virulencia. SpvB induce la depolimerizacin de los filamentos de actina, llevando a la muerte celular. En este trabajo de Tesis, mostramos la generacin de una biblioteca de expresin en fagos, a partir de linfocitos de llamas inmunizadas con el dominio cataltico de SpvB, para obtener VHHs que reconocen a SpvB e inhiben su actividadenzimtica. LosclonesdeVHHsantiSpvBsesecuenciarony clasificaron de acuerdo al CDR3. Fueron seleccionados 5 clones, los cuales se expresaron y purificaron como protena recombinante. Mediante dos ensayos independientes, mostramos que estos VHHs inhiben a SpvB. Uno de los ensayos nos permiti cuantificar la relacin molar VHH:SpvB para lograr un 100% de inhibicin identificando as a VHH5, que inhibe a SpvB en relacin equimolar. Se transfectaron macrfagos con VHH5 y se infectaron con Salmonella typhimurium. El anlisis de las clulas por microscopa de fluorescencia mostr claramente que VHH5 expresado en el interior celular, tiene la capacidad de proteger su citoesqueleto. Por otro lado, mediante la translocacin de SpvB al citoplasma, realizamosunensayoenclulastransfectadasconVHH5paradiscriminarelefecto deSpvBde otros factoresde virulencia. Los resultadosmostraronquela expresin intracelular de VHH5 protege el citoesqueleto del efecto citoptico causado por SpvB. Estos resultados constituyen una prueba de concepto sobre el uso de anticuerpos de dominio nico de llama para la inhibicin de enzimas intracelulares. Palabras claves: anticuerpos de dominio nico, intrabodies, inhibidores enzimticos,Salmonella,SpvB.

Singledomainantibodiesasintracellularinhibitorsofabacterialtoxin Abstract Camelids produce unusual antibodies composed only of heavy chains. The antigen combining site of these antibodies is formed solely by the heavychain variable domain (VHH). Their CDR3s form long fingerlike extensions that can protrudeintocavitiesonantigens,e.g.theactivesitecreviceofenzymes.Salmonella tyhimurium are pathogenic intracellular bacteria that express an ADP ribosyltransferase called SpvB, which is essential for its virulence. SpvB induces the depolymerization of actin filaments leading to cell death. In the present work, we show the generation of an expression phage library from SpvBimmunized llama lymphocytes to obtain VHHs that inhibit SpvB activity. SpvBrecognizing VHHs clones were sequenced and classified according to their CDR3. Five independent clones were isolated, and the VHH proteins codified by them were expressed and purified. All VHHs were able to inhibit SpvB in two different assays. We quantitatively analyzed the inhibition of SpvB activity by fluorescence using pyrenelabelled actin as substrate. VHH5 completely inhibited SpvB activity in an equimolar ratio. Furthermore, VHH5 was subcloned in a vector for eukaryotic expression. As such, eukaryotic cells were transfected and cells expressing VHH5 were infected with Salmonella typhimurium to test their effect on virulence. Fluorescence microscopy analyses clearly showed that VHH5, when expressed as an intrabody, effectively protected cells from wild type SpvB expressing strains of Salmonella. Transfected cells were also protected against the cytotoxic activity of a translocation competent chimeric SpvBC2 toxin. These resultsconstituteaproofofprincipleoftheuseofsingledomainantibodiesforthe specificintracellularinhibitionofnormalorpathogenicenzymaticfunctions. Keywords:Singledomainantibodies,intrabodies,enzymaticinhibitors, Salmonella,SpvB.

Parte de los resultados mostrados en esta Tesis dieron lugar a la siguiente publicacin:

Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Wesolowski J, Alzogaray V, Reyelt J, Unger M, Juarez K, Urrutia M, Cauerhff A, Danquah W, Rissiek B, Scheuplein F, Schwarz N, Adriouch S, Boyer O, Seman M, Licea A, Serreze DV, Goldbaum FA, Haag F, Koch-Nolte F. Med Microbiol Immunol. 2009 Aug;198(3):157-74. Review.

Tambin hemos publicado el siguiente trabajo, estrechamente relacionado con esta Tesis:

Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ectoADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo. Koch-Nolte F, Reyelt J, Schssow B, Schwarz N, Scheuplein F, Rothenburg S, Haag F, Alzogaray V, Cauerhff A, Goldbaum FA. FASEB J. 2007 Nov;21(13):3490-8.

El siguiente trabajo ser prximamente enviado para su publicacin en FASEB J:

Single domain llama antibodies as specific intracellular inhibitors of SpvB, the actin ADP-ribosylating toxin of Salmonella typhimurium Alzogaray Vanina, Danquah Welbeck, Aguirre Andrs, Urrutia Mariela; Berguer Paula; Garca Vscovi Eleonora; Haag Friedrich; Koch-Nolte Friedrich and Goldbaum, Fernando A.

Abreviaturas ADN:cidodesoxirribonucleico ADNc:ADNcopia Amp:ampicilina ARNm:cidoribonucleicomensajero CDR:regindeterminantedelacomplementariedad CH:dominioconstantedelacadenapesada CI:cuerposdeinclusin CL:dominioconstantedelacadenaliviana DO:densidadptica Fab:fragmentodeuninalantgeno Fc:fragmentocristalizable FR:frameworkregion;regindelacadenavariableubicadaentrelosCDRs Fv:fragmentovariable hcIgG:inmunoglobulinaGdecadenapesada HEL:lisozimadehuevodegallina IFA:adyuvanteincompletodeFreund Ig:Inmunoglobulina Kan:kanamicina KDa:kilodalton mAb:anticuerpomonoclonal

MBP:protenadeuninamaltosa(maltosebindingprotein) MOI:multiplicidaddeinfeccin(multiplicityofinfection) ON:todalanoche OPD:ortofenildiamina pb:paresdebases PBS:bufferdefosfatosalino PBST:PBS+Tween PM:pesomolecular PCR:reaccinencadenadelapolimerasa scFv:fragmentovariabledecadenanica sdAb:anticuerpodedominionico SDSPAGE:geldepoliacrilamidadesnaturalizante SFB:suerofetalbovino spv:plsmidodevirulenciadeSalmonella spvB:genquecodificaparaSpvB Tet:Tetraciclina VH:dominiovariabledelacadenapesada VHH:reginvariabledelacadenapesadaenhcIgG VL:dominiovariabledelacadenaliviana VNAR:anticuerpodecadenapesadadepecescartilaginosos

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INTRODUCCIN LosAnticuerpos

1 2

Figura 1. Representacin esquemtica de una IgG convencional y 6 fragmentosquesepuedenobtenerapartirdelamisma AnticuerposdeCadenaPesadadeCamlidos Figura2:DistintosisotiposdeIgGdecamlidos AplicacionesdeVHHs SpvB:UnatoxinacrucialdelpatgenoSalmonellaTyphimurium OBJETIVOS MATERIALESYMTODOS 1.Reactivos 1.1.Soluciones,MediosyBuffers 2.CepasdeE.coli 3.Lneascelulares 4.Primers 5.Clonado,expresinypurificacindeSpvB 5.1.Clonado 5.2.Expresin 5.3.Purificacin 5.4.Biotinilacin 6.ActividadenzimticadeSpvB:RadioactividadyFluorometra 6.1.EnsayodeRadioactividad 6.2.EnsayodeFluorometra 7.ObtencindeIgGsdellamayVHHsrecombinantesantiSpvB 7.1.Inmunizaciones 7.2.Evaluacindelarespuestapoliclonal 7.3.Construccindeunabibliotecadeexpresinenfagos deVHHsdellama Figura3:Secuenciadelsitiodeclonadoyregionesflanqueantes delvectorparaexpresinenfagospHEN2 9 11 21 25 30 32 33 33 33 34 34 35 35 35 36 36 37 37 38 38 38 39 39 41

Indice _____________________________________________________________________________________

7.4.SeleccindefragmentosVHHantiSpvBensolucin 7.5.Evaluacindelmtododeelucin 8.Secuenciacindeclonesdeinters 8.1.ExpresinypurificacindeVHHssolubles 9.EnsayosinvitrodelainhibicinenzimticadeSpvB: RadioactividadyFluorometra 9.1.Radioactividad 9.2.Fluorometra 10.ExpresindeVHHsenclulaseucariotas 10.1.ClonadodeVHH5yVHHNR 10.2.AnlisisdelaexpresindeVHHs:WesternBlot eInmunofluorescencia 12.EnsayoscitopticosutilizandolaquimeraC2INC/SpvB 13.EnsayoscitopticosutilizandolaquimeraC2INC/SpvB yVHH5comoprotena RESULTADOSYCONCLUSIONES 1.ProduccindeldominioCterminaldelaenzimaSpvB Figura4.PurificacindeSpvB 2.MedicindelaactividadenzimticadeSpvB Figura5.Representacinesquemticadelaactividadenzimtica deSpvB Figura6:Autorradiografa.ADPribosilacindelamolculadeactina Figura7.Autorradiografa.ADPribosilacindelamolculadeactina endiferentescondiciones Figura8.Fluorometra.Inhibicindelapolimerizacindeactina porSpvB Figura9:Fluorometra.Inhibicindelapolimerizacindeactina condiferentescantidadesdeSpvB 3.Produccindefragmentosdeanticuerposdellamas:VHHs Figura10.EsquemarepresentativodelageneracindeVHHs especficosantiSpvB 3.1.GeneracindelabibliotecadeexpresinenfagosdeVHHs 43 44 45 45 46 46 47 48 48 50 52 53 54 55 56 57 57 58 59 61 62 63 63 64

11.InfeccindemacrfagosconSalmonellasppySalmonellamutante 51

Indice _____________________________________________________________________________________

Figura11.TitulacindelsueroinmunedelallamaN9208 ensureactividadporSpvB Figura12.Secuenciacindeclonesprovenientesdelabiblioteca defagos 3.2.SeleccindefragmentosVHHsantiSpvB Tabla1.Fraccindebacterifagosincubados(input)yrecuperados (output)luegodecadarondadeseleccin Figura13.EnriquecimientodefagosquereconocenaSpvBdurante consecutivasrondasdeseleccin 4.CaracterizacindeVHHsyanlisisinvitrodelainhibicin enzimticadeSpvB Figura14.Alineamientodelasecuenciaaminoacdicade20clones elegidosalazar Figura15.PurificacindeVHHsseleccionados Figura16.Radioactividad.InhibicindelaADPribosilacindela molculadeactinamediadaporSpvBatravsdeVHHsespecficos Figura17.Radioactividad.InhibicindeSpvBpordiferentescantidades deVHH Figura18.Fluorometra.InhibicindelaADPribosilacindeactina mediadaporSpvBatravsdeVHHsespecficos Figura19.PerfildelporcentajedeinhibicindeSpvBenfuncin delarelacinmolarVHH:SpvB 5.ExpresindeVHHsenelinteriordeclulaseucariotas Figura20.ExpresindelosVHHsenclulaseucariotas Figura22.ExpresindeMBPVHH5entreslneascelulares 6.EnsayosdeinfeccinconSalmonellatyphimuriumySalmonella mutante Figura23.InfeccindemacrfagosRAW 7.EnsayosdetranslocacinconlatoxinadefusinC2IN/CSpvBal interiorcelular Figura24.MorfologadeclulasVeroincubadasconlatoxinadefusin C2IN/CSpvB Figura25.IncubacindeVHH5conlatoxinadefusinC2IN/CSpvB Figura26.TranslocacindeC2INC/SpvBalinteriordeclulas transfectadasconVHH5

64 66 67 68 69 71 72 75 77 79 82 84 85 86 88 89 91 92 94 94 96

Tabla2.PorcentajedeclonesespecficosobtenidosenelELISAdefagos 71

Figura21.ExpresindeVHH5HisyVHHNRHisenclulaseucariotas 87

Indice _____________________________________________________________________________________

CONCLUSIONESGENERALES DISCUSIN BIBLIOGRAFA 98 100 112

INTRODUCCIN

LOSANTICUERPOS

Lafuncinesencialdelsistemainmunolgicoesgenerarunarespuestaefectiva contra los antgenos externos mientras evita reaccionar deletreamente hacia los antgenos propios. El sistema inmunolgico de los vertebrados comprende al sistema inmune innato y al sistema inmune adaptativo. El sistema inmune innato constituye la primera lnea de defensa contra los patgenos, y es capaz de reconocer a un nmero limitado de estructuras moleculares de los patgenos. El mismo est filogenticamente conservado y est presente en casi todos los organismos multicelulares, en muchos de los cuales es el nico sistema inmunolgico (1). La respuesta inmune adaptativa, a diferencia de la innata, es capaz de modificarse frente a exposiciones repetidas a un antgeno. El sistema inmune adaptativo est constituido por los clsicamente llamados componente celular y componente humoral. La respuesta inmune humoral se basa en la generacin de anticuerpos (Inmunoglobulinas, Ig) por los linfocitos B. Las Igs son protenas que funcionan como adaptadoras entre el agente externo al cual reconocen especficamente y las clulasomolculasefectorasdelarespuestacontraeseagente(2). Los anticuerpos estn formados por regiones constantes y regiones variables. Estas ltimas tienen una gran variabilidad de secuencia; en el ser humano, aproximadamente 109 tipos de regiones variables diferentes estn presentes en un momento dado (3). Siendo esta regin la involucrada en el reconocimiento del antgeno, se cuenta virtualmente con anticuerpos contra cualquier posible epitope (determinante antignico) existente. Esta variabilidad surge de mecanismos combinatorialesydeprocesosdemutacin(2) CadalinfocitoBrealizaenestadiostempranosdesuontogenia,unarmadode

la regin variable del anticuerpo, por rearreglos en su ADN que recombinan los llamadosminigenes.Esteprocesocombinatorialserealizademaneraindependiente en 2 regiones del genoma, una que corresponde a los genes de la cadena pesada de 2

 las Igs, combinando un gen V, un gen D y un gen J, y otra que corresponde a la cadena liviana, donde no hay minigenes D, y por lo tanto, posee un menor nmero de combinaciones. Durante la unin fsica de estos genes, se introducen nucletidos al azar, lo cual aumenta an ms la variabilidad al cambiar el marco de lectura. Con cada cadena, durante el proceso de recombinacin, se incluye la regin constante correspondiente.Estasdoscadenaspolipeptdicasseunen,unavezexpresadas,enel retculo endoplsmico del linfocito B, originando la molcula de anticuerpo. Las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena liviana (VH y VL, respectivamente) conforman en conjunto el fragmento variable (Fv). Los linfocitos con rearreglos productivos exponen la molcula de anticuerpo en la superficie celular, y aquellos linfocitos que, en el contexto de los rganos linfticos perifricos reconocen antgenos propios, sufren un proceso de seleccin negativa. Los clones de linfocitos que pasan el proceso de seleccin tienen la capacidad de proliferar ante la presencia del antgeno reconocido por su anticuerpo de superficie. Al producirse esta unin, en presencia de estmulos provenientes de los linfocitos T, se genera la expansin de dichos clones, y su diferenciacin hacia clulas productoras de anticuerpos plasmocitos que liberan grandes cantidades de anticuerpos solubles a la circulacin sangunea y linftica. Adems, durante las divisiones celulares se introducenmutacionesenciertospuntosdelareginvariable,principalmenteenlas zonas que conforman los lazos o loops de contacto con el antgeno, llamadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR: complementarity determining regions). Este fenmeno se conoce como hipermutacin somtica y aumenta la variabilidad, alterando la afinidad de los anticuerpos. Los anticuerpos resultantes, nuevamente son seleccionados en funcin de su reactividad contra el antgeno,procesodenominadoseleccinclonal,enriqueciendoalapoblacinconlos clonescon mayor afinidadporel antgeno. Este procesoconjuntode seleccinclonal e hipermutacin somtica se conoce como maduracin de la afinidad y permite generar anticuerpos altamente especficos, con afinidades que llegan a rdenes de 1010M1. 3

 Los linfocitos B maduros coexpresan en la membrana Igs de isotipo IgM e IgD. Los linfocitos B activados por el contacto antgenoanticuerpo y otras seales, realizan un cambio o switch de isotipo. Los primeros anticuerpos secretados en unarespuestahumoralsonsiempreIgM,peroamedidaqueprogresalarespuestase producen anticuerpos de igual especificidad antignica pero de diversos isotipos. pesada, que inicialmente en las IgM es de tipo . Luego, se produce el cambio hacia Estos anticuerpos se generan por cambios en la regin constante de la cadena

cadenas de tipo , generndose los anticuerpos de tipo IgG. La respuesta inmune humoral est mayormente mediada por anticuerpos de tipo IgG.

Concomitantemente,ocurreelprocesodemaduracindelaafinidad. Normalmente, los anticuerpos IgG de mamferos son heterotetrmeros, formados por dos cadenas pesadas y dos livianas. Las cadenas pesadas estn formadas por tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3) y un dominio variable (VH) y estn unidas entre si por la regin constante mediante puentes disulfuro entre cistenas conservadas. Las cadenas livianas estn formadas por un solo dominio constante (CL) y un dominio variable (VL). La cadena pesada y la cadena liviana estn unidas por un puente disulfuro entre los dominios CH1 y CL e consisteenunbarrildehojas.Laestructuradecadadominiovariableseencuentra interacciones no covalentes. La regin variable de los anticuerpos, estructuralmente

estabilizada por puentes disulfuro entre cistenas conservadas. El barril de hojas est constituido por el armazn o Framework (FR: framework region) y por los CDRs. Los 6 CDRs 3 de cada cadena forman la superficie de contacto con el antgeno, la cual tambin puede incluir residuos de las regiones FR. En la mayora de los casos, los CDR3, y particularmente el CDR3 de la cadena pesada, forman la mayorpartedeloscontactosconelantgeno(4). Siendo los CDR loops relativamente flexibles, la superficie de contacto puede adoptar geometras diversas. Sin embargo, ciertas generalidades han surgido del estudio de diferentes complejos antgenoanticuerpo. Los primeros estudios estructurales fueron realizados con anticuerpos antihaptenos y la 4

 complementariedad estructural entre las molculas es tal, que se ajusta a un modelo de llavecerradura. En el caso de antgenos ms complejos, las geometras adoptadas varan. Para antgenos intermedios, como polipptidos y carbohidratos, se observa una topologa de tipo surco, mientras que para protenas, la superficie es principalmente plana (5). En estos casos, la metfora de llavecerradura no se aplica,ylasuperficiedecontactosuelemostrarcambiosenlaorientacindecadenas laterales con respecto a la estructura del anticuerpo libre, en un marco compatible con procesos de ajuste inducido (4) o de estabilizacin de confrmeros preexistentes (4, 6). Tanto la flexibilidad de los CDRs, como la presencia de molculas de agua en la superficie de contacto, dificultan la prediccin de la complementariedad entre un anticuerpoyunantgenodeterminadomedianteelestudiodesustopologas(6).En el caso de antgenos peptdicos, se ha visto que la maduracin de la afinidad conllevacambiosqueaumentanlarigidezdelosCDRsy,enantgenosproteicos,los cambios aumentan la complementariedad y el rea de la superficie de contacto con el epitope (78). Estos hallazgos indican que la maduracin de la afinidad est relacionadaconunajustefinodelasuperficiedeinteraccin. Unodelosprincipalesobjetivosdelaingenieradeanticuerposesminimizarel tamao de las Igs para el desarrollo de drogas y, de esta manera, utilizar los fragmentos de anticuerpos como herramientas teraputicas (9). Un importante avance fue el desarrollo de anticuerpos monoclonales obtenidos de ratones inmunizados (10). Sin embargo, estos anticuerpos presentan ciertas caractersticas que dificultan su aplicacin teraputica (11). Los anticuerpos monoclonales murinos son inmunognicos en humanos y pueden tambin generar reacciones alrgicas, por lo tanto su administracin repetida a pacientes est limitada. Por otro lado, su gran tamao y complejidad constituyen otras limitaciones, especialmente para la produccin(12).

 Posteriormente se desarrollaron a partir de la Ig de 150 KDa bivalente intacta, pequeos fragmentos de unin al antgeno tales como el Fab y el Fv. El Fab, de 50 KDa,estformadoporlosdominiosVH,VLylosdominiosconstantesCH1yCL.El Fv, de 25 KDa, est formado por los dominios variables de ambas cadenas. Los dominios del fragmento Fv se disocian fcilmente y requieren el agregado de un linker o puentes disulfuro para vincular ambas cadenas, formando as un fragmento Fvdenicacadena(scFv:singlechainFv)Figura1.

Figura 1. Representacin esquemtica de una IgG convencional y de los fragmentos que se puedenobtenerapartirdelamisma.

Tambin pudieron ser aislados el VH y el VL como dominios nicos monomricos denominndose anticuerpos de dominio nico (sdAb: single domain antibody)(9,1114). Los avances tecnolgicos en el diseo de fragmentos de anticuerpos in vitro de alguna manera intentan imitar las estrategias de seleccin empleadas por el sistema inmune.Apartirdelasbibliotecasdeexpresinesposibleaislarmuchosanticuerpos diferentes contra virtualmente cualquier antgeno. Una de las herramientas ms empleadas a partir de bibliotecas es el uso de display en fagos utilizando un 6

 bacterifago filamentoso de E. coli. (15). Mediante esta tcnica, los fragmentos de anticuerpos son expuestos sobre la superficie del fago y los mismos pueden ser seleccionados por unin al antgeno. Luego, estos fagos son utilizados para infectar bacterias donde los fragmentos de anticuerpos son expresados (1617). Una de las ms exitosas aplicaciones de esta tcnica de display en fagos ha sido el aislamiento de anticuerpos monoclonales a partir de grandes bibliotecas de fagos (17). A partir del ADN genmico y del ADNc pueden amplificarse repertorios grandes y diversos de Fab, scFv o sdAbs para la construccin de bibliotecas y posterior seleccLa ingenieragenticadedisplayenfagosemulaallinfocitoBexpresandoalanticuerpo sobre su superficie, teniendo a su vez el fenotipo y genotipo de la Ig (18). in en fagos. Se pueden desarrollar tres tipos de bibliotecas de fagos: inmune, naive y sintticas. En las bibliotecas inmunes, el repertorio de fragmentos de anticuerpos puedeserobtenidoapartirdeanimalesinmunizados(19),odepacientesinfectados. La ventaja que tiene el desarrollo de este tipo de bibliotecas es la obtencin de una gran proporcin de anticuerpos especficos y en general con elevada afinidad hacia un antgeno determinado (16). Se han construido bibliotecas inmunes a partir de especies diferentes, entre las cuales se incluyen ratones (19,21), humanos (2223), gallinas (2425), conejos (26) y camlidos (27). Las bibliotecas naive son obtenidas a partir del ARNm de IgM de animales no inmunizados. Tambin se pueden disear bibliotecas a partir de un repertorio naive de ARNm de IgD. La afinidad de los anticuerpos seleccionados a partir de este tipo de bibliotecas es proporcional al tamao de la misma; por ejemplo, para una biblioteca de tamao 3x107 clones se logranafinidadesenelordende1067M1(2829).Porltimo,lasbibliotecassintticas son construidasartificialmente porensamblado in vitrode lossegmentosdegenes V y lossegmentosde genes DJ.Muchas de estasbibliotecas sondiseadas apartirdel CDR3 de la cadena pesada, introduciendo variaciones mediante sntesis al azar. Eventualmente pueden obtenerse anticuerpos con afinidades en el orden nanomolar apartirdeestetipodebibliotecas(16).Sinembargo,debenanalizarsepreviamentea 7

 la construccin de la biblioteca ciertas caractersticas de los fragmentos a sintetizar, como por ejemplo solubilidad, estabilidad, etc. Esta estrategia ha sido aplicada con xito para insertar loops variables en protenas no derivadas de Ig tales como tetranectinas, dominios de protena A y lipocalinas (11). Otro mtodo que ha sido descripto es el display y seleccin en ribosomas, en los cuales las protenas son totalmentetraducidasinvitro(3031). LascadenaspesadasylosdominiosVHsoncapacesdeunirsealantgenoan sin la presencia de cadenas livianas, como sucede naturalmente en camlidos. Sin embargo, las estructuras de los complejos antgenoanticuerpo indican que son importanteslasinteraccionesqueambosdominioshacenconelantgeno,teniendoel dominio VL el rol de otorgar diversidad estructural (3235) por ejemplo incrementando la superficie de interaccin con el antgeno. Se hicieron bibliotecas combinando a los dominios VH con un dominio VL proveniente de un nico gen (3637). Dependiendo de la tcnica utilizada para realizar esta combinacin, se obtendrndiferentesdiversidadesestructuralesytamaosderepertorios. Existe una diversidad de mtodos de seleccin para aislar los fagos (clones) que se unen especficamente al antgeno, de aqullos que no se unen. Estos incluyen el antgeno inmovilizado sobre una superficie slida, columnas o biosensor (19, 29, 38), seleccin utilizando el antgeno biotinilado (39), sobre clulas procariotas (40) o clulas eucariotas (23), seleccin sustractiva usando procedimientos de sorting (41), enriquecimientos sobre tejidos o piezas de tejidos (42) y utilizando animales vivos (43). EltamaodelasbibliotecascombinatorialesdefragmentosFvoscFvdebeser del orden de 1010 a 1011 clones, ya que no todos los dominios VH se combinan eficientemente con un dado dominio VL y viceversa. La interfaz VH:VL contiene muchos aminocidos variables, lo que restringe la posibilidad estructural de combinaciones posibles. Por ello, para lograr anticuerpos especficos con afinidades 8

 altas, se debe aumentar mucho la diversidad combinatorial, es decir el tamao de la biblioteca. Para un laboratorio estndar en el uso de tcnicas de biologa molecular, lograrbibliotecasdeesetamaoconstituyeundesafomaysculo.Estehechoesuna delaslimitacionesmsimportantesparaelusoextendidodeestatcnica(12). En algunos peces cartilaginosos, como los tiburones, existen anticuerpos naturales formados nicamente por cadenas pesadas, lo cual permiti aislar sdAb, denominndose a estos fragmentos VNAR (11, 4445). En el ao 1993 se descubrieron los anticuerpos de cadena pesada de camlidos (46), surgiendo as una interesante alternativa para el desarrollo de fragmentos de unin al antgeno de pequeotamao.

ANTICUERPOSDECADENAPESADADECAMLIDOS

Los camlidos son una familia de mamferos artiodctilos (flia. Camelidae,

orden Artiodactyla) pertenecientes al suborden Tylopoda, de los cuales actualmente existen tres gneros (Lama, Vicugna, Camelus). La diferenciacin y especiacin de estos animales ha sido producto de un largo y complejo proceso evolutivo de millones de aos. Las especies actuales tuvieron su origen en Amrica del Norte en el Eoceno tardo, hace unos 40 millones de aos. Algunos grupos migraron a travs del Estrecho de Bering desde Amrica del Norte a Eurasia, extendindose por toda Europa,fricayChina(camellos).Porotrolado,otrosgrupos,pasandoporelIstmo dePanam,invadieronlasplaniciesypampasdeAmricadelSur(llamasyvicuas) (47). Los camlidos poseen gran importancia econmica debido al uso de su lana, piel y fibra, y como fuente de alimento y de transporte en ambientes deshabitados por el hombre como es el desierto de Gobi. En los ltimos 15 aos el sistema inmunolgico de los camlidos tambin ha sido un tema de gran inters. En el ao 9

 1993, pudieron detectarse en el suero de camlidos, mediante cromatografa de afinidad sobre protena A y protena G, tres fracciones de IgG: una correspondiente alaIgG1heterodimricaconunacadenapesadade50KDayunalivianade30KDa, y dos fracciones homodimricas de 45 KDa y 43 KDa correspondientes a las IgG2 e IgG3, respectivamente. Fue de gran sorpresa la aparicin una nica fraccin en los isotipos IgG2 e IgG3, por lo tanto se plante la hiptesis de que ambos carecan de cadenas livianas. Posteriormente, esta hiptesis pudo ser confirmada mediante el anlisisdelsueroporcolumnadefiltracinmolecular.Fueentoncesapartirdeestos resultadosqueseconcluyqueloscamlidosposeen,ademsdelosanticuerposIgG convencionales heterotetramricos, al menos 2 isotipos de IgG homodimricos que constan nicamente de cadenas pesadas (46). En estos anticuerpos, llamados IgG de cadena pesada (heavy chain IgG: hcIgG), se observan dos tipos de regiones constantes de cadena pesada, una con una regin bisagra notoriamente ms larga que la otra, lo que permiti distinguir la existencia de los isotipos IgG2 e IgG3. Las IgG convencionales nicamente constituyen el isotipo IgG1. En las hcIgG, el fragmento Fv queda formado nicamente por la regin variable de la cadena pesada, y se denomina VHH (4849) (Figura 2). Estudios comparativos sobre camlidos del viejo mundo (camellos) y del nuevo mundo (llamas y vicuas) mostraron que las hcIgG componen el 50% de los anticuerpos presentes en el suero de camellos y que en las especies del nuevo mundo esa proporcin es un poco menor,aproximadamentedel25%45%(46,50). 10


Figura 2: Distintos isotipos de IgG de camlidos. A: Estructura de IgGs convencionales de camlidos, esencialmente idnticas a las otras IgGs de mamferos. A la izquierda se muestra un esquema de la molecula de IgG, denominado isotipo IgG1 en camlidos. Se indican los fragmentosen los que se puede subdividir la molcula. A la derecha, semuestra un modelo tridimensional de la estructura cristalogrfica de una molcula de IgG, con la misma coloracin que el esquema. Turquesa: regiones CH. Verde: Regiones VH. Marrn: Regiones CL. Naranja: Regiones VL. B: Estrucutra de las IgG de cadena pesada (hcIgG) de camlidos. El isotipo IgG2 tiene una regin bisagra considerablemente mayor que el isotipo IgG3. NoteselafaltadeldominioCH1enambosisotipos.ElfragmentoVHHdeuninalantgeno constadeunasolacadenapolipeptdica.LaclavedecoloreslamismaqueparaA).

Existen en camlidos nueve genes , de los cuales cinco son funcionales en el rearreglodegenesparalareginconstantedelasIgs.Dosdeestosgenes( 1ay 1b) codifican para las Igs convencionales (IgG1a e IgG1b) y todo el ADNc analizado del gen contiene al exn CH1. Los otros tres genes ( 2a, 2c y 3), codifican para las 11

 hcIgG y tienen ausente el exn CH1 en su ADNc. Dos de ellos, 2a y 2c, codifican para una regin bisagra de 12 y 15 aminocidos, respectivamente y el gen 3 para unareginbisagrade35aminocidos.Estoexplicaladiferenciaenelpesomolecular entre estas subclases cuando fueron analizadas sobre protena A/G. Por lo tanto, los camlidos poseen dos isotipos convencionales (IgG1a y IgG1b) y tres isotipos de hcIgG correspondientes a IgG2a, IgG2c e IgG3. Los otros cuatro genes estn presentes en la lnea germinal pero no han sido encontrados en el rearreglo genmico ni tampoco en el ADNc (51). En las hcIgGs, el dominio Fv est vinculado directamentea travs dela reginbisagraa losdominiosCH2y CH3. El anlisisdel gen 2a y de dos isotipos IgG de llamas obtenidos a partir de bibliotecas genmicas revel que los genes que codifican para el dominio CH1 estn presentes en el genoma de camlidos, pero el extremo 3 del exn posee mutaciones puntuales responsables de la eliminacin de la secuencia que codifica para el dominio CH1 durante el splicing del ARNm (49, 52). El hecho de que las especies pertenecientes a la familia Camelidae utilicen un mecanismo comn para eliminar el dominio CH1, indicaquelashcIgGsprovienendeunancestroencomn(49). Los genes de las regiones constantes de las hcIgG tienen la tpica

organizacin gnica de las IgG de mamferos, incluyendo el largo conservado de dominios homlogos e intrones (5354). Cada gen que codifica para la regin constante tiene cuatro exonesconocidos como CH1, la regin bisagra,CH2y CH3, y dos exones de unin a transmembrana (53). Todos los genes de las hcIgG conservan la secuencia de nucletidos CH1, pero en todos ellos el exn CH1 tiene presente la mutacin puntual en el extremo 3, el cual es un elemento clave para la prdida del primer dominio constante (51, 53). Tambin estn conservados los residuos claves de las principales funciones efectoras de las IgG y los sitios de glicosilacin(5253,55). En las hcIgGs, VHH es el mnimo fragmento funcional de unin al antgeno que se puede obtener derivado de una Ig (4849). El proceso combinatorial de la regin variable en los hcIgG se realiza de la misma manera que en las IgG 12

 convencionales, es decir, por recombinacin de los genes VDJ, en donde el gen V codifica para el CDR1 y CDR2 y el CDR3 es codificado por la combinacin los genesVDJ(54,5657). El repertorio VHVHH de la lnea germinal de los camlidos fue evaluado por Southern blot y por clonado y secuenciacin mltiple de los genes de la lnea germinal. La base de datos conteniendo 92 segmentos de genes V establece que los camlidos poseen, por un lado, 42 genes nicos de la lnea germinal de VHHs y 50 genes de VH convencionales. La identificacin de la lnea germinal de los camlidos demostrqueexistengenesVespecficosparaVHHsdistintosdelosutilizadosenel repertoriodelasIgGconvencionales.Sinembargo,losgenesDyJsoncomunespara ambostiposdeanticuerpos(51,5859).Elanlisisdelasregionesflanqueantesindica que el dominio VHHs tiene todos los elementos esenciales y conservados tpicos de un dominio V, incluyendo la regin promotora conservada de las Igs y tambin la secuencia seal de recombinacin (RSS). Esto apoya la hiptesis de que los genes de la lnea germinal de VHHs participan en el rearreglo somtico de genes VDJ de las IgsduranteladiferenciacindelasclulasB(53). Sedemostrqueenelgenomadelasalpacasexisteunnicolocusdelacadena pesada de la Ig, que contiene todos los elementos genticos necesarios para la generacin de los dos tipos de Igs presenten en el sistema inmune de los camlidos (60). Sin embargo, an no se ha determinado si en camlidos existen uno o dos precursores de linfocitos B para dar lugar a clulas productoras de VH o de VHH. Una posibilidad es que en un nico precursor se produzca un rearreglo que azarosamente d lugar a la generacin de un VH o un VHH y que as, la naturaleza del primer rearreglo productivo determine el destino del linfocito B. Una hiptesis alternativa sera que los dos tipos de IgGs se expresen en dos linajes separados, originadosdedosprecursoresindependientesenloscualeselrearreglodelgenVya estdefinido.

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 Las evidencias genticas demuestran que las hcIgG son codificadas por un conjunto separado de genes V y genes C en los camlidos. Sin embargo, no se descartalaposibilidaddequeunaporcindelashcIgGseaderivadasomticamente a partir de genes VH, dado que los genes que codifican para ambos tipos de inmunoglobulinas forman parte del mismo locus (51). La organizacin del genoma en el locus de la cadena pesada en los camlidos se espera que siga una tpica estructura multignica: (V)n(D)n(JH)n(CH)n como se presenta en otras especies (61 62). dominio VH de las IgGs convencionales; tienen tambin una estructura de barril , formada por nueve cadenas que son plegadas en dos hojas que se juntan unas con La estructura general y el plegado del dominio VHH no es diferente de la del

otras y estn estabilizadas por un puente disulfuro conservado. Se forman as 4 regiones FR unidas por las 3 regiones CDR que conforman el sitio de combinacin antignico (49). Sin embargo, algunas diferencias se evidencian como son las sustituciones localizadas en el FR2. En los dominios VH los residuos que estn ubicados en esa regin interactan con el domino VL y estn conservados evolutivamente (63). Cuatro sustituciones fueron reportadas en el FR2 de VHHs: V37FY; G44QE; L45RC, W47G (48, 55), las cuales estn incluidas en la lnea germinal (52, 59) y hacen que esta regin del dominio sea una zona con caractersticas hidroflicas (49, 59). Estas sustituciones en VHHs explicaran la falta de unin a la cadena liviana en estos anticuerpos. La presencia constante de estas sustituciones en el FR2 de VHHs (48) y su importancia estructural (64), permite clasificar a VHHs en una nueva familia, denominada VH3H para distinguirlos de la familiaVh3delasIgGconvencionales(58). Es posible crear dominios camelizados a partir de dominios VH de Igs convencionales que alcancen elevada solubilidad introduciendo un nmero muy limitado de mutaciones en aquellos residuos que contactan con el dominio VL, 14

 imitando de alguna manera a los residuos presentes en VHHs de los camlidos. Se ha demostrado que al sustituir 3 aminocidos en los FR2 de VH humanos con los aminocidos presentes en VHHs de camlidos, se logra un mejor plegamiento y solubilidad. El aspecto ms atractivo de este dominio camelizado es la posibilidad de utilizar el dominio VH de humanos en aplicaciones teraputicas debido a su baja inmunogenicidad(6566).Sehanobtenidodominioscamelizadosqueseexpresanen clulas eucariotas a partir de fragmentos VH de Igs de conejos con un correcto plegado en un ambiente reductor. Por ejemplo, se ha generado un anticuerpo camelizado derivado de una Ig de conejo con especificidad para la protena Vif del virus de inmunodeficiencia humana (HIV). Mediante la mutacin de 5 aminocidos selogrproducirunanticuerpodealtasolubilidad,quenoseunealacadenaliviana y mantiene su especificidad. Los resultados muestran que este anticuerpo es capaz debloquearaVifneutralizandolainfeccinviral(67). Si bien las regiones de los FR1 y FR3 de VHHs tienen un alto grado de homologa con las regiones FR de los VH de las Igs convencionales de camlidos, humano y ratn (59), existen aminocidos conservados en algunos VHH como por ejemplo (de VH a VHH): L11S, P14A y A83P. En los dominios VH, los residuos L11, P14, A83 se encuentran localizados en la regin opuesta del sitio de unin al antgeno, y por lo tanto pueden contactar con el dominio CH1 (68); adems, el residuo L11 forma parte de la uninarticulacin (ballandsocket joint) entre los dominiosVHyCH1(69).EnlashcIgG,alestarausenteeldominioCH1,esprobable que los aminocidos de esta regin estn expuestos al solvente. El incremento en la hidrofilicidadprovocadoporlasustitucinL11SayudaamantenereldominioVHH soluble(48,55,70). Adems de las diferencias establecidas en los FRs, las regiones hipervariables de los VHH tambin presentan grandes diferencias con respecto al dominio VH de las Igs convencionales. En los dominios VHHs, el sitio de combinacin antignico se

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 forma con solo 3, en lugar de 6, loops CDR. Estas regiones, principalmente el CDR1 yCDR3,enpromediosonmslargasenlosVHHqueenlosdominiosVH. El CDR1 de los dominios VH normalmente involucra los residuos 3135 (71), pero en los VHH esta regin se alarga, involucrando los residuos 2735. En la lnea germinal de los VHH estn presentes dos nuevas regiones propensas a sufrir mutaciones (hotspots). Estas mutaciones en la lnea germinal conducen a sustituciones de aminocidos (por ejemplo F27Y y F29Y), causando efectos importantes en el CDR1 como son nuevas conformaciones del loop, ampliando de estamaneraelrepertorioestructuraldelosVHH;otrasmutacionespuedenprovocar una sutil modificacin en la superficie que podra mejorar la interaccin del VHH con el antgeno. La presencia dehotspotsen loscodones 27y29 en la lneagerminal de los VHH, convierte a esa regin en una zona con elevada variabilidad y adems, de gran importancia en la interaccin con el antgeno (49, 59). Estudios cristalogrficos de dos VHH en complejo con su antgeno demuestran cmo los aminocidoslocalizadosenesazonadelCDR1interaccionanconelantgeno(64,72). Adems, el anlisis de la estructura cristalogrfica de un VHH libre de antgeno contralahormonagonadotrofinacorinicahumana(hCG)muestraclaramentecmo el loop CDR1 es expuesto al solvente y forma una estructura que protruye ligeramente (73).Se ha propuestocomo alternativa,en la construccinde bibliotecas sintticas, variar estos aminocidos (65, 74), para incrementar el repertorio de anticuerposydeestamaneraencontrarmscandidatosdeuninasuantgeno(59). Estudios comparativos sobre estructuras de anticuerpos indican que existe un nmero limitado de conformaciones cannicas para las regiones hipervariables, a excepcin del CDR3 de la cadena pesada que no asume ninguna de las conformaciones establecidas (64, 7577). Los tomos de la cadena principal de los CDRs adoptan algunas de las posibles estructuras cannicas establecidas, las cuales dependen del largo del CDR y de la ubicacin de residuos claves presentes en determinadas posiciones (7576, 78). Se determin que las estructuras cannicas del 16

 CDR1 y del CDR2 de los dominios VH aparecieron muy tempranamente durante la evolucin del sistema inmune, debido a la presencia de residuos claves conservados en humanos y peces cartilaginosos, especies muy distanciadas filogenticamente (72). Basndonos en algunas estructuras cristalogrficas resueltas, como por ejemplo un VHH contra anhidrasa carbnica, el CDR1 adopta una de las estructuras cannicas ya establecidas tanto en el VHH libre como en complejo con su antgeno (70); sin embargo, otras estructuras cristalogrficas revelan que esta regin no adopta ninguna de las estructuras cannicas predichas (64,79,73,80). Inclusive, se ha propuestoun nuevo tipode estructura cannicapara el CDR1deVHH denominada tipo4(70,79). La arquitectura del CDR2 de VHHs es ms variable que la de los dominios VH(70),peroentodas lasestructurasresueltas seleatribuyenestructuras cannicas establecidas. El anlisis estructural muestra que estos CDR tienen un repertorio estructural ms amplio que el observado para los VH convencionales (49), pero es necesario obtener ms cantidad de estructuras cristalizadas, ya que el conjunto de estructurasdisponibleseslimitado(70). Los fragmentos VHHs, adems de tener las cistenas conservadas C22 y C92, presentes tambin en todos los dominios VH, presentan frecuentemente puentes disulfuro adicionales que unen sus CDRs. Los puentes disulfuro se forman generalmenteentreelCDR3yelCDR1oCDR2,aunqueaveces,dependiendodelas especies, las uniones pueden variar. En llamas se forman puentes disulfuro entre el CDR3 y la C33 o C50 del CDR2, y en camellos entre el CDR3 y la Cys45 del FR2. En CDRs de corta longitud en llamas, es poco probable encontrar residuos cistena extras (55, 73). La formacin de puentes disulfuro adicionales restringe la flexibilidad y permite disminuir la penalidad entrpica relacionada con la unin al antgeno de estos CDRs largos (49, 64); adems brindan estabilidad al dominio y generan la formacin de nuevos loops, aumentando de esta manera el repertorio de 17

 paratope de unin al antgeno (59). Aunque son casos excepcionales, se han encontrado residuos cistena en los CDRs de IgG de bovinos (81), de ratones y de humanos(71). El CDR3, por otro lado, alcanza significativamente mayor longitud en estos fragmentos VHHs que en los VH de las Igs convencionales. El largo promedio del CDR3 de los dominios VH de humanos y ratones es de 12 y 9 aminocidos, respectivamente (82), mientras que en camlidos el CDR3 de los VHHs alcanza un largo promedio de entre 16 y 18 aminocidos, con excepcin de los de llamas, que puedentener untamao menor (55, 73). Incluso, se ha reportadoqueelCDR3 de un VHH inhibitoriocontra lisozima de huevo de gallina (HEL) alcanza una longitudde 24aminocidos(64).Sehademostradocondetallepara esteVHH,queelCDR3,con su mayor longitud, puede adoptar una estructura que protruye del sitio de combinacin, entra en el sitio activo y realiza una mmica molecular del oligosacrido sustrato de la lisozima, tanto a nivel funcional como estructural (83). Estructuras cristalizadas, muestran que 6 de 8 VHH contra HEL, con CDR3 largos y convexos,reconocendosepitopessuperpuestosqueabarcanunagrancavidad,sitio donde se une el sustrato de la enzima (84). La generacin de pptidos sintticos a partir de VHH contra HEL, y aqullos formados por los mismos residuos que el CDR3 del fragmento natural mostraron afinidad por el antgeno y resultaron inhibidores competitivos (49). Tambin se demostr que otros VHHs con CDR3 ms cortos, obtenidos contra enzimas como la anhidrasa carbnica, amilasa y lactamasa se unen al sitio activo, bloqueando la actividad cataltica de la enzima. En este mismo trabajo, las hcIgG obtenidas contra lactamasa, a diferencia del

fragmentoVHH,notuvieroncapacidadinhibitoria(8586). Por lo tanto, el CDR3 posee la extraordinaria capacidad de formar estructuras largas y convexas que ofrecen gran superficie de interaccin, permitiendo que se extienda dentro de cavidades o hendiduras presentes en el antgeno. Este tipo de geometra se encuentra poco representada en las IgGs convencionales; en general se ha visto que los anticuerpos inhibitorios de tipo convencional tienen CDRs planares 18

 yfuncionanporimpedimentoestricoydisminucindelamovilidaddelsitioactivo (5, 87). Dado que los 3 CDRs de los VHHs tienen una gran variabilidad estructural, mayor longitud y adoptan estructuras convexas, y adems, principalmente a travs del CDR3, se unen preferencialmente a cavidades del antgeno, se considera que los fragmentos VHH son muy buenos candidatos para ser utilizados como inhibidores enzimticos (64, 8485). Al carecer de cadenas livianas y estar formados por una nica cadena polipeptdica, los VHHs son muy atractivos para ser utilizados en ingeniera de protenas. Es posible clonar estos fragmentos en bibliotecas de expresin en bacterifagos, de manera mucho ms sencilla que las equivalentes bibliotecas de anticuerpos convencionales. El tamao necesario para cubrir la diversidad natural es menor, ya que no hay diversidad combinatorial. Esto facilita mucho su construccin, en comparacin con una biblioteca de anticuerpos convencionales, que requiere la combinacin de los dominios VH y VL. Por esta raznsenecesitanbibliotecasdemenortamao(106a108clones)paraobtenervarios clonesdealtaafinidadyespecificidadparaelantgenodeseado(49). El repertorio de los VHHs es obtenido por PCR utilizando un solo set de primers a partir de linfocitos B presentes en la sangre, ndulos linfticos o de bazo deanimalesinmunizados.ElrepertoriodelosVHHspuedeserclonadoenunvector para fagos y los VHHs especficos pueden ser seleccionados por varios mtodos (panning) (1617). Una vez seleccionados, los fragmentos de inters pueden ser expresadosenformarecombinantelocualsevetambinampliamentefacilitadopor lascaractersticasintrnsecasdelosVHHs.LaexpresindelosVHHsrecombinantes origina una protena de dominio nico de aproximadamente 15 KDa, mucho ms pequeo que los fragmentos Fab, scFv o Fv; adems son fciles de expresar y purificarapartirdelespacioperiplasmticodeE.coli(88),compartimentodondelas protenas son correctamente plegadas ya que el medio ambiente oxidativo estimula la formacin de puentes disulfuro generndose as un VHH funcional. Tambin se 19

 ha reportado que los VHHs obtenidos a partir de cuerpos de inclusin pueden replegarse fcilmente (49). El rendimiento es ms elevado que el obtenido para los scFv (27), y se pueden expresar en otros sistemas como levaduras, plantas y clulas eucariotas (89). Estudios comparativos de VHH y scFv o Fab muestran que los primeros tienen mejor solubilidad, elevada resistencia a prolongadas incubaciones a 37C y que las afinidades tienen valores en el rango nanomolar al igual que en los anticuerpos convencionales obtenidos para los mismos antgenos (27). Tambin se ha demostrado que los VHHs se unen especficamente a su antgeno a temperaturas extremascomo90C(90). Enresumen,encamlidoselrepertorioestructuraldelosVHHesampliamente diversificadoporunamayorlongitudenlosCDR1yCDR3,loquepermiteunagran plasticidad para el remodelado del paratope, introduccin de puentes disulfuro adicionales y alta tasa de mutacin somtica. Adems se observauna alta incidencia deinsercionesdelecionesyreemplazodegenes(51,59).LosVHHssonconsiderados una herramienta importante para el diseo de drogas o compuestos (91), por varias razones: son ms fciles de obtener, tienen un menor tamao, alta afinidad y especificidad por su antgeno y se obtienen altos niveles de expresin, mayor estabilidad y solubilidad. Estas caractersticas hacen de estos fragmentos una herramientaidealparavariasaplicacionesbiotecnolgicasyteraputicas.

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APLICACIONESDEVHHS
Es lgico elegir anticuerpos para el uso de compuestos teraputicos dado que son molculas naturales que han evolucionado de los vertebrados protegiendo al organismo de infecciones, clulas malignas y toxinas (11). Se ha reportado que el fragmento Fab es capaz de penetrar en tejidos densos, como por ejemplo tumores slidos,ysehareportadoquelosscFvpuedenresultaranmsefectivos(92).Porlo tanto, la reduccin del tamao a dominios nicos monomricos (sdAb), como VH y VL tericamente deberan hacerlos ms potentes en este aspecto. Sin embargo debe tenerse en cuenta que la eliminacin de una de las partes podra disminuir la afinidadporsu antgeno(93),en comparacin conel dominoFv original a partirdel cual el VH es derivado (94). Tambin, est bien establecido que los dominios VH aislados mantienen una actividad residual de unin al antgeno (9596) y es comn observarquelosmismos tiendan a agregarse debido a la gran superficie hidrofbica expuestaalsolventeenelladoquecontactaconeldominioVL(11). Los hcIgG generados naturalmente a partir de camlidos, principalmente los dominios nicos VHH, son empleados en un amplio espectro de aplicaciones teraputicas. Los blancos potenciales incluyen desde protenas de la superficie celular tanto de clulas eucariotas como de bacterias patgenas, toxinas, venenos, citoquinas,otrasprotenassecretadas,einclusoprotenasintracelulares(11,44). Las construcciones multivalentes y multiespecficas son diseadas con el fin de aumentar la funcionalidad de un fragmento de anticuerpo mejorando la unin al antgeno a travs de efectos de avidez, por el aumento de la especificidad o por el entrecruzamiento de dos antgenos (11). A partir de VHHs, este tipo de construcciones son ms fciles de obtener comparando con los scFv, y las mismas permanecen activas e intactas en el plasma a 37C por largos perodos de tiempo

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 (86). La aplicacin preclnica de VHHs obtenidos contra el factor de necrosis tumoral (TNF) fue explorada como antagonistas en un modelo de ratn de artritis reumatoidea (AR). La construccin bivalente de VHHs contra TNF humano mostr un incremento en la avidez y gran potencial como antagonista, excediendo incluso a los anticuerpos antiTNF usados clnicamente en AR (97). Por otro lado, se seleccionaron y caracterizaron VHH con funcin antagonista contra el receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR) asociado al desarrollo de tumores slidos. Los VHHs seleccionados inhiben la unin del EGF a su receptor (EGFR) sin actuar comoagonistadelmismo(12). A partir de bibliotecas de llamas no inmunizadas se han podido obtener VHH especficos contra algunas toxinas bacterianas como la toxina del clera, la enterotoxina B estafiloccica y la neurotoxina botulnica A (9899). A partir de VHH monomricos, VHH bivalentes y VHH quimricos (la forma bivalente unida a un Fc dehumano)selogrneutralizarunatoxinadeescorpin,brindandounaimportante aplicacin en sueroterapia (100).Tambin se han obtenido VHH contra fimbrias de la superficie de E. coli F4 que bloquean la adhesin de las bacterias a las clulas hospedadoras. La aplicacin de altas dosis de este VHH en cerdos infectados redujo ladiarreainducidaporlabacteria(101). Muchas compaas producen fragmentos sdAbs dirigidos contra una amplia variedad de antgenos, todos con importantes aplicaciones teraputicas. Entre estas compaas, se encuentran Ablynx, que produce sdAbs a partir de anticuerpos de camlidos, Haptogen y Wyeth a partir de anticuerpos de tiburones, y Arana, DomantisyGSK,apartirdeanticuerposdehumanos. Los fragmentos sdAb poseen la limitacin de no poder atravesar la membrana celular y por lo tanto no es posible utilizarlos contra antgenos intracelulares. Se han desarrollado dos estrategias para permitir el acceso de los sdAb al medio intracelular: la fusin a pptidos que permiten la translocacin a travs de la membrana y, por otro lado, la transfeccin de clulas con construcciones de ADN que codifiquen para el sdAb. La eficiencia de translocacin de sdAb a travs de la 22

 membrana resulta muy variable (44, 102103), por eso la estrategia de transfeccin y expresindelsdAbesunaalternativainteresante. Se define a los intrabodies como molculas de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos diseados para ser expresados intracelularmente y ejercer su funcin en determinados compartimentos subcelulares. Estos anticuerpos son usados como herramientas biotecnolgicas para interrumpir, modular o definir funciones de un amplio rango de antgenos. Se ha estudiado el efecto de los intrabodies en modelos de cncer, de infeccin por el HIV y de enfermedades autoinmunes y neurodegenerativas (104). Algunos blancos de los intrabodies analizados fueron protenas estructurales, regulatorias y enzimas del HIV y se ha observado que pueden modular tanto eventos tempranos como tardos del ciclo viral (105). A pesar de que los scFv son los fragmentos ms comnmente empleados para la expresin en el citoplasma de clulas eucariotas y son utilizados como agentes teraputicos (106),existeninconvenientescomoelplegadoincorrecto,bajasolubilidad,cortavida media de la protena y elevada tendencia a la agregacin (107108). Un problema asociado con la expresin de los intrabodies surge por el estado redox de los compartimentos subcelulares debido a que la formacin de puentes disulfuro en los scFv se ve gravemente comprometida, conduciendo a intrabodies no funcionales (106, 109110). Varias estrategias son empleadas para mejorar la estabilidad de estos fragmentos como son la ingeniera gentica, la seleccin de fragmentos de anticuerpos a partir de bibliotecas de intrabodies (106, 108, 111) y el empleo de chaperonas (112113). En algunos casos, la fusin de intrabodies con la protena de unin a maltosa (maltosa binding protein, MBP) de E. coli aumenta su solubilidad y estabilidad (112, 114). Se han utilizado sdAds como VL (115) y VH (116) como intrabodies, y los mismos tienen ms elevada estabilidad, solubilidad y mayores nivelesdeexpresinquelosscFv(117).

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 El uso de VHHs resulta una alternativa prometedora en el diseo de intrabodies debido a su elevada estabilidad y excelente plegado bajo condiciones extremas.Portalmotivo,VHHsfusionadosaprotenasfluorescentes(choromobody intrabody) son expresados en diferentes compartimentos y estructuras subcelulares de clulas eucariotas, y pueden reconocer diversos epitopes, incluyendo antgenos que se expresan en bajas concentraciones (118). Por otro lado, VHHs especficos contra la protena S del virus de la hepatitis B son expresados en el retculo endoplsmico y causan una marcada reduccin en la concentracin de partculas virales tanto en modelos in vitro como in vivo (119). A su vez, VHHs contra un retrovirus porcino, expresados en el citoplasma, bloquean la replicacin viral e inhiben la citotoxicidad inducida por el virus (120). Adems, tambin se pudo observar que VHHs expresados en el citoplasma efectivamente inhiben la apoptosis celular inducida por stress oxidativo causante de enfermedades neurodegenerativas (121). En nuestro conocimiento, no existen anticuerpos de llamas utilizados como intrabodies para inhibir toxinas bacterianas intracelulares. Por lo tanto, presentamos y demostramos en esta Tesis el uso de anticuerpos de llama como inhibidores de toxinas bacterianas intracelulares. Particularmente, este trabajo aprovecha las caractersticas expuestas de los hcIgG de camlidos para obtener anticuerpos contra una toxina bacteriana por inmunizacin de llamas y realizacin de una biblioteca de VHHs. Como prueba de concepto, en este trabajo de Tesis utilizamos VHHs obtenidosparainhibirlainfeccinporSalmonellatyphimurium.

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SPVB: UNA TOXINA CRUCIAL SALMONELLATYPHIMURIUM

DEL

PATGENO

El gnero Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae, orden Enterobacteriales (122). Este gnero est compuesto por bacilos Gramnegativos e intracelulares facultativos. Salmonella spp es un patgeno de humanos y animales, y causa un amplio espectro de enfermedades como gastroenteritis, fiebre tifoidea y bacteremia, las cuales tienen su origen en la infeccin entrica (123124). El gnero Salmonella comprende dos especies: Salmonella entrica, que se subdivide en ms de 2000 serovariedades (125), y Salmonella bongori. Parauna nomenclatura simplificada en esta Tesis consideraremos los nombres de serovariedades como nombres de especies.Deestemodo,SalmonellaentericasubgrupoentericaserotipoTyphimuriumse referircomoSalmonellatyphimurium. La estrecha relacin que existe entre las especies de Salmonella que causan enfermedades en distintos huspedes de mamferos ha conducido a estudiar intensamente los mecanismos patognicos de S. typhimurium en ratones como modeloparacomprenderlasenfermedadeshumanas. Lanaturalezayseveridad dela infeccingeneralmentedependen de laespecie de Salmonella y del hospedador (123124). Algunas especies estn especficamente adaptadasaunhospedadordeterminado,comoS.typhiahumanos,S.pullorumalas aves de corral, S. dublin al ganado vacuno y S. arizonae a reptiles. Otras, como S. typhimurium, S. enteritidis, y S. choleraesius tienen un amplio espectro de hospedadores causando diferentes enfermedades en cada uno de ellos, por ejemplo S. typhimurium, que causa una infeccin letal y sistmica en ratones, y en humanos unalevegastroenteritis(125126)

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 Salmonella typhi y paratyphi son especies mortales para el humano, que causan fiebre tifoidea sistmica, y constituyen uno de los principales problemas de salud en lospasessubdesarrolladosdelmundo.Seestimaquehayunos20millonesdecasos yalrededordeunas200.000muertesanuales(127128).OtrascomoS.typhimuriumy S. enteritidis generan intoxicacin alimentaria en los pases industrializados (126), causando millones de infecciones y muertes en poblaciones de humanos cada ao (129131). En infecciones sistmicas, Salmonella penetra la mucosa intestinal e invade las clulas M de las placas de Peyer (132); las bacterias eventualmente destruyen las clulas M invadidas y el epitelio adyacente (133134) accediendo al tejido linfoide. Cuando el tejido linfoide es invadido, Salmonella es fagocitada por macrfagos, en los que crece y se replica en un compartimento membranoso especial, denominado vacuola contenedora de Salmonella (VCS). Las VCS que contienen a las bacterias forman extensiones filamentosas en la membrana, conocidas como SIF (Salmonella induced filaments), las cuales son indispensables para la supervivencia intracelular (135).Lasbacteriasseacumulanyreplicanmasivamenteenrganosquesonricosen clulas fagocticas, como son el hgado, el bazo y en la mdula sea, generando insuficiencia en los rganos afectados, la sepsis bacteriana y la muerte del individuo (123). Estudios realizados en modelos in vivo e in vitro, mostraron que Salmonella spp causa la muerte celular de macrfagos (136139). Al estudiar mutantes de S. typhimuriumquenosereplicandentrodemacrfagosseobservquelasmismasson atenuadasparalavirulenciaenratones(140141),sugiriendoquelasupervivenciay replicacinenmacrfagosesesencialparalavirulencia(124,142143).Lainteraccin del patgeno con la clula hospedadora est particularmente caracterizada por factores que estn localizados sobre la superficie de la bacteria o que son secretados hacia el espacio extracelular. Aunque las protenas secretadas por la bacteria son numerosas,diversasytienenunampliorangodefuncionesqueincluyenprotelisis, hemlisis, citotoxicidad, fosforilacin y desfosforilacin, solamente unas pocas vas puedentransportarestasprotenasdesdeelcitoplasmadelabacteriahaciaelespacio 26

 extracelular (123). Cuatro vas de secrecin de protenas (tipo I a IV) han sido descriptas en bacterias Gram negativas (144147). La virulencia en bacterias patgenas est mediada en gran medida por la presencia de genes que codifican para factores de virulencia, organizados en islas de patogenicidad (IP). Estas IP son segmentos de ADN localizados en el cromosoma de la bacteria, que no estn presentes en organismos relacionados no patognicos (148151). Algunas de estas IP codifican para el sistema de secrecin tipo III (SST3) el cual permite secretar y translocar protenas patgenas, llamadas efectores, desde la bacteria hacia el citoplasma de las clulas hospedadoras (123, 152). En Salmonella, existen dos SST3, los cuales estn codificados por la isla de patogenicidad 1 (IPS1) y la isla de patogenicidad 2 (IPS2) (153155). Estos dos SST3 desempean roles diferentes durante la patognesis de Salmonella.El SST3 y sus efectorescodificadosporla IPS1 sonnecesariosparalainvasinenlasclulasepitelialesdelamucosaintestinal((123, 152). La invasin a las clulas M es un evento activo, dado que los efectores promueven el rearreglo del citoesqueleto de actina, provocando proyecciones en la membrana denominadas ruffling, lo que favorece la internalizacin de la bacteria al hospedador (156157). Adems, la entrada a las clulas M parece estar mediada por fimbrias propias de cada especie (158). Por lo tanto, el IPS1 y las fimbrias funcionan sinrgicamente en la invasin de la barrera intestinal (123). El segundo SST3 y sus efectores codificados por la IPS2 son esenciales para la supervivencia y replicacin dentro de macrfagos, y a su vez para el desarrollo de la enfermedad sistmica(142)(130;(153,155,159161)147151).Unodelosefectoresrequeridosenla infeccindemacrfagoseselopernspv(salmonellaplasmidvirulence)(162,156),el cual se encuentra localizado en un gran plsmido de virulencia presente en algunas especies de Salmonella (163165,157159). El opern es esencial para infecciones sistmicas en ratones, virulencia en otras especies (166172,160166) y para el crecimiento e infeccin de cultivos de macrfagos, provocando desprendimiento y muerte celular luego de 24 horas de infeccin (162,156). En algunas especies ancestrales los genes spv se han insertado en el cromosoma de la bacteria (173,167). 27

 El opern spv est compuesto por cinco genes: un gen regulador positivo (spvR) (174175,168; 169) y cuatro efectores (spvA, spvB, spvC, y spvD) (163, 165). Uno de los genes efectores que determina en gran parte el fenotipo que causa el opern, es el gen spvB, el cual codifica para la protena SpvB. Esta protena depolimeriza el citoesqueleto deactina,conduciendoa la muerte celularenlasclulas hospedadoras (176), siendo la misma secretada desde la bacteria al citoplasma de las clulas hospedadoras(177).SpvBesunpolipptidodecadenanicade65KDaformadopor dosdominios:Nterminal(residuosdeaminocidos1366)yCterminal(residuosde aminocidos 374591). Ambos dominios estn unidos por siete prolinas (177). El dominio Nterminal de SpvB funciona como una seal de transporte extracelular en laprotena,siendoesencialparalasecrecindeSpvB(124).EldominioCterminales una ADPribosiltransferasa que transfiere covalentemente la ADPribosa (ADPR) a partir de la molcula de nicotinamida adenina dinuclotido (NAD) al residuo arginina177delaactina(178180),depolimerizandosusfilamentos.Laestructurade SpvB fue resuelta, observndose que el dominio cataltico Cterminal adopta la estructura cannica de una amplia familia de ADPribosiltransferasas y consiste en unplegamiento / condoshojas casiperpendicularesyuxtapuestasaundominio helicoidal(180). La ADPribosilacin es un modo de accin comn de muchas toxinas bacterianas (181). Muchas toxinas que ADPribosilan son secretadas al espacio extracelularyluegotranslocadasalcitosoldelasclulashospedadorasconayudade un dominio de translocacin (por ejemplo, la toxina de difteria) o con ayuda de una subunidad asociada (por ejemplo, las toxinas de Clostridium y clera). Estas toxinas secretadas son susceptibles a la neutralizacin por anticuerpos convencionales y la inmunizacin activa y pasiva es utilizada eficientemente para prevenir o tratar enfermedades mediadas por alguna de estas toxinas (182183). Otras bacterias patgenas, como Salmonella inyectan toxinas directamente desde vacuolas hacia el citoplasma de clulas eucariotas, a travs de algn sistema de secrecin 28

 especializado,comoeselcasodeSpvBqueessecretadoporelSST3codificadoporla IPS2(178,184)evitandoassuneutralizacinporanticuerpos. Las estrategias teraputicas dirigidas a bloquear la actividad enzimtica de SpvB con inhibidores de tamao pequeo, tienen la desventaja de generar posibles efectossecundarioscomolainhibicindeADPribosiltransferasasendgenas(185).

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OBJETIVOS

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 El objetivo general de este trabajo consiste en demostrar como prueba de concepto que es posible generar, caracterizar y utilizar anticuerpos de llama de dominionicocomoinhibidoresespecficosdetoxinasbacterianasintracelulares. Losobjetivosparticularesson:

Clonar, expresar y purificar el dominio cataltico Cterminal de la toxina SpvBdeSalmonellatyphimurium. Utilizar mtodos radioactivos y fluoromtricos para analizar la actividad enzimticadeSpvB. Inmunizar llamas con dicho dominio y verificar que se produzca una respuestainmunehumoralespecfica. Obtener a partir de sangre perifrica de dichos animales una biblioteca combinatorialdefragmentosVHHs. Seleccionar, mediante el antgeno biotinilado en solucin, fagos que expresenVHHsespecficoscontraSpvB. Caracterizar VHHs especficos mediante secuenciacin y capacidad de inhibicindelaactividadenzimticadeSpvB. Seleccionar VHHs con mayor capacidad inhibitoria, y demostrar que inhibenenformadosisdependienteaSpvB. ExpresardichosVHHsinhibitoriosenclulaseucariotas. DemostrarlacapacidadinhibitoriadedichosVHHscomointrabodies.

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MATERIALESYMTODOS

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 1.Reactivos 1.1.Soluciones,MediosyBuffers: Nombre Composicin 2xTY 16g/lTriptona,10g/lExtractodelevadura,5g/lNacl,pH7.4 Buffer10 300mMNaCl,50mMNaH2PO4,10mMImidazol,pH8(conDTTparaSpvB) Buffer250 300mM NaCl, 50mM NaH2PO4, 250 mM Imidazol, pH 8 (con DTT para SpvB) LB 10g/lTriptona,5g/lExtractodelevadura,5g/lNacl,pH7.4 LBagar LB+10g/lAgarAgar OPD 2mg/ml OPD (Sigma) en buffer citrato/fosfato 50mM pH=5 + 0.02%(v/v) H2O2 PBS 10mMNa3PO4pH=7.4,150mMNaCl,2.7mMKCl PBST PBS+0.05%(v/v)Tween20 SFB5% 10%(v/v)SFBenRPMI1640 SOC 20g/l Triptona, 10g/l Extracto de levadura, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl,10mMMgSO4,20mMGlc TES 30mMTrisHClpH8,20%(m/v)Sacarosa,1mMEDTA TBE 45mMTrisboratopH8.3,2mMEDTA Las sales y reactivos de uso comn cuyo proveedor no se especifica son de calidad paraanlisisyprovienendeMerckoSigma. 2.CepasdeE.coli: Cepa Fenotipo supE44 thi 1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacIZYAargF) U169 deoR (80 DH5 dlac(lacZ)M15) F{lacIq, Tn10(TetR)} mcrA (mrrhsdRMSmcrBC) 80lacZ M15 lacX74 Top10F recA1araD139(araleu)7697galUgalKrpsL(StrR)endA1nupG F::Tn 10 (TetR) proA+ B+ lacIq(lacZ)M15/recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) thi XL1BlueF hsdR17(rm+)supE44relA1lac 33

 3.Lneascelulares LneacelularTipocelular HEK293fibroblastosembrionariosderinhumano Hela:epitelialesdecarcinomacervicalhumano J774A.1monocitos/macrfagos RAW264.1macrfagos Vero76 epitelialesderin

CHOclulasdeovariodehmsterchino 4.Primers nombre secuencia (5' > 3') Clonado de SpvB en pET26b SP1-NcoI cct cct ccg acc atg gga ggt aat tca tct cga c SP4-XhoI gat tct tag ctc gag tga gtt gag tac cct cat gtt Clonado de VHHs en pHEN2 Lam07-NotI gat ggt gat gat gat gtg cgg ccg cgc tgg ggt ctt cgc tgt ggt gcg Lam08-NotI gat ggt gat gat gat gtg cgg ccg ctg gtt gtg gtt ttg gtg tct tgg VH1b-SfiI gct gga ttg tta tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc cag gts mar ctg cag sag tcw gg VH6b-SfiI cgt gga ttg tta tta tct gcg gcc cag ccg gcc atg gcc gat gtg cag ctg cag gcg tct ggr gga gg Clonado de MBP-VHH5 y MBP-VHHNR en pcDNA6 MBP-VHH- act agt gca aag ctt atg aaa atc gaa gaa ggt aaa ctg gta atc tgg Hind III VHH- XbaI ggt aat cgg tct aga tca tgg ttg tgg ttt tgg tgt ctt gg 34

 5.Clonado,expresinypurificacindeSpvB pET26b (+) (Novagene). La cepa de E. coli DH5 fue transformada con el plsmido en medio LB con kanamicina (Kan) a 37C y se plaquearon alcuotas de dichos cultivos en placas LB agar + Kan a 37C. Se tomaron colonias nicas y se realizaron minipreps (QIAprep Spin Miniprep Kit, QIAGEN) para obtener ADN de buena calidad.Secorrieronalcuotasengeldeagarosa1%TBEyseestimlaconcentracin y pureza del mismo. La misma fue determinada por absorbancia, considerando que una DO260=1.0 = 50 ng/l. Se tomaron alcuotas del ADN y se eligieron 5 clones los cuales fueron secuenciados. Por otro lado, se transform la cepa E. coli BL21 con ADNpuroydeconcentracinestimadaysecrecieroncultivos,luegoseplaquearon alcuotasdeestoscultivosenplacasdeLBagar+70g/mldeKan. 5.2.Expresin:SpvBfuepurificadaapartirdecitoplasmaydecuerposdeinclusin. Para ambos casos, a partir de la cepa E. coli BL21 transformada se crecieron cultivos en medio LB con Kan a 37C durante toda noche (ON). Una dilucin de estos cultivos se creci hasta alcanzar una DO600=0.50.8 en agitacin constante a 37C. Cuando el cultivo alcanz la DO esperada, se indujo con 1mM IPTG para sobre expresarlaprotenarecombinante. Para la obtencin de la protena de citoplasma, luego de la induccin el cultivo fue lisis: 50 mM Tris/HCl, 5 mM EDTA, 0.5 % tritn, mercaptoetanol y 1 mM PMSF pH8. El pellet solubilizado fue sonicado varias veces para reducir al mnimo la viscosidad,centrifugadoa18.000xgyelsobrenadantefuedializadoONconelbuffer decorrida(buffer10). Para obtener la protena a partir de cuerpos de inclusin, el cultivo se incub ON a 37C, se centrifug, y el pellet fue resuspendido en el buffer de lisis. El pellet solubilizado, fue sonicado varias veces para reducir al mnimo la viscosidad, 35 dejado ON a 28C, centrifugado a 4000xg y el pellet fue resuspendido en buffer de 5.1. Clonado: La secuencia del dominio Cterminal de SpvB fue clonada en el vector

 centrifugadoa18.000xgyluegolavado3vecescon50mMTris/HCl,5mMEDTA,1 mM PMSF pH 8 para eliminar el exceso de tritn. El pellet fue solubilizado en 6M GdnHCl ON a temperatura ambiente en agitacin. El pellet completamente soluble se someti a varios cambios de dilisis con PBS para lograr el replegado de la protena.Porltimo,serealizunadilisisONconelbufferdecorrida(buffer10). 5.3. Purificacin: Se realizaron dos pasos de purificacin de la protena. En el paso inicial se utiliz una columna HisTrapTM HP (GE Healthcare) y la misma fue previamente lavada con el buffer de corrida. El sobrenadante dializado contra el buffer de corrida (Buffer 10) fue purificado en la columna HisTrapTM HP. Se utiliz como buffer de elucin el buffer250. Para la elucin de SpvB se utiliz un gradiente creciente de imidazol de 10mM a 250 mM. La fraccin correspondiente a SpvB fue dializada con TrisHCL pH 8 + 0.5 mM NaCl, 1 mM DTT. Luego se procedi a un segundo paso de purificacin, utilizando una columna de tamiz molecular ( S75: SuperdexTM 75). Las muestras fueron calentadas durante 10 min a 90C y analizadas porgelSDSPAGE. 5.4. Biotinilacin. SpvB fue biotinilada y para tal fin se sigui el protocolo del fabricante (EZLink SulfoNHSLCBiotin, Pierce). La biotinilacin de SpvB fue corroboradaporELISA.Laplacafuesensibilizadacon1gdestreptavidinaen50l PBS en pocillos de placa Maxisorp (Nunc) durante 1 hs a temperatura ambiente. Se lav cada pocillo 3 veces con PBST y se agreg 0.5g de SpvB biotinilada en 50l PBS durante 1 hs a temperatura ambiente. Los pocillos se bloquearon con 200l 3% (m/v) leche descremada PBST ON a 4C. La placa se lav tres veces con PBST. A continuacin se incubaron los pocillos con suero de llama antiSpvB durante 1 h diluidos en 1% (m/v) leche descremada en PBST. Como anticuerpo secundario se utiliz un antiIgG de llama desarrollado en conejo en dilucin 1/1000 el cual se revel con un antiIgG de conejo conjugado a peroxidasa (HRP) desarrollado en cabra(Sigma)endilucin1/1000.Laplacaselav,yseagregunasolucinfrescade sustrato OPD. Luego de 10 min, la reaccin cromognica fue detenida por agregado 36

 de H2SO4 4N. La DO492 de cada pocillo fue medida en un lector de placas de ELISA (960MetertechInc). 6.ActividadenzimticadeSpvB:RadioactividadyFluorometra. 1g de la enzima pura, 1Ci [32P]NAD, 1 mM ADPribosa y 1 mM DTT durante 1 h a 37C. Se utiliz como fuente de actina un lisado de clulas CHO (ovario de hamster chino, 1x106 clulas). Las muestras fueron incubadas en acetona fra ON a 20Cyluegocentrifugadasa16000xgdurante30minutosa4C.Elpelletfuelavado dosvecesconacetonafrayresuspendidoenloadingbuffer.Comocontrolserealiz lamismamezcla,perosinelagregadodelaenzima.Alcuotasdelareaccinydelos controlesfueron sometidos a una corrida electroforticaporSDSPAGE15%yluego el gel fue expuesto a autorradiografa durante 24 hs para poder evaluar la actina marcada radioactivamente. Tambin se midi la actividad enzimtica de SpvB utilizando actina comercial. Para tal fin, se sigui un protocolo idntico al detallado anteriormente. Se utiliz un equipo Storm (Molecular dynamics, Amersham PharmaciaBiotech)paraobservarlasbandasdeactinamarcadasradioactivamente. Para poder estimar la cantidad mnima necesaria de SpvB, se realiz un ensayo de actividad enzimtica variando la cantidad de SpvB, a diferentes tiempos. Para ello, se sigui un protocolo idntico al detallado anteriormente. Se incub un lisado de 37C.Seagregalareaccin1Ci[32P]NAD(AmershamPharmaciaBiotech),1mM ADPribosay1 mM DTT. Seincubaronlasmuestrasenacetona fra ONa20Cyse centrifugarona16000xgdurante30min.Selavelpelletdosvecesconacetonafray se resuspendi en loading buffer. Las muestras fueron sometidas a corrida electroforticaporSDSPAGE15%.Luegoserealizunaautorradiografadurante24 hs. 37 clulas CHO con 50 ng, 25 ng y 10 ng de SpvB pura durante 10, 30 y 60 minutos a 6.1. Ensayo de radioactividad: Se midi la actividad enzimtica de SpvB incubando

 6.2. Ensayo de Fluorometra: Aplicando la tcnica de fluorometra, se midi la actividad enzimticade SpvB.En estosensayos la polimerizacinde la actina puede ser visualizada por el incremento de fluorescencia luego del agregado de un buffer que permite dicha polimerizacin (buffer G). Se incubaron 0.5 g (6.66x108M) de SpvB pura, 0.4 mg/ml de actina marcada con pyrene (Actin Polymerization Biochem Kit) y 0.05mM de NAD durante 15 min a temperatura ambiente. Luego fue monitoreada la lnea de base durante 3 minutos y por ltimo se agreg a la reaccin el buffer de polimerizacin de actina (buffer G) y la fluorescencia fue monitoreada durante15min.ComocontrolesdelensayoseincubaSpvBenausenciadeNADy enpresenciadeunVHHnorelacionado(VHHNR). Para estimar la cantidad de enzima necesaria para inhibir la polimerizacin de actina, se utilizaron diferentes cantidades de SpvB. Para tal fin, se incub 0.5 g (6.66x108M), 0.25 g (3.33x108M) y 0.05 g (6.66x109M) de SpvB pura, 0.4 mg/ml actina marcada con pyrene y 0.05 mM de NAD durante 15 min a temperatura ambiente. La lnea de base fue evaluada durante 3 minutos y se agreg a la reaccin el buffer G y la fluorescencia fue monitoreada durante 20 min. En todos los casos para monitorear la fluorescencia se utiliz un aparato espectrofotmetro de luminiscencia(PerkinElmer). 7.ObtencindeIgGsdellamayVHHrecombinantesantiSpvB 7.1. Inmunizaciones: Se inmunizaron dos llamas (Lama glama) con 3 dosis de 0.8 mg de ADN y 3 dosis de 250g de protena. Para la inmunizacin con ADN se utiliz un vector de expresin que codifica para el Cterminal de SpvB (pME CD8F.SpvB.GPIDA). Para la inmunizacin con protena, se utiliz SpvB pura emulsionada en adyuvante incompleto de Freund (IFA, Sigma) en relacin 1:1 v:v protena:adyuvante. Se realizaron seis inmunizaciones en total, a intervalos de 21 38

 das. Antes de las inmunizaciones y luego de las realizadas con protena, se extrajo una muestra de sangre de la vena yugular para analizar la respuesta policlonal anti SpvB generada por las inmunizaciones anteriores en ambas llamas. A los 20 das luego de la ltima inmunizacin, se extrajeron 120 ml de sangre heparinizada del animal con mejor respuesta (9208), para aislar clulas mononucleares y analizar la respuestasricapoliclonal. 7.2. Evaluacin de la respuesta policlonal: El suero de la llama 9208 fue analizado por ELISA para determinar el ttulo de anticuerpos antiSpvB alcanzado luego de la ltima inmunizacin. Para ello se inmoviliz SpvB pura (0.5g en PBS) en pocillos de placa Maxisorp (Nunc) durante 2 hs y se bloque con 200 l en 3% (m/v) leche descremada en PBST (bloqueante) ON a 4C. A continuacin, se incubaron los pocilloscon dilucionesseriadasdel suero de llamadurante 1h diluidos en1% (m/v) leche descremada en PBST. Como anticuerpo secundario se utiliz un antiIgG de llama desarrollado en conejo (dilucin 1/1000), el cual se revel con un antiIgG de conejoconjugadoaHRPdesarrolladoencabra(Sigma)endilucin1/1000.Selav,y se agreg una solucin fresca de sustrato OPD. Luego de 10 min, la reaccin cromognica fue detenida por agregado de H2SO4 4N. La DO492 de cada pocillo fue medida en un lector de placas de ELISA (960 Metertech Inc). En todos los pasos,

salvo que se indique lo contrario, el volumen utilizado por pocillo fue de 50l; los lavados fueron realizados con PBST (3 repeticiones) y las incubaciones fueron realizadasencmarahmeda.Cadadeterminacinfuerealizadaporduplicado. 7.3. Construccin de una biblioteca de expresin en fagos de VHHs de llama: A partir de la sangre heparinizada de la llama 9208, se aislaron las clulas mononucleares por centrifugacin en gradiente de FicollHypaqueTM PLUS (GE Healthcare). El ARN total proveniente de las clulas fue purificado con TRIZOL (Invitrogen). El ARN obtenido fue analizado por electroforesis en gel de agarosa 1% en TBE para corroborar su integridad y cuantificado por absorbancia a 260 nm, 39

 considerando que una DO260=1.0 corresponde a 40 g/ml de ARN. La muestra fue considerada altamente purificada (relacin DO260/DO2801.8a pH bsico). Apartirde 16 g de ARN total, se procedi a realizar sntesis de la primera hebra incubando la

muestrapor10mina70Cenpresenciade2gOligodT18,seenfrirpidamentey se llev a 0.4 mM dNTPs, 1U/ul RNAsin, y 8U/l MMLVRT (Promega) en un

volumen de 100l en Buffer RT. Se incub por 1 h a 42C y se detuvo la reaccin incubando15mina70C.ElADNdoblecadena(dcADN)fueobtenidoporPCRcon primersespecficosparaVHHdellama(50).Serealizarondosreacciones,utilizando 2 primers diferentes correspondientes a las primeras bases de la regin variable,VH1byVH6bquecontienen sitios dereconocimiento de la enzima SfiI,con un primer complementario a la regin bisagra de las hcIgG, Lam07 y Lam08 que contienen un sitio de reconocimiento de la enzima de restriccin Not1. Las reacciones de PCR constaron de los siguientes ciclos: 1 ciclo inicial de desnaturalizacin(5mina95C),30ciclosdeamplificacin(1min95C,1min55C, 500pb, fueron purificados desde gel de agarosa (GFX PCR DNA & Gel Band 1 min 72C) y un ciclo final de elongacin (10 min 72C). Los productos de PCR, de

purification kit, Qiagen), digeridos secuencialmente por las enzimas de restriccin SfiI y NotI y repurificados a partir de gel de agarosa. Los insertos fueron mezclados y ensayados en ligaciones a escala pequea con el plsmido de expresin en fagos pHEN2 (Figura 3), que confiere resistencia a ampicilina (Amp) (186) previamente digerido con las enzimas SfiI y NotI. Se probaron dos relaciones molares vector:inserto diferentes. Para la relacin molar 1:3 (vector:inserto) se utiliz 50 ng deplsmidoy15ngdeinserto,yparalarelacinmolar1:6(vector:inserto)seutiliz 50ngdeplsmidoy30ngdeinserto.Laeficienciadetransformacindecadaunade las ligaciones y de una reaccin control sin inserto fue determinada por transformacin por pulso elctrico de 50 l de clulas de E. coli XL1 Blue electrocompetentes de alta eficiencia (~3,3x109 ufc/g ADN) con 1l de la reaccin. Los parmetros del electroporador (BioRad Gene Pulser II System) se establecieron en 2.5 kV, 25 F y 200 . Como los resultados fueron satisfactorios con la relacin 40

 molar1:3vector:insertoseprocediarealizarligacionesaaltaescala.Seincub1g devectorcon300ngdelamezcladelosinsertos,1Xbufferligasay0.1U/ldeligasa de bacterifago T4 (Promega) en 200 l de reaccin, ON a 15C. La reaccin fue purificada mezclando 1 volmen de fenol:cloroformo:alcohol isoamlico 25:24:1. Luego de centrifugar, la fase acuosa fue extrada 2 veces con cloroformo y precipitada con 0.15 volmenes de acetato de sodio 2 M pH=5.2, 2 volmenes de EtOH absoluto fro y 20 ng glucgeno ON a20C. Luego de centrifugar a 12.000xg 30mina4C,elprecipitadoselavconEtOH70%,sedejsecaryseresuspendien 15ldeddH2Oestril.
LMB3 ----------------------> RBS TT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC CAT GAT TAC GCC AAG CTT GCA TGC AAA TTC pelB leader TAT TTC AAG GAG ACA GTC ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA M K Y L L P T A A A G SfiI TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAGGTGCAGCTGCAGGTCGACCTCGAG L L L L A A Q P A M A

TGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGCACAGGTCCAACTGCAGGAGCTCGATATCA NotI 6xHis-tag AACGG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG GCC GCA GAA CAA AAA CTC A A A G A A E Q K L H H H H H H myc-tag Amber ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG ACT GTT GAA AGT TGT TTA I S E E D L N G A A * E T V E S C L fdSeq1 <---------------------GCA AAA CCT CAT ACA GAA AAT TCA TTT ... A K P H T E N S F ...

Figura3:Secuenciadelsitiodeclonadoyregionesflanqueantesdelvectorparaexpresin enfagospHEN2.SedetallanennegritalossitiosdereconocimientodeSfiIyNotI,elsitiode unin a ribosomas se encuentra subrayado. Se muestra la traduccin a aminocidos del pptidosealpelB,ytambinladelareginroabajodelinsertoconteniendolassecuencias 6xHistag y myctag (subrayadas) y el codn mbar. Los primeros aminocidos de la protena pIII del fago M13 se indican en itlica. Se muestran los primers usados para la secuenciacindelosinsertos.AdaptadodeGriffiths(186).

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 Se procedi entonces a transformar 180l de clulas electrocompetentes con 3l de la ligacin, en un total de 5 transformaciones. Se utiliz un total de 1.3 g de ADN paralastransformaciones.Seresuspendieronrpidamentelasclulaselectroporadas en 1.5 ml de medio SOC y se juntaron todas las transformaciones en un mismo tubo de cultivo (aproximadamente 7.5 ml volumen final) y se incubaron a 37C durante 40minutosconagitacinparapermitirlaexpresindelaresistenciaaAmpotorgada porelplsmido. Por un lado, se plaquearon alcuotas de estos cultivos en placas de LB agar + 100 g/ml de Amp y se cont el nmero de colonias para determinar el tamao de la biblioteca. Se tomaron 10 colonias nicas, se cultivaron en 3 ml de LB + Amp y se guardaron los cultivos para su posterior secuenciacin y para analizar la variabilidaddelabiblioteca. Por otro lado, se le agreg al cultivo de clulas electroporadas 300 ml de medio 2xTY+100g/mlAmp+glucosaestril1%yseincubpor1ha37Cconagitacin, luegoseagregAmphastaunaconcentracinfinalde 50g/mly seincubporotra hora ms en iguales condiciones. Se guardaron alcuotas de este cultivo como stockdelabibliotecaa70Cen10%glicerol.Elrestodelcultivofuellevadoa500 ml con medio 2xTY+ 100 g/ml Amp y glucosa estril 1% hasta DO0.5. Para

obtenerpartculas defagosqueexpresen VHHs como protenadefusincon pIII, se determin aproximadamente la densidad celular por absorbancia a 600 nm, considerando que una DO600=1 corresponde a 8x108 bacterias/ml y se agreg una suspensin de fagos helper VCSM13 a una multiplicidad de infeccin (MOI: multiplicity of infection) MOI=20 de manera de asegurar la infeccin de todas las clulas y por ende la representacin de todos los fagos, y se incub media hora mas a37Cenagitacin.Elcultivofuecentrifugadoa3000xgdurante10minutosyluego fue resuspendido en 400 ml en medio 2xTY + 50g/ml Amp + 10g/ml Tetraciclina (Tet) + 70 g/ml Kan, y se incub ON a 30C con agitacin. El cultivo fue centrifugado, y los fagos del sobrenadante fueron precipitados agregando 4% PEG 8000 y 0.5M NaCl concentracin final, incubando en hielo durante 1 hora y 42

 centrifugando a 4000xg a 4C durante 45 min. El precipitado se resuspendi en 5 ml de PBS estril, de los cuales 1 ml se reserv para cuantificar el contenido de fagos, 3 ml se congelaron con N2 lquido y se guardaron a 70C y el mililitro restante se reservparalaseleccindebindersdeSpvB. 7.4.SeleccindefragmentosVHHantiSpvBensolucin:Serealizaron3rondasde seleccin (panning) en solucin y para cada una de ellas se utilizaron dos concentraciones de SpvB biotinilado: 10 nM y 50 nM. Se mezcl la enzima biotinilada con los fagos de la biblioteca previamente cuantificados a una densidad de 1.6x1014 en 4% (m/v) leche descremada en PBS. Como control negativo se utilizaron los fagos de la biblioteca mezclados con PBS. Se incubaron los tubos durante 2 hs a temperatura ambiente con agitacin suave para permitir la unin de VHHs a SpvB biotinilado. Luego se agreg 100 l de esferas magnticas con streptavidina previamente bloqueadas en 5% (m/v) leche descremada en PBS y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente para permitir la unin del complejo (VHHfago+SpvBesferas/streptavidina). Para separar el complejo del sobrenadante se utiliz un imn y se lav 7 veces con 1% (m/v) leche descremada en PBST y de esta manera poder descartar los fagos no unidos especficamente. Los fagos retenidos al complejo fueron eluidos por cambio de pH utilizando 200 l de 100 mM de trietilamina durante 5 min a temperatura ambiente agitando suavemente. Los fagos eluidos fueron rpidamente neutralizados agregando 100l 1M Tris HCl pH 7.4. Diez l de los fagos eluidos fueron utilizados para infectar 2.5

ml de cultivo de clulas XL1Blue en fase exponencial incubando 30 min a 37C y alcuotas de estos cultivos fueron plaqueadas en placas de LB agar + Amp para cuantificar. El resto de los cultivos infectados con fagos provenientes de la primera ronda fue usado como fuente de fagos para la segunda ronda de seleccin. Cada cultivo (2,5ml) fue llevado a 8 ml de volumen con medio 2xTY + 100 g/ml Amp + 10 g/ml Tet + 1% glucosa estril, crecido durante 1 h a 37C, luego se agreg 50g/ml 43

 Amp y se incubaron a 37C por 1 h ms. Se determin aproximadamente la densidad celular por absorbancia a 600 nm, y se infect cada cultivo con fago helper VCSM13 a una MOI=20 y se incub 30 min a 37C. Los cultivos fueron centrifugados a 3000xg durante 10 min y luego resuspendidos en 150 ml de 2xTY + 100g/mlAmp+10g/mlTet+70g/mlKan.LoscultivosseincubaronONa30C con agitacin y al da siguiente los fagos del sobrenadante se precipitaron con 4% PEG 8000 y 0.5 M NaCl concentracin final como se indic anteriormente y se resuspendieron en PBS estril. Los fagos previamente cuantificados se utilizaron para la segunda ronda de seleccin en condiciones idnticas a la primera. En este caso,seincubaron2x1013fagosylosmismosfueroneluidosdelamismamaneraque se realiz para la primera ronda. La tercera ronda de seleccin fue llevada a cabo en condiciones idnticas a las anteriores rondas, y se respet el mtodo de elucin empleado. En la ronda 3 la cantidad de fagos incubados fue de 2x1013, y los fagos eluidos fueron cuantificados por infeccin de cultivos bacterianos y alcuotas de los mismosfueronplaqueadasenplacasdeLBagar+Amp. 7.5. Evaluacin del mtodo de elucin: A partir de los fagos eluidos con 50 nM de la ronda 2 y 40 de la ronda 3) y se prepararon fagos a escala pequea (200 l) en antgeno se infectaron 80 colonias de bacterias (20 provenientes de la ronda 1, 20 de

placas de cultivo de 96 pocillos. Se analiz por ELISA la especificidad contra SpvB y

se cont con diferentes controles. La placa fue sensibilizada con 0.5 g de streptavidina en 50 l PBS en pocillos de placa Maxisorp (Nunc) durante 2 hs a temperatura ambiente. Se lav cada pocillo 3 veces con PBST y se agreg 0.5g de SpvB biotinilada en 50l PBS durante 2 hs a temperatura ambiente. Los pocillos se tres veces con PBST. A continuacin se incubaron los pocillos con 50 l de bloquearon con 200l 3% (m/v) leche descremada PBST ON a 4C. La placa se lav

sobrenadante de los fagos producidos suplementados con 1% leche descremada durante 3 hs.Nuevamentelaplaca fuelavada 3vecescon PBST. Los fagosretenidos fueronreveladosconunanticuerpomonoclonalantiM13conjugadoaHRP(Sigma), 44

 en dilucin 1/2000. Luego, se lavo y se agreg una solucin fresca de sustrato OPD. pocillo fue medida en un lector de placas de ELISA (960 Metertech Inc). Se utiliz como control positivo fagos producidos a partir de una biblioteca de VHH anti transialidasa, como control negativo se utilizaron fagos de la ronda 3 los cuales fueron incubados en pocillos sin sensibilizar. Se utiliz el programa GraphPad Software para graficar el ELISA de fagos. Se seleccionaron 10 clones positivos de la ronda2y10clonesdelaronda3ylosmismosfueronsecuenciados. 8. Secuenciacin de clones de inters: Fueron secuenciados 10 clones antiSpvB de la ronda 2 y 10 clones de la ronda 3, ambos provenientes de la seleccin con 50 nM de antgeno. Se cultivaron las bacterias en medio selectivo y a partir de colonias aisladas se crecieron ON a 37C con agitacin en 3 ml de medio. Se obtuvo el ADN plasmdico en preparacin de baja escala (miniprep) utilizando un kit comercial (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen). La integridad y pureza de la preparacin fue evaluada porelectroforesisen geldeagarosa1% (m/v)enTBE.La concentracin fue determinada por absorbancia a 260 nm, considerando que una DO=1 corresponde a 50 ng/l de dcADN. A partir de muestras de buena calidad y concentracin 200 ng/l se secuenci el inserto correspondiente al VHH utilizando los primers LMB3 (5caggaaacagctatgac3) y Fdseq1 (5gaattttctgtatgagg3) (Figura 3), complementarios aregionesdelvectorflanqueantesalsitiodeclonado,enelserviciodesecuenciacin de la Fundacin Instituto Leloir. Las secuencias fueron analizadas utilizando el programaNCBIblast. 8.1. Expresin y purificacin de VHHs solubles: Se eligieron 5 VHHs representativos con diferente longitud en su CDR3 y se expresaron los fragmentos VHHs de inters (VHH5, VHH6, VHH16, VHH38 y VHH1) transformando con el ADN puro la cepa E. coli Top10, que al ser no supresora reconoce el codn mbar LareaccincromognicafuedetenidaporagregadodeH2SO44N,ylaDO492decada

45

 entre el VHH y pIII como codn stop, secretando VHH al espacio periplasmtico. A partir de 1 litro de cultivo bacteriano en LB + 50 g Amp en fase exponencial (DO=0.7)seindujolaexpresindeVHHagregando1mMIPTG1eincubando4hsa 30C en agitacin. Se aisl luego la fraccin periplsmica por shock osmtico, resuspendiendo el precipitado bacteriano en 60 ml de TES fro, incubando en hielo durante 10 min y centrifugando 4000xg durante 20 min a 4C. El sobrenadante se reserv y el precipitado se resuspendi en 40 ml de TES:H2O relacin 1:4 fro, se incub nuevamente en hielo y se centrifug, y el sobrenadante se mezcl con el anteriorysedializaronlos100mlconelbufferISP10ONa4C.Seapliclafraccin soluble de la dilisis a una columna de afinidad de nquel (HiTrapTM Amersham Biosciences) previamente equilibrada en el mismo buffer de dilisis. Luego de lavar extensivamenteconelmismobuffer,lasprotenasretenidasseeluyeronaplicandoel buffer ISP250 en un gradiente continuo de 10 mM a 250 mM de imidazol en 60 min. Los picos de absorbancia a 280 nm fueron colectados y alcuotas de cada fraccin fueron evaluadas por SDSPAGE 15%. Las muestras con protena de inters fueron dializadas en PBS y se sometieron a un segundo paso de purificacin por columna S75 la cual previamente haba sido equilibrada con 0.5 M NaCl en PBS. La protena de inters migra con un PM aparente cercano a los 20 KDa. Se determin la concentracin de VHH por absorbancia a 280 nm, utilizando el coeficiente de extincin terico obtenido a partir de la secuencia aminoacdica correspondiente, usandoelprogramaProtParam(www.expasy.ch).

9. Ensayos in vitro de la inhibicin enzimtica de SpvB: Radioactividad y Fluorometra 9.1. Radioactividad: Se incubaron 10 ng (1.21X109 M) de SpvB con 10g (2.16X106 M) de los VHH seleccionados (VHH1, VHH6, VHH5, VHH16 y VHH38) y con un clulas CHO (1x106 clulas), 1 Ci [32P]NAD (Amersham), 1 mM ADPribosa y 1 46 VHH no relacionado (VHH NR) durante 1 h a 37C. Luego se agreg un lisado de

 mM DTT y se incub nuevamante durante 10 min a 37C. Se agreg a cada reaccin loadingbufferylasmuestrasfueroncalentadasdurante10mina95Cysometidasa una corrida electrofortica en gel SDSPAGE 15%. Luego, el gel fue secado y sometido a autorradiografa durante 24 hs a 80C. Tambin se llevaron a cabo ensayos de dosis respuesta, y para tal fin se incubaron 10 ng de SpvB con dosis incrementadas de VHHs las cuales fueron de 10 ng hasta 10 g. Cada reaccin de VHHs y enzima fue incubada durante 1 h a 37C y luego se agreg a cada una de ellas un lisado de clulas CHO (1x106 clulas), 1Ci [32P]NAD (Amersham), 1 mM ADPribosa y 1 mM DTT y se incubaron durante 10 min a 37C. Luego, a cada reaccinseleagregloadingbufferylasmuestrasfueroncalentadasdurante10min a 95C y sometidas a una corrida electrofortica en gel SDSPAGE 15%. El gel fue sometido a autorradiografa durante 24 hs a 80C. Se utiliz un equipo Storm (Molecular dynamics,Amersham Pharmacia Biotech) para observar la actina marcadaradioactivamente. 9.2.Fluorometra:Paratodoslosensayosseutiliz0.5g(6.66X108M)deSpvBpura y se incub durante 1 h a temperatura ambiente con diferentes concentraciones de los VHHs seleccionados. Para el VHH1 se utilizaron 4X107M; 3.2X107M; 2.4X107M; 1.6X107M.ParaelVHH5seutilizaron1.33X107M;6.66X108M;4.66X108M;3.33X108 M; 2.33X108 M y 1.33X108 M. Para VHH6 se utilizaron 8.69X108 M; 1.73X107 M; 4.34X108 M; 2.60X108M; 1.3X108M. Para VHH38 se utilizaron 2.4X107M; 1.6X107M; 8X108M; 4X108M. Se agreg a cada reaccin una concentracin de 0.4 mg/ml de actina marcada con pyrene (Actin Polymerization Biochem Kit) y 0.05 mM NAD durante 15 min a temperatura ambiente. Luego la lnea de base fue monitoreada durante 3 min y por ltimo se agreg el buffer de polimerizacin (buffer G) y la seal de fluorescencia fue monitoreada durante 20 min mediante un espectrofotmetrodeluminiscencia.Encadaensayoseincluyuncontrolqueindic el 0% de polimerizacin de actina compuesto por 0.5 g (6.66X108 M) de SpvB, 0.4 mg/ml de actina marcada con pyrene y 0.05 mM NAD, y un control que indic el 47

 100% de polimerizacin de actina compuesto por 0.4 mg/ml de actina marcada con pyrene y 0.05 mM NAD. Para ambos controles se sigui el mismo protocolo de incubacin que para el detallado anteriormente. Para monitorear la fluorescencia se utiliz un aparato espectrofotmetro de luminiscencia (Perkin Elmer). Se calcul el porcentaje de inhibicin de los VHHs seleccionados a partir de las curvas de fluorescencias. Para tal fin se fij un tiempo de 800 segundos y se tom como referencia los valores de 100% y 0% de polimerizacin actina. Para cada relacin molardecadaunodelosVHHanalizadossecalculelporcentajedeinhibicinyse realiz un ajuste de los datos utilizando el programa ORIGEN Pro 8. Para monitorearlafluorescenciaseutilizunaparatoespectrofotmetrodeluminiscencia (PerkinElmer). 10.ExpresindeVHHsenclulaseucariotas 10.1. Clonado de VHH5 y VHHNR: Fue seleccionado VHH5 y un VHH no relacionado (VHHNR) para clonarlos en el vector de expresin eucariota pcDNA6 (Invitrogen). Se desarroll el mismo protocolo para ambos VHHs. Todas las reacciones de PCR constaron de los siguientes ciclos: 1 ciclo inicial de desnaturalizacin(5mina95C),30ciclosdeamplificacin(1min95C,1min55C, 1 min 72C) y un ciclo final de elongacin (10 min 72C). El fragmento VHH fue amplificado por PCR a partir del vector pHEN2 con el primer (primer2 NterEcoRI el primer VHHXbaI. Los productos de PCR de 500pb fueron digeridos secuencialmente por las enzimas de restriccin EcoR1 y XbaI (NEB) y purificados desde gel de agarosa (GFX PCR DNA & Gel Band purification kit, Qiagen). Los fragmentos fueron ligados en el vector procariota pMALc2 (NEB) el cual haba sido previamente digerido con las mismas enzimas. Este vector posee el gen malE que codifica para la protena de fusin MBP. Se utilizaron 50 ng de plsmido y 15 ng de 48 5GAGGGAAGGATTTCAGAATTCGCCCAGGTGAAACTGCAGG3)ycon

 inserto (relacin molar 1:3 vector inserto) para la ligacin. La eficiencia de transformacin de la ligacin y de una reaccin control sin inserto fue determinada portransformacinporshocktrmicode50ldeclulasdeE.coliDH5 con1lde la reaccin. Se resuspendieron las clulas transformadas en 3 ml de medio LB y se incub a 37C durante 45 min con agitacin para permitir la expresin de la resistencia a Amp otorgada por el plsmido. Se plaquearon alcuotas de estos cultivos en placas LB agar 50 g/ml Amp. Algunas colonias positivas fueron seleccionadas y se cultivaron en 3 ml de medio LB+Amp y su ADN se purific el mediante minipreps (Invitrogen). Se procedi entonces a realizar una segunda PCR utilizandolosprimersespecficosparaobtenerelfragmentoMBPVHH(MBPVHH HindIII y VHH5XbaI, ver tabla). Los productos de PCR obtenidos de aproximadamente 1.500 pb fueron digeridos secuencialmente con las enzimas de restriccin HindIII y XbaI (NEB), purificados desde gel y ligados en el vector de expresin eucariota pcDNA6 (Invitrogen) el cual haba sido previamente digerido con las mismas enzimas. La eficiencia de transformacin de la ligacin y de una reaccin control sin inserto fue determinada por transformacin por shock trmico de 50 l de clulas de E. coli DH5 con 1 l de la reaccin. Se resuspendieron las clulas transformadas en 3 ml de medio LB y se incub a 37C durante 45 min. Se plaquearon alcuotas de estos cultivos en placas LB agar 50 g/ml Amp. Se seleccionaron 5 colonias y por digestin y secuenciacin las mismas dieron resultados positivos, es decir, todos los clones seleccionados tenan el fragmento MBPVHH5yMBPVHHNR. Otra estrategia empleada fue obtener a los VHHs sin la MBP. Para tal fin se sigui un protocolo similar al mencionado anteriormente. La diferencia radic en que los fragmentos amplificados por PCR a partir del vector pHEN2 fueron directamente clonados en el vector de expresin eucariota pcDNA6. Para tal fin, se utilizaron los primers (primer4 Nter EcoRI 5 GAG GGA AGG ATT TCA GAA TTC ATG GCC CAG GTG AAA CTG CAG G 3) y el primer VHHXbaI. Se obtuvieron clones positivosdelaconstruccinVHH5HispcDNA6yVHH1HispcDNA6. 49

 10.2. Anlisis de la expresin de VHHs. Western Blot e Inmunofluorescencia: Se realiz una maxiprep (Quiagen) con las construcciones obtenidas anteriormente. Se creci un cultivo de 500 ml y se siguieron las instrucciones del fabricante. La integridad y pureza del ADN fue chequeada por electroforesis en gel de agarosa 1% (m/v) en TBE. La concentracin fue determinada por absorbancia a 260 nm, considerando que una DO=1 corresponde a 50 ng/l de dcADN. Obtenido el ADN de ambas construcciones, se procedi a transfectar clulas eucariotas. Se utilizaron variaslneascelulares:HEK,Hela,macrfagosRAWyJ774yVero(ATCC).Entodos los casos se incub 1g de vector (MBPVHH5 o MBPVHHNR) con el reactivo de transfeccin JetPei (Polyplus transfection) y se siguieron las instrucciones del fabricante.LasclulasfueroncultivadasenRPMI(PAA)y5%SFB(PAA)enestufaa 37C, 5% CO2 y llevadas a 50% de confluencia. Las clulas fueron transfectadas y se dejaron durante 24 hs para permitir la expresin del VHH en el citoplasma de las mismas. Para analizar la expresin de los VHHs por western blot en las diferentes lneas celulares, las clulas fueron tripsinizadas (TrypLETM Express, GIBCO) y lisadascon0.05%detritnenPBS.Ellisadofueresuspendidoenloadingbufferylas muestrasfueronsometidasacorridaelectroforticaenSDSPAGE15%.Secorrobor laexpresinMBPVHH revelandoconun anticuerpoprimario antiMBP (policlonal de conejo, Abcam) y uno secundario anticonejo IgG conjugado a HRP (Sigma). Las clulas que fueron transfectadas con la construccin VHH5His se revelaron con un anticuerpoantiHisPeroxidasa(Sigma). Para analizar la expresin de MBPVHH por inmunofluorescencia las clulas fueron cultivadas en placas de 24 wells y crecida ON sobre cubreobjetos de 12 mm de dimetro (Deckglaser) y luego transfectadas como se detallo anteriormente. Posteriormente se fijaron con 4% de paraformaldehdo y se permeabilizaron con 0.05% de tritn X100 en PBS. Las clulas fueron incubadas con un anticuerpo primario antiMBP (policlonal de conejo, Abcam) y uno secundario antiIgG de conejo acoplado a CyTM 3 (Amersham). Las clulas coloreadas de rojo denotan la 50

 expresin del VHH en el citoplasma de las mismas. Los ncleos fueron teidos de colorazul(Hoechst,Invitrogen). 11.InfeccindemacrfagosconSalmonellatyphimuriumySalmonellamutante Las cepas de Salmonella typhimurium y Salmonella mutante (wt y mut respectivamente) fueron crecidas ON en medio LB suplementado con 0.3 M NaCl a 37C sin agitacin. Las bacterias fueron usadas para infectar macrfagos a una MOI=100.SalmonellamutanteposeedelecionadoelgenspvB,porlotantonoexpresa la protena SpvB. Esta mutante fue cedida por el laboratorio de la Dra. Eleonora GarcaVscoviylamismafuerealizadaporelDr.AndrsAguirre. La lnea celular RAW 264.7 (ATCC) fue cultivada en placas de 24 pocillos en RPMI 1640 (PAA) con 5% SFB (PAA) y crecida ON sobre cubreobjetos de 12 mm de dimetro (Deckglaser) a 37C en estufa con 5% de CO2. Las clulas fueron transfectadas con 1 g de ADN de cada una de las construcciones (MBPVHH5 y MBPVHHNR) utilizando el reactivo JetPEI (Polyplus transfection) y siguiendo el protocolo del fabricante. Las clulas fueron incubadas 24 hs a 37C y CO2 5% para permitir la expresin de VHH en el citoplasma celular. Luego, fueron lavadas 3 veces con HBSS (Hanks Balanced SALT Solution, GIBCO) e infectadas con las cepas deSalmonellawtySalmonellamut,centrifugadasa18Cdurante10mina200xgpara permitir el contacto de la bacterias con los macrfagos. Para permitir la entrada del patgeno a la clula hospedadora se incub durante 30 min en estufa a 37C y 5% CO2. Luego, el sobrenadante fue aspirado cuidadosamente y las clulas fueron lavadas 2 veces con HBSS. Se agreg RPMI 1640 suplementado con 5% de SFB y gentamicina 50g/ml. Las clulas fueron cultivadas durante 16 hs a 37C en estufa con 5% de CO2. Para realizar la inmunofluorescencia, se lavaron 2 veces las clulas con HBSS y se fijaron con 4% de paraformaldehdo durante 15 min. Luego fueron lavadas nuevamente dos veces con HBSS y permeabilizadas con 0.05% Triton X100 51

 en PBS durante 5 min. La actina fueron teidos y visualizada con faloidinaFITC (Sigma). Las bacterias fueron teidas con un anticuerpo primario antiLPS de Salmonella typhimurium (Abcam, 1/2000) y un anticuerpo secundario Alexa 350 (Molecular Probes, 1/200). Para confirmar la expresin intracelular de VHHs se utiliz un anticuerpo primario antiMBP (Abcam 1/2000) y luego un anticuerpo secundario IgG Cytm3Linked (Amersham). Las muestras fueron visualizadas por microscopiadefluorescencia. 12.EnsayoscitopticosutilizandolaquimeraC2INC/SpvB Clulas Vero fueron cultivadas en DMEM (GIBCO) suplementadas con 5% SFB (PAA) a 37C y 5% de CO2 durante 24 hs en botellas de 25 cm2. Las clulas fueron transfectadascon5gdeambasconstrucciones(MBPVHH5yMBPVHHNR)ycon 0.5 g de GFPpcDNA6 como control de transfeccin. Se utiliz el reactivo jetPEI (Polyplus transfection) y las clulas fueron incubadas durante 6 hs a 37C en estufa conCO25%.Luegodelaincubacin,lasclulasfueronlavadas3vecesconDMEMy tripsinizadas (TrypLETM, GIBCO) y cultivadas en placas de 24 pocillos con DMEM y 5% SFB sobre cubreobjetos de 12 mm de dimetro durante 12 hs. Para los ensayos citopticos, se ensayaron diferentes cantidades de toxinas, las cuales fueron: C2I (0.1 g/ml) + C2IIa (0.2g/ml) y de C2IIa (0.5g/ml) + C2INC/SpvB (0.25g/ml); por otro lado: C2I (0.2g/ml) + C2IIa (1g/ml) y de C2IIa (2g/ml) + C2INC/SpvB (1 g/ml)yporltimo::C2I(0.5g/ml)+C2IIa(1g/ml)ydeC2IIa(5g/ml)+C2IN C/SpvB(2.5g/ml).Sloconlaltimacombinacindeconcentracionesdetoxinasse observelredondeamientodel100%delasclulas.Lasclulasfueronincubadascon las toxinas durante 3 hs a 37C y 5% de CO2 y luego lavadas dos veces cuidadosamente con DPBS (GIBCO). Las clulas fueron fijadas con 4% de paraformaldehdo durante 15 min, lavadas dos veces con DPBS y permeabilizadas con 0.05 Triton X100 en DPBS durante 5 min. La actina fue teida con faloidina 52

 FITC (SIGMA). Las clulas transfectadas fueron teidas con un anticuerpo primario antiMBP (Abcam, 1/2000) y un anticuerpo secundario IgG Cytm3Linked (Amersham).Lasmuestrasfueronvisualizadaspormicroscopiadefluorescencia. 13. Ensayos citopticos utilizando la quimera C2INC/SpvB y VHH5 como protena Se preincubaron 10g del VHH5 con 2.5g/ml de C2INC/SpvB durante 15 min a 4C. Como control se incubaron 10g del VHH5 y 0.5g/ml de C2 con 1g/ml de C2IIa; 0.5 g/ml C2I con 1 g/ml C2IIa y clulas sin toxinas. Las clulas fueron incubadas durante 3 hs a 37C y 5% de CO2 con las toxinas. Luego se tomaron fotografas de contraste de fase para observar la morfologa de las clulas tratadas conlastoxinas.

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RESULTADOSYCONCLUSIONES

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 1.ProduccindeldominioCterminaldelaenzimaSpvB El dominio cataltico Cterminal de la enzima SpvB de Salmonella typhimurium fue clonado, expresado, purificado y obtenido como protena recombinante. Luego, fue utilizado para inmunizar llamas y para estudios de actividad e inhibicin enzimtica de SpvB. Todos los ensayos de esta Tesis fueron realizados con el dominio Cterminal de SpvB, a excepcin de los ensayos intracelulares donde se utiliz el patgeno. Por lo tanto, nos referiremos al dominio cataltico Cterminal de estaenzimacomoSpvB. ParaobtenerSpvBexpresadaypurificada,elgendeldominioCterminaldela enzima fue clonado en el vector pET26b(+). La clonacin introduce un 6xHistag en el extremo Cterminal de SpvB lo que facilita su posterior purificacin. Luego, se transformaron bacterias para expresar la protena en forma recombinante. En la primera purificacin se confirm la identidad de la protena por Western Blot (no mostrado).SpvBfueexpresadaypurificadadecitoplasmaydecuerposdeinclusin y su rendimiento fue evaluado. Para ambos casos se realizaron dos pasos de purificacin, uno inicial por columna de nquel y uno posterior por tamiz molecular (S75: Superdex 75). Tanto la expresin y la purificacin como cada una de las fraccioneseluidasfueronanalizadasporSDSPAGE.CuandoSpvBfuepurificadade cuerposdeinclusinserealizunanlisispordicrosmocirculardelaprotenaenel UV lejano y pudimos confirmar que la misma se encontraba correctamente plegada. En la Figura 4 se muestra un gel SDSPAGE de la protena SpvB purificada a partir decitoplasma(A)ydecuerposdeinclusin(B)luegodelapurificacinporS75.

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A
97 66 45

M 12

B
12M
97 66
nm

45
Dicrosmocircular (mdeg)

210 0

220

230

240

250

260

30

30

-5

20

-10 Buffer 20 SpvB -15 Figura 4. Purificacin de SpvB. Se muestra la corrida electrofortica correspondiente a una alcuotadelpicoobtenidodeSpvBluegodelaS75.A:Purificacinapartirdecitoplasma.B: Purificacin a partir de cuerpos de inclusin y espectro de dicrosmo circular. Se observan enambosgeleslasfraccioneseluidasdelaS75 correspondientesaunPMaproximadode28 KDa.(Calle2:SpvB)yaprotenasdemayorPM(Calle1);M:MarcadoresdePMenKDa. Se pudo observar una banda aproximada a los 28 KDa correspondiente

al peso esperado de SpvB. El grado de pureza a partir de citoplasma y cuerpos de inclusin result adecuado, aunque nunca se logr obtener un 100% de pureza para ambos casos. Luego de varios intentos por mejorar las purificaciones que provenan de citoplasma logramos obtener rendimientos satisfactorios. Por ejemplo, pudimos observar que la incubacin de cultivos a 28C en agitacin toda la noche mejor notablemente la expresin de SpvB en el citoplasma. El rendimiento en general fue de0.5a2mgdeSpvBporlitrodecultivoparaamboscasos. DebidoaquenoseencontraronimportantesdiferenciasalobtenerSpvB

de citoplasma o cuerpos de inclusin, las purificaciones fueron obtenidas a partir de citoplasma, lo cual no requiere el replegamiento de la protena. Se biotinilaron fracciones purificadas de SpvB para estudios posteriores y la biotinilacin fue corroboradaporELISA(nomostrado).

56

 Porlotanto,fueposibleexpresarypurificareldominiocatalticoCterminalde SpvB tanto a partir de citoplasma como de cuerpos de inclusin, con un rendimientoadecuado. 2.MedicindelaactividadenzimticadeSpvB. Para poder analizar la actividad enzimtica de SpvB, luego de purificar la enzima, desarrollamos dos tcnicas muy diferentes entre si: radioactividad y fluorometra. En los ensayos por radioactividad, la incorporacin de la ADPribosa en la molcula de actina a partir del NAD marcado radioactivamente (32PNAD) indica que la actina es ADPribosilada por la enzima SpvB. Esta tcnica es muy utilizada por varios autores para medir la actividad enzimtica de SpvB (177, 178179, 187). A continuacin se muestra en la Figura 5 una representacin esquemtica de la reaccin.

ActinaADPribosilada SpvB

Figura 5. Representacin esquemtica de la actividad enzimtica de SpvB. Se puede observar cmo SpvB se une a la molcula de NAD, libera la nicotinamida y transfiere la ADPribosa a protenas blanco, como la actina en este caso. Cuando la actina es ADP ribosilada,susfilamentossedepolimerizan.

57

 Paramedirlaactividadenzimticadelasfraccionespurificadasatravsdeesta tcnica,1gdelaenzimapurafueincubadaenpresenciade32PNADydeunlisado de clulas CHO, el cual fue utilizado como fuente de actina. Los ensayos se realizaron a 37C. La marca radioactiva observada a un peso molecular de 43 KDa (PMaproximadodelamigracinelectroforticadelamolculadeactina)indicaque SpvBADPribosilalaactinapresenteenellisadodelasclulas.Empleandolamisma tcnica, pero cambiando la fuente de actina, es decir utilizando actina comercial, tambinseobservlamarcaradioactivaalos43KDa.Pudimosutilizarcomocontrol positivo SpvB pura, proveniente del laboratorio del Dr Fritz KochNolte, a la cual se le haba medido la actividad enzimtica con resultados satisfactorios. En la Figura 6 se muestra una autorradiografa con las bandas de actina marcadas radioactivamente.

Lisadodeclulas
C MCHO C+

Actina pura
C+ Actina MC

43KDa

SpvB

++++

Figura 6. Autorradiografa. ADPribosilacin de la molcula de actina. La marca de actina radioactiva indica que SpvB ADPribosila a la molcula de actina. C (control negativo): controlsinenzima;C+(controlpositivo):controlconenzima;M:marcadoresdePM.

Claramente se pudo observar que el dominio Cterminal de SpvB purificado tena actividad ADPribosiltransferasa, observndose por autorradiografa la marca de una nica banda radioactiva a los 43 KDa, lo cual indic que la actina fue ADP ribosilada.

58

 Aplicando la misma tcnica se analiz la cantidad mnima necesaria de SpvB paraADPribosilaralaactina.Elensayofuerealizadodemaneramuysimilarqueel mencionado anteriormente. Aqu, tambin se utiliz un lisado de clulas CHO, pero antes de lisar las clulas las mismas fueron previamente contadas para aadir aproximadamenteuna cantidad similar de actinaa cadareaccin.Decidimossumar una variable ms al ensayo que fue el tiempo de incubacin. En la Figura 7 se muestra una autorradiografa con bandas marcadas radioactivamente a los 43 KDa correspondientesalamolculadeactina.
Figura 7. Radioactividad. ADPribosilacin de la molcula de actina en diferentes condiciones. Se muestra la marca de actina radioactiva correspondiente a los 43KDa para todas las condiciones ensayadas. C (control negativo): control sin enzima; M: marcadores dePM.

10 min.30 min.60 min. Actina SpvB

50ng25ng10ng50ng25ng10ng50ng25ng10ng

Como se pudo visualizar por autorradiografa, an a bajas cantidades de enzimaytiemposdeincubacincortos,SpvBADPribosilalamolculadeactina.En todas las reacciones ensayadas solo se observ una nica banda de 43 KDa marcada radioactivamente indicando la especificidad de SpvB por su sustrato. La actina fue ADPribosilada independientemente de la cantidad de enzima como tambin de los tiemposdeincubacinensayados. Apartirdeestosresultadospudimosdemostrarycorroborarquelasfracciones de SpvB que haban sido purificadas tenan actividad enzimtica y adems, que son suficientes 10 ng de enzima durante 10 minutos de incubacin para ADPribosilar a laactina. 59

 Tambin existe otra manera de medir la actividad enzimtica de SpvB (179) la cual llevamos a cabo debido a que la misma sera de gran utilidad para futuros ensayos. La tcnica de fluorescencia nos permite una evaluacin cuantitativa y sensible para medir la actividad enzimtica de SpvB. En este ensayo la actina marcada con pyrene (actinapyrene) se encuentra en forma de monmero (Gactina) y para que pueda polimerizar es necesario agregar a la reaccin un buffer de polimerizacin de actina. La molcula pasa de un estado de monmero a un estado de formacin de filamentos, es decir, de polimerizacin (la actina pasa de Gactina a Factina).LaFactina,adiferenciadelaGactina,emitefluorescencia;porlotanto,en este ensayo un incremento en la fluorescencia a travs del tiempo indica que la actina fue polimerizada.Se puedeobservar este fenmeno en laFigura 8en la curva denominadaactinapyrene.Cuando0.5gdeSpvBfueincubadoconactinapyrene y con NAD no se observ incremento de fluorescencia, indicando que SpvB impidi la polimerizacin de la actina (Figura 8, curva SpvB). Por otro lado, la ausencia de sustrato NAD en la reaccin mostr una curva con incremento de la fluorescencia (Figura 8, SpvB sin NAD). Debido que a partir de esta tcnica evaluaremos la capacidadinhibitoriadeVHHsseleccionadoscontraSpvB,consideramosimportante incluir en este ensayo un grupo control conteniendo en la reaccin un VHH no relacionado (VHHNR). La incubacin de SpvB con VHHNR mostr ausencia completa de fluorescencia (Figura 8, SpvB + VHHNR). En la Figura 8 se pueden apreciartodaslascurvasmencionadasanteriormente. 60



Fluorescencia(ua)
200

Actinapyrene
150

SpvB sinNAD

100

50

SpvB+VHHNR
0

SpvB

0 200 400 600 800 Tiempo(s) Figura 8. Fluorometra. Inhibicin de la polimerizacin de actina por SpvB. El incremento en la fluorescencia a travs del tiempo indic que la actina fue polimerizada. El agregado a lareaccindeSpvBydeunVHHNRmostrausenciacompletadelafluorescencia.

Se pudo observar claramente que SpvB ADPribosila la actina, impidiendo su polimerizacin,yqueparatalefectoutilizalamolculadeNADcomosustratodela reaccin.ElagregadodeunVHHNRnoinhibilaactividadenzimticadeSpvB. Para cuantificar la cantidad mnima requerida de SpvB para ADPribosilar a la actina incubamos durante 10 minutos diferentes cantidades de SpvB, con NAD y actinapyrene. A medida que se agregaron dosis mayores de SpvB se observ una disminucin de la fluorescencia. En la Figura 9 se muestran tres curvas con diferentes cantidades de SpvB y una curva correspondiente al control sin enzima (actinapyrene).

61



Fluorescencia(ua)

200

Actinapyrene 0,05gSpvB

150

100

0,25gSpvB

50

0,5gSpvB
0 0 200 400 Tiempo(s) 600 800

Figura 9. Fluorometra. Inhibicin de la polimerizacin de actina con diferentes cantidadesdeSpvB. Semuestralavariacindelafluorescenciaenfuncindeltiempo.Para que la actina est totalmente ADPribosilada se requieren 0.5g (6.6x108M) de enzima. Se muestratambinlacurvacontrolsinSpvB(Actinapyrene).

Seobservclaramentequecon0.5gdeSpvBlatotalidaddelaactinapresente en la reaccin fue ADPribosilada. Por lo tanto, a partir de fracciones purificadas de SpvB y aplicando dos tcnicas diferentes entre si, pudimos observar que con una determinadacantidaddeenzimaatiemposcortosdeincubacin,SpvBADPribosila laactina.LaenzimautilizademaneraespecficaalNADyalaactinacomosustratos delareaccin. Elhechodecontarconmtodossencillosparamedirlaactividadenzimticade SpvB nos permiti disear estrategias de inmunizacin en llamas con SpvB para obtenerhcIgG,porloquenosabocamosaello. 62

 3.Produccindefragmentosdeanticuerposdellamas:VHHs Para obtener las regiones variables VHHs de las hcIgG a partir de una biblioteca de expresin en bacterifagos se dise un plan de inmunizacin en llamas. Luego, VHH que reconocieron a la enzima fueron seleccionados, secuenciados y purificados. Se realizaron ensayos in vitro e intracelulares de la inhibicinenzimticadeSpvB.EnlaFigura10semuestraunesquemadelprotocolo utilizadoparalaconstruccindelabibliotecaylaobtencindeVHHs.
Figura 10. Esquema representativo de la generacin de VHHs especficos antiSpvB. Se inmunizaron llamas con SpvB purificada. Se analiz por ELISA la reactividad del suero contra SpvB. A partir del ARNm de las clulas mononucleares (CMN) se construy una biblioteca de VHHs en un vector de expresin en fagos. Los bacterifagos se seleccionaron por unin a SpvB en solucin mediante 3 rondas. Se realiz un ELISA para analizar la reactividad de los fagos eluidos contra SpvB. Se secuenciaron 10 clones de la ronda 2 y 10 clones de la ronda 3 especficos contra SpvB. Se transformaron bacterias E. coli no supresoras(Sup)conelADNde5clonesseleccionadosyluegoseexpresaronypurificaron los5VHHs.

63

3.1.GeneracindelabibliotecadeexpresinenfagosdeVHHs Se inmunizaron dos llamas con 3 dosis de un plsmido que codifica para SpvB y con 3 dosis de SpvB. Inmediatamente antes de cada inoculacin con protena se extrajeron muestras de sangre para analizar la respuesta inmunolgica policlonal contra el inmungeno obtenida por la inmunizacin anterior. De las dos llamas, una de ellas (N 9208) present respuestas sensiblemente mayores que la restante (no mostrado) por lo que en adelante se trabaj slo con este animal. En la Figura 11 se muestra el ensayo de ELISA de titulacin contra SpvB de los sueros inmunes luego decadainmunizacinconprotenaydelsueropreinmune.

1.25

DO492nm

1.00

0.75

preimmune post1ra.Imnu. post2da.Inmu. post3ra.Inmu.

0.50

0.00 100 1000 10000 1/dilucin Figura 11. Titulacin del suero de la llama N 9208 en su reactividad por SpvB. Se ensayaron diluciones seriadas de los sueros por ELISA luego de cada inmunizacin con SpvB analizando la presencia de IgG totales antiSpvB. Comparativamente se incluy el suero preinmune. Se muestra el promedio de los duplicados de la densidad ptica (DO) en funcindelainversadeladilucinensayada.

0.25

Como se puede apreciar, se obtiene una respuesta humoral significativa luego de la segunda inmunizacin. Al comparar el ttulo de IgGs totales antiSpvB obtenido luego de la primera inmunizacin con el obtenido luego de la tercera

64

 inmunizacin, observamos que este ltimo resultaba significativamente mayor. El nivel de respuesta luego de la tercera inmunizacin fue considerado adecuado, por lo cual se extrajo sangre heparinizada para proceder a la construccin de una bibliotecadeexpresinenfagosdelosfragmentosvariablesdelashcIgG:VHH. La construccin de bibliotecas de expresin en fagos de anticuerpos de camlidos est facilitada por la existencia de hcIgG en estos organismos. La obtencin y clonacin de los ADNc correspondientes a los fragmentos VHHs de la llamaN9208luegodelasinmunizacionesserealizcomosedetallaenMaterialesy Mtodos.LosinsertosVHHsobtenidosporPCRfueronligadosenelvectorpHENy serealizlaelectroporacindebacteriasE.coliSup+(XL1Blue,supresora).Elvector pHEN permite la expresin de los fragmentos como protena de fusin con la protenapIIIdelacpsidedelfagoM13conuncodnmbarentreambosdominios. De esta manera, se pueden analizar las especificidades de los clones obtenidos y luego por infeccin de bacterias E. coli Sup (Top10, no supresora) obtener el fragmentoVHHaislado.Adems,laclonacinintroduceun6xHistagenelextremo CterminaldelfragmentoVHHloquefacilitasuposteriorpurificacin. La electroporacin de bacterias de E. coli Sup+ con el producto de ligacin nos permiti obtener una biblioteca de un tamao de 4x107 clones (ver Figura 10). En bibliotecas de camlidos obtenidas a partir de hcIgG donde no hay diversidad combinatorial debido a la ausencia de la cadena liviana, este tamao es suficiente paraaislarclonesconreactividadesdeunampliorangodeafinidad. Para analizar la calidad y variabilidad de la biblioteca se secuenciaron 10 clones elegidos al azar. En la Figura 12 se muestra la secuencia de los 10 clones seleccionados.

65

4 RFTISRDNAKSTLYLQMNALKPEDTGRYYC ARD-----SG----GSLRGLG-- --RFTISRDDTSKSLWLQMNALKPADTAVYYC NVSPVPYCSGF---GTILSLGS WGQG 6 Figura12.Secuenciacindeclones provenientesdelabibliotecadefagos.Semuestranlas secuencias de 10 clones elegidos al azar a partir de la biblioteca de fagos. Se indican en la figura las regiones framework (FR); las 3 regiones determinantes antignicas (CDR1, 2 y 3); en amarillo se muestran las cistenas cannicas; en turquesa las cistenas adicionales y en rosa se indican los residuos aminoacdicos caractersticos del FR2 de camlidos. Se indican losclones3y5conflechasloscualescomparten100%dehomologa.

Clones FR1CDR1 FR2CDR2 8 ----------RLSCAAS GFTLDDYGLG WFRQAPGKEREGVS CISSSVGNTYYRDFVKG 9 --------SLRLSCAAS GFTLDYYAIG WFRQAPGKEREGVS CISSSGGSTYYADSVKG 1 GGLVQAVSSLRLSCAAS GFTFDEYSIG WFRQAPGKEREGLS CISANDGYIYYED-SKD 2 --------SLRLSCAAS GDTICIGDMA WYRQSPGKEREWVA TLTYG-GVPAYRDTMKD 7 GGPVEAGGSLTLACAAS GRTSTLYTMA GFRQAPRNEREFVA FIA-TGGNTNYADSVE10 GGLVQAGGSLRLSCAAS GRTFYNYAMG WFRQAPGKEREFVA AISWSGGSTLYADSVKG 3 -GLVQPGGSLTLSCAAS GISNSINAMS WYRQAPGKQRELVA RIW-RSGSTNYKDSVQG 5 -GLVQPGGSLTLSCAAS GISNSINAMS WYRQAPGKQRELVA RIW-RSGSTNYKDSVQG 4 GGLVAPGESLKLSCVAS GFHFNYRLF- WVRQPPGADIEFVA SIGSAGMSKAYADAVKG 6 GGLVQAGGSLRLSCAAS GDTICISTMG WYRQGPGKERELVA SITRQGGAN-YADSVKG FR3CDR3 FR4 8 RFTISRDRAKNTVSLQMNSLKPEDTAIYYC AAVHRSQFKLGPLCTRGGSMDV WGQG 9 RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC AVAQ-SCLRGG---VRGG---Y WGQG 1 RFTISTDKAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYIC GAPR-HCSAYGP-----SPTDH WGQG 2 RLTISKDKGKNTLYLQMNGLKSDDTAVYYC HGTRDGPALCG------RVREY WGQG 7 RFTISGDYAKNTVYLQMNDLKPADTAVYFC AANVKGPYY-------KPLYDY WGQG 10 RFTISRANAQNTVYLQMNKLKPEDTAVYYC AADADAQPMGV-----IENYDY WGQG 3 RFIISRDNGKNTIWLHMNNLKTEDTAVYYC AAGQAAMTG-------VETFDY WGQG 5 RFIISRDNGKNTIWLHMNNLKTEDTAVYYC AAGQAAMTG-------VETFDY WGQG

Las secuencias fueron alineadas, analizadas y agrupadas de acuerdo a su homologa. En ninguno de los clones analizados se observaron secuencias que no corresponden a VHH ni correspondientes a clones sin inserto, lo que demostr que la biblioteca es de buena calidad. Se pudo observar tambin que nueve de ellos son diferentes entre si, indicando que la biblioteca obtenida es variable. Los clones 3 y 5 comparten el 100% de homologa sugiriendo que provienen de una misma lnea germinal VH y el mismo rearreglo VDJ. El largo promedio del CDR3 en todas las secuencias analizadas fue de 16.5 aminocidos. Adems de la presencia de las cistenas cannicas, el 50% de los clones mostr cistenas adicionales. Los clones 1, 8 y 9 presentaron cistenas en el CDR2 y en el CDR3, mientras que los clones 2 y 6 mostraroncistenasadicionalesenelCDR1yenelCDR3. 66

 3.2.SeleccindefragmentosVHHsantiSpvB A partir de la biblioteca obtenida se procedi a infectar el cultivo de bacterias con el fago helper para poder obtener bacterifagos y de esta manera seleccionar aqullosquereconozcanaSpvB.LaseleccindebacterifagosqueseunieronaSpvB se realiz por incubacin en solucin con el antgeno biotinilado, y el complejo (SpvB+fago) fue capturado a partir de bolitas magnticas recubiertas con streptavidina. Se realizaron tres rondas de seleccin y en cada una de ellas se hicieronlavadosextensivos.LaelucindelosbacterifagosunidosaSpvBseobtuvo por acidificacin brusca del medio y posterior neutralizacin. Los bacterifagos obtenidos en la primera ronda fueron amplificados y utilizados para una segunda y tercer ronda en condiciones idnticas a la anterior (ver Figura 10). La seleccin fue hecha con dos concentraciones de antgeno, 10 nM y 50 nM. En cada ronda se cont con un control negativo el cual consisti en fagos de la biblioteca que no fueron enfrentados contra el antgeno y donde tambin se sigui el mismo protocolo de incubacin, lavado y elucin. El nmero de fagos incubados (Input) y el nmero de fagos eluidos (Output) en cada una de las rondas de seleccin se muestra en la Tabla1.

67


Ronda1 Ronda2 Ronda3 Input Output Input Output Input Output 10nMAg.Biot. 2.8x107 2.0x1013 1.0x109 2.0x1013 7.0x1010 1.6x1014 ControlNeg. 2.2x107 2.0x1013 5.2x108 2.0x1013 2.0x1010 1.6x1014 50nMAg.Biot. 4.0x107 2.0x1013 8.7x109 2.0x1013 3.3x1010 1.6x1014 ControlNeg. 2.2x107 2.0x1013 2.5x108 2.0x1013 7.7x107 1.6x1014 Tabla 1. Fraccin de bacterifagos incubados (input) y recuperados (output) luego de cada ronda de seleccin. Se muestra un enriquecimiento de fagos con 50 nM de SpvB biotinilado en solucin durante las rondas de seleccin. Comparativamente se incluy un controlnegativoconsistenteenfagosdelabibliotecasinenfrentaraSpvB.

Comosepuedeobservar,luegodetresrondasdeseleccinutilizando50nMde antgeno biotinilado se obtuvo una importante seleccin de clones que reconocen a SpvB. El hecho de que se haya obtenido una mejor seleccin a esa concentracin de antgeno se reflej en el output de la ronda 3 donde se pudo visualizar que la seleccin de clones es tres rdenes de magnitud mayor con respecto al control negativo. Esta diferencia indic que hubo un importante enriquecimiento en la poblacin de clones especficos contra SpvB. Sin embargo, con 10 nM se mantuvo prcticamente el mismo orden de magnitud en el output de todas las rondas de seleccin indicando un enriquecimiento de ambas poblaciones, es decir, de bacterifagosespecficosynoespecficos. Estosresultadosmuestranqueapartirdelmtododeseleccinensolucincon 50 nM de SpvB, se obtuvieron fagos que reconocieron a SpvB por medio de tres rondasdeseleccin. Por lo tanto, debido a las claras diferencias entre ambas concentraciones, en adelante slo se trabaj con los bacterifagos eluidos con 50 nM de antgeno. 68

 Consideramos que no fueron necesarias nuevas rondas de seleccin ya que la diferencia obtenida con el control negativo es significativa, y adems podra llevar a la prdida de variabilidad. Decidimos entonces evaluar el mtodo de seleccin y paratalfinseanalizendetallelareactividaddeloscloneseluidos. A partir de los bacterifagos eluidos de cada ronda de seleccin se seleccionaron un total de 80 clones elegidos al azar, de los cuales 20 pertenecieron a la ronda 1, 20 clones a la ronda 2 y 40 clones a la ronda 3 y se analiz su reactividad contra SpvB por medio de un ELISA de fagos. En la Figura 13 se muestra el ELISA de fagos donde cada punto de las rondas 1, 2 y 3 representan fagos que fueron preparados a partir de una nica colonia. Se incluyeron en el ensayo varios controles.

1.5 2.0

Ronda1 Ronda2 Ronda3 Control+ Control

p1:Policlonal1 p2:Policlonal2 p3:Policlonal3 S F:sinfagos

DO 492nm

1.0

0.5

0.0 1 2 3 C+ Cp1 p2 p3 SF

Figura 13. Enriquecimiento de fagos que reconocen a SpvB durante consecutivas rondas de seleccin. Se muestra la reactividad contra SpvB de los clones VHH individuales elegidos al azar, para cada ronda seseleccin. 1: Ronda 1; 2:Ronda 2 y 3: Ronda 3; C: fagos de la ronda 3 en pocillos sin sensibilizar; C+: fagos antitransialidasa en pocillos sensibilizados con transialidasa; p1, p2 y p3: fagos policlonales eluidos de cada ronda de seleccin.

69

 En la ronda 1 la mitad de los clones no mostr reactividad contra la enzima pero en la siguiente ronda esa poblacin haba disminuido considerablemente. Ntese que en todas las rondas, la mayora de los clones especficos tuvieron DO elevadas y por encima de la media. Los pocillos utilizados para el control positivo (C+) fueron sensibilizados con la protena transialidasa de T. cruzi e incubados con fagos producidos a partir de una biblioteca de VHH antitransialidasa. Este control permiti corroborar que la tcnica haba funcionado correctamente. La misma informacin fue brindada por el control sin fagos (SF). Los controles de los policlonales (p1, p2 y p3) ensayados en el ELISA fueron provenientes de los bacterifagos eluidos en cada ronda, y solamente presentaron reactividad los de la ltimarondadeseleccin.Siobservamoslospoliclonalesdelaronda2ydelaronda 3 y los comparamos con sus respectivos controles negativos (ver Tabla 1) tal vez podra suponerse que en la ronda 2 existi una mayor competencia entre bacterifagos especficos e inespecficos, fenmeno no observado en la ronda 3. Puede ser factible que dicha competencia haya originado que el policlonal 2 no presentereactividadporSpvB,sucediendolocontrarioenelpoliclonal3. Por lo tanto, los resultados muestran que a lo largo de las rondas de seleccin hubounimportanteenriquecimientodeclonesespecficoscontraSpvB. En la Tabla 2 se muestra el porcentaje de clones positivos de cada una de las rondasdeseleccin.

70

Rondas 1 2 3

Clonespositivos 50%(10de20) 85%(17de20) 92,5%(37de40)

Tabla 2. Porcentaje de clones especficos obtenidos en el ELISA de fagos. Se muestra el nmero total de clones analizados y el porcentaje y nmero total de clones que reconocen a SpvBatravsdelasdistintasrondasdeseleccin.

Se puede visualizar claramente que en la ronda 1 el 50% de los clones fue especficocontraSpvByqueenlaronda3dichoporcentajeascendaal92.5%. En su conjunto, todos estos resultados demostraron que en la ronda 2 hubo un importante enriquecimiento de clones especficos contra SpvB y haber realizado una rondamsdeseleccinpermiti queelsistemaseenriquecieraanms,alcanzando unporcentajedeclonesespecficosmuyelevado. 4.CaracterizacindeVHHsyanlisisinvitrodelainhibicinenzimticadeSpvB Para evaluar la diversidad de los clones contra SpvB seleccionamos 10 clones de la ronda 2 y 10 clones de la ronda 3 con DO492 1.8 y por secuenciacin se los analizmsdetalladamente. Los fragmentos VHHs fueron secuenciados y analizados para evaluar la diversidad de los clones contra SpvB obtenidos luego de las rondas de seleccin y analizados por ELISA de fagos. Las secuencias de los 20 clones se muestran en la Figura14,alineadasporlalongituddelCDR3yporsusimilitud. 71

Grupo

FR1
Ronda2.Clon5 Ronda2.Clon17 Ronda2.Clon13 Ronda2.Clon19 Ronda2.Clon18 Ronda2.Clon1 Ronda2.Clon6 Ronda3.Clon16 Ronda3.Clon20 Ronda3.Clon33 Ronda3.Clon37 Ronda3.Clon12 Ronda3.Clon1 Ronda3.Clon38 Ronda2.Clon20 Ronda2.Clon16 Ronda2.Clon3 Ronda3.Clon24 Ronda3.Clon39 Ronda3.Clon40 MAQVKLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MAQVKLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MAQVKLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MAQVKLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MAQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MAQVKLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MAQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MAQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MAQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MAQVKLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MAQVKLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MAQVKLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MAQVKLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS MADVQLQASGGGLVQPGGSLTLSCAVS MADVQLQASGGGLVQPGGSLRLSCAAS MADVQLQASGGGLVQPGGSLRLSCAAS MADVQLQASGGGLVQPGGSLRLSCAAS MADVQLQASGGGLVQPGGSLRLSCAAS MADVQLQASGGGLVQPGGSLRLSCAAS MADVQLQASGGGLVQPGGSLRLSCAAS

CDR1 FR2 CDR2

GSIFSINAMG GSIFSINAMG GSIFSTNAMG GSIFSINAMG GSIFSINAMG GTIFSINAMG GTIFSINAMG GSIFSINAMG GSIFSINAMG GSIFSINAMG GTIFSINAMG GTIFSINAMG GSIFSINAMG ANLFSSNIMG ASLFSINAMN ASLFSINAMN ASLFSINAMN ASLFSINAMN ASLFSINAMN ASLFSINAMN WYRRAPGKERELVA WYRRAPGKERELVA WYRRAPGKERELVA WYRRAPGKERELVA WYRRAPGKERELVA WYRRAPGKQRELVA WYRRAPGKQRELVA WYRRAPGKERELVA WYRRAPGKERELVA WYRRAPGKERELVA WYRQAPGKQRELVA WYRRAPGKQRELVA WYRRAPGKERELVA WYRQTPGKEREFVA WYRQTPGKERELVA WYRQTPGKERELVA WYRQTPGKERELVA WYRQTPGKERELVA WYRQTPGKERELVA WYRQTPGKERELVA GISTGGYTSYRDSVKG GISTGGYTSYRDSVKG GISTGGYTSYRDSVKG GISTGGYTSYRDSVKG GISTGGYTSYRDSVKG GISTGGYTQYRDSVKG GISTGGYTQYRDSVEG GISTGGYTSYRDSVKG GISTGGYTSYRDSVKG GISTGGYTSYRDSVKG GISTGGYTSYRDSVKG GISTGGYTQYRDSVKG GISTGGYTSYRDSVKG TLTRAGSTNYADSAKG VLTSGAYSGYADSVKG VLTSGAYSGYADSVKG VLTSGAYSGYADSVKG VLTSGAYSGYADSVKG VLTSGAYSGYADSVKG VLTSGAYGGYADSVKG

2 3 4

FR3
Ronda2.Clon5 Ronda2.Clon17 Ronda2.Clon13 Ronda2.Clon19 Ronda2.Clon18 Ronda2.Clon1 Ronda2.Clon6 Ronda3.Clon16 Ronda3.Clon20 Ronda3.Clon33 Ronda3.Clon37 Ronda3.Clon12 Ronda3.Clon1 Ronda3.Clon38 Ronda2.Clon20 Ronda2.Clon16 Ronda2.Clon3 Ronda3.Clon24 Ronda3.Clon39 Ronda3.Clon40 RFTISRVNAENMVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRVNAENMVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRVNAENMVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRVNAENMVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRVNAENMVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRVNANNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRVNANNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRVNAENMVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRVNAENMVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRVNAENMVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRVNAENMVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRVNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRVNAENMVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRDNARTTVNLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRDLAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRDLARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRDLAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRDLAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRDLAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC RFTISRDLAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC

CDR3 FR4
WGQG WGQG WGQG WGKG WGKG WGKG WGQG WGKG WGKG WGKG WGQG WGKG GAKG WGQG WGQG WGQG WGQG WGQG WGQG WGQG

2 3 4

Figura 14. Alineamiento de la secuencia aminoacdica de 20 clones elegidos al azar. Se muestralasecuenciadeaminocidosde10VHHsdelaronda2yde10VHHsdelaronda3 elegidos al azar despus de las rondas de seleccin. Los VHHs fueron clasificados en 4 grupos de acuerdo a la longitud del CDR3. Grupo 1: 18 aminocidos; Grupo 2: 16 aminocidos; Grupo 3: 13 aminocidos; Grupo 4: 9 aminocidos. Se puede visualizar que se sealaron las regiones FR, los 3 CDR, las cistenas cannicas (amarillo), los residuos tpicos de VHH encontrados en el FR2 (rosa) y se sealaron en color gris las variantes de aminocidosdentrodecadagrupo.

NIVPVDLTMTPPNYGMDY NIVPVDLTMTPPNYGMDY NIVPVDLTMTPPNYGMDY NIVPVDLTMTPPNYGMDY NIVPVDLTMTPPNYGMDY NAVPVDLTQTPPNYGMDY NAVPVDLTQTPPNYGMDY NIVPVDLTMTPPNYGMDY NIVPVDLTMTPPNYGMDY NIVPVDLTTTPPNYGMDY NIVPVDLTMTPPNYGMDY NAVPVDLTQTPPNYGMDY NIAPSI-L-PPPTTAWTT NAVLV-----HGSTAYNI NADLG-----YR----DV NADLG-----YR----DV NADLG-----YR----DV NADLG-----YR----DV NADLG-----YR----DV NADLG-----YR----DV

72

 Como se puede apreciar, el anlisis de la secuencia, en base a la longitud y a la similituddelCDR3delosVHHspermiticlasificaralassecuenciasencuatrogrupos diferentes. El grupo 1 se caracteriz por tener un CDR3 de 18 aminocidos de longitud y estuvo formado por el 60% de los clones (12 de 20). Los 3 CDRs de estos clones fueron muy similares entre si, inclusive en algunos casos idnticos. Este grupo estuvo representado por prcticamente la misma cantidad de clones provenientes de ambas rondas de seleccin. El grupo 2 y el grupo 3 estuvieron representados por el 5% de los clones (1 de 20) con un CDR3 de 16 y de 13 aminocidos de longitud, respectivamente. El clone del grupo 2 y del grupo 3 slo estuvieron presentes en la ronda 3. El grupo 4, con un CDR3 de 9 aminocidos de longitud, estuvo conformado por el 30% de los clones (6 de 20) y todos mostraron 100% de homologa de secuencia, a excepcin del clon 40 y del clon 16 que fueron distintos en un nico aminocido. Este grupo estuvo formado por la misma proporcindeclonesderivadosdeambasrondasdeseleccin. La identidad de secuencia que se present por un lado entre los clones del grupo1yporelotro,entrelosclonesdelgrupo4,sugierequedentrodecadaunode estos grupos existe una relacin clonal, es decir que provienen de un mismo clon de linfocitos B. Sus diferencias surgen por mutacin somtica posterior al rearreglo V DJ durante la ontogenia de los linfocitos B. Por otro lado, la secuencia del clon del grupo 2 present un CDR1 y un CDR2 idnticos a algunas de las secuencias del grupo1,perodifieremarcadamenteensuCDR3,sugiriendoquederivdelamisma lnea germinal VH pero con un rearreglo VDJ diferente. De la misma manera, el clon 38 del grupo 3 habra derivado de la misma lnea germinal que los clones del grupo4,yaquesusCDR1yCDR2sonsimilares. Todas las secuencias de los clones analizados presentaron las cistenas cannicas en la posicin 22 y 92, pero en ningn caso se observaron cistenas adicionales como present el 50% de las secuencias de la biblioteca. Tambin se 73

 observaron en el FR2 los residuos hidroflicos caractersticos de los VHHs y en ninguna secuencia la leucina 11 estuvo remplazada por el residuo serina. Los CDRs de los 20 clones analizados son claramente diferentes a los CDRs de los clones de la bibliotecaantesdelprocesodeseleccin. El anlisisde las secuencias en suconjuntopermiti concluir que losclones del grupo 1, con CDR3 de mayor longitud y secuencias muy similares, fueron los ms representativos, es decir que hubo una fuerte seleccin de esos VHHs a lo largo de las rondas de seleccin. Por otro lado, la comparacin y anlisis de las secuencias de ambas rondas nos permiti observar que la ronda 3 present mayor variabilidad, resaltando la importancia de haber realizado una tercera ronda de seleccin, lo cual incrementlasprobabilidadesdeencontrarVHHsinhibitorios. Para analizar si alguno de los VHHs secuenciados especficos contra SpvB inhibe la actividad enzimtica de SpvB, se eligieron 5 VHHs representativos: los clones 5 y 6 del grupo 1 (VHH5 y VHH6), el clon 1 del grupo 2 (VHH1), el clon 38 del grupo 3 (VHH38) y el clon 16 del grupo 4 (VHH16). Se expresaron como protenas recombinantes y fueron purificados a partir de un lisado periplasmtico. Se realizaron dos pasos de purificacin, uno inicial por columna de nquel y otro final por tamiz molecular S75. En la Figura 15 se muestra como ejemplo un gel SDS PAGE de un VHH representativo luego de la purificacin inicial por columna de nquel(Figura15A)yluegodelapurificacinfinalporS75(Figura15B).

74

A
Nquel
Vo12M

B
S75
1M

30 30 20 20 14 14 Figura 15. Purificacin de los VHHs seleccionados. Se muestra la corrida electrofortica en SDSPAGEcorrespondienteaA:alcuotasdelafraccineluida(Vo)ydelospicosobtenidos al aplicar el gradiente de imidazol (Pico 1 y VHH). B: Purificacin final por S75 de un VHH representativo;M:MarcadoresdePMenKDa.

97 66 45

97 66 45

Todos los clones seleccionados pudieron ser purificados. La migracin electrofortica mostr que los VHHs tienen un PM cercano a los 20 KDa. El rendimiento fue aproximadamente de 1 a 5 mg de VHH por litro de cultivo y el gradodepurezafueadecuado. Con el objetivo de analizar si los VHHs seleccionados poseen la capacidad de inhibir a SpvB, se aplicaron las mismas tcnicas empleadas para medir la actividad enzimtica de SpvB: radioactividad y fluorometra. El ensayo de radioactividad consisti en medir la incorporacin de 32PADPRibosa (a partir del 32PNAD) a la 75

 molcula de actina. El ensayo de fluorometra consisti en el sensado de la polimerizacin de actinapyrene evidenciada por incremento de la fluorescencia a travsdeltiempo. Para el ensayo de radioactividad se incubaron 10 ng de SpvB, 32PNAD y un lisado de clulas CHO, como fuente de actina. Posteriormente se realiz una corrida electrofortica y por autorradiografa se observ la presencia de actina marcada radioactivamente (Figura 16, calle 2). La banda de 43 KDa indic que la actina fue ADPribosilada; dado que en la calle 1, en ausencia de SpvB, no se observ la banda de actina, podemos concluir que la ADPribosilacin fue realizada por SpvB. Los ensayos de inhibicin enzimtica se realizaron en una primera instancia utilizando una relacin molar SpvB:VHH de 1:1000. La inhibicin de la ADPribosilacin fue evaluada por el agregado de los diferentes VHHs seleccionados a la reaccin. Para talfin,seincubpreviamentealaenzimaconlosdiferentesVHHsyluegoseagreg alareaccinel lisado declulasyel32PNAD.En laFigura16(calles3,4,6,7y8)se puede visualizar claramente que el agregado de cada uno de los VHHs origin la ausencia de la banda marcada radioactivamente, indicando que todos los VHHs ensayados bloquearon la actividad enzimtica de SpvB. Se incluy en el ensayo un VHHNR como control de especificidad. Ntese la marca radioactiva de la actina indicando que fue ADPribosilada cuando la enzima fue incubada con el VHHNR (Figura16,calle5).

76

12 34 56 78

Actina

VHH SpvB

1 38 NR 1665

+++++++

Figura 16. Radioactividad. Inhibicin de la ADPribosilacin de la molcula de actina mediadaporSpvBatravsdeVHHsespecficos.Semuestraunaautorradiografaobtenida al incubar un lisado de clulas CHO con SpvB, 32PNAD y diferentes VHHs antiSpvB o un VHH no relacionado (VHH NR). Se puede observar en los controles sinVHH (calle 2) y con VHH NR (calle 5) la banda correspondiente a la actina marcada radioactivamente. SpvB: 10 ng(1,21x109M);VHHs:10g(2,16x106M).

Este resultado nos permite concluir que todos los VHHs seleccionados son especficos contra SpvB y que en las condiciones analizadas bloquean su actividad enzimtica. En una segunda instancia sobre la evaluacin de la capacidad inhibitoria de estos VHHs, aplicando la misma tcnica, realizamos ensayos de dosisrespuesta. Es decir,semantuvoconstantelacantidaddeSpvB(10ng)ysefueronagregandodosis incrementadas de VHH, las cuales fueron de 10 ng hasta 10 g. En cada curva se incluyuncontrolpositivoelcualestuvocompuestoporSpvB,32PNADyunlisado de clulas y un control de especificidad donde se incluy un VHHNR. Por un lado se analiz por autorradiografa la disminucin gradual de la banda marcada radioactivamenteamedidaqueseagregalareaccinmayorcantidaddeVHH.Por otro lado, se intent cuantificar la presencia de las bandas a travs del Storm, teniendo en cuenta el rea de cada una de ellas. En la Figura 17 se muestra una autorradiografa de VHH1 (Figura 17A), VHH5 (Figura 17B) y de VHH6 (Figura 17C). 77


Actina

12345678910

VHH1

+ ++++++++

VHHNR

SpvB

B
Actina

12345678910

VHH5 VHHNR SpvB

+ ++++++++

78

12345678910 Actina VHH6 VHHNR SpvB Figura 17. Radioactividad. Inhibicin de SpvB por diferentes cantidades de VHH. Se muestra una autorradiografa obtenida al incubar un lisado de clulas CHO con SpvB, 32P NADydiferentescantidadesdeA:VHH1,B:VHH5,C:VHH6oconunVHHNR.

++++++++

En estos ensayos fue clara la aparicin de la banda de actina marcada radioactivamente en presencia de SpvB (Figura 17A, B y C, 1) y cuando se incub con VHHNR (Figura 17A, B y C, 3). El anlisis de todos los VHHs nos permiti observar ausencia de la banda radioactiva con 10g de VHHs, indicando que los 3 VHHs analizados inhibieron a SpvB en las condiciones analizadas. Con respecto a VHH1,estafuelanicacantidaddeanticuerpocapazdeinhibirenun100%aSpvB. Sinembargo,paraVHH5yparaVHH6tambinseobservausenciadebandaspara 5g y para 1 y 5g, respectivamente. A partir de este anlisis, podramos concluir queVHH5yVHH6sonmejoresinhibidores queelVHH1,debidoaquesoncapaces de inhibir a SpvB en dosis ms bajas. Se pudo observar en la autorradiografa de VHH1 y VHH5 que algunas cantidades de VHHs ensayadas, no correspondieron a una relacin de dosisdependencia (Figura 17A, 8 y 9 y Figura 17B, 7 y 8). Por lo tanto, cuando cuantificamos estas bandas a travs del Storm no logramos obtener una curva adecuada que responda a un efecto de dosisdependencia. De todas maneras, esta tcnica nos permiti concluir claramente que los VHHs seleccionados bloquean especficamente la actividad enzimtica de SpvB en relacin molar SpvB:VHH 1:1000. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, decidimos realizar 79

 unensayoquepermitacuantificarlacapacidadinhibitoriadecadaunodelosVHHs seleccionados.Aplicamosparaellolatcnicadefluorometra. Como se mencion anteriormente en los ensayos de actividad enzimtica de SpvB por medio de la tcnica de fluorometra, un incremento de la fluorescencia a travsdeltiempoindicaquelaactinapyrenemonomricaformafilamentos,esdecir que se polimeriza (Gactina a Factina). En estos ensayos de inhibicin de la actividad enzimtica de SpvB se pudo observar que cuando 0.5g (66 nM) de SpvB fueron incubados con la actinapyrene y con NAD no se observ incremento de fluorescencia, indicando que la enzima ADPribosila la totalidad de la actina presente en la reaccin, previniendo as la conversin de Gactina a Factina. Nosotros consideramos que esta curva corresponde al 0% de polimerizacin. Contrariamente, en ausencia de SpvB se produjo polimerizacin de la actina, efecto que fue observado por un incremento de la fluorescencia, y por lo tanto esta curva corresponde al 100% de polimerizacin. Se pueden visualizar ambos controles en la Figura 18 (SpvB (0%); Actinapyrene (100%)) para todos los VHHs analizados. Para poder calcular la cantidad mnima de VHH necesaria para inhibir a 0.5g de SpvB se analizaron los VHHs seleccionados y cantidades variables de cada uno de ellos fue previamente incubada con la enzima. En la Figura 18 se muestra el anlisis para cadaunodeellos. 80

A
300 200 100 0

VHH1

Fluorescencia (ua)

Actina pyrene (100%) 1:5 (SpvB:VHH) 1:4 (SpvB:VHH) 1:3 (SpvB:VHH) 1:2 (SpvB:VHH) SpvB (0%)

0 300 200 100 0 0

200

400

600

800

Tiempo(s)

VHH5
Actina pyrene (100%) 1:2 (SpvB:VHH) 1:1 (SpvB:VHH) 1:0.7 (SpvB:VHH) 1:0.5 (SpvB:VHH) 1:0.35 (SpvB:VHH) 1:0.2 (SpvB:VHH) SpvB (0%)

Fluorescencia (ua)

200

400

600

800

Tiempo(s)

81

C
300 200 100 0 0 D 300 200 100 0 0

VHH6

Fluorescencia (ua)

Actina pyrene (100%) 1:2 (SpvB:VHH) 1:1 (SpvB:VHH) 1:0.5 (SpvB:VHH) 1:0.3 (SpvB:VHH) 1:0.15 (SpvB:VHH)

SpvB (0%)

200

400

600

800

Tiempo(s)

VHH38

Fluorescencia (ua)

Actina pyrene (100%) 1:3 (SpvB:VHH) 1:2 (SpvB:VHH) 1:1 (SpvB:VHH) 1:0.5 (SpvB:VHH)

SpvB (0%)

200

400

600

800

Tiempo(s) Figura 18. Fluorometra. Inhibicin de la ADPribosilacin de actina mediada por SpvB a travs de VHHs especficos. Se muestra la variacin de la fluorescencia en funcin del tiempo. Diferentes concentraciones de A: VHH1, B: VHH5, C: VHH6 y D: VHH38, fueron utilizadas manteniendo constante la concentracin de SpvB. 100% de polimerizacin: 0.4mg/ml actinapyrene + 0.05 mM NAD. 0% de polimerizacin: 0.4 mg/ml actinapyrene + 6.66x108MSpvB+0.05mMNAD.SemuestraparacadacurvalarelacinmolarSpvB:VHH.
82

 Para todos los VHHs analizados, cuando SpvB fue incubada con cantidades crecientesdeVHH,seprodujounincrementoenlafluorescencia.Estoindicquelos VHHs inhiben la polimerizacin de actina mediada por SpvB de manera dosis dependiente. Se necesit una cantidad diferente de cada VHH para bloquear completamente a SpvB y as poder alcanzar el 100% de polimerizacin. Fue notorio visualizar que VHH5 y VHH6 a una relacin molar SpvB:VHH 1:1 lograron bloquear completamente a SpvB generndose un 100% de polimerizacin. Sin embargo, VHH38 y VHH1 necesitaron un exceso molar de 3 (SpvB:VHH 1:3) a 5 veces (SpvB:VHH 1:5), respectivamente, para lograr inhibir completamente a la enzimayalcanzarel100%depolimerizacin. Estos resultados nos permitieron concluir que los VHHs seleccionados inhiben especficamente a SpvB, pero se necesita de cada uno de ellos una determinada cantidad para bloquear completamente a la enzima. Es decir, logramos obtener 4 VHHsconcapacidadinhibitoriadiferenteporSpvB. A partir de las curvas de fluorometra se evalu el porcentaje de inhibicin de cada uno de los VHHs analizados. Para tal fin se fij un tiempo (800 segundos) y se tom como referencia el 100% y el 0% de polimerizacin de actina y se calcul el porcentaje de inhibicin para cada curva analizada, es decir para cada relacin molar. Se puede apreciar en la Figura 19 el porcentaje de inhibicin en funcin de la relacinmolarVHH:SpvB.

83


Figura 19. Perfil del porcentaje de inhibicin de SpvB en funcin de la relacin molar VHH:SpvB. Se muestran las curvas obtenidas para cada VHHs analizado. Se utilizaron los valores de fluorescencia obtenidos a los 800 segundos para calcular el porcentaje de inhibicin tomando como referencia los valores a 100% y 0% de polimerizacin correspondienteacadaVHHs.

El anlisis conjunto de todos los VHHs nos permiti concluir que VHH5 y VHH6, con CDR3 ms largos y de secuencias muy similares entre si, lograron alcanzar una inhibicin de la actividad enzimtica de SpvB del 100% a una relacin molar 1:1 SpvB:VHH, indicando que ambos fragmentos son muy buenos inhibidores. Notablemente nuestros resultados sugieren que hay una correlacin entrelalongituddelCDR3,lasimilituddesecuenciayelporcentajedeinhibicin. Porlotanto,medianteestosanlisisinvitropudimosseleccionardosVHHscon la capacidad de inhibir a SpvB en relacin equimolar. Esto nos condujo a elegir uno deellospara,enunaprimeraetapa,intentarsuexpresinenelcitoplasmadeclulas eucariotasyenunasegundaetapa,realizarensayosdeinhibicinintracelular. 84

 5.ExpresindeVHHsenelinteriordeclulaseucariotas Los ensayos in vitro nos permitieron demostrar que a partir de las tcnicas aplicadas pudimos hallar VHHs que inhiben la actividad enzimtica de SpvB. Estos resultados nos condujeron a evaluar la capacidad inhibitoria de estos VHHs en el interior de clulas eucariotas, y para esto, expresar a los VHHs como intrabodies (93). Segn la bibliografa, estos fragmentos pueden ser expresados en diferentes compartimentos de clulas eucariotas (108112). Por lo tanto, elegimos a VHH5 y a un VHHNR utilizado como control y se evalu su expresin en el citoplasma de distintas lneas celulares eucariotas. Ambos VHHs fueron fusionados a MBP (MBP VHH5 y MBPVHHNR) y luego clonados en el vector pcDNA6 de expresin eucariota. El clonado de ambos MBPVHHs en el vector de expresin eucariota pcDNA6 fue corroborado por digestin con enzimas especficas y por secuenciacin (no mostrado). Dos motivos nos condujeron a clonar ambos VHHs junto a MBP. El primerofuepoderotorgarlemejorestabilidadalVHH,yaquesehademostradoque MBP acta como chaperona aumentando la solubilidad y estabilidad de los intrabodies tanto en el citoplasma de bacterias como en el de clulas eucariotas (103; 104). El segundo fue poder utilizar a MBP como tag y de esta manera poder evaluar y visualizar la expresin de los intrabodies. Todas las transfecciones se realizaron en forma transiente. En una primera etapa, y para asegurarnos que MBP VHH5 y MBPVHHNR se podan expresar en el citoplasma de las clulas, elegimos dos lneas celulares que segn el reactivo utilizado (jetPeiTM, Polyplus transfection) son las ms accesibles para la transfeccin. Por tal motivo utilizamos las lneas celulares HEK y Hela para evaluar la expresin de los VHHs, y la misma fue analizada en un principio por Western blot. Para asegurarnos de trabajar en cada ensayo con la misma cantidad de clulas y as poder comparar la expresin en los distintos tipos celulares, las mismas fueron cultivadas hasta un 50% de confluencia, transfectadas, contadas y luego lisadas. Se puede apreciar en la Figura 20 la

85

 presencia de una banda de 63 KDa correspondiente a MBPVHH5 (A) y MBP VHHNR(B).

A

HEKHela
NTTMNTT

97 66
MBPVHH5

45 B HEK MBPT5TNR MBPVHHNR T5:Transfectadas conMBPVHH5 TNR:transfectadas conMBPVHHNR Figura 20. Expresin de los VHHs en clulas eucariotas. A: Las clulas que fueron transfectadas con MBPVHH5 (T) y el control de clulas sin transfectar (NT) se lisaron y alcuotas de dicho lisado fueron sometidas primero a una corrida electrofortica y luego a unWesternblotutilizandounanticuerpoantiMBP.M:marcadoresdepesomolecular.B:El mismo protocolo se sigui para visualizar y corroborar la expresin del MBPVHHNR. Se incluyeron alcuotas del MBPVHH5 y de MBP sola. Ntese que la migracin electrofortica originunPMcercanoalos63KDaparaambosMBPVHHs.

86

 Este resultado claramente mostr que ambos VHHs lograron expresarse en el citoplasma de clulas eucariotas luego de 24 hs de transfeccin. Se puede observar quelaexpresinfuemselevadaparaMBPVHH5enclulasHela. Por otro lado, tambin evaluamos si ambos VHHs podan expresarse sin MBP en el citoplasma de clulas eucariotas. Para este caso, se clonaron directamente ambos fragmentos en un vector de expresin eucariota pcDNA6 y se utiliz como tag6xHis.EnlaFigura21semuestraunWesternblotdeambosVHHs.
VHHs His T5:transfectadasconVHH5His TNR:transfectadasconVHHNRHis NT:notransfectadas Figura 21. Expresin de VHH5His y VHHNRHis en clulas eucariotas. A partir de un lisado de clulas HEK se pudo visualizar y confirmar por Western blot la expresin de ambos VHHs (VHH5 y VHHNR) en el citoplasma de clulas eucariotas revelando con un anticuerpo antiHis. Se muestra como control un lisado de clulas sin transfectar (NT). El PMcorrespondeaaproximadamente20KDa.

T5TNRNT

87

 Independientemente de la presencia o ausencia de MBP, fue claro que ambos VHHs pudieron expresarse en el citoplasma de clulas eucariotas, sugiriendo que estosfragmentostolerancorrectamenteelmedioambientereductordelcitoplasmay corroborandosumuybuenaestabilidadenesteambiente. En una segunda etapa, la expresin de MBPVHH5 y de MBPVHHNR tambin fue corroborada y evaluada por inmunofluorescencia en lneas celulares comoHela,macrfagosRAWyclulasVero.Paratalfinaquellasclulasquefueron transfectadasyqueexpresaronMBPVHH5pudieronseridentificadaspormediode un anticuerpo secundario acoplado a CyTM3 coloreando el citoplasma de las clulas derojo.EnlaFigura22semuestraninmunofluorescenciasdelastreslneascelulares donde se puede apreciar claramente la expresin de MBPVHH5. Tambin se logr expresarMBPVHHNRendichaslneascelulares(nomostrado)yambosintrabodies fueron expresados en macrfagos J774 (no mostrado) con resultados similares a los mostradosparamacrfagosRAW.
HelaVeroMacrfagos MBPVHH5 MBPVHH5 MBPVHH5 Figura 22. Expresin de MBPVHH5 en tres lneas celulares. Se observa el citoplasma de las clulas coloreado de rojo, indicando que MBPVHH5 se expres en todas las lneas celulares.

88

 En todas las lneas celulares probadas MBPVHH5 y MBPVHHNR se expresaron como intrabodies en el citoplasma de las clulas. La eficiencia de transfeccin fue variable de una lnea celular a otra. Por ejemplo, en clulas Hela la eficiencia fue de un 25 a 30%, mientras que en macrfagos y clulas Vero fue de un 10 a 15%, inclusive en macrfagos ese porcentaje en algunas ocasiones se vio disminuido.SibienlasconstruccionesVHHsHispudieronserexpresadasenclulas HEK,comoobservamosmedianteWesternblot,lasmismasnoresultaronadecuadas para realizar los ensayos de inmunofluorescencia. Probablemente esto se deba a inconvenientes con esta tcnica utilizando el anticuerpo antiHis. Por lo tanto, en adelante todos los ensayos de expresin intracelular de VHHs se realizaron con las construccionesMBPVHHs. Los ensayos de inhibicin intracelular fueron llevados a cabo en las lneas celulares RAW, J774 y Vero. A pesar de los reiterados intentos y grandes esfuerzos por mejorar la eficiencia de transfeccin, no logramos obtener mejoras al respecto. EnunaprimeraetapaserealizaronensayosdetransfeccinconambosMBPVHHse infeccin con el patgeno Salmonella typhimurium y en una segunda instancia se realizaronensayosdetransfeccinconambosMBPVHHsytranslocacindeSpvBal interiordeclulasVero.Paraamboscasosseanalizproteccincelularpormediode MBPVHH5. 6.EnsayosdeinfeccinconSalmonellatyphimuriumySalmonellamutante Para evaluar la capacidad inhibitoria de VHH5 como intrabody en el citoplasma de macrfagos, se llevaron a cabo ensayos de infeccin con el patgeno Salmonella typhimurium (Salmonella wt). La infeccin en cultivos de macrfagos con Salmonella wt induce cambios morfolgicos caracterizados por redondeamiento, 89

 desprendimiento y apoptosis luego de 24 hs de infeccin (114; 170; 181). Sin embargo, se reportaron ensayos de infeccin con Salmonella typhimurium mutante, la cual poseemutaciones puntuales enelgen spvB (originando SpvB mutada ensu sito activo) que no mostraron modificaciones en el citoesqueleto, es decir que no se presentaron los cambios morfolgicos mencionados anteriormente (172). Para los ensayos de infeccin se transfectaron de manera transiente macrfagos RAW, los mismos fueron infectados con Salmonella wt y los resultados fueron visualizados por inmunofluorescencia. Incluimos los siguientes controles: por un lado, Salmonella typhimurium mutante (Salmonella mut), la cual tiene delecionado el gen spvB en el plsmido de virulencia y por lo tanto la enzima no se expresa en el citoplasma de la clula hospedadora; por otro lado, las clulas fueron transfectadas con MBP VHHNReinfectadas.Paraelanlisisdelosresultados,consideramosquelasclulas estaban protegidas cuando se las infect y mostraron su citoesqueleto polimerizado. En la Figura 23 se puede apreciar una inmunofluorescencia del ensayo de infeccin consuscorrespondientescontroles.

90


Figura 23. Infeccin de macrfagos RAW. Inmunofluorescencia de macrfagos RAW transfectados con MBPVHH5 (VHH5), MBPVHHNR (VHH tr) o sin transfectar, e infectadosconSalmonellawtoconlacepaquenoexpresaSpvB(Salmonellamut).Seobserva en la fila superior la presencia de las bacterias (anticuerpo antiSalmonella, azul). En la fila central se muestran las clulas marcadas con faloidinaFITC (verde). En la fila inferior se muestran las clulas marcadas con antiMBP (rojo). Se muestran los controles correspondientes.

En los macrfagos RAW transfectados con los vectores que codifican para MBPVHH5 y para MBPVHHNR se confirm por microscopia de fluorescencia que ambosfueronigualmenteexpresadosenelcitoplasma(Figura23;L,O).Luego,estos cultivos fueron infectados con Salmonella wt (Figura 23; J, M) y la morfologa del citoesqueleto (Figura 23; K, N) fue observada, analizada y comparada con los controles incluidos en el ensayo. Las clulas que expresaron MBPVHHNR y que fueron infectadas mostraron su citoesqueleto redondeado. Al observar las clulas en cultivo, se pudieron visualizar clulas parcialmente despegadas y tambin se observ apoptosis celular. Esta morfologa (citoesqueleto redondeado) fue similar a la presentada por las clulas que solo fueron infectadas con Salmonella wt (Figura 23D,EvsN).EsteefectofueatribuidoengranparteaSpvB,debidoaquelasclulas que fueron infectadas con Salmonella mut (Figura 23G) no mostraron su citoesqueleto modificado (Figura 23H). Las clulas que expresaron MBPVHH5 y fueron infectadas con Salmonella wt, si bien presentaron un cambio parcial en su morfologa, presentaron el citoesqueleto protegido, sugiriendo que el mismo podra ser comparado al citoesqueleto que se visualiz en las clulas infectadas con Salmonellamut(Figura23HvsK). Estos resultados, efectivamente nos indicaron que MBPVHH5 protege a las clulas del efecto txico causado por el factor de virulencia SpvB, es decir, VHH5 neutraliza a la toxina en el citoplasma de las clulas. Esta proteccin result especfica debido a que, como se mostr anteriormente, las clulas que expresaron MBPVHHNR y fueron infectadas con Salmonella wt se redondearon. Claramente, MBPVHHNRnoprotegialasclulasdelefectotxicocausadoporSpvB. 91

 Para cuantificar la cantidad de clulas protegidas por MBPVHH5, se contaron en cada pocillo las clulas que expresaron el intrabody y que haban sido infectadas. Observamosqueenel94%delasclulasquefuerontransfectadasconMBPVHH5e infectadas,elcitoesqueletoseencontrabaprotegido.Consideramosqueelporcentaje declulasquemostrsucitoesqueletoprotegidoessignificativo. ParadiscriminarlosefectoscitotxicosgeneradosporSpvBdeotrosfactoresde virulencia presentes en el patgeno, encaramos nuevos ensayos en los cuales SpvB fuetranslocadaalinteriorcelular. 7. Ensayos de translocacin con la toxina de fusin C2IN/CSpvB al interior celular Para evaluar de forma unvoca la capacidad inhibitoria del VHH5 sobre SpvB, analizamos el efecto protectivo del intrabody expresado en el interior de clulas VerolascualesfuerontratadasconSpvBagregadaexgenamente. En los ensayos de translocacin, trabajamos con la toxina de fusin C2IN/C SpvB para que SpvB pudiera translocarse al interior de las clulas, utilizando la estrategia descripta por Pust et al (188). A continuacin se detalla brevemente la estrategia utilizada por los autores mencionados. Clostridium botulinum posee una toxina denominada C2 que, al igual que SpvB, ADPribosila la actina, depolimerizando los filamentos y causando prdida de la morfologa celular evidenciada por el redondeamiento y generando apoptosis celular. El patgeno resideenendosomascuandoseencuentraenelinteriordelasclulashospedadoras. Clostridium secreta la toxina C2, la cual interacciona con otro componente proteico 92

 denominadoC2IIa,elcualseuneareceptoresdelamembranadelosendosomas.La interaccindeamboscomponentesylaunindeC2IIaareceptoresdelamembrana de los endosomas permiten que la toxina C2 sea translocada al citoplasma de las clulas hospedadoras. El componente enzimtico de C2, llamado C2I es una ADP ribosiltransferasa. La interaccin de C2 con C2IIa es mediada por el Nterminal de C2(C2IN).C2INesenzimticamenteinactivo.Porlotanto,C2IN yC2IIapuedenser utilizados como adaptador y translocador, respectivamente, para el ingreso de protenas al interior de clulas eucariotas. SpvB no puede ingresar al interior de clulas eucariotas, por tal motivo se dise una quimera utilizando el componente enzimticamente inactivo de Clostridium spp, C2IN. Estos autores fusionaron el dominio Cterminal de SpvB (CSpvB) junto a C2IN, construyendo as una quimera denominada C2IN/CSpvB. Ensayos realizados con la quimera mostraron cambios morfolgicos detectados en las clulas los cuales son atribuidos al efecto txico causadoporSpvB. Enunaprimeraetapayparacalcularqucantidaddetoxinasfueronnecesarias para que el 100% de las clulas se redondearan, se incubaron diferentes cantidades de C2I + C2IIa por un lado y por otro C2IN/CSpvB + C2IIa y las mismas fueron agregadas a un cultivo de clulas Vero durante 3 hs. En los ensayos de infeccin pudimos identificar a las clulas infectadas mediante tincin o anticuerpos especficos; en este ensayo no result posible realizar la identificacin de las toxinas. Por esto, fue de gran importancia conocer la cantidad de toxinas necesaria (ver Materiales y mtodos) para asegurar que la totalidad de las clulas estuviera afectada para, en una etapa posterior, analizar el efecto inhibitorio de VHH5. En la Figura 24 se muestra la morfologa de las clulas sin tratar y las tratadas con las toxinas,mediantemicroscopadecontrastedefase. 93


Figura24.Morfologa declulasVeroincubadasconla toxinadefusinC2IN/CSpvB.Se incubaron clulas Vero con las toxinas C2I + C2IIa o C2IN/CSpvB + C2IIa durante 3 hs y luegolamorfologacelularfueanalizadapormicroscopadecontrastedefase. Claramente se puede observar que la toxina de fusin C2IN/CSpvB indujo el
C2I+C2IIa C2IN/CSpvB+C2IIa

redondeamiento de las clulas, de la misma manera que el control positivo con la toxina de Clostridium spp. Posteriormente, analizamos la capacidad de VHH5 de inhibiraC2IN/CSpvB.Paratalfin,lastoxinasC2IyC2IN/CSpvBfueronincubadas previamente en presencia o ausencia de VHH5 y luego fueron agregados al cultivo de clulas Vero durante 3 hs. Nuevamente, la citotoxicidad fue monitoreada por microscopadecontrastedefase(Figura25).
Figura 25. Incubacin de VHH5 con la toxina de fusin C2IN/CSpvB. Se muestran fotografas de microscopa de contraste de fase de clulas Vero incubadas con C2I en presencia o ausencia de VHH5 o con C2IN/CSpvB en presencia o ausencia de VHH5. Se muestraelcontroldeclulasVerosintratar.

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 Como se observ en el ensayo anterior, las clulas tratadas con la toxina C2IN/CSpvB se redondearon, al igual que el control de clulas tratadas con la toxinadeClostridium(Figura25DyB).Seobservaclaramentequelasclulastratadas con la mezcla VHH5 + C2IN/CSpvB conservan su morfologa intacta, similar a la morfologa de las clulas sin tratar (Figura 25A y E). VHH5 no tuvo un efecto inhibitorio en la toxicidad de C2I, evidenciando su especificidad por SpvB (Figura 25C).El100%delasclulastratadasconVHH5conservsumorfologaintacta. EnestecasoelefectoprotectordeVHH5cuandoesincubadoconlaquimerase puede deber a la inhibicin de la actividad txica o alternativamente, a la inhibicin de la translocacin de SpvB al interior de las clulas. Para estudiar la capacidad inhibitoriadeVHH5sobrelaactividadenzimticadelatoxinadefusin,realizamos unensayosimilarutilizandoaVHH5comointrabody. Evaluamos si VHH5 como intrabody es capaz de inhibir a la toxina de fusin C2IN/CSpvB en el interior de clulas eucariotas. Para observar este efecto, clulas Verocreciendoensubconfluenciasetransfectaroncon laconstruccinMBPVHH5y los cultivos fueron incubados con la toxina de fusin C2IN/CSpvB. Las clulas fueronobservadaspormicroscopadefluorescencia(Figura26).

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Figura 26. Translocacin de C2IN/CSpvB al interior de clulas transfectadas con VHH5. Inmunofluorescencia de clulas Vero transfectadas con MBPVHH5, con MBPVHHNR (VHH tr)osintransfectar()ytratadasconlatoxinaC2IoconC2IN/CSpvBosintratar.En la fila superior se muestran las clulas marcadas con faloidinaFITC (verde). En la fila inferiorsemuestranlasclulasmarcadasconantiMBP(rojo).

Las clulas transfectadas con MBPVHH5 e incubadas con C2IN/CSpvB no presentaron redondeamiento celular (Figura 26K y L). Tanto las clulas tratadas con C2IN/CSpvB y no transfectadas (Figura 26I y J) como las transfectadas con MBP VHHNR e incubadas con C2IN/CSpvB presentaron redondeamiento (Figura 26M y N). Estos resultados muestran que MBPVHH5 inhibe los efectos citopticos causadosporC2IN/CSpvB. MBPVHH5 no tiene ningn efecto sobre la toxicidad de C2I, evidenciando la especificidad de VHH5 por la toxina SpvB (Figura 26G y H). Las clulas transfectadasconMBPVHH5eincubadasconC2IN/CSpvB(Figura26KyL)tienen una morfologa levemente modificada con respecto a las clulas no tratadas (Figura 26A y B), pero similar a las que fueron solamente transfectadas (Figura 26C y D), lo quesugierequelatransfeccinporsimismamodificaalasclulas. Pudimos estimar que el 98% de las clulas transfectadas con MBPVHH5 e incubadas con C2IN/CSpvB conserv su citoesqueleto intacto y el 2% restante presentsumorfologaalgomodificada. 96

 El conjunto de estos resultados nos permite concluir que VHH5 bloquea la actividaddeSpvBcuandolamismaestranslocadaalinteriordeclulaseucariotas. En resumen, pudimos probar que VHH5 inhibe a SpvB en clulas

eucariotasportresensayosdiferentes.Comoestosensayosdifierenenlafuentedela toxina y del anticuerpo, podemos concluir que el fragmento VHH5 de llamas es especfico para SpvB y funcionalmente activo en un ambiente reductor como es el citoplasmadeclulaseucariotas.

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Conclusionesgenerales
La enzima SpvB fue purificada y su actividad enzimtica fue medida por radioactividad y fluorometra. El dominio Cterminal de SpvB que obtuvimos, ADPribosilaalaactina,depolimerizandolosfilamentosdelamisma.

Sediseunplandeinmunizacinenllamasylasmismasfueroninmunizadas con el dominio cataltico Cterminal de SpvB. Se produjo una respuesta humoral significativa contra SpvB, lo que permiti generar una biblioteca de expresin en fagos (de tamao 4x107 clones) de los fragmentos variables de hcIgG denominados VHH. La biblioteca obtenida fue de buena calidad y variable.

A partir de tres rondas de seleccin en solucin con 50 nM de SpvB, se obtuvieron fagos que reconocieron a SpvB. Mediante un ELISA de fagos a partir de clones nicos, se identific la presencia de un gran porcentaje de clonesespecficoscontraSpvB.

El anlisis de las secuencias de los VHHs especficos contra SpvB revel que el grupomayoritariotieneunCDR3de18aminocidosdelargo.

Se pudieron expresar y purificar como protena soluble cinco VHHs representativos. Mediante un ensayo de radioactividad pudimos observar que todoslosVHHsseleccionadosinhibieronlaactividadenzimticadeSpvB.

El ensayo de fluorometra permiti cuantificar la capacidad de cada VHH de inhibiraSpvB.LosanticuerposVHH5yVHH6lograronun100%deinhibicin enrelacinequimolarenlascondicionesensayadas.

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 Fue posible expresar VHHs como intrabodies en el citoplasma de diferentes lneascelularesysuexpresinnoafectlaintegridadcelular.

La expresin de VHH5 en macrfagos que luego fueron infectados con Salmonella, logr neutralizar la toxina y, si bien las clulas presentaron un cambioparcialensumorfologa,mostraronelcitoesqueletoprotegido.

La translocacin de SpvB al interior de clulas Vero no indujo citotoxicidad en las clulas que expresaron VHH5 como intrabody. A diferencia de los ensayos de infeccin, no se observaron alteraciones en la arquitectura celular, debido a laausenciadeotrosfactoresdevirulenciadeSalmonella.

Los controles realizados en los ensayos de infeccin y de translocacin nos permitieron concluir claramente que la actividad de SpvB es inhibida especficamentepor VHH5(ynopor VHHNR)yadems,queVHH5reconoce especficamente a SpvB, debido a que no tuvo un efecto inhibitorio sobre la toxicidaddelatoxinaC2IdeClostridiumspp.

Estos resultados constituyen una prueba de concepto sobre el uso de anticuerpos dedominionicodellamaparalainhibicindeenzimasintracelulares.

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DISCUSIN

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 Una estrategia atractiva para impedir el proceso infectivo de bacterias y virus es el bloqueo de factores de virulencia mediante anticuerpos especficos. Sin embargo,estaestrategiapresentadificultadesenelcasodepatgenosintracelulares, dado que el medio intracelular es un ambiente reductor en el cual los anticuerpos convencionales no presentan estabilidad estructural (176,184). En este trabajo de tesis evaluamos la obtencin y el uso de anticuerpos de dominio nico, estables en un ambiente reductor, para inhibir a la toxina SpvB de Salmonella spp. Las enzimas que ADPribosilan, como la toxina del clera y la toxina diftrica, son factores de virulencia esenciales en una gran variedad de patgenos bacterianos, incluyendo ciertas bacterias intracelulares (181183). La virulencia de Salmonella spp est determinada en parte por la toxina SpvB, una ADPribosiltransferasa secretada al citoplasma de las clulas hospedadoras que interfiere en la polimerizacin de la actina,causandoapoptosisymuertecelular. Los camlidos poseen, adems de anticuerpos convencionales, anticuerpos desprovistos de cadena liviana y del dominio CH1, denominados hcIgG. El sitio de unin al antgeno en los hcIgG est formado por un nico dominio, llamado VHH (46,48). El hecho de que este dominio sea de pequeo tamao, y est formado por una nica cadena polipeptdica, facilita su obtencin y posibles aplicaciones. En este trabajo estudiamos las caractersticas de VHHs obtenidos a partir de una llama inmunizadaconeldominiocatalticodelaenzimaSpvBdeSalmonellatyphimuriumy demostramos que estos anticuerpos pueden bloquear intracelularmente la actividad enzimticaycitotxicadeestatoxinabacteriana. Una parte de este trabajo se centr en la generacin de una biblioteca inmune de expresin en bacterifagos de la regin variable (VHH) de las hcIgG. A partir de la biblioteca obtenida, de tamao de 4x107 clones, se expresaron los bacterifagos y se seleccionaron en solucin aqullos que reconocieron a SpvB. Previamente a la seleccin de VHHs especficos contra SpvB, secuenciamos 10 clones elegidos al azar 101

 y no se encontraron clones sin inserto ni secuencias no correspondientes a VHHs. Ninguno de estos clones coincidi con los clones secuenciados luego de la seleccin. La biblioteca result de alta calidad y variabilidad y su tamao result adecuado, resultando similar al obtenido para otras bibliotecas construidas en el laboratorio (189,190191). A pesar de que en los clones secuenciados de la biblioteca el 50 % present cistenas adicionales, stas no fueron encontradas en ninguno de los clones secuenciados luego de la seleccin. Pensamos que esto podra deberse a que la conformacin adquirida en los VHHs que poseen dichas cistenas no resulte adecuadaparaunirseaSpvB. En bibliotecas obtenidas previamente, la seleccin se realiz a partir de un ELISA inmovilizando el antgeno en fase slida, seguida por una elucin clsica o por una elucin especfica (189190, 192), o mediante seleccin sobre clulas expresando el antgeno en su membrana (191). Nosotros, en cambio, elegimos el mtodo de seleccin por afinidad en solucin (193). Al utilizar el inmungeno en solucin se conserva su estructura nativa, no producindose la desnaturalizacin que ocurre al adsorberlo a una superficie slida. De esta manera se seleccionan mayoritariamente anticuerpos que reconozcan al antgeno en su estado nativo. Otra ventaja de esta tcnica es que posibilita trabajar con bajas concentraciones de antgeno y as permite seleccionar a los anticuerpos con mayor afinidad. Cabe destacar que el mtodo de seleccin en solucin permite discriminar a los anticuerpos por su afinidad intrnseca a diferencia de la seleccin en fase slida, en lacualtambinjuegaunrollaavidez. La seleccin fue hecha con dos concentraciones de antgeno, 10 nM y 50 nM. Observamos que con 10 nM de SpvB no hubo un enriquecimiento significativo de fagos especficos mientras que con 50 nM de SpvB s lo hubo. Esto sugiere que en nuestro sistema, se estaran seleccionando anticuerpos con una afinidad en el orden submicromolar. Para confirmar esto se deber realizar un anlisis por biosensor. Estos resultados fueron similares a los obtenidos para otros VHHs generados en nuestro laboratorio (189, 191192) y a otros VHHs mencionados en la bibliografa. 102

 Porejemplo,eneltrabajodeKochNolteycol.,lasafinidadesdelosdominiosVHHs analizados estuvieron en un rango de 36 a 55 nM (191) y en el de Ratier y col., estuvieron en el rango de 22 a 86 nM (192). A pesar de haber maximizado las condicionesparaobteneranticuerposdemayorafinidadquelosobtenidosporotros mtodos en nuestro laboratorio, no logramos obtener anticuerpos con mayor afinidad. Para obtener anticuerpos de mayor afinidad, se debera haber aumentado elnmerodeinmunizaciones,lafrecuenciadelatomademuestrasoeltamaodela biblioteca. Sin embargo, consideramos importante evaluar los costos, los tiempos y elbienestar de losanimales. Pudimos obtener con el plan deinmunizacin diseado y el mtodo de seleccin elegido, anticuerpos capaces de inhibir la actividad enzimticadeSpvB,objetivoprincipaldenuestrotrabajo. Los 20 clones elegidos al azar, secuenciados y seleccionados presentaron un FR2 tpico de camlidos y ausencia completa del dominio CH1. Ninguno present mutaciones en la leucina11 y tampoco se observaron puentes disulfuro adicionales. Si bien se ha postulado que la presencia de puentes disulfuro adicionales confiere unamayorestabilidadalosdominiosVHHs,laausenciadelosmismosenlosclones de VHHs obtenidos no impidi su expresin y purificacin, e incluso fue posible conservarlos durante varias semanas a 4C y a altas concentraciones de imidazol sin que su estabilidad y capacidad de unin por el antgeno se vieran comprometidas. Clasificamos a los 20 clones seleccionados de acuerdo al largo y a la similitud del CDR3. En VHHs, el CDR3 se caracteriza por el largo y elevada variabilidad y ademsproveeunagransuperficiedeuninalantgenocapazdepenetrarenelsitio activo de enzimas inhibiendo su actividad (64, 8485). Notablemente, la mayora de los clones present un CDR3 de 18 aminocidos de largo. Consideramos que los clones con CDR3 ms largos eran los mejores candidatos para inhibir la actividad ADPribosiltransferasadeSpvB.

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 Para realizar un anlisis detallado sobre la capacidad inhibitoria de estos fragmentos, elegimos5 VHHs representativosdela poblacinanalizada, de acuerdo alalongituddesuCDR3.ParamedirlaactividadenzimticadeSpvBdesarrollamos dos tcnicas muy diferentes entre si, mediante el uso de radioactividad y de fluorescencia. Mediante el ensayo de radioactividad, observamos que todos los VHHs analizados bloquean la capacidad de SpvB de ADPribosilar la actina, mientras que el VHH no relacionado es incapaz de inhibir a SpvB, demostrando la especificidad de los VHHs seleccionados. Todos los VHHs especficos ensayados inhibieron a SpvB en una relacin molar SpvB:VHH de 1:1000, no logrndose observar claramente mediante esta tcnica la inhibicin de la actividad enzimtica a menores concentraciones de VHH, como se explic en Resultados y Conclusiones. En trabajos previos, empleando esta misma tcnica logramos obtener una curva de dosisrespuestacon3VHHsqueinhibenlaactividadADPribosiltransferasadeecto enzimas de la superficie de linfocitos (191). Es posible que en este trabajo se haya logrado realizar la curva de dosis respuesta debido a que realizaron los ensayos con un sustrato de SpvB cuantificado (en este caso agmatina) en lugar del lisado de clulas (como fuente de actina) que nosotros utilizamos. Teniendo en cuenta los resultados de esta Tesis en los ensayos de fluorometra, podemos decir que los VHHs evaluados s son capaces de inhibir la actividad de SpvB en menores concentraciones de anticuerpo. Probablemente podramos haberlo mostrado por radioactividad modificando algunos procedimientos del ensayo, sin embargo decidimosaplicarlatcnicadefluorometra.Elanlisisdefluorometranospermiti determinar cuantitativamente la capacidad inhibitoria de cada uno de los VHHs seleccionados. Cada VHH bloque de manera dosisdependiente la actividad ADP ribosiltransferasa de SpvB y dos VHHs, VHH5 y VHH6, inhibieron a SpvB en relacin 1:1 en concentraciones nanomolares. Resulta interesante notar que VHH5 y VHH6, con CDR3 de 18 aminocidos y secuencias muy similares, fueron capaces de producirun100%deinhibicinaunarelacinSpvB:VHHequimolar.Estainhibicin seprodujoutilizandounaconcentracinde66nMdeenzimaydeVHH,porlotanto 104

 se puede estimar que el valor de la afinidad de estos VHHs sera cercano a 66 nM. Esta estimacin concuerda con la realizada en las rondas de seleccin de fagos. Para medir la afinidad de estos VHHs por SpvB, queda pendiente realizar el anlisis en biosensor. Por otro lado, aquellos VHHs con un CDR3 ms corto y distinto, necesitaron un exceso molar de 3 a 5 veces ms de VHH para alcanzar el 100% de inhibicin.EstosresultadosnossugierenquelosanticuerposVHH5yVHH6seunen al sitio activo o a un sitio solapado con el sitio activo de SpvB, inhibiendo la actividadADPribosiltransferasadelaenzima.Encambio,losotrosVHHs,quizsse unan ms dbilmente a la enzima (menor afinidad), o alternativamente, interacten con un sitio parcialmente solapado con el sitio activo de SpvB. Mediante la utilizacin de biosensor con mutantes de SpvB en su sitio activo se podran analizar las hiptesis mencionadas. A partir de la cristalizacin de estos VHHs unidos a la enzima se podrn confirmar estas hiptesis. Segn nuestros resultados, y lo establecido anteriormente, es posible que exista una correlacin entre el tamao del CDR3 y el porcentaje de inhibicin. Para corroborarlo, tendremos que analizar ms VHHsespecficoscontraSpvBporlatcnicadefluorometra. Se ha demostrado que los VHHs pueden ser expresados en el citoplasma de clulas eucariotas y en otros compartimentos celulares, siendo funcionalmente activos (118,119, 121). Los trabajos reportados hasta el momento sobre intrabodies, engeneralestnbasadosenlainhibicindeprotenasyvirus,peronoseobtuvieron inhibidores intracelulares de toxinas bacterianas. Por este motivo, y porque tanto VHH5comoVHH6conCDR3demayorlongitudinhibenlaactividadenzimticade SpvB en relacin equimolar, consideramos que ambos fragmentos eran buenos candidatos para inhibir a SpvB en el interior de clulas eucariotas, es decir, que podan ser utilizados como intrabodies. La eficacia de un intrabody est determinada por su afinidad, estabilidad y nivel de expresin dentro de las clulas. Sehadescriptoque,anconafinidadesmuybajas,ciertosVHHstienenlacapacidad de inhibir la accin de protenas intracelulares (121). Como indican Gueorguieva y 105

 col., VHHs con afinidades micromolares pueden inhibir eficientemente funciones celulares si el intrabody es lo suficientemente estable y tiene elevados niveles de expresin. En dicho trabajo se muestra la capacidad de VHHs expresados como intrabodies y con afinidades en el rango micromolar, de inhibir una protena citoplasmtica involucrada en enfermedades neurodegenerativas. Los resultados obtenidosenestetrabajodeTesissugierenquelasafinidadesdeVHH5yVHH6por SpvBseencuentranenelrangonanomolar.Teniendoencuentaestoylayaconocida estabilidad de los VHHs en ambientes reductores, elegimos a VHH5 como posible candidato a inhibir a SpvB en el interior de clulas eucariotas. Los VHHs pudieron ser expresados en 5 lneas celulares. En una primera etapa y para asegurarnos que los VHHs se podan expresar en el citoplasma de las clulas, utilizamos lneas celulares como HEK y Hela, usualmente usadas para transfeccin. Como los resultados fueron satisfactorios, luego se intent y se corrobor la expresin en las lneas de macrfagos (RAW y J774) y en clulas Vero. Fue de gran importancia e inters expresar los intrabodies en estas lneas ya que estos son los tipos celulares utilizados como modelos en la infeccin por Salmonella. La presencia del intrabody (VHH5 y VHHNR) en ningn caso inhibi el crecimiento celular ni tampoco se observ una modificacin de la morfologa celular, sugiriendo que los VHHs son bien tolerados por las clulas y no interfieren en ningn otro proceso celular. Dado queenunatransfeccintransienteelnmerodeclulastransfectadaspuedeserbajo o heterogneo, intentamos en un principio obtener lneas de transfeccin estables en clulas Hela y macrfagos en J774. A pesar de que ambas lneas sobrevivieron al procesodeseleccinporantibiticos,(esdecir,quecontenanel plsmidoconelgen del VHH y la resistencia a Geneticina), luego de unas semanas ambas lneas dejaron de replicarse. A pesar de que con clulas Hela se avanz un poco ms, hasta el momento no ha sido posible obtener una lnea estable de clulas que expresen un VHH. Si bien se ha reportado la obtencin de una lnea celular de expresin estable de un VHH (183), este trabajo se ha realizado en clulas CHO, las cuales no son

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 tiles para nuestros ensayos. Por lo tanto, debimos trabajar con un sistema de transfeccintransiente. Por medio de dos experimentos independientes entre si, uno infectando con la bacteria Salmonella wt y el otro translocando la toxina SpvB al interior de las clulas, demostramos que VHH5 es capaz de bloquear la actividad ADP ribosiltransferasa de SpvB en el citoplasma de clulas eucariotas. En los ensayos de infeccin, VHH5 protegi a las clulas de la citotoxicidad causada por SpvB en los tiempos evaluados. Pudimos observar que las clulas que expresaron VHH5 y que fueron infectadas mostraron su citoesqueleto protegido, indicando que el intrabody neutraliza a la toxina en el citoplasma de la clula. Las diferencias observadas entre la morfologa celular de las clulas sin infectar y la de las infectadas con Salmonella mut evidencian que la presencia de otros factores de virulencia diferentes a SpvB en Salmonella wt producen leves modificaciones en la arquitectura celular. Consideramos que en aquellas clulas en las que el intrabody se expres correctamente y que luego fueron infectadas, el citoesqueleto fue totalmente protegido de la actividad de SpvB, y que las leves alteraciones en la arquitectura celular fueron producto de otros factores de virulencia y posiblemente de la transfeccin, como se muestra en el ensayo de translocacin. De esta manera, en las clulastransfectadasconVHH5einfectadas,noseobservaelmismofenotipoqueen las clulas sin infectar, pero s resulta similar al observado en las clulas infectadas con la bacteria mutante para SpvB. A pesar de los cambios morfolgicos en el citoesqueleto de las clulas transfectadas con VHH5 e infectadas con Salmonella spp, el intrabody es capaz de proteger a las clulas de la ADPribosilacin causada por SpvB disminuyendo notablemente la mortalidad de las mismas, al menos en los tiempos empleados en el ensayo. Una lnea de expresin estable de VHH5 nos hubiese permitido evaluar la supervivencia celular a tiempos mayores. Como se mencion previamente, la baja eficiencia de transfeccin y en algunos casos la ausencia de expresin del intrabody fue una limitante que se present en estos ensayos, y por tal motivo los mismos fueron repetidos varias veces. Con una lnea 107

 estable se hubiese logrado una homognea expresin de VHH y descartado la alteracin que induce el proceso de transfeccin en las clulas, restndole as variablesalsistema. Pudimos estimar que un 94 % de clulas transfectadas e infectadas present el citoesqueleto protegido, es decir, que la mayora de las clulas no mostr signos de mortalidad luego de 24 hs de infeccin. En el 6 % restante de las clulas que expresaron VHH5 y que fueron infectadas, el citoesqueleto no fue protegido. Consideramos que esto pudo deberse a un defecto en la expresin o el plegamiento deVHH5. En el ensayo de translocacin de SpvB al interior de clulas eucariotas, VHH5 expresado en el citoplasma de clulas Vero neutraliz completamente a la toxina logrando una proteccin total. El 98 % de las clulas transfectadas con VHH5 present el citoesqueleto intacto, no manifestando signos de muerte celular, como redondeamiento y desprendimiento celular. Las diferencias observadas entre las clulas transfectadas y las clulas sin transfectar evidencian, como se coment previamente, que la transfeccin en si modifica levemente la morfologa celular, caracterstica observada en esta lnea celular, como tambin en la mayora de las lneascelularesutilizadasenestetrabajo.Loscontrolesrealizadostantoconlatoxina C2I de Clostridium botulinum como con el VHH no relacionado, proporcionaron resultados contundentes. El 100 % de las clulas tratadas con estos controles presentaron redondeamiento y desprendimiento celular. Este sistema brind importantes ventajas en comparacin con el ensayo de infeccin con Salmonella; una de ellas es la ausencia de otros factores de virulencia bacterianos, permitiendo atribuir las modificaciones en la morfologa celular nicamente a los efectos citotxicoscausadosporSpvB. Por otro lado, adoptando un sistema similar al mencionado anteriormente, pero preincubando la toxina SpvB con VHH5, pudimos demostrar que el VHH5 inhibe la toxicidad de SpvB, reflejado en la morfologa intacta de las clulas, la cual 108

 claramente fue comparable con la morfologa de las clulas sin tratar. No descartamos la posibilidad de que VHH5 pueda ejercer un efecto protectivo inhibiendolatranslocacindelatoxinaalinteriordelasclulas. Apartirdeensayosquedifierenenlafuentedelatoxinayenladelanticuerpo, pudimos demostrar que VHH5 inhibe la ADPribosilacin de la toxina SpvB en el interior de clulas eucariotas. Nosotros hipotetizamos que el CDR3 de este VHH, se introduce en el sitio activo de SpvB. De todas maneras, a partir de estudios estructurales sobre los contactos que efectivamente se establecen en la interaccin entre VHH5 y SpvB podremos confirmar esta hiptesis. Para ello, intentaremos cristalizarelcomplejoentreVHH5ySpvB. En este trabajo de Tesis se demuestra que a partir de una biblioteca de una llama inmunizada con el dominio cataltico de SpvB se obtuvieron VHHs que bloquean especficamente la actividad ADPribosiltransferasa de SpvB en el interior de clulas eucariotas. VHHs que bloquean la actividad de SpvB no solo constituyen herramientastilesparainvestigacin,tambinproveenlabaseparaeldesarrollode nuevos agentes teraputicos, por ejemplo a travs de la transfeccin o la expresin transgnica de intrabodies, a travs de la fusin a dominios translocadores o bien a travsdepptidossintetizadosenbasealCDR3.Enalgunosanimalesdomsticosya se han establecido tanto la introduccin transgnica como la expresin tejido especfica de genes forneos. Para aumentar la resistencia en animales domsticos hacia cepas patgenas de Salmonella, una estrategia experimental podra ser la expresin transgnica de VHHs como intrabodies neutralizando a SpvB en el citoplasma de las clulas blanco de este patgeno. En este contexto, es interesante sealarquelaexpresintransgnicadeanticuerposdellamadedominonicoyaha sido utilizada con xito en Drosophila para bloquear la agregacin nuclear de una protena (194) y en plantas (papas) para bloquear la actividad de una enzima cloroplstica que procesa el almidn (195). Por otro lado, la fusin gentica a 109

 dominios de translocacin puede servir como un mecanismo para translocar protenas a travs de la membrana hacia el citoplasma de las clulas (102103); de hecho, recientemente se ha utilizado para introducir anticuerpos convencionales scFvcontraeloncogencmycenelcitoplasmadeunalneacelularhumana(103).Del mismo modo, la fusin de un VHH a una protena o pptido adecuados podra ser utilizada para neutralizar a SpvB en el citoplasma de clulas epiteliales. Debido a su alta solubilidad y capacidad de replegado y menor tamao, los anticuerpos de dominio nico de camlidos podran ser incluso ms aptos para tales estrategias de translocacinquelosanticuerposconvencionales. ConrespectoalCDR3,debidoallargoyasuinteraccinconelantgeno,puede ser utilizado para la sntesis y el diseo de pptidos, manteniendo la especificidad y funcionalidaddelanticuerpodedominionico.Esteprincipiohasidorecientemente demostrado a partir de un VHH que bloquea a la lisozima (196). Los pptidos son fciles de producir en grandes cantidades y pueden ser ms fciles de translocar a travs de la membrana plasmtica que las protenas para el diseo de drogas de pptidosmimticos. Nuestro trabajo proporciona una prueba de concepto para el desarrollo de VHHs para neutralizar a toxinas que ADPribosilan. En trabajos previos mostramos la capacidad de VHHs de inhibir in vivo a la ectoenzima ART2.2, una ADP ribosiltransferasa que se expresa en la superficie de los linfocitos que tiene una estrecha relacin con toxinas bacterianas que ADPribosilan (191). Como SpvB, la exoenzima S de Pseudomonas aeruginosa y HopU1 de Pseudomonas syringae son citotoxinas que ADPribosilan y que son translocadas al citoplasma de clulas de animales y de plantas, respectivamente, a travs del sistema de secrecin de tipo III (197198). Teniendo en cuenta que los VHHs son muy estables en distintos ambientes y que se pueden adaptar a formatos multivalentes, son particularmente adecuados para ser utilizados como herramientas en un nmero variado de estrategias. 110

 Nuestros resultados subrayan la potencialidad de VHHs de camlidos para bloquear enzimas de inters biolgico en compartimentos extra e intracelulares. El presentetrabajoesunaporteoriginalsobrelautilizacindeanticuerposdellamade dominio nico para inhibir toxinas bacterianas en el interior de clulas eucariotas. Los VHHs que bloquen a SpvB, adems de constituir una herramienta en investigacin, pueden proporcionar una importante base para el desarrollo de nuevosreactivosteraputicos.

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